Αφηρημένο

είναι

Ιστορικό

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την αναγέννηση του όγκου μετά τη χημειοθεραπεία, καίτοι η άμεση επιβεβαίωση αυτού παραμένει επικείμενη. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε κατά πόσον φαρμακευτική αγωγή θα μπορούσε να εμπλουτίσει και να διατηρήσει ΚΕΠ και αν οι υψηλές ογκογόνο και μεταστατικό ικανότητες των ΚΕΠ βασίστηκαν σε αξιοσημείωτη ικανότητά τους να παράγουν ανάπτυξη και αγγειογόνων παραγόντων και εκφράζουν συγγενείς υποδοχείς τους να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και το σχηματισμό στρώματος.

Μεθοδολογία /Εκτίμηση

η επεξεργασία των κυττάρων όγκου του πνεύμονα με δοξορουβικίνη, σισπλατίνη, ετοποσίδη ή ως αποτέλεσμα την επιλογή των κυττάρων που επιβιώνουν φαρμάκου (DSCs). Αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν CD133, CD117, SSEA-3, TRA1-81, Oct-4, και της πυρηνικής β-κατενίνης και έχασαν την έκφραση του δεικτών διαφοροποίησης κυτοκερατίνες 8/18 (CK 8/18). DSCs ήταν σε θέση να αναπτυχθούν ως σφαίρες του όγκου, τη διατήρηση της ικανότητας αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση. Διαφοροποιημένες πρόγονοι χάσει την έκφραση του CD133, απέκτησε CK 8/18 και απέκτησε την ευαισθησία των ναρκωτικών. Με την παρουσία των φαρμάκων, η διαφοροποίηση των DSCs καταργήθηκε επιτρέποντας πολλαπλασιασμό των κυττάρων με CSC-όπως χαρακτηριστικά. Πνεύμονα DSCs κατέδειξε υψηλή ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό μετά από εμβολιασμό σε ποντίκια SCID, η οποία υποστήριξε την ταξινόμησή τους ως ΚΕΠ. Luminex ανάλυση των ανθρώπινων και ποντικού κυτοκινών σε επεξεργασία με υπερήχους κυτταρολύματα parental- και CSC προερχόμενα όγκων αποκάλυψε ότι CSC προερχόμενο όγκους περιείχε δύο έως τρεις φορές υψηλότερα επίπεδα της ανθρώπινης αγγειογόνες και αυξητικούς παράγοντες (VEGF, bFGF, IL-6, IL- 8, HGF, PDGF-ΒΒ, G-CSF, και SCGF-β). ΚΕΠ έδειξε επίσης αυξημένα επίπεδα έκφρασης της ανθρώπινης VEGFR2, FGFR2, CXCR1, 2 και 4 υποδοχείς. Επιπλέον, τα ανθρώπινα ΚΕΠ αναπτύσσονται σε SCID ποντίκια διεγέρθηκαν στρώμα ποντικού για να παράγουν αυξημένα επίπεδα αγγειογόνες και αυξητικών παραγόντων.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η χημειοθεραπεία μπορεί να οδηγήσει σε πολλαπλασιασμό των ΚΕΠ και την πρόληψη της διαφοροποίησή τους. Οι υψηλές ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό των ΚΕΠ που συνδέονται με την παραγωγή του δικτύου αποτελεσματική κυτοκίνη που μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα στόχο για την αύξηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας του καρκίνου

Παράθεση:. Λεβήνας V, Marrangoni AM, DeMarco R, Gorelik Ε, Lokshin ΑΕ ( 2008) Drug-επιλεγμένο ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα Stem Cells: κυτοκίνης δικτύου, Ογκογονικά και μεταστατικές ιδιότητες. PLoS ONE 3 (8): e3077. doi: 10.1371 /journal.pone.0003077

Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: May 25, 2008? Αποδεκτές: 8 Αυγούστου, 2008? Δημοσιεύθηκε: 27 Αυγούστου 2008

Copyright: © 2008 Λεβήνας et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτές οι μελέτες υποστηρίχθηκαν από επιχορηγήσεις από RO1 CA098642, R01 CA108990, Avon (ΝΙΗ /NCI), Susan Ίδρυμα Komen (ΑΕΛ), και DOD BC051720 επιχορήγηση, επιχορηγήσεις από Harry Lloyd Φιλανθρωπικό Ταμείο, Hillman Ίδρυμα και την Πενσυλβάνια Υπουργείο Υγείας (EG).

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα τελευταία χρόνια, σημαντικές πειραματικές αποδείξεις έχει δημιουργηθεί για την υποστήριξη του ρόλου του μικρού πληθυσμού της αυτο-ανανέωση των κυττάρων που θα μπορούσαν να στηρίξουν την ανάπτυξη κακοηθών [1], [2]. Αυτός ο πληθυσμός ονομάσθηκε καρκίνο κύτταρα έναρξης ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) για την υψηλή τους ικανότητα για αυτο-ανανέωση, σε πολλαπλές διαφοροποίηση, και ανώτερα επίπεδα κακοήθειας. Οι ΚΕΠ έχουν ταυτοποιηθεί και απομονωθεί σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένων του μαστού, του εγκεφάλου, του προστάτη, του παγκρέατος, των πνευμόνων, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του [3] – [11]

ΚΕΠ ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής με βάση διαλογή κυττάρων και NOD. /ποντίκια SCID ξενομεταμόσχευση. ΚΕΠ εκφράζουν δείκτες επιφανείας κυττάρου ιστού-ειδική: π.χ. ΚΕΠ μαστού εκφράζουν CD44 + /CD24

χαμηλή [3], και του εγκεφάλου, του προστάτη, των πνευμόνων και του παγκρέατος ΚΕΠ εκφράζουν CD133 + [2], [4], [7], [8 ], [10].

κυτταρομετρία ροής με βάση το κύτταρο-διαλογής η οποία επιτρέπει την απομόνωση ενός «πλευρά πληθυσμού» (SP) με εμπλουτισμένο δραστικότητα καρκίνο βλαστικών κυττάρων έχει περιγραφεί από Goodell et al [12]. Τα κύτταρα SP χαρακτηρίζονται από διακριτή χρώση χρωστική Hoechst 33342 χαμηλή, αποδίδεται στην έκφραση του ABCG2, ένα ΑΤΡ-δέσμευσης κασέτα (ABC) μεταφορέας [13]. κύτταρα SP δείχνουν, επίσης, περισσότερο καρκινογόνα χωρητικότητα από κύτταρα μη-SP [13] – [15]. Κυτταρομετρία ροής με βάση τις μεθόδους διαλογής ΚΕΠ, με τη χρήση ειδικών δεικτών ιστού CSC, καθώς και το σχηματισμό σφαιρικών συμπλεγμάτων της αυτο-αναπαραγόμενα κύτταρα [16] – [18], επιτρέπουν την απομόνωση ενός κυτταρικού πληθυσμού εμπλουτισμένου σε πρώιμο προγονικά /βλαστοκύτταρα .

Λόγω της υψηλής αντοχής τους για τα ναρκωτικά και την γένεσιν όγκων, τα ΚΕΠ πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την αναγέννηση του όγκου μετά από χημειοθεραπεία [19], [20], μολονότι η άμεση επιβεβαίωση αυτού εξακολουθεί να είναι επικείμενη. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι ΚΕΠ μπορεί να εμπλουτιστεί και στη συνέχεια απομονώνεται από κύτταρο όγκου πληθυσμούς μετά την αγωγή του φαρμάκου.

Στην παρούσα μελέτη φάρμακο επιζώντων κυττάρων (DSCs) απομονώθηκαν από ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη, δοξορουβικίνη, ετοποσίδη ή . Απομονωμένες DSCs έδειξε υψηλή κλωνογονικού ικανότητες, τον εμπλουτισμό με κύτταρα SP, η έκφραση της κυτταρικής επιφάνειας CSC και οι δείκτες των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων, μια ικανότητα για αυτο-ανανέωση, την παραγωγή διαφοροποιημένων απογόνων και υψηλή ογκογόνο δυναμικό παρακάτω SCID μεταμόσχευση ποντίκια. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι αυτές οι DSCs ήταν ΚΕΠ.

Έχει επίσης προταθεί ότι τα ΚΕΠ έχουν υψηλό μεταστατικό δυναμικό [21]. Πρόσφατα, η σχέση μεταξύ του παγκρέατος ΚΕΠ και μετάσταση όγκου καταδείχθηκε [8]. Έχουμε αποδείξει ότι το φάρμακο απομονωθεί ΚΕΠ του πνεύμονα έχουν υψηλό μεταστατικό δυναμικό.

Εξακολουθεί να είναι ασαφές τι ιδιότητες των ΚΕΠ επιφέρουν αυξημένη ογκογονικότητα και μεταστατικό δυναμικό. Υποθέσαμε ότι τα ογκογόνα και μεταστατική ικανότητα των ΚΕΠ βασίστηκαν σε αξιοσημείωτη ικανότητά τους να παράγουν ανάπτυξη και αγγειογόνων παραγόντων, οι οποίοι διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, καθώς και την προαγωγή του σχηματισμού του αγγειακού συστήματος του όγκου, ώστε να παρέχει οξυγόνο και θρεπτικές ουσίες για την τοπική ανάπτυξη του όγκου ή μακρινό ανάπτυξης μετά τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων σε διαφορετικές ανατομικές θέσεις. Έτσι, η εξαιρετικά αποδοτική παραγωγή της ανάπτυξης και αγγειογονικών παραγόντων είναι μια θεμελιώδης ιδιότητα του ογκογενή κύτταρα. Ο VEGF είναι ένας ισχυρός αγγειογόνος παράγοντας [22], ενώ αυξητικούς παράγοντες όπως bFGF, EGF, και HGF μπορεί να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό του, όχι μόνο καρκινικά κύτταρα αλλά επίσης και των ενδοθηλιακών κυττάρων και έτσι πρόδηλη προ-αγγειογόνος και αντιαποπτωτικά αποτελέσματα [23]. Ορισμένα στοιχεία δείχνουν ότι οι χημειοκίνες, όπως IL-8 (CXCL8), MCP-1 (CCL2) και RANTES (CCL5), όχι μόνο διεγείρει τη μετανάστευση, αλλά επίσης και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και στρωματικών, συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών κυττάρων [24]. Πρόσφατα δείχθηκε ότι η IL-8 παρουσιάζει ισχυρή αγγειογενετική δράση μέσω μετενεργοποίησης του VEGF υποδοχέα 2 (VEGFR2) [25]. Έτσι, οι διαφορετικοί τύποι παραγόντων όγκου παραγωγής (κυτοκίνες, χημειοκίνες, αγγειογόνες και αυξητικούς παράγοντες) έχουν επικαλυπτόμενες λειτουργίες στην προώθηση της ανάπτυξης του όγκου. Πολυάριθμες πειραματικά και κλινικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η εξουδετέρωση της ανάπτυξης ή αγγειογενετικών παραγόντων, ή το κλείδωμα σηματοδότηση του υποδοχέα τους, θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου, επιβεβαιώνοντας την σημασία αυτών των παραγόντων σε πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [26]. Έτσι, η παραγωγή της ανάπτυξης και αγγειογόνων παραγόντων από ΚΕΠ φαίνεται κρίσιμη για ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό τους. Ωστόσο, αυτή η κυτοκίνη CSC και /δίκτυο αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων δεν είχε διερευνηθεί προηγουμένως.

Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη ανάλυση των διαφόρων κυτοκινών, χημειοκινών και αυξητικούς παράγοντες που παράγονται από πρόδρομα κύτταρα των όγκων Η460 και απομονωμένες ΚΕΠ χρησιμοποιώντας πολυπλεξίας τεχνολογία xMAP (Luminex Corp., Austin, ΤΧ), το οποίο επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση πολλών διαλυτών παραγόντων. Αυτή η ανάλυση διεξήχθη

in vitro

σε καλλιεργημένα κύτταρα και

in vivo

χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο όγκο ξενομόσχευμα μοντέλο σε ποντίκια SCID. Οι ανθρώπινοι όγκοι αναπτύσσονται σε SCID ποντίκια αποτελούνται από ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και ποντικού στρώμα. Σε υπερήχους εκχυλίσματα των ξενομόσχευμα ανθρώπινων όγκων που περιέχονται κυτοκίνες που παράγονται από τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, καθώς και από στρωματικά κύτταρα ποντικού. Συγκεντρώσεις του κάθε τύπου κυτοκινών μπορούν να αναλυθούν χρησιμοποιώντας κιτ πολυπλεξίας αναπτυχθεί ειδικά για την ανίχνευση του ανθρώπου ή ποντικού κυτοκίνες. Αυτό θα μπορούσε να παρέχει πληροφορίες σχετικά με το δίκτυο κυτταροκινών που παράγονται από ΚΕΠ και την ικανότητά τους να διεγείρουν τον σχηματισμό στρώματος.

Οι μελέτες μας δείχνουν ότι τα κύτταρα των ναρκωτικών επιζών του πνεύμονα όγκου έχουν τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ, και να παράγει αυξημένα επίπεδα πολλαπλές κυτοκίνες, την ανάπτυξη και αγγειογονικών παραγόντων και των υποδοχέων τους. Αυτά τα ευρήματα φέρει νέα διορατικότητα στην κατανόηση των μηχανισμών που ευθύνονται για την υψηλή ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό των ΚΕΠ του πνεύμονα και την ικανότητά τους να επιβιώσουν χημειοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινα καλλιεργημένα καρκινικές κυτταρικές σειρές, OVCAR-3 (των ωοθηκών), MCF-7 (στήθος) και Η460 (πνεύμονα), ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσα καλλιέργειας, όπως συνιστάται από την ATCC, συμπληρωμένο με 20% FBS (Millipore Inc., Billerica, ΜΑ).

Αντιδραστήρια

Η σισπλατίνη, δοξορουβικίνη, ετοποσίδη, και Hoechst 33342 ήταν από τη Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα αντισώματα κατά της ανθρώπινης CD24, CD34, CD44, CD24, CD117, CD90, VLA-4, και VLA-5 ήταν από Beckman Coulter (Fullerton, CA). Αντισώματα έναντι FGFR2, VEGFR1, VEGFR2, και CXCR1, 2, 4 ήταν από R &?. D Systems INC (Minneapolis, ΜΝ). Το αντίσωμα έναντι VLA-6 ελήφθη από Abd Serotec (Raleigh, ΝΥ). Αντισώματα έναντι CD 133 και κερατίνες 8/18 ήταν από Abcam Inc. (Abcam, Cambridge, ΜΑ). Alexa Fluor®-488 συζευγμένο ποντικού αντιανθρώπινο TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-1-4, και το αντίσωμα κατά της ανθρώπινης β-κατενίνης αγοράσθηκαν από BD Biosciences Inc. (San Diego, CA). Το αντίσωμα έναντι φωσφόρου β-κατενίνης ήταν από τη Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, ΜΑ). Μια εμβρυϊκών βλαστικών (ES) κιτ δείγμα δείκτη, σχεδιασμένο για την ανίχνευση του SSEA-1, 3, 4, TRA-1-60, TRA-1-81, και Oct-4, ελήφθη από την Chemicon International (Tamecula, Ca). Alexa Fluor®-488 φαλλοϊδίνη και δευτερογενή Abs συζευγμένο με Alexa 488, 546, και 680 ήταν από την Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Δοκιμασίες κλωνογονικότητας

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 10-50 κύτταρα /cm

2 σε 100 mm

2 πιάτα Petri ή σε μια πυκνότητα 0,5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 14 ημέρες. Για την καταμέτρηση των αποικιών, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Coomassie λαμπρό μπλε.

κυτταρομετρία ροής

Για την πλευρά του πληθυσμού (SP) ανάλυση των κυττάρων που χρησιμοποιούνται πρότυπο πρωτόκολλο [12]. Για την αναστολή ABCG2 μεταφορέα, 10 μΜ fumitremorgin C (Calbiochem /EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA) προστέθηκε 10 λεπτά πριν από την προσθήκη της Hoechst. Σε μερικά πειράματα, η βεραπαμίλη (50 μmol /L) προστέθηκε με βαφή για να επιβεβαιωθεί η SP (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο MoFlo (Cytomation, Fort Collins, CO). Διέγερση της Hoechst χρωστική διεξήχθη χρησιμοποιώντας λέιζερ υπεριώδους στα 351 nm να 364? ο φθορισμός μετρήθηκε με ένα φίλτρο 515 nm-πλευρά πληθυσμού (Hoechst μπλε) και με 608 EFLP οπτικό φίλτρο (Hoechst κόκκινο). κέρδη Μέσο προσαρμόστηκαν για να ρυθμίσετε την κύρια ομάδα κυττάρων, η οποία περιλαμβάνει τα περισσότερα από τα κύτταρα που περιέχουν ένα αντίγραφο του DNA στο κέντρο των μονάδων. κύτταρα CD133 + ταξινομήθηκαν από τη γονική καρκίνο του πνεύμονα Η460 πληθυσμού που χρησιμοποιεί MoFlo κυτταρομετρητή και πρότυπο πρωτόκολλο για χρώση ανοσοφθορισμού.

διαδικασία χρώσης κυττάρων για Cellomics ArrayScan αυτοματοποιημένη απεικόνισης

Τα κύτταρα φθορισμό βάφονται όπως περιγράφεται [27]. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων, πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα FACS, επωάζονται με αντισώματα έναντι CD24, CD34, VLA-4, VLA-5, VLA-6, CD44, CD87, CD90, CD117, FGFR2, VEGFR1 και VEGFR2 συζευγμένο με FITC, ΡΕ, ή PC5, για 1 ώρα, μονιμοποιήθηκαν σε 2% PFA για 20 λεπτά, πλύθηκαν σε PBS, και χρωματίστηκαν με Hoechst 33342. για να δοκιμαστεί CD133, CXCR1, CXCR2 και έκφραση CXCR4, τα κύτταρα επωάστηκαν με τα αντίστοιχα πρωτογενή αντισώματα και τότε με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με Alexa 488, 546, ή 680 φθοροχρώματα (Molecular Probes /Invitrogen) για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Hoechst 33342.

Για την ανίχνευση ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν, permeabilazed, και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα δείκτες, β-κατενίνης, και κυτοκερατίνες 8/18 για 1 ώρα και με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με Alexa 488, 546, ή 680 φθοροχρώματα (Molecular Probes /Invitrogen) για 1 ώρα. Για ακτίνη κυτταροσκελετό χρώση, τα κύτταρα επωάστηκαν με Alexa Fluor 488 φαλλοειδίνη για 1 ώρα. πυρήνες κυττάρου στη συνέχεια βάφτηκαν με Hoechst 33342 στα 2 μg /ml για 20 λεπτά για την αναγνώριση μεμονωμένων κυττάρων και να βελτιστοποιηθεί εστίαση

Για να λεκιάζουν σφαίρες όγκου, όλοι οι χειρισμοί έγιναν υπό τη μικροσκοπική έλεγχο:. σφαίρες όγκου απαλά τοποθετήθηκαν σε ατομικά φρεάτια εξαιρετικά χαμηλών προσκολλημένων 96 φρεατίων, και η επώαση με πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα ήταν η ίδια όπως περιγράφεται παραπάνω για τις προσκολλημένες καλλιέργειες.

Όλες οι διαδικασίες επώασης και στερέωση διεξήχθησαν σε θερμοκρασία δωματίου.

Cellomics ArrayScan αυτοματοποιημένη απεικόνισης

Η Cellomics ArrayScan HCS Reader (Cellomics /ThermoFisher, Pittsburgh, PA) χρησιμοποιήθηκε για τη συλλογή πληροφοριών σχετικά με τη διανομή των σημασμένο με φθορισμό συστατικών στα χρωματισμένα κύτταρα. Το σύστημα ArrayScan HCS σαρώνει πολλαπλά πεδία σε μεμονωμένα φρεάτια, αποκτώντας και αναλύοντας κάθε μία από τις εικόνες των κυττάρων σύμφωνα με καθορισμένα αλγορίθμων. Ο σαρωτής είναι εξοπλισμένο με φίλτρα εκπομπής και διέγερσης (XF93, Omega Optical, Brattleboro, VT, USA) για την επιλεκτική απεικόνιση σημάτων φθορισμού. Τα δεδομένα συλλήφθηκαν, εξάγεται, και αναλύονται με ArrayScan ΙΙ Δεδομένων και Data Viewer έκδοση 3.0 (Cellomics), Quattro Pro έκδοση 10.0.0 (Corel, Οττάβα, Οντάριο, Καναδάς), και MS Excel 2002 (Microsoft, Redmond, WA).

Πολιτισμού πνεύμονα σφαίρες καρκίνου

ανάπτυξη Αναστολή αξιολογήθηκε σε με βάση την κυτταρίνη (MC-based) μέσο μεθύλιο όπως περιγράφεται [16], [17]. Εν συντομία, Η460 κύτταρα και φάρμακο που επιλέγεται κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 0,8% μέσο χωρίς MC-based ορού (Stem Technologies Cell, Vancouver, Canada) συμπληρωμένο με 20 ng /ml EGF (BD Biosciences), bFGF, και 4 μg /mL ινσουλίνη (Sigma ) και απλώνονται σε 500-10000 κύτταρα /mL σε εξαιρετικά χαμηλής προσκολλημένα 24-96 φρεατίων (Corning, Corning, ΝΥ). EGF, bFGF (20 ng /mL), και η ινσουλίνη (4 μg /mL) προστέθηκαν κάθε δεύτερη ημέρα για δύο εβδομάδες. Το μέσο αντικαταστάθηκε ή συμπληρώνεται με φρέσκο ​​παράγοντες ανάπτυξης δύο φορές την εβδομάδα. Προκειμένου να αξιολογηθεί η αυτό-ανανέωση δυναμικού των κυττάρων, σφαίρες συλλέχθηκαν με ήπια φυγοκέντρηση, διαχωρίστηκαν σε εναιωρήματα μονών κυττάρων, διηθείται και καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω.

Διαφοροποίηση

Cells διαχωριστεί από σφαίρες (τρίτη γενιά) επιστρώθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα /mL σε πλάκες 96 φρεατίων προεπικαλυμμένες με κολλαγόνο IV (BD Biosciences) σε μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% FBS χωρίς αυξητικούς παράγοντες και μεταφέρθηκαν σε νέες πλάκες όταν έφθασε καλλιέργειες συμβολή. Για να δοκιμαστεί η αυτο-ανανέωση δυναμικό των διαφοροποιημένων κυττάρων, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε ημιστερεό μέσο χωρίς ορό συμπληρωμένου με EGF, FGF, και της ινσουλίνης και την ικανότητά τους να σχηματίζουν σφαίρες όγκου αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Για την εκτέλεση φαινοτυπική χαρακτηρισμός των κυττάρων από σφαίρες και τα κύτταρα μετά την διαφοροποίηση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) και χρωματίζονται με διάφορα αντισώματα, όπως περιγράφεται παραπάνω.

αντίσταση Chemotherapy μελέτες

Η460 γονικά κύτταρα, κύτταρα που ελήφθησαν από σφαίρες καρκίνο του πνεύμονα, και τρεις εβδομάδες μετά τα κύτταρα ΚΕΠ διαφοροποίηση απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων προεπικαλυμμένες με κολλαγόνο IV (BD Biosciences) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Μετά από 24 ώρες η δοξορουβικίνη και σισπλατίνη προστέθηκαν στις τελικές συγκεντρώσεις (0.016-025 μg /ml και 0,165 έως 3,30 μg /ml, αντίστοιχα). Μετά από 72 ώρες αγωγής, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342, και ο αριθμός των κυττάρων ανά φρεάτιο μετρήθηκαν με Cellomics Array σάρωσης VTI (Cellomics /ThermoFisher, Pittsburgh, ΡΑ), όπως περιγράφεται [27].

Μετανάστευση και

δοκιμασία εισβολής

Η δραστηριότητα μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων σε απόκριση σε ανθρώπινη ανασυνδυασμένη IL-8 (100 ng /ml) μετρήθηκε σε BD Biocoat Matrigel εισβολής Chambers (BD Biosciences, San Jose, CA) σύμφωνα με πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Ανάλυση ογκογόνο και μεταστατικό ιδιότητες των DSCs και καρκινικών κυττάρων Η460

τα πειράματα διεξάγονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που παρέχονται από το Θεσμικό Animal Care and Use Επιτροπής Πανεπιστήμιο του Πίτσμπουργκ (IACUC) και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου. SCID ποντίκια, 7-8 εβδομάδων (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ΜΕ), διατηρήθηκαν στις εγκαταστάσεις ζώου του Πανεπιστημίου του Πίτσμπουργκ Ινστιτούτου για τον Καρκίνο (UPCI).

Για να συγκρίνετε ογκογόνων ιδιοτήτων, Η460 κύτταρα και DSCs συλλέχθηκαν και εγχύθηκαν (σε 200 μΙ PBS) υποδορίως (sc) σε ποντίκια SCID σε συγκεντρώσεις 5 × 10

3-5 × 10

5 κύτταρα ανά ποντικό (5 ποντικοί ανά ομάδα) χωρίς Matrigel. Οι όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Οι ποντικοί θανατώθηκαν όταν οι όγκοι τους μετρήθηκε περίπου 2 εκατοστά σε διάμετρο.

Για να αναλυθεί η ικανότητα των κυττάρων Η460 και ΚΕΠ για να σχηματίσουν μεταστάσεις, 5 × 10

4 κύτταρα εμβολιάσθηκαν ενδοφλεβίως (iv) στην ουραία φλέβα του SCID ποντίκια. Τα ποντίκια SCID ήταν Τ, Β και ΝΚΤ κυττάρων με ανεπάρκεια αλλά είχε ενεργά κύτταρα ΝΚ που θα μπορούσε να εξαλείψει τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα που κυκλοφορούν στο αίμα. Για να καταστρέφουν τα κύτταρα ΝΚ, τα ποντίκια SCID εμβολιάστηκαν ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) με 0.2 ml αντι-ασιαλο GM1 IgG (αραιωμένο 1:20) 24 ώρες πριν από την ε.φ. ενοφθαλμισμό των κυττάρων του όγκου [28]. Μετά από 60 ημέρες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν? πνεύμονες, το συκώτι και τα νεφρά απομακρύνθηκαν και στερεώθηκαν σε διάλυμα του Βουίη? και μεταστατικά οζίδια μετρήθηκαν κάτω από ανατομικό μικροσκόπιο.

Προετοιμασία εκχυλίσματα όγκων

Οι όγκοι αναπτύσσονται υποδορίως σε SCID ποντίκια αφαιρέθηκαν και καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο. Κατεψυγμένα ιστούς όγκων κόπηκαν, σε υπερήχους για 20 s, και φυγοκεντρήθηκαν στα 15.000 g για 10 λεπτά ώστε να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. εκχυλίσματα όγκων φυλάχθηκαν στους -80 ° C.

Multiplex ανάλυση των κυτοκινών

Ανάλυση της ανθρώπινης κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και σε επεξεργασία με υπερήχους προϊόντα λύσης όγκου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της πολυπλεξίας τεχνολογία xMAP (Luminex Corp., Austin, TX). Multiplex κιτ για την ανίχνευση των 49 ανθρώπινες κυτοκίνες: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12ρ40, IL -13, IL-15, IL-17, GM-CSF, ΙΡΝ-α, TNFa, MCP-1, MCP-2, MCP-3, ΙΡ-10, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β, RANTES, VEGF, bFGF , G-CSF, ηωταξίνη, HGF, MIG, GROa, sIL-2R, sVCAM-1, CTACK, LIF, M-CSF, NGF, PDGF-BB SCF, SCGF-β, SDF-1α, ο TNF β, IFN-TRAIL γ, EGF, TNFRI, TNFRII, DR5, IL-1Rα, και sIL-6R αγοράσθηκαν από την Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Multiplex κιτ για την ανίχνευση των sFas, sFasL, TGFa, φρακταλκίνη, sCD40L, TRAP, CS154, MIF, sVCAM-1, sICAM-1, ΜΡΟ, αδιπονεκτίνη, ΜΜΡ-9, και tPAI-1 αγοράστηκαν από την Linco /Millipore (St. Louise, ΜΟ). Το κιτ για την ανίχνευση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-3 αγοράστηκε από την R &? D Research (Minneapolis, ΜΝ). Η πολλαπλή κιτ για καρκίνο ανίχνευση αντιγόνων CEA, CA-125, CA 19-9, CA 15-3, CA72-4, AFP καθώς mesothelin, IGFBP-1, καλλικρεΐνη 10, EGFR, ErbB2, και Cyfra 21-1 ήταν παραγγελία στην Εγκατάσταση UPCI Luminex πυρήνα (www.upci.upmc.edu/facilities/luminex). κυτοκίνες Mouse αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας 19-plex κιτ για IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, ΙΡΝ-γ, MIG, GM-CSF, ΜΙΡ-1α, IL-12ρ40 /ρ70, KC, TNFa, MCP-1, VEGF, bFGF και (Invitrogen /Biosource). Οι αναλύσεις των υπερκειμένων του όγκου και σε υπερήχους εκχυλίσματα όγκων εκτελέσθηκαν σε 96 φρεατίων μικρο πλάκα σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Μέρη εκχυλίσματα όγκων χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση πρωτεΐνης. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD pg /mg πρωτεΐνης.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Συγκρίσεις μεταξύ των τιμών πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test δύο ουρών Student. Για τη σύγκριση των πολλαπλών ομάδων, εφαρμόστηκε ένα μονόχρωμο ή αμφίδρομη δοκιμή ANOVA. Η στατιστική ανάλυση των μεταστατικών οζιδίων διεξήχθη χρησιμοποιώντας τεστ Mann-Whithey. Για όλες τις στατιστικές αναλύσεις το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε σε μια πιθανότητα της & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Απομόνωση των ΚΕΠ με βάση την αντοχή τους σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα

ωοθηκών OVCAR -3, του μαστού MCF-7, και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) Η460 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη (1-5 μΜ), ετοποσίδη (1-5 μΜ), ή δοξορουβικίνη (0,067 – 0,125 μg /ml) για 3 ημέρες. Η συντριπτική πλειονότητα των κυττάρων πέθανε. Πάνω από τις επόμενες 7 ημέρες κάποιοι επιβιώνουν κύτταρα έμοιαζαν γηρασμένα κύτταρα με διευρυμένη και ισοπέδωσε μορφολογία [30]. Αυτά τα «γηρασμένα» κύτταρα μεγάλωσαν σε μέγεθος και πέθανε κατά τη διάρκεια των εβδομάδων 2-4. Κατά τη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας μετά τη θεραπεία φαρμάκου, μικρά, στρογγυλά, ή ατρακτοειδή κύτταρα με χαμηλότερο προσκόλληση ανιχνεύθηκαν και αναπτυσσόμενες αποικίες τους σταδιακά αντικατέστησε τις «γηρασμένα» κύτταρα σε πληθυσμούς καρκινικών κυττάρων σε αγωγή με φάρμακο (Σχήμα 1Α). Υποθέσαμε ότι το φάρμακο που επιβιώνουν μικρά κύτταρα ΚΕΠ. Για να το επαληθεύσετε, οι επεκτάθηκε κύτταρα επιβιώνουν φάρμακο (DSCs) αναλύθηκαν για κλωνογόνο ικανότητα τους, SP φαινότυπο, δείκτες CSC, ικανότητα αυτο-ανανέωσης, ικανότητα να διαφοροποιούνται και ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό.

Α , Μορφολογία της γονικής MCF7, OVCAR3 και Η460 κύτταρα και επιβίωσαν φάρμακο κύτταρα (DSCs)

MCF-7 και κύτταρα Η460 υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη (0.125 μg /ml).? OVCAR-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με σισπλατίνη (3,3 μg /ml). Μετά από 48 ώρες τα φάρμακα απομακρύνονται και τα ναρκωτικά επιζώντα κύτταρα (DSCs) καλλιεργήθηκαν για 3-4 εβδομάδες.

B, Αυξημένη σχηματισμό αποικιών από DSCs απομονώνονται από τη γονική MCF7 (μαστού), Η460 (πνεύμονας) και OVCAR-3 (ωοθηκών) κυτταρικές σειρές καρκίνου.

Κύτταρα σπάρθηκαν 0.5 κύτταρο /ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων με μέσα καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% του FBS και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για δύο εβδομάδων. Το ποσοστό σχηματισμού αποικίας υπολογίστηκε. *** – P & lt? 0.001.

C, Ανάλυση της πλευράς πληθυσμού (SP) σε DSCs και τη γονική MCF7, OVCAR-3 και κυτταρικές σειρές Η460

. Καρκινικά κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 μg /ml Hoechst33342 (ΑΦ). Μερικά κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 μΜ fumitremorgin C (FTC) για 10 λεπτά πριν από την Hoechst προσθήκης (HO + FTC). Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI με 20% FBS και ιωδιούχο 2 μg /ml προπίδιο και ταξινομούνται χρησιμοποιώντας MoFlo κυτταρόμετρο. Τα στοιχεία για βιώσιμα κύτταρα αναλύθηκαν για παραμετρικές συσχετίσεις και σχολιασμένο χρησιμοποιώντας FCS Express.

Η

ικανότητας κλωνισμού των DSCs

Η κλωνογονικού ικανότητα της γονικής Η460, OVCAR3 και MCF7 κύτταρα και οι πληθυσμοί DSC ελέγχθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Λιγότερο από 40% των γονικών κυττάρων ήταν σε θέση να σχηματίσουν κλώνους, ενώ ο κλώνος που σχηματίζει χωρητικότητα DSCs ήταν περισσότερο από διπλάσια υψηλότερο (Εικόνα 1Β).

Ανάλυση του φαινοτύπου SP

Ανάλυση του SP κλασμάτων απεκάλυψε ότι δοκιμάστηκε γονικές κυτταρικές σειρές διέφεραν στο ποσοστό του κλάσματος SP, που κυμαίνονται από 0,6% σε OVCAR3, 0,5% σε MCF7, σε 5,2% σε κύτταρα Η460 (Σχήμα 1 C). κλάσματα κυττάρων SP ήταν σημαντικά υψηλότερη σε πληθυσμούς DSC κυμαίνεται από 10,7% σε MCF7, 15,6% στην OVCAR3 σε 35,3% το Η460. Μια ξεχωριστή χαμηλή Hoechst 33342 χρώση των κυττάρων SP έχει αποδοθεί στην έκφραση ABCG2, ένα ΑΤΡ-δέσμευσης κασέτα (ABC) μεταφορέας [13]. Για να αξιολογηθεί δραστηριότητα μεταφορέα ABCG2, fumitremorgin C (FTC), χρησιμοποιήθηκε ένας συγκεκριμένος ABCG2 αναστολέα. Το κλάσμα SP κυττάρων DSC μειώθηκε σημαντικά με την παρουσία του FTC (σχήμα 1Γ), επιβεβαιώνοντας έτσι προς τα πάνω ρύθμιση ABCG2 μεταφορέα σε DSCs.

Ανάλυση των ΚΕΠ και των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (ESC) δείκτες

η Array Cellomics σάρωσης HCS Reader (Cellomics /ThermoFisher) χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση και ανάλυση της έκφρασης των ΚΕΠ και των δεικτών των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων σε DSCs. Αυτή η προσέγγιση βασίζεται σε ένα συνδυασμό μικροσκοπία και κυτταρομετρία ροής μεθόδων σε ένα σχήμα 96 φρεάτων. Τα πλεονεκτήματα της προσέγγισης περιλαμβάνουν: Τα 10 φορές λιγότερο από ό, τι τα κύτταρα που απαιτούνται για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, πολυφασματική φθορισμός μικρο-απεικόνισης είναι αυτοματοποιημένη, και οι εικόνες αποθηκεύονται, οπτικοποιούνται και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ισχυρές εφαρμογές λογισμικού

την ανάλυση. αποκάλυψε ότι ο πληθυσμός DSC από κύτταρα MCF-7 ήταν CD44 θετικά με χαμηλά επίπεδα έκφρασης CD24 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), που αντιστοιχεί στο προηγουμένως εντοπιστεί φαινότυπο ΚΕΠ μαστού [3]. Οι DSCs από την OVCAR-3 γραμμή ωοθηκών εκφράζεται CD44 + και ES δείκτη Oct-4 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Μέχρι σήμερα, τα ανθρώπινα ΚΕΠ πνεύμονα είναι κακώς χαρακτηρίζεται από [10], [15]. Ως εκ τούτου, επικεντρώθηκε δίπλα στον χαρακτηρισμό των ιδιοτήτων CSC σε DSCs από πνεύμονα Η460 κυτταρική σειρά όγκου. Ανάλυση των CD34, CD24 /CD44, CD87, και CD90 δεικτών κυτταρικής επιφάνειας δεν έδειξαν διαφορική έκφραση μεταξύ Η460 γονικών και DSC πληθυσμούς (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), ενώ απομονωμένο ανθρώπινο DSCs πνεύμονα ήταν εμπλουτισμένα για την CD133 + πληθυσμού (Σχήματα Α, Β). Εμείς επόμενη ανέλυσε την έκφραση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (ESC) δείκτες, αντιγόνα ποδοκαλυκίνη, TRA-1-60, TRA-1-81, γλυκολιπίδιο αντιγόνα, το στάδιο-ειδικά αντιγόνα SSEA-3, 4, και του παράγοντα μεταγραφής Oct-4, σε Η460 γονικών κυττάρων και απομονωμένες DSCs. Υψηλότερη έκφραση του TRA-1-81, SSEA-3, και Oct-4 βρέθηκε σε απομονωμένες DSCs σε σύγκριση με τη γονική Η460 κύτταρα (Σχήμα 2C, D), υποστηρίζοντας την υπόθεσή μας ότι DSCs πρόδηλη δεικτών που σχετίζονται με SCs.

Η460 κύτταρα και DSCs, αναπτύσσονται σε πλάκες 96-φρεατίων, σταθεροποιήθηκαν και επωάστηκαν με πρωτογενές Abs έναντι CD133, TRA-1-81, SSEA-3, Oct-4, ή cytokeratins8 /18 και στη συνέχεια με δευτερεύον Abs. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με Hoechst 33342. εικόνες κυττάρων αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας την Cellomics ArrayScan HCS Reader (20Χ, 40Χ στόχοι) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το δομικό στοιχείο λογισμικού στόχο ενεργοποίησης BioApplication.

Α, ανοσοφθορισμού εικόνες των καρκινικών κυττάρων. Β, ένταση φθορισμού (pix) του CD133 συναρτήσει της περιοχής αντικειμένου.

Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει ένα μόνο κύτταρο. Κύτταρα στα δεξιά της κόκκινης γραμμής είναι CD133 + (πάνω από χρώση ελέγχου IgG).

C, Εικόνες των καρκινικών κυττάρων ανοσοφθορισμό χρωματισμένο καρκινικά κύτταρα για TRA-1-81, SSEA-3 και δείκτες Oct-4

ES κυττάρων. Δ φθορισμού ένταση του TRA-1-81, SSEA-3 και Oct-4, συναρτήσει της περιοχής αντικειμένου. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει ένα μόνο κύτταρο. Κύτταρα στα δεξιά της κόκκινης γραμμής είναι θετικά (πάνω από χρώση ελέγχου IgG). E,

Εικόνες της ανοσοφθορισμό προετοιμασμένα κύτταρα του όγκου για cytokeratins8 /18.

F,

Η ένταση φθορισμού των cytokeratins8 /18 σε κύτταρα Η460 (μαύρα στίγματα) και DSCs (γκρι κουκκίδες) συναρτήσει της περιοχής αντικείμενο

.

Η

Χαμηλά επίπεδα κυτοκερατίνες δείκτης διαφοροποίησης (CK) έκφραση σε DSCs

καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα είναι γνωστό ότι εκφράζουν τύπου Ι CK18 και τύπου II κυτοκερατίνες Ck8, γνωστή δεικτών διαφοροποίησης σε αυτά τα κύτταρα [31]. Συγκρίναμε την έκφραση του Ck8 /18 σε κύτταρα Η460 και DSCs. Σε σύγκριση με γονική κυτταρική γραμμή Η460, DSCs εξέφρασαν πολύ χαμηλά επίπεδα Ck8 /CK18 (Σχήμα 3Δ, E), υποδεικνύοντας μία χαμηλή κατάσταση διαφοροποίηση των απομονωμένων DSCs.

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και επωάστηκαν με Alexa 488 Fluor® phalloidin ή με πρωτοταγείς Abs εναντίον β-κατενίνης και με δευτερογενή Alexa Fluor 488 συζευγμένο Abs. Στη συνέχεια τα κύτταρα βάφτηκαν με Hoechst33342. εικόνες των κυττάρων αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας το Cellomics ArrayScan HCS Reader (στόχος 20Χ) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την Ενότητα λογισμικού Διαμέρισμα Ανάλυση BioApplication και την Ενότητα λογισμικού στόχο ενεργοποίησης BioApplication.

Α, Εικόνες των κυττάρων Η460 και DSCs ανοσοφθορισμό χρώση για β-κατενίνης (Α).

Β,

Μια μέση ένταση φθορισμού της πυρηνικής β-κατενίνης σε Η460 (μαύρη γραμμή) και DSCs (γκρι γραμμή)

.C,

Μια μέση ένταση φθορισμού των κυτταρικών phosphor- β-κατενίνης σε Η460 (μαύρη γραμμή) και DSCs (γκρίζα γραμμή). D, Κυτταροσκελετού εικόνες των κυττάρων Η460 και DSCs ανοσοφθορισμό χρώση για phalloidin και Hoechst33342.

Η

έκφραση της β-κατενίνης

Οι πρωτεΐνες σηματοδότησης Wnt έχει αποδειχθεί ότι παίζουν ρόλο στον έλεγχο βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση. β-κατενίνης είναι ένας βασικός παράγοντας στο μονοπάτι Wnt, μετάδοση σημάτων Wnt στον πυρήνα και να παίζει καθοριστικό ρόλο στην ογκογένεση [32] – [34]. Εδώ αναλύσαμε την ενδοκυτταρική διανομή του β-κατενίνης σε κύτταρα Η460 και DSCs. DSCs έδειξαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα ολικής και της πυρηνικής β-κατενίνης από γονικών Η460 κύτταρα (Σχήμα 3Α, Β), ενώ φωσφορυλιωμένη β-κατενίνης ήταν παρούσα σε χαμηλά επίπεδα σε DSCs σε σύγκριση με γονικά κύτταρα Η460 (Σχήμα 3C). Είναι γνωστό ότι σε διαφοροποιημένα κύτταρα όπου σηματοδότηση Wnt είναι απούσα, το επίπεδο της β-κατενίνης ρυθμίζεται από ένα πολυπρωτεϊνικό «συγκρότημα καταστροφής» το οποίο δεσμεύει και φωσφορυλιώνει β-κατενίνης, καθιστά υποψήφιο για ουβικιτινίωση και πρωτεολυτική αποικοδόμηση [32]. Σε βλαστικά κύτταρα όπου παρουσιάζονται οι συνδετήρες Wnt, αυτό το «συγκρότημα καταστροφή» αναστέλλεται, αποτρέποντας φωσφορυλίωση β-κατενίνης και αποδόμησης, οδηγώντας σε σταθεροποίηση και πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης [32] – [34]. Έτσι, τα υψηλά επίπεδα πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης και τα χαμηλά επίπεδα φωσφορυλιωμένης β-κατενίνης προτείνουν τη δραστική σηματοδότηση Wnt σε DSCs.

Ανάλυση της κυτταρικής μετανάστευσης και της έκφρασης των μορίων προσκόλλησης VLA

μας μορφολογική ανάλυση των DSCs και γονικών κυττάρων Η460 αποκάλυψε διαφορές στο σχήμα των κυττάρων και των ιδιοτήτων πρόσφυσης, προτείνοντας πιθανές διαφορές στην οργάνωση του κυτταροσκελετού τους. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, χρησιμοποιήσαμε Alexa 488 phalloidin να απεικονίσει το F-ακτίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, γονικών κυττάρων Η460 έχουν στρογγυλό σχήμα και ομοιόμορφη κατανομή της F-ακτίνης στο κυτταρόπλασμα, ενώ κάποιοι DSCs έχουν lamellipodial επέκταση και ακτίνη αιχμές βρίσκονται στην αιχμή των κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι DSCs έχουν μεγαλύτερη «μεταναστευτικό φαινότυπο» από μητρικά κύτταρα Η460. Διερευνήσαμε τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων Η460 και DSCs χρησιμοποιώντας ένα

in vitro

μετανάστευση και εισβολή δοκιμασία χρησιμοποιώντας την IL-8 ως χημειοελκυστικό. Ότι, μόνο το 13,7% των γονικών κυττάρων Η460 εισέβαλαν μέσω του Matrigel, 87,5% των DSCs ήταν επεμβατική.

Μόρια προσκόλλησης, συμπεριλαμβανομένου ιντεγκρίνες, διευκολύνουν την επιβίωση των κυττάρων σηματοδότησης και εμπλέκονται στην κινητικότητα, διακυτταρική προσκόλληση, χημειόταξη, και μετάσταση [35]. Συγκρίναμε την έκφραση των ιντεγκρινών VLA-4, VLA-5, και VLA-6 σε κύτταρα Η460 και DSCs. Βρήκαμε ότι DSCs είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα της VLA-5 και χαμηλότερα επίπεδα VLA-6 σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα, ενώ το VLA-4 τα επίπεδα ήταν παρόμοια και στις δύο υποπληθυσμούς (Εικόνα 4D). Στέρηση προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων μπορεί να προκαλέσει απόπτωση. Αυτή η μορφή της απόπτωσης, που επάγεται ως αποτέλεσμα της απώλειας της κυτταρικής προσκόλλησης σε ένα υπόστρωμα, ονομάστηκε anoikis. Η χαμηλή πρόσφυση του DSCs μπορεί να μειώσει την εξάρτησή τους από ορισμένα σωζόμενα σήματα και να οδηγήσει σε αντίσταση στην anoikis. Anoikis-ανθεκτικά κύτταρα έδειξαν υψηλότερη μεταστατική ικανότητα [36].