Αφηρημένο

PIK3CA

προς τα πάνω ρύθμιση, η ενίσχυση και η μετάλλαξη έχει αναφερθεί ευρέως σε καρκίνους των ωοθηκών και άλλων όγκων, γεγονός που υποδηλώνει έντονα ότι

PIK3CA

είναι ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο. Ωστόσο, μέχρι σήμερα οι μηχανισμοί που διέπουν

PIK3CA

ρύθμιση και ενεργοποίηση

in vivo

είναι ακόμα ασαφής. Κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, αλληλεπιδράσεων ξενιστή-όγκου μπορεί να παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στην επεξεργασία του όγκου. Εδώ, αναφέρουμε ένα νέο μηχανισμό, μέσω του οποίου το μικροπεριβάλλον του όγκου ενεργοποιεί το

PIK3CA

ογκογονίδιο. Θα δείξουμε ότι

PIK3CA

αυξητική ρύθμιση εμφανίζεται σε μη πολλαπλασιαζόμενα περιοχές του όγκου

in vivo

. Έχουμε αναγνωριστεί και χαρακτηριστεί το

PIK3CA

5 ‘ανάντη μεταγραφική ρυθμιστική περιοχή και επιβεβαίωσε ότι

PIK3CA

μεταγραφικά ρυθμίζεται μέσω NF-κΒ οδού. Αυτά τα αποτελέσματα προσφέρουν έναν νέο μηχανισμό μέσω του οποίου η μικροπεριβάλλον του όγκου ενεργοποιεί άμεσα ογκογόνο οδών σε κύτταρα όγκου

Παράθεση:. Yang Ν, Huang J, Greshock J, Liang S, Barchetti Α, Hasegawa Κ, et al. (2008) μεταγραφική ρύθμιση του

PIK3CA

Oncogene από NF-κΒ στον καρκίνο των ωοθηκών μικροπεριβάλλον. PLoS ONE 3 (3): e1758. doi: 10.1371 /journal.pone.0001758

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Edathara Αβραάμ, του Πανεπιστημίου του Αρκάνσας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Γενάρη του 2008? Δεκτές: 7 Φεβρουαρίου 2008? Δημοσιεύθηκε: 12, Μαρτίου του 2008

Copyright: © 2008 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από NCI P01-CA83638 SPORE σε καρκίνο των ωοθηκών (Βραβείο σταδιοδρομίας Ανάπτυξης, LZ)? το Ταμείο των ωοθηκών Cancer Research (GC και LZ)? Mary Kay Ash Φιλανθρωπικό Ίδρυμα (LZ) και η Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία (LZ). AG υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια predoctoral υποτροφία από το Υπουργείο Παιδείας (Πρόγραμμα ΗΡΑΚΛΕΙΤΟΣ, ΕΠΕΑΕΚ). DK εν μέρει υποστηρίζεται από την Ένωση ιταλική Έρευνας για τον Καρκίνο (AIRC)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

φωσφατιδυλινοσιτόλης-3 «κινάσης (ΡΙ-3 κινάση) είναι ένα ενδοκυτταρικό μετατροπέας με ειδικότητα λιπίδιο υπόστρωμα εμπλέκεται σε ένα ευρύ φάσμα των οδών σηματοδότησης που σχετίζεται με καρκίνο που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων, την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό [1], [2], [3], [4 ], [5], [6], [7]. Είναι προσληφθεί και ενεργοποιείται από πολλαπλούς κινάσες τυροσίνης υποδοχέα και παράγει δεύτερους αγγελιοφόρους μέσω φωσφορυλίωσης των λιπιδίων ινοσιτόλης μεμβράνης στην θέση D3 [3], [8]. ΡΙ-3 κινάση αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως υποθετικό ογκογονίδιο, λόγω της ικανότητάς του να δεσμεύει πολυώματος μεσαίο Τ αντιγόνο [9], [10]. Μοριακή κλωνοποίηση του ΡΙ-3 κινάσες αποκάλυψε ένα μεγάλο και σύνθετο οικογένεια που περιέχει τρεις κατηγορίες των πολλαπλών υπομονάδων και ισομορφών [3], [8]. Ωστόσο, πώς κάθε υπομονάδα συμβάλλει ακριβώς στην πρόοδο και τη συντήρηση του καρκίνου είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη [3], [5].

Το

PIK3CA

γονίδιο κωδικοποιεί την καταλυτική υπομονάδα ρ110-άλφα, ένα από τα οι τρεις καταλυτικές πρωτεϊνικές υπομονάδες των κλάσης IA ΡΙ-3 κινάσες που συνήθως ενεργοποιείται από παράγοντα ανάπτυξης υποδοχέα κινασών τυροσίνης.

PIK3CA

ταυτοποιήθηκε ως γρίπη ρετροϊό που κωδικοποιείται ογκογονίδιο που μετασχηματίζει ινοβλάστες εμβρύου κοτόπουλου [11]. Πολυάριθμες πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι

PIK3CA

και κατάντη οδούς συχνά στόχο γονιδιωματική ενίσχυση, μετάλλαξη ή υπερέκφραση σε συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών [12], [13], [14], [15], [16] [17], [18], [19], [20]. Προηγούμενες μελέτες σχετικά με τη λειτουργία του

PIK3CA

έχουν επικεντρωθεί κυρίως στις ρυθμιστικές κυκλωματικούς μέσα στο καρκινικό κύτταρο.

In vitro

,

PIK3CA

διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό κυττάρων [1], [2], [3], [4], [5], [7]. Ωστόσο, μέχρι σήμερα παραμένει άγνωστο αν

PIK3CA

αναλαμβάνει διαφορετικούς ρόλους ανάλογα με την κατάσταση ή /και το πλαίσιο στο οποίο βρίσκεται το κύτταρο όγκου. Επιπλέον, παραμένει ασαφές το πώς ένα τέτοιο ρόλο του

PIK3CA

μπορεί να επηρεαστεί από το περιβάλλον του όγκου.

δυναμικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των γενετικών απορρύθμιση στα καρκινικά κύτταρα και αντιδραστική μοριακών και κυτταρικών μεταβολών στα κύτταρα του ξενιστή συμπλήρωση του όγκου μικροπεριβάλλον διαδραματίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην προώθηση κακοήθη μετασχηματισμό και την εξέλιξη του όγκου και την ανάπτυξη [21], [22]. Μετά την εξαγορά της κρίσιμης γενετικές αλλαγές, τα καρκινικά κύτταρα υποβάλλονται σε μεταβολική /ισχαιμικό στρες και να επεξεργαστείτε τη γύρω μικροπεριβάλλον. Με τη σειρά του, κύτταρα-ξενιστές χρησιμεύουν για να επεξεργαστείτε τον όγκο, την προώθηση της επιλογής των κυττάρων του όγκου που επωφελούνται από επιρροές μικροπεριβάλλον του όγκου. Έμφυτη και προσαρμοστικών μηχανισμών ανοσολογική απόκριση σε όγκους με αποκορύφωμα τη φλεγμονή έχουν λάβει σημαντική προσοχή σε αυτό το πλαίσιο, η φλεγμονή έχει αποδειχθεί για να προωθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου και την εξέλιξη [23], [24], [25]. Tumor-σχετίζεται λευκοκύτταρα παράγουν πολυάριθμες προ-αγγειογόνος παράγοντες που προωθούν νεοπλαστική αγγείωση [26], [27], [28], [29]. Επιπλέον, πυρηνικό παράγοντα κάππα Β (NF-κΒ), ένας κρίσιμος μεταγραφικός ρυθμιστής της φλεγμονής, έχει δειχθεί ότι παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στη φλεγμονή με γνώμονα την καρκινογένεση και την προώθηση της ανάπτυξης και της εξέλιξης [25] του όγκου, [30], [31 ], [32], [33], [34], [35]. Έχει έτσι υποτεθεί ότι η συνεχής και δυναμική cross-talk μεταξύ καρκινικών κυττάρων και κυττάρων ξενιστών εξασφαλίζει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και διατηρεί ανάπτυξη του όγκου [21], [22]. Οι αμοιβαίες επιδράσεις των αλληλεπιδράσεων με όγκο υποδοχής έχουν χαρακτηριστεί σε σχέση με την αγγειογένεση. Ωστόσο, το πώς οι αλληλεπιδράσεις όγκου-ξενιστή επηρεάζουν άμεσα τα καρκινικά κύτταρα παραμένουν εν μέρει απροσδιόριστο.

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC), η πιο κοινή κακοήθεια των ωοθηκών, εξακολουθεί να είναι η κύρια αιτία θανάτου μεταξύ των γυναικολογικών κακοηθειών [36]. Η έλλειψη στρατηγικών πρόληψης, έγκαιρης διάγνωσης μεθόδων και αποτελεσματικές θεραπείες για τη θεραπεία της υποτροπιάζουσας όγκους των ωοθηκών δημιουργεί μια πιεστική ανάγκη να κατανοήσουμε την παθογένεση της και να προσδιορίσει μοριακούς στόχους τόσο για τη διάγνωση και τη θεραπεία του ΕΓΚ σε διαφορετικό στάδιο εξέλιξης της νόσου [20], [37] , [38], [39], [40], [41]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την έκφραση του

PIK3CA in vivo

και τη σχέση της με το μικροπεριβάλλον του όγκου στον καρκίνο του ανθρώπου ωοθηκών. Η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός του

PIK3CA

5 ‘μεταγραφική ρυθμιστική περιοχή (TRR) μαζί με λειτουργικά πειράματα επικύρωσης επιβεβαίωσε ότι

PIK3CA

ρυθμίζεται μεταγραφικώς από μικροπεριβάλλον, μέσα από φλεγμονή και NF-κΒ. Αυτά τα αποτελέσματα προσφέρουν έναν νέο μηχανισμό μέσω του οποίου η μικροπεριβάλλον του όγκου ενεργοποιεί άμεσα ογκογόνο οδών σε καρκινικά κύτταρα και προάγει την ανάπτυξη του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη συλλέχθηκαν στο Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια και το Πανεπιστήμιο του Τορίνο, στην Ιταλία [42]. Οι ιστοί ελήφθησαν μετά από γραπτή συγκατάθεση των ασθενών στο πλαίσιο ενός γενικού πρωτοκόλλου συλλογή ιστών που εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο του ιδρύματος Institutional Review (IRB) του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια και το Πανεπιστήμιο του Τορίνο. Όλες οι όγκοι ήταν από την πρωτοβάθμια τόπων, και συλλέχθηκαν κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης debulking από λάβει προηγούμενη θεραπεία οι ασθενείς με σταδίου ΙΙΙ και IV του καρκίνου των ωοθηκών. Τα δείγματα καταψύχθηκαν ακαριαία αμέσως και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Τα δείγματα συλλέχθηκαν με τοπική έγκριση του διοικητικού συμβουλίου επανεξέταση θεσμικές και επεξεργασία σύμφωνα με τις διαδικασίες που εγκρίθηκε από την πράξη HIPAA.

Πολιτισμός τηλέφωνα

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Invitrogen). Σε μερικά πειράματα τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο εμπλουτισμένο με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο TNF-α (50 ή 100 ng /ml, BD Bioscience, San Jose, CA) για διάφορους χρόνους όπως υποδεικνύεται.

Ολικό RNA απομόνωση και τον ποσοτικό Σε πραγματικό χρόνου RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από 100 έως 500 mg του κατεψυγμένου ιστού ή 1 × 10

6 καλλιεργημένα κύτταρα με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Μετά την επεξεργασία με RNase-free DNase (Invitrogen), ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας Superscript First-Strand Synthesis Kit για RT-PCR (Invitrogen) υπό συνθήκες που καθορίζονται από τον προμηθευτή. cDNA ποσοτικοποιήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου για το ΑΒΙ Prism 7900 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems). Ανθρώπινα

PIK3CA

πρόσθιο εκκινητή: TCA ΑΑΟ GAT ΤΟΟ GCA CTT ΤΤ, και να αντιστρέψει αστάρι: GCC ΤΕΕ ACT TGC CTA TTC AG. Η PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίων SYBR Green PCR Πυρήνας (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. PCR ενίσχυση του γονιδίου GAPDH οικοκυρικής διεξήχθη για κάθε δείγμα ως έλεγχος για τη φόρτωση του δείγματος και να επιτρέψουν την κανονικοποίηση μεταξύ των δειγμάτων. Μια πρότυπη καμπύλη κατασκευάστηκε με φορέα PCR II ΤΟΡΟ-κλωνοποίησης (Invitrogen) που περιέχει το ίδιο εισαχθέντος τεμαχίου και ενισχύεται από τον πραγματικό χρόνο PCR.

Tissue Microarray

Η μικροσυστοιχία ιστός δομήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43], [44]. Εν συντομία, οι όγκοι εγκλείστηκαν σε παραφίνη και 5-μm τομές βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη για να επιλέξετε αντιπροσωπευτικές περιοχές για βιοψίες. Τέσσερις βασικές βιοψίες ιστού ελήφθησαν από κάθε δείγμα. Η παρουσία του ιστού του όγκου για τις σειρές δειγμάτων επαληθεύτηκε χρωματισμένο τμήμα αιματοξυλίνη-εοσίνη.

ανοσοϊστοχημεία (IHC) και Ανάλυση Εικόνας

IHC διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Vectastain ABC Kit, όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Vector, Burlingame, CA). Χρησιμοποιήσαμε τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα (όλα από Βϋ Pharmingen εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά): κουνελιού αντι-ανθρώπινης Κί67 (1:200, ϋΑΚΟ, Carpinteria, CA)? κουνελιού αντι-ανθρώπινης κυτοκερατίνης (1:200, ϋΑΚΟ)? κουνελιού αντι-ανθρώπινο p65 (1:400, Santa Cruz, Santa Cruz, CA)? ποντικού αντι-ανθρώπου ρ110α (1:250 ή δύο παρα δέκα)? αρουραίου αντι-ποντικού CD31 (1:200)? ποντικού αντι-ανθρώπου HIF1Α (1:200)? ποντικού αντι-ανθρώπινου c-Jun (1:200)? αρουραίος CD11b αντι-ποντικού (1:200). Αντισώματα επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου ή όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η ανοσοαντίδραση οπτικοποιήθηκε με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (Vector). Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [45]. Εν συντομία, οι τομές επωάστηκαν σε διαδοχικά 5% φυσιολογικό ορό? πρωτογενή αντισώματα για 2 ώρες? και φθορίζοντα επισημασμένα δευτερογενή αντισώματα (Vector) για 30 λεπτά. Οι τομές επιχρωματίστηκαν με DAPI προτού επιθεωρηθεί με την μικροσκόπιο φθορισμού. Εικόνες συλλέχθηκαν μέσω Cool SNAP Pro έγχρωμη ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) και το δείκτη χρώση αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 4.1 λογισμικό (Media Cybernetics).

ΤΟΥΝΕΛ Δοκιμασία

η υπεροξειδάση ApopTag στο κιτ ανίχνευσης situ (Intergen) χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει αποπτωτικά κύτταρα

in vivo

και

in vitro

. Η διαδικασία εκτελείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τομές ιστών όγκου μονιμοποιήθηκαν με 1% παραφορμαλδεϋδη σε PBS, ακολουθούμενο από ψυχρή αιθανόλη και οξικό οξύ μετα-στερέωσης. Μετά την επώαση με τα υπολείμματα του διγοξιγενίνη νουκλεοτιδίων και τερματική τρανσφεράση δεσοξυνουκλεοτιδίων για μία ώρα στους 37 ° C, τα κύτταρα επωάστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο αντίσωμα αντι-διγοξιγενίνης.

πλασμίδια

Το ποντίκι

PIK3CA

cDNA γενναιόδωρα από τον Dr. Roberts (Harvard University). Θηλαστικών πλασμίδιο έκφρασης pCDNA3 ήταν από την Invitrogen. Για την κατασκευή της λουσιφεράσης πλασμίδια ανταποκριτές, 5’TRRs του ανθρώπου και ποντικού

PIK3CA

ενισχύθηκαν από BAC ή γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιώντας Expand PCR System High Fidelity (Roche, Indianapolis, ΙΝ) και εισάγεται ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης σε pGL3 -Βασικές φορέα (Promega, Madison, WI). Ακολουθίες 5’TRR σε όλα αυτά τα κατασκευάσματα ανταποκριτή επαληθεύτηκαν με καθορισμό αλληλουχίας DNA.

5 ‘ταχείας ενίσχυσης των άκρων cDNA (5’ RACE)

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το κιτ RNeasy Mini RNA (Qiagen, Valencia CA) και το «σύστημα RACE 5 (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε. Το προϊόν PCR 5 ‘RACE εισήχθη εντός του συστήματος κλωνοποίησης ΤΑ (Invitrogen).

Το πλασμίδιο Επιμόλυνση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 3 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και αυξήθηκαν για μία νύχτα σε -40% συρροή πριν από την επιμόλυνση. Όλα τα πλασμίδια επιμολύνθηκαν με αντιδραστήριο διαμόλυνσης Fugene6 (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την επιλογή ανθεκτικών σε νεομυκίνη κύτταρα, εφαρμόστηκε 400 μg /ml νεομυκίνη (Invitrogen). Για τα πειράματα shRNA, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA που εκφράζουν pLTsuppressor1.0. In vitro πειράματα έδειξαν ότι η καταστολή του

PIK3CA

mRNA παρέμεινε για μέχρι και 30 ημέρες. Όλα τα πειράματα διαμόλυνσης έγιναν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές με διαφορετικές απομονώσεως DNA.

Δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων στα 3 χ 105 κύτταρα /φρεάτιο και αναπτύσσονται όλη τη νύκτα σε 40% συρροή πριν από την επιμόλυνση. Για να ελεγχθεί η δραστικότητα προαγωγέα του

PIK3CA

, συνολικά κατασκεύασμα ανταποκριτή 0,5 μg και 0.01 μg ρΡΙ_-ΤΚ εσωτερικού ελέγχου (Promega) χρησιμοποιήθηκαν για κάθε επιμόλυνση. Όλα τα πειράματα διαμόλυνσης έγιναν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές με διαφορετικές απομονώσεις DNA. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, ανάλυση λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκε σε Luminoskan Ascent (Thermo-Labsystems, Waltham, ΜΑ) χρησιμοποιώντας σύστημα προσδιορισμού Dual-Luciferase Reporter (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Για τα πειράματα συν-επιμόλυνση, 1 μg από κάθε pCMV-ΙκΒα ή pCMV-IκBαM πλασμίδιο (Clonetech, Mountain View, CA) χρησιμοποιήθηκε.

Shift Κινητικότητα ηλεκτροφορητικής Δοκιμασία (EMSA)

Πυρηνική εκχύλισμα από κύτταρα παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας NE-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Εκχύλιση Αντιδραστήρια συν Ανάσχεση κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης Kit (Pierce, Rockford, IL) ακολουθώντας τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή και αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Ανασυνδυασμένη NFκB (Ρ50) διατάχθηκε από την Promega. 5′-βιοτίνη-σημασμένο ολίγο DNA που περιέχει το άγριου τύπου ανθρώπινη

PIK3CA

NFκB θέση σύνδεσης (GACGTGGGGGATTTTTCGCGTA), μεταλλαγμένη ανθρώπινη

PIK3CA Ιστοσελίδα πρόσδεσης NFKB (GACGTGGGCGATTTTTCGCGTA), αγωνίζομαι ανθρώπινη

PIK3CA

ΝΡκΒ θέση πρόσδεσης (TCAGATAGACGAGACTTGAGTC), θέση δέσμευσης ελέγχου άγριου τύπου ΝΡκΒ (AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG) [35], η περιοχή ελέγχου μεταλλαγμένη ΝΡκΒ πρόσδεσης (AGTTGAGGCGACTTTCCCAGG) συντέθηκαν και τα δύο συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια ανοπτήθηκαν για να ληφθεί η ανιχνευτή δίκλωνου. EMSA διεξήχθη χρησιμοποιώντας LightShift χημιφωταύγειας EMSA Kit (Pierce). Το πυρηνικό εκχύλισμα (ή ρ50) και 30 fmol του επισημασμένου ανιχνευτή επωάστηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 10 × συν 1 μg πολυ (dI-dC) σε σύστημα αντίδρασης 20 μΐ σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Το σύνολο 20 μΙ αντίδραση σύνδεσης φορτώθηκε σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 7,5% και να τρέξει σε θερμοκρασία δωματίου σε 0,25 × TBE στα 110 V για 1-1,5 ώρες. Η ηλεκτροφόρηση αντίδραση δέσμευσης στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε Brightstar-Plus θετικά φορτισμένη μεμβράνη νάιλον (Ambion, Austin, ΤΧ) σε Trans-Blot SD Semi-Dry ηλεκτροφορητική μεταφορά κυττάρων (Bio-Rad, Hercules, CA) σε 15 V για 30 λεπτά και εγκάρσια -συνδεδεμένες στο υπεριώδες Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) σε διακλαδικό επίπεδο σύνδεσμο αυτοκινήτων για 1 λεπτό. Ανίχνευση Βιοτίνη-σημασμένο ανιχνευτή DNA εκτελέστηκε ακολουθώντας αυστηρά το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) θα

δοκιμασία τσιπ για να ανιχνεύσει δεσμευτικές για την ανθρώπινη p65

PIK3CA

υποκινητή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας Upstate πλινθίου (Upstate, Charlottesville, VA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Διασπασμένο DNA επωάστηκε στους 4 ° C όλη τη νύκτα με 2 μg ανοσοκαταβύθιση πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού IgG προς ρ65 (Santa Cruz) ή 2 μα φυσιολογική IgG ελέγχου κουνελιού. Εισόδου και χρωματίνη-ανοσοκαταβυθίστηκαν DNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα PCR για την ανίχνευση της ρ65 δεσμευτική για τον προαγωγό (με εκκινητές 5′-GCACCAAGACACTACCTTGAATC-3 ‘και 5′-CTCTGCAGTCCTTTGACTCACTT-3′) ή επί του υποκινητή GAPDH (με εκκινητές 5’-GACACCATGGGGAAGGTGAA -3 ‘και 5′-GAGTAGGGACCTCCTGTTTC-3’) χρησιμοποιώντας το κιτ PCR πυρήνα (Roche).

Βιοπληροφορική

Μια έρευνα για τις πιθανές μεταγραφικού παράγοντα sites στο ανθρώπινο και το ποντίκι δεσμευτική

PIK3CA

5’TRRs πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Mat Επιθεωρητής V2.2 σε https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html [46].

Στατιστικά

η στατιστική ανάλυση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SPSS στατιστικών (SPSS). Όλα τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD, και ρ & lt? 0,05 χρησιμοποιήθηκε για σημαντικότητα

Αποτελέσματα

PIK3CA

υπερεκφράζεται σε μη πολλαπλασιαζόμενα περιοχών καρκίνο των ωοθηκών

Για να αποκαλύψει χωρικές πτυχές του

PIK3CA

ρύθμιση στον όγκο

in vivo

, εξετάσαμε για πρώτη φορά την έκφραση της ρ110α σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου των ωοθηκών. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ισχυρή έκφραση ρ110α ανιχνεύθηκε κυρίως σε ομάδες των μη-πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα Ki67- όγκου (Σχήμα 1 Α έως C). Σε αυτά τα κύτταρα, ρ110α ήταν μετατοπίζεται προς την κυτταρική μεμβράνη (Εικόνα 1 C). Σε αντίθεση, Ki67 + περιοχές με χαμηλή έκφραση του ρ110α, που βρίσκονται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, ενώ μόνο λίγοι + κύτταρα Κί67 παρουσίασαν ρ110α στη μεμβράνη των κυττάρων (Σχήμα 1 Β). Μια μικροσυστοιχία ιστός χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω επικύρωση αυτού του αποτελέσματος σε ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών. Σε 18 από 30 (60%) των όγκων, η έκφραση ισχυρής ρ110α (και εντοπισμός μεμβράνης) ανιχνεύθηκε κυρίως σε περιοχές του όγκου Ki67-, ενώ στους άλλους όγκους έκφραση ισχυρή μεμβράνη ρ110α εντοπίστηκαν είτε και οι δύο στα δύο κύτταρα όγκου Ki67- και Κί67 + (5 /30, 16,7%)? κυρίως σε κύτταρα όγκου Κί67 + (3 /30,10.0%)? ή ήταν μη ανιχνεύσιμο. (4/30? 13,3%)

Α έως Γ Double ανοσοχρώση της ρ110α (πράσινο, FITC) και Ki67 (κόκκινο, Texas Red) σε ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών Β Υψηλή μεγέθυνση του α περιοχή από ένα με χαμηλή έκφραση του ρ110α. ρ110α εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα και εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα του Κί67-θετικών κυττάρων όγκου. Γ Υψηλή μεγέθυνση μιας περιοχής από το Α με υψηλή έκφραση του ρ110α. ρ110α εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα και εντοπίζεται στη μεμβράνη πλάσματος σε Ki67-αρνητικά κύτταρα όγκου. Δ και Ε Ανοσοϊστοχημική εντόπιση του Κί67 επιτρέπει τον σαφή καθορισμό των τομέων πολλαπλασιάζονται και των περιοχών της μη πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα

in vivo

το 2008 ξενομοσχεύματος όγκους των ωοθηκών. Ε Υψηλή μεγέθυνση του τομέα από D δείχνει το όριο μεταξύ μιας πολλαπλασιαζόμενα και μια περιοχή μη-πολλαπλασιαζόμενα. ΣΤ Η ισχυρή έκφραση και την εντόπιση της κυτταρικής μεμβράνης των ρ110α βρίσκεται μόνο σε Ki67-αρνητικό περιοχές. F. Το τμήμα δίπλα στο Δ, χρωματίστηκαν με αντίσωμα έναντι ανθρώπινου ρ110α (αραίωση 1: 250). G. Υψηλή μεγέθυνση του τομέα από F δείχνει το όριο μεταξύ πολλαπλασιαζόμενα και μη πολλαπλασιαζόμενα περιοχή. H. Υψηλή μεγέθυνση του τομέα από το G δείχνει εντοπισμό μεμβράνης της ρ110α στην περιοχή μη-πολλαπλασιαζόμενα. I. Η ανοσοχρώση των ανθρώπινων κυτοκερατίνης εντοπίζει καρκινικά κύτταρα σε πολλαπλασιαζόμενα και μη πολλαπλασιαζόμενα περιοχές στο μοντέλο 2008 ξενομοσχεύματος. Η γραμμή ανιχνεύει το όριο μεταξύ των δύο περιοχών, όπως ορίζεται από χρώση Ki67 σε παρακείμενο τμήμα (βλέπε J). Αμφότερα τα πολλαπλασιαζόμενα και μη πολλαπλασιαζόμενα περιοχές είναι θετικά για την ανθρώπινη κυτοκερατίνη (FITC, πράσινο), υποδεικνύοντας καρκινικά κύτταρα. Οι κυτταρικοί πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI. J έως L. διπλό ρ110α και Ki67 ανοσοχρώση χάρτες

PIK3CA

ενεργοποίηση σε πολλαπλασιαστικά ή μη πολλαπλασιαστικά περιοχές το 2008 όγκους ξενομοσχεύματος. J. Κί67 (κόκκινο, Texas Red) και ρ110α (FITC, πράσινο) παρουσιάζουν αμοιβαία έκφραση. Κ και L. High μεγέθυνση των πολλαπλασιαζόμενων περιοχής (Ι) και μη-πολλαπλασιαζόμενα περιοχή (H) από το J.

Η

Για την περαιτέρω επιβεβαίωση του αποτελέσματος αυτού, ερευνήσαμε όγκους ξενομοσχεύματος που δημιουργείται με την κυτταρική γραμμή 2008 καρκίνου των ωοθηκών . Το πλεονέκτημα αυτού του μοντέλου είναι ότι διαφορετικές περιοχές των πολλαπλασιαζόμενων και ανάπαυσης καρκινικά κύτταρα μπορεί να προσδιοριστεί με σαφήνεια

in vivo

με χρώση Ki67 (Σχήμα 1 D και E) [47]. Παρομοίως με την αμοιβαία έκφραση παρατηρήθηκε στα ανθρώπινα δείγματα, ισχυρή ρ110α έκφραση ανιχνεύθηκε σε κύτταρα όγκου μόνο σε Ki67-, μη πολλαπλασιαζόμενα περιοχές (Σχήμα 1 F έως Η). Σε αυτές τις περιοχές, ρ110α εντοπίστηκε κυρίως στην μεμβράνη των κυττάρων (Σχήμα 1 Η). Διπλή χρώση επιβεβαίωσε ότι οι περιοχές που εκφράζουν ρ110α ήταν στην πραγματικότητα κατοικείται από καρκινικά κύτταρα, τα οποία εξέφραζαν κυτοκερατίνης, επιθηλιακή δείκτης όγκου (Σχήμα 1 I έως Κ). Με αυξημένη συγκέντρωση πρωτογενούς αντισώματος (από 1:200 έως 1:50), η ασθενής έκφραση ρ110α θα μπορούσε επίσης να ανιχνευθεί σε Ki67 + περιοχές, αλλά ρ110α εντοπισμένη διάχυτα στο κυτταρόπλασμα σε αυτές τις περιοχές (Σχήμα 2). Έτσι, ογκογονίδιο

PIK3CA

σημαντικά υπερεκφράζεται σε μη πολλαπλασιαζόμενα περιοχές στον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών

in vivo

. Αυτά τα μη πολλαπλασιαζόμενα περιοχές στερούνται πάντα υποστήριξη των αιμοφόρων αγγείων και περιέχουν πολυάριθμα νεκρωτικά /αποπτωτικών κυττάρων καθώς και πλούσια λεμφοκυττάρων που διηθούν (Σχήμα 3).

A. Ανοσοϊστοχημική χρώση των ρ110α χρησιμοποιώντας υψηλή συγκέντρωση πρωτογενούς αντισώματος (1:50) αποκαλύπτει χαμηλή έκφραση του ρ110α διάχυτα στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων σε Κί67-θετικό (+ Ki67) περιοχές. Β και Γ Υψηλή μεγέθυνση του μη-πολλαπλασιαζόμενων (Β) και πολλαπλασιασμό (C) περιοχές από το Α

Η

Α. Διπλή ανοσοχρώση CD31 (κόκκινο, Texas Red) και ρ110α (πράσινο, FITC) στο μοντέλο 2008 ξενομοσχεύματος. Έντονη χρώση ρ110α εντοπίζεται κυρίως σε περιοχές του όγκου που βρίσκονται μακριά από τα τριχοειδή αγγεία. B. Triple χρώση ρ110α (κόκκινο, Texas Red), Ki67 (μπλε, AMCA) και TUNEL (πράσινο, FITC) στο μοντέλο ξενομοσχεύματος 2.008.

Η

Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός του ανθρώπου και ποντικού

PIK3CA

υποστηρικτές

για να κατανοήσουμε καλύτερα τα σήματα ρύθμισης που συμβάλλουν στην ρύθμιση προς τα άνω του

PIK3CA

στον καρκίνο, 5 ‘ανάντη ρυθμιστικές αλληλουχίες του ανθρώπινου

PIK3CA

γονίδιο ήταν αναγνωρισθείς. 5′-ταχεία ενίσχυση cDNA άκρου (5 ‘RACE) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της θέσης έναρξης μεταγραφής (TSS) του ανθρώπινου

PIK3CA

(Σχήμα 4Α και Β). Ένα τμήμα 125 bp της 5′-αμετάφραστη περιοχή (UTR) και 2,3 Kbp του TRR της ανθρώπινης

PIK3CA

κλωνοποιήθηκαν από ανθρώπινο βακτηριακό τεχνητό χρωμόσωμα (BAC, αριθμός κλώνος: PR11-245C23). Βρήκαμε ότι η ανοδική ρυθμιστική περιοχή 5 ‘της ανθρώπινης

PIK3CA

βρίσκεται περίπου 50 Kbp ανάντη του κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης ιστοσελίδα (Εικόνα 4Α). Αυτή η περιοχή είναι ιδιαίτερα πλούσια σε GC (Σχήμα 4Β). Χαρτογράφηση RT-PCR επιβεβαίωσε περαιτέρω την TSS του

PIK3CA

, και ένα μικρό παραλλαγή ματίσματος ταυτοποιήθηκε (Σχήμα 4C έως Ε). Το μυϊκό

PIK3CA

5 ‘ανάντη ρυθμιστική αλληλουχία κλωνοποιήθηκε επίσης με την ίδια μέθοδο, και βρέθηκε να είναι 63,6% ταυτότητα προς την ανθρώπινη αλληλουχία (Σχήμα 5) και να περιλαμβάνουν ένα μικρό εσώνιο.

Α. Απεικόνιση της δομής του ανθρώπινου

PIK3CA

γονίδιο και «ανοδική ρυθμιστική περιοχή του 5. B. Μια περιοχή ιδιαίτερα πλούσια σε GC βρίσκεται στο

PIK3CA

5’TRR. Γ Εικονογράφηση των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για τη χαρτογράφηση RT-PCR του

PIK3CA

θέση μεταγραφικής έναρξης (SST). D. Αποτελέσματα της χαρτογράφησης RT-PCR. Δεν υπάρχει ζώνη μεταξύ της προς τα εμπρός εκκινητή F1 βρίσκεται ανάντη του SST και το αντίστροφο R εκκινητή που βρίσκεται στην εξόνιο 1 του

PIK3CA

. Οι σωστές ζώνες μεγέθους θα μπορούσε να ανιχνευθεί μεταξύ F2 ή F3 εκκινητή (και τα δύο βρίσκονται στα κατάντη του SST) και αντίστροφο εκκινητή RE Μια μικρή παραλλαγή ματίσματος βρίσκεται στην 5’UTR του ανθρώπινου

PIK3CA

γονίδιο, το οποίο μπορεί επίσης να ανιχνευθεί με χαρτογράφηση RT-PCR (εκκινητές F2 και R). ΣΤ συνοπτικά αποτελέσματα της μεταγραφικής δραστηριότητας του

PIK3CA

θραύσματα TRR.

Η

Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η μεταγραφική δραστηριότητα της περιοχής του υποκινητή, ολόκληρο το 2,3 Κορ 5 ‘TRR ​​ή αυξητικά θραύσματα κολοβωμένη υποκινητή υποκλωνοποιήθηκαν μαζί με ένα 316 ή μια περιοχή μετεγγραφής 150 bp εντός του pGL-βασικό φορέα αναφοράς λουσιφεράσης για να αποκαλύψει έκφρασης (Σχήμα 4F). Ισχυρή μεταγραφική δραστηριότητα εντοπίζεται στην περιοχή -2.340 έως -159 bp με τη δοκιμασία λουσιφεράσης, ενώ μεταγραφική δραστηριότητα μειώθηκε σημαντικά μετά -159 bp (Εικόνα 4F).

Στη συνέχεια, παράγοντα μεταγραφής θέσεις δέσμευσης είχαν προβλεφθεί στην ανθρώπινη

PIK3CA

5’TRR

in silico

από GenomatiX (https://www.genomatix.de/index.html). θέσεις πρόσδεσης για πολλούς παράγοντες μεταγραφής που σχετίζονται με άγχος βρέθηκαν, συμπεριλαμβανομένων των NF-κΒ? υποξία παράγοντα (HIF)? πρωτεΐνες θερμικού σοκ (HSP)? και πρωτεΐνη ενεργοποιητή 1 (ΑΡ1) (Σχήμα 6). Έτσι, τα σήματα του στρες που προκαλείται από αυτούς τους παράγοντες μπορεί να ρυθμίζουν

PIK3CA

έκφραση στα κύτταρα του όγκου μη πολλαπλασιαζόμενα σε περιοχές μειωμένης αγγείωσης και την αύξηση των λεμφοκυττάρων-διηθούντα.

Η

Η έκφραση και ο εντοπισμός των υποψήφιων μεταγραφή παράγοντες

in situ

η

η έκφραση και ο εντοπισμός των τριών υποθετικών ρυθμιστικών παραγόντων που προέκυψαν από την παραπάνω

in silico

ανάλυση, HIF1α? c-Jun, μέλος του συγκροτήματος ΑΡ1? και η ρ65 υπομονάδα του ΝΡ-κΒ, υποβλήθηκαν σε διαλογή σε 2.008 ξενομοσχεύματα. Επειδή η λειτουργία αυτών των παραγόντων απαιτεί την έκφραση και την πυρηνική μετατόπιση, θεωρήσαμε ισχυρή έκφραση και την πυρηνική εντόπιση έμμεση απόδειξη της λειτουργικής ενεργοποίησης. Ισχυρή έκφραση της πυρηνικής HIF1α παρατηρήθηκε σε αποσπασματικές συστάδες κυττάρων στο Ki67- περιοχές. HIF1α πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε επίσης σε περιοχές Ki67 +, αλλά εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 7 Α, D και G). c-Jun πρωτεΐνη αυστηρά εκφράζεται στα όρια μεταξύ Κί67 + και περιοχές Ki67-, όπου ανιχνεύθηκε μόνο πυρηνική χρώση. Λίγοι διάσπαρτα c-Jun-θετικά κύτταρα θα μπορούσε επίσης να ανιχνευθεί σε Ki67 + περιοχές, αλλά η πυρηνική c-Jun δεν παρατηρήθηκε σε περιοχές Ki67- (Σχήμα 7 Β, Ε και Η). Ισχυρή πυρηνική εντόπιση των πρωτεϊνών /p65 ΝΡ-κΒ παρατηρήθηκε στις περιφέρειες Ki67- και Ki67 περιοχές + δίπλα στις Ki67- περιοχές (Σχήμα 7 C, F και Ι). Είναι ενδιαφέρον ότι, το ισχυρότερο πυρηνικό ΝΡ-κΒ /p65 ανιχνεύθηκε δίπλα σε περιοχές νέκρωσης ιστού (Σχήμα 7 F). Αυτά τα δεδομένα μαζί με το

PIK3CA

ανάλυση υποκινητή δείχνουν ότι HIF1α και NF-κΒ εμπλέκονται στην ρύθμιση προς τα άνω του

PIK3CA

σε περιοχές Ki67-

in vivo

. Συνεπής με αυτή την υπόθεση, η οδός υποξία /HIF έχει αναφερθεί για τη ρύθμιση

PIK3CA

σε καρκινικά κύτταρα [48]. Από υποξική ρύθμιση του

PIK3CA

έχει επιβεβαιωθεί, είμαστε δίπλα επικεντρώθηκε στην ρύθμιση του

PIK3CA

από την οδό NF-κΒ.

Α έως Γ Ανοσοϊστοχημική χρώση των υποψηφίων μεταγραφικοί παράγοντες HIF1α, c-Jun και NF-κΒ το 2008 ξενομοσχεύματα. Η γραμμή δείχνει το όριο μεταξύ των Ki67 ρ110α-χαμηλή +, και Ki67- ρ110α-υψηλή περιοχές. Δ F. High μεγέθυνση από το Α έως C, αντίστοιχα, δείχνει έκφραση και πυρηνικό εντοπισμό του HIF1Α, c-Jun και NF-κΒ σε 2.008 ξενομοσχεύματα. G έως Ι Εικονογράφηση του εντοπισμού του υποψηφίου παραγόντων μεταγραφής HIF1α, c-Jun και NF-κΒ στο μοντέλο 2008 ξενομοσχεύματος. Μεγάλες τελείες αντιπροσωπεύουν κυτταροπλασματική εντόπιση, ενώ οι μικρές κουκίδες αντιπροσωπεύουν πυρηνικού εντοπισμού. Η γραμμή αντιπροσωπεύει το όριο μεταξύ των Ki67 ρ110α-χαμηλή +, και Ki67- ρ110α-υψηλή περιοχές.

Η

NF-κΒ προσδένεται στον υποκινητή και απορυθμίζει

PIK3CA

έκφραση

Σύμφωνα με ένα σημαντικό ρόλο του ΝΡ-κΒ στη ρύθμιση

PIK3CA

βρήκαμε ΝΡ-κΒ θέση δέσμευσης συναινετική αλληλουχιών σε ανθρώπινα και ποντικού

PIK3CA

5’TRRs (Σχήμα 8Α). Η θέση δέσμευσης NF-κΒ ανθρώπινο προαγωγό που βρίσκεται στο -807 έως -786 bp. Ελέγξαμε εάν NF-κΒ ρυθμίζει τη μεταγραφική δραστηριότητα της ανθρώπινης

PIK3CA

υποστηρικτής

in vitro

. ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ απαιτεί απελευθέρωση από την ανασταλτική υπομονάδα του ΙκΒα, το οποίο επιτρέπει ΝΡ-κΒ μετατόπιση προς τον πυρήνα [34], [35]. Παροδική αναγκαστική έκφραση του άγριου-τύπου ή μεταλλαγμένης ΙκΒα ΙκΒα (IκBαM), δύο εκ των οποίων δεσμεύονται ΝΡ-κΒ και να μπλοκάρει τη μετατόπιση του προς τον πυρήνα, εξασθένησε την μεταγραφική δραστικότητα του

PIK3CA

υποκινητή, όπως αποκαλύπτεται με δοκιμασία λουσιφεράσης. Αφαίρεση του θέση δέσμευσης ΝΡ-κΒ από την περιοχή υποκινητή καταργηθεί η ανασταλτική δράση του ΙκΒα ή IκBαM (Σχήμα 8 Β και C).

A. Απεικόνιση της προβλεπόμενης θέσης δέσμευσης NF-κΒ σε ανθρώπινα (κορυφή) ή ποντικού (κάτω)

PIK3CA

περιοχή προαγωγού. B. Απεικόνιση των κατασκευασμάτων που περιλαμβάνουν λουσιφεράση που συνδέονται με την ανθρώπινη

PIK3CA

υποκινητή με (Luc-2340/316) ή χωρίς την θέση δέσμευσης NF-κΒ (Luc-378/316). Γ Περίληψη της λουσιφεράσης δραστηριότητες του Luc-2340/316 και Luc-378/316 συν-επιμολύνθηκαν με ρΟΜν ΙκΒα ή ρΟΜν IκBαM. δοκιμασία D. Gelshift χρησιμοποιώντας πυρηνικό εκχύλισμα κυττάρων καρκίνου των ωοθηκών μετά από διέγερση ΤΝΡ-α. Διαδρομή 1, θέση δέσμευσης NF-κΒ του αγρίου-τύπου ανθρωπίνου

PIK3CA

υποκινητή (wt hu

PIK3CA

ανιχνευτή ΝΡ-κΒ) μόνο? λωρίδες 2 και 3, κβ hu

PIK3CA

NF-κΒ καθετήρα + πυρηνικό εκχύλισμα? λωρίδα 4, ελέγχουν NF-κΒ καθετήρα + πυρηνικού εκχυλίσματος, διαδρομές 5 και 6, μεταλλαγμένα hu

PIK3CA

NF-κΒ καθετήρα + πυρηνικό εκχύλισμα? λωρίδα 7, μεταλλαγμένα έλεγχο NF-κΒ καθετήρα + πυρηνικό εκχύλισμα? λωρίδες 8 και 9, αγωνίζομαι hu

PIK3CA

NF-κΒ καθετήρα + πυρηνικού εκχυλίσματος. δοκιμασία μετατόπισης πηκτώματος με τη χρήση Ε ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης /ρ50 ΝΡ-κΒ. Διαδρομή 1, κβ hu

PIK3CA

NF-κΒ ανιχνευτή μόνη της? λωρίδες 2 και 3, κβ hu

PIK3CA

καθετήρα NF-κΒ + p50? λωρίδα 4, μεταλλαγμένα hu

PIK3CA

NF-κΒ ανιχνευτή μόνη της? διαδρομές 5 και 6, μεταλλαγμένα hu

PIK3CA

NF-κΒ ανιχνευτή + p50? λωρίδα 7, ελέγχουν NF-κΒ ανιχνευτή μόνη της? διαδρομές 8 και 9, τον έλεγχο του ΝΡ-κΒ ανιχνευτή + ρ50.

Η

Η προβλεπόμενη αλληλουχία δέσμευσης του ΝΡ-κΒ στον ανθρώπινο

PIK3CA

υποκινητή δοκιμάστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετατόπισης γέλης. Πυρηνικές πρωτεΐνες από το 2008 με καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική γραμμή κατεργάζεται με ΤΝΡ-α ήταν σε θέση να μετατοπίσει (δεσμεύουν) αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων που περιέχουν την προβλεπόμενη θέση δέσμευσης NF-κΒ του ανθρώπινου

PIK3CA

υποκινητή, αλλά δεν ήταν σε θέση να στραφούν είτε μετάλλαξης είτε ψευδο ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες (Σχήμα 8 D). Επιπλέον, ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη /ρ50 ΝΡ-κΒ ήταν σε θέση να μετατοπίσουν τις αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων που περιέχουν θέσεις πρόσδεσης την προβλεπόμενη ΝΡ-κΒ, επιβεβαιώνοντας την παρουσία τους στον ανθρώπινο

PIK3CA

προαγωγό (Σχήμα 8 Ε). Τέλος, η παρουσία της θέσης δέσμευσης NF-κΒ στο

PIK3CA

υποστηρικτής επιβεβαιώθηκε με τη δοκιμασία χρωμοσωμικών ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας).

Η φλεγμονή μπορεί να ρυθμίσει

PIK3CA

έκφραση μέσω ΝΡ κΒ μονοπάτι

Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου, μεταβολικές /ισχαιμικό στρες προκαλεί το θάνατο καρκινικών κυττάρων, την πρόσληψη φλεγμονωδών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων μακροφάγων. Αυτές οι κυτοκίνες προφλεγμονώδεις απελευθέρωσης που ενεργοποιούν το μονοπάτι ΝΡ-κΒ [25], [33], [34], [35]. Εμείς χαρτογραφηθεί η κατανομή των νέκρωση, μακροφάγα που διηθούν όγκο και την ενεργοποίηση του NF-κΒ στο μοντέλο 2008 ξενομοσχεύματος. Μορφολογικές νέκρωση ανιχνεύθηκε κυρίως σε Ki67- ρ110α + περιοχές, συχνά βρίσκονται στο κέντρο τους (Σχήμα 9 Α). Βιαστικό διείσδυση του CD11b + μακροφάγα, τα οποία παράγουν κυτοκίνες προ-φλεγμονής όπως TNF-α, βρέθηκε σε συνδυασμό με περιοχές νέκρωσης (Εικόνα 9 Β έως D).

A. H & amp? Ε χρώση του 2008 όγκου αποκαλύπτει μια προεξέχουσα περιοχή της νέκρωσης (Ν). Β και C. Η ανοσοϊστοχημική χρώση του ποντικού CD11b αποκαλύπτει μακροφάγων διεισδύουν σε ένα ξενομόσχευμα 2008. κύτταρα CD11b + διεισδύουν όγκους σε Ki67-αρνητικών περιοχών πλησίον της νέκρωσης. Γ υψηλής μεγέθυνσης από το Β Δ Double ανοσοχρώση των CD11b (πράσινο, FITC) και Ki67 (κόκκινο, Texas Red) αποκαλύπτει CD11b + μακροφάγα κυρίως σε μη πολλαπλασιαζόμενα Ki67-αρνητικών περιοχών. Ε ChIP ανάλυση του ΝΡ-κΒ δέσμευση στον ενδογενή

PIK3CA

υποκινητή.