Αφηρημένο

παρακρινικές λειτουργία είναι ένας σημαντικός μηχανισμός της επικοινωνίας κυττάρου-κυττάρου μέσα σε μικροπεριβάλλον του ιστού στην κανονική ανάπτυξη και την ασθένεια.

In vitro

μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας προσομοίωσης ιστού ή στο μικροπεριβάλλον του όγκου είναι απαραίτητα εργαλεία για να οριοθετηθούν τα επιθηλιακά-στρωματικά αλληλεπιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων παρακρινικές λειτουργία, αλλά μια ιδανική τρισδιάστατη (3D) μοντέλο όγκου ειδικά μελετώντας παρακρινικές λειτουργία λείπει σήμερα. Για να καλυφθεί αυτό το κενό έχουμε αναπτύξει ένα νέο 3D μοντέλο συγκαλλιέργειας σε δύο στρωμάτων μικροσφαιριδίων υδρογέλης, αλγινικό, ενσωματώνοντας επιθηλιακό καρκίνο του προστάτη και στρωματικά κύτταρα σε ξεχωριστά διαμερίσματα των μικροσφαιριδίων. Τα κύτταρα παρέμειναν περιορισμένες και βιώσιμο πλαίσιο των αντίστοιχων αρμοδιοτήτων τους για πάνω από 30 ημέρες. Ως απόδειξη της αρχής όσον αφορά τη λειτουργία παρακρινική του μοντέλου, μετρήσαμε φέρον γείσα συνιστώσα Ε-καδερίνης (SE-CAD) στο ρυθμισμένο μέσο, ​​ένα μεγάλο δεσμευμένο μεμβράνη κυτταρικής προσκόλλησης μόριο που είναι ιδιαίτερα απορρυθμισμένη σε καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη. Εκτός από την απόδειξη ότι SE-CAD μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με αξιοπιστία στο ρυθμισμένο μέσο, ​​τα πειράματα χρονικής πορείας έδειξαν επίσης ότι η ποσότητα του Se-CAD επηρεάζεται από την αλληλεπίδραση των επιθηλιακών-στρωματικών. Συμπερασματικά, η μελέτη προβλέπει ένα νέο 3D

in vitro

μοντέλο συν-καλλιέργειας που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη παρακρινούς αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου

Παράθεση:. Fang Χ, Sittadjody S, Gyabaah Κ, Opara ΕΚ, Balaji KC (2013) Μυθιστόρημα 3D Co-Πολιτισμός Πρότυπο για τα επιθηλιακά-στρωματικά κύτταρα Αλληλεπίδραση στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (9): e75187. doi: 10.1371 /journal.pone.0075187

Επιμέλεια: Elad Katz, AMS Biotechnology, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 3 Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 11 Αυγ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Fang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το Wake Forest University θεσμικών κεφαλαίων στην KC Balaji και από ΝΙΗ CA079448 επιχορήγηση X. Fang. ιστοσελίδα χρηματοδότης είναι https://www.wakehealth.edu/. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πολλά από τα

μοντέλα in vitro

κύτταρα συν-καλλιέργεια διάθεση. μελέτη των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου χρησιμοποιούν δισδιάστατες πιάτα ή πλάκες [1,2,3] (2D) Petri. Ωστόσο, στις περισσότερες ζωντανούς οργανισμούς τα κύτταρα ενσωματώνονται σε ένα τρισδιάστατο (3D) μικροπεριβάλλον, που περιβάλλεται από άλλα κύτταρα και επηρεάζονται από διαλυτούς παράγοντες που εκκρίνονται στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Εναλλακτικά μοντέλα σάντουιτς μπορεί να χρησιμοποιηθεί για πολυστρωματικές ανάπτυξη των κυττάρων, αλλά οι περιορισμοί είναι προφανείς, καθώς τα κύτταρα θα τροποποιούσαν τα πρότυπα μορφολογικά χαρακτηριστικά, το μεταβολισμό και τη γονιδιακή έκφραση τους σε 2D καλλιέργεια, ειδικά όταν είναι από ανώτερους οργανισμούς [4,5]. Επιπλέον, τα συμβατικά καλλιέργειες 2D κυττάρων περιορίζουν κυψελοειδών επικοινωνιών και μεταφοράς των διαλυτών παραγόντων, οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά, την απομάκρυνση των αποβλήτων και τον κυτταρικό μεταβολισμό, όπως παρουσιάζονται στην φυσική βιολογική περιβάλλοντα [6,7]. Ως εκ τούτου, είναι κρίσιμο να αναπτυχθεί

in vitro

συστήματα μοντέλων που προσομοιώνουν μικροπεριβάλλοντα ιστού για την παραγωγή αξιόπιστων και βιολογικά νόημα πειραματικά αποτελέσματα.

συστήματα 3D modeling προσομοίωσης μικροπεριβάλλον του ιστού αναπτύχθηκαν για να αντιμετωπίσει τους περιορισμούς που συνδέονται με 2D μοντέλα [8]. Ενώ 3D

in vitro

μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας ξεπεραστούν αρκετοί περιορισμοί του 2D μοντέλων, βελτίωση σε 3D modeling είναι απαραίτητη για τη διάκριση συγκεκριμένων τύπων της αλληλεπίδρασης κυττάρου-κυττάρου, όπως κυττάρου-κυττάρου άμεση, αυτοκρινή ή παρακρινή λειτουργίες. Οι πρόοδοι στην βιοϋλικών και τεχνικές βιοτεχνολογίας επιτρέπουν τη χρήση των νέων υλικών, όπως τζελ κολλαγόνου, λαμινίνη και Matrigel ™ σε κυτταρική καλλιέργεια, την ανάπτυξη συνθετικών εξωκυττάριας ουσίας και να δημιουργήσει μια ποικιλία από μοντέλα 3D [5,9,10,11,12,13,14, 15]. Μεταξύ των διαθέσιμων βιοϋλικών, αλγινικό υδρογέλη κατέχει προτιμάται ιδιότητες για την κυτταρική μεταμόσχευση, χορήγησης φαρμάκων και της μηχανικής ιστών. Το αλγινικό είναι ένας πολυσακχαρίτης και ένα βιοσυμβατό πολυμερές που προέρχεται από καφέ φύκια. Με την προσθήκη των δισθενών κατιόντων όπως ασβέστιο ή βάριο, αλγινικό πολυμερή μπορεί να είναι ιονικώς εγκάρσια συνδεδεμένα για να σχηματίσουν μία υδροπηκτή. Η υδρόφιλη φύση των ικριωμάτων αλγινικού επιτρέπει υψηλή κυτταρική φόρτωσης που παραμένουν βιώσιμη και λειτουργική στον πολιτισμό [16,17,18]. Επιπλέον, η παραγωγή του αλγινικού υδρογέλης είναι σχετικά απλή και ενθυλάκωση μπορεί να επιτευχθεί υπό μη αυστηρές συνθήκες. Διάφοροι τύποι κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων νευρωνικών κυττάρων, οστεοβλάστες, χονδροκύτταρα, μυοβλάστες, έχουν ενθυλακωθεί, καλλιεργήθηκαν και επεκτάθηκε σε αλγινικό υδροπήγματα [19,20,21,22,23].

Στην εργασία αυτή δημιούργησε ένα 3D καρκίνο του προστάτη επιθηλιακά-στρωματικά αλληλεπίδρασης σε αλγινικό μικροσφαιρίδια υδρογέλης με συν-καλλιέργεια του καρκίνου του προστάτη C4-2 κύτταρα (σταθερά επιμολυσμένα με Protein Kinase D1 (PKD1) ή φορέα ελέγχου) και κανονικά στρωματικά κύτταρα προστάτη (WPMY-1 κύτταρα) στο ίδιο μικροκάψουλας, αλλά σε ξεχωριστό υπο-στρώματα. Αυτό το σύστημα είναι ιδανικό για να μελετήσει παρακρινή επίδραση μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων, επειδή άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ επιθηλιακών και στρωματικών κυττάρων δεν επιτρέπεται. Ως απόδειξη της αρχής για τη μελέτη παρακρινή λειτουργία, μετρήσαμε αποβολή E-cadherin (SE-CAD) σε διαλυτές μέσα μαζικής ενημέρωσης. Το SE-CAD είναι ένα 80 kDa αποκόπτεται κομμάτι της E-cadherin, μια κόλλα διαμεμβρανική πρωτεΐνη των κυττάρων που απορυθμίζεται σε αρκετές καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του προστάτη [3,24,25,26]. Αυξημένα SE-CAD έχει αναφερθεί σε υγρά και ορό ασθενών με μια ποικιλία καρκίνων και άλλων ασθενειών [25,27,28,29,30] και τα επίπεδα στον ορό έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται θετικά με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη και υποτροπή της νόσου. Έτσι, SE-cad προτείνεται να είναι ένα νέο βιοδείκτη για πρόγνωση του καρκίνου. Περιγράψαμε προηγουμένως την κάτω ρύθμιση των PKD1 σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη [31], και ότι ΡΚϋ1 προωθεί την Ε-καδερίνη ρίχνοντας μέσω αυξημένης μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) -2 και -9 έκκριση [24].

Υλικά και μέθοδοι

Cell Culture

κυττάρων

C4-2 σταθερά επιμολυσμένα με φορέα pcDNA3.1 (φορέας κύτταρα) ή PKD1-GFP (κύτταρα PKD1) αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο μας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. στρωματικά κύτταρα Κανονική προστάτη (WPMY-1) ελήφθησαν από την ATCC. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ (υψηλή γλυκόζη) (HyClone, Cat # SH30243.01) με 10% FBS και 1% Antibioltic αντιμυκητιασικές (HyClone Cat # SV30079.01) σε 15-cm στείρα πλάκα καλλιέργειας και επωάζονται στους 37 ° C με 5% CO

2. Όταν τα κύτταρα έφθασαν 80% συρροή, μέσα απομακρύνθηκαν από κάθε πλάκα και τα κύτταρα πλύθηκαν με αποστειρωμένο PBS τρεις φορές, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με θρυψίνη (HyClone, Cat # SH30236.01) για 20 λεπτά και μεταφέρεται σε αποστειρωμένους σωλήνες φυγοκέντρησης. Αυτά πλύθηκαν με PBS και πάλι, και μετά επαναιωρήθηκαν σε μέσο DMEM για ενθυλάκωση.

Κατασκευή μικροκαψουλών

Ο στρωματικά, τον φορέα και ΡΚϋ1 κύτταρα έγκλειστα σε αλγινικό υδρογέλη χρησιμοποιώντας ένα μικρο-ρευστού συσκευή με ορισμένες τροποποιήσεις της ενθυλάκωσης όπως περιγράφεται από Tendulkar et al. και Khanna et al. [32,33]. Εν συντομία, πρώτα κυτταρικό τύπο (στρωματικών ή φορέα ή ΡΚϋ1) αναμίχθηκε με 1,5% (w /v) υπερκαθαρού χαμηλού ιξώδους υψηλής mannuronate αλγινικό (LVM) (NovaMatrix, Sandvika Νορβηγία) και εξωθείται διαμέσου της συσκευής ενθυλάκωσης μικρο-ρευστού. Τα σταγονίδια που παράγονται συλλέχθηκαν σε διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου 100 mM. Μετά την εγκάρσια σύνδεση αλγινικού για πέντε λεπτά σε CaCl

2, οι μικροκάψουλες πλένονται με 0,9% NaCl που περιέχει 20 mM ΟαΟ

2. Οι μικροκάψουλες στη συνέχεια επωάστηκαν με πολυ-Ε-ορνιθίνη (ΟΑΠ) (0.1% β /ο) για 20 λεπτά για να δημιουργήσει ένα στρώμα ΟΑΠ, το οποίο χρησιμεύει ως εκλεκτικός βασικής μεμβράνης περμανάντ. Οι ΟΑΠ επικαλυμμένα μικροκάψουλες στη συνέχεια αναμιγνύονται με το δεύτερο τύπο κυττάρου (στρωματικών ή φορέα ή ΡΚϋ1) αιωρήθηκε σε 1,5% (w /v) LVM και ενθυλακώνονται ξανά χρησιμοποιώντας το μικρο-ρευστού συσκευή με σκοπό την απόκτηση πολλαπλών στρώσεων μικροκάψουλες. Οι μικροκάψουλες πλύθηκαν με 0,9% NaCl που περιέχει 20 mM ΟαΟ

2 και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει ορό εμβρύου μόσχου (10% ν /ν) στους 37 ° C με 5% CO

2.

βιωσιμότητα Δοκιμασία

για αξιολόγηση της βιωσιμότητας των εγκλεισμένων κυττάρων, λίγα κάψουλες από κάθε επιμολυσμένα ομάδα αφαιρέθηκαν και μεταφέρθηκαν σε καθαρούς 24-φρεατίων, τα μέσα αναρροφήθηκαν προσεκτικά και τα κύτταρα χρωματίζονται. χρώση ελέγχου Single κυτταρικό τύπο: CFDA SE (Vybrant® CFDA SE τηλέφωνο Tracer Kit, Invitrogen) ανασυσταθέν σε ϋΜΕΜ ελεύθερο ορού (SFM, HyClone) (1: 400) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο (500 μλ /φρεάτιο) και επωάστηκε για 15 λεπτά στους 37 ° C, 5% CO

2 στον επωαστήρα. Στη συνέχεια, SFM με CFDA SE αντικαταστάθηκε από DMEM με 10% FBS και επωάζονται πάλι για άλλα 30 λεπτά στους 37 ° C, 5% CO

2 στον επωαστήρα. Το μέσο που περιέχει ορό στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (Life Technologies /Invitrogen, Grand Island, ΝΥ) και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 λεπτά και οι μικροκάψουλες πλύθηκαν 3 φορές για να απομακρυνθεί η περίσσεια PI. Οι μικροκάψουλες στη συνέχεια παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο ανεστραμμένου φθορισμού (Zeiss Axiovert 200Μ) και απεικονίζεται. Ο αριθμός των ζωντανών και νεκρών κυττάρων προσδιορίστηκε ποιοτικά από τη σύνθετη εικόνα που αποκτήθηκε χρησιμοποιώντας Image-Pro λογισμικό συν (έκδοση 6.3.1.542). Διπλή χρώση κυτταρικού τύπου: Για να αποδειχθεί η απόκλιση διαμερισματοποίηση διαφορετικών τύπων κυττάρων στις πολυεπίπεδη μικρο-κάψουλες, ο εσωτερικός πυρήνας κύτταρα προ-βάφτηκαν με Κυττάρων Tracker πράσινο (Invitrogen, Cat # C2925) και τα εξωτερικά κύτταρα στρώματος ήταν προ- βάφονται με κυττάρων-Tracker Orange (Invitrogen), πριν από την σύνθεση των πολλαπλών στρώσεων μικρο-κάψουλες. Πριν από την παρατήρηση, οι μικροκάψουλες βάφτηκαν με SYTOX Μπλε Nucleic Acid Stain (Invitrogen, Cat # S11348) για νεκρά κύτταρα. Οι πολυεπίπεδη μικρο-κάψουλες στη συνέχεια απεικονίζονται χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss Axiovert 200Μ).

Ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανίχνευση (ELISA)

Για την αξιολόγηση των λειτουργιών παρακρινή ενθυλακωμένων κυττάρων, τα επίπεδα της sE-CAD μετρήθηκε στο μέσο καλλιέργειας. Κάθε ομάδα μικροκάψουλας καλλιεργήθηκε σε τετράδυμα και το αναλωθέν μέσο συλλέχθηκε κάθε αναπληρωτή ημέρα. Ενώ συλλογή των χρησιμοποιημένων μέσων, τα μέσα σε κάθε φρεάτιο αναμίχθηκε πλήρως? 1 ml (το ήμισυ του συνολικού όγκου) λήφθηκε έξω από κάθε φρεάτιο και αντικαταστάθηκε με 1 ml φρέσκου πλήρους ϋΜΕΜ με 10% FBS και 1% αντιβιοτικά. Το μέσο δείγμα φυλάσσονται σε καθαρό σωλήνα Eppendorf στους -20 ° C. Για κύτταρα που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια ιστού 2D αγωγή τρυβλία Petri, μέσα συλλέχθηκαν όταν τα κύτταρα έφθασαν συρροή 90-100% (τριήμερη επώαση). Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε για κάθε κυτταρική σειρά για αργότερα κανονικοποίηση. Τα επίπεδα της SE-CAD μετρήθηκαν με κιτ ELISA από R &?. Συστήματα D, Quantikine (ανθρώπινη SE-cadherin) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών

Αποτελέσματα

Η βιωσιμότητα των κυττάρων διατηρείται για τουλάχιστον ένα μηνών σε μικροσφαιρίδια

με βάση τις προηγούμενες εκθέσεις του μικροκάψουλες πολλαπλών στρώσεων που παράγονται για παράδοση πρωτεΐνη [32,33] σχεδιάσαμε μικροκάψουλες διπλό στρώμα, το οποίο αποτελούνταν από ένα αλγινικό άλας εσωτερικό πυρήνα και το εξωτερικό στρώμα του αλγινικού (Σχήμα 1 ) διαχωρίζονται από μία ηλεκτροστατικά-συνδεδεμένης πολυκατιονικό επιλεκτικής διαπερατότητας πολυ-L-ορνιθίνη (ΟΑΠ) παλτό με μέγεθος πόρου & lt? 150 kDa [32]. Ότι η άμεση αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου απέτρεψε μοντέλο, κυτταρική εκκρίσεις θα μπορούσε να διεισδύσει μέσα από το παλτό ΟΑΠ επιτρέποντας παρακρινικές δραστηριότητα. Ως πρώτο βήμα προς την κατεύθυνση επικύρωσης του υποδείγματος για παρακρινή λειτουργία, αξιολογήσαμε τη βιωσιμότητα των κυττάρων.

Αριστερά είναι ένα μοντέλο γελοιογραφία των μικροσφαιριδίων δύο στρωμάτων. Ο εσωτερικός πυρήνας και το εξωτερικό στρώμα διαχωρίστηκαν με επικάλυψη ΟΑΠ όπως φαίνεται. Τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε χωριστές στιβάδες υποδεικνύεται με κόκκινα βέλη. Δεξιά είναι μια πραγματική μικροσφαιριδίων παρατηρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο φωτός. Στρωματικά κύτταρα αναπτύχθηκαν στον εσωτερικό πυρήνα για 7 ημέρες, και εξωτερικό στρώμα είναι κενό.

Η

Τα στρωματικά κύτταρα (WPMY-1), τον φορέα κύτταρα C4-2 (κύτταρα C4-2 σταθερά επιμολυσμένα με pcDNA3 0.1) και τα κύτταρα C4-2 ΡΚϋ1 (κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα C4-2 και εκφράζουν ΡΚϋ1) παρέμειναν βιώσιμα εντός του εσωτερικού πυρήνα ή εξωτερικού στρώματος στις μικροκάψουλες διπλή στρώση για 4 εβδομάδες, και παρέμεινε περιορίζεται σε αντίστοιχα στρώματα τους χωρίς μετανάστευσης μέσω της ΟΑΠ ( Σχήμα 2). Στη συνέχεια, δύο διαφορετικούς τύπους κυττάρων συν-καλλιεργήθηκαν σε εσωτερικό πυρήνα ή εξωτερικό στρώμα του ίδιου μικροκάψουλας, και οι δύο τύποι κυττάρων παρέμειναν βιώσιμα σε συν-καλλιέργεια για τουλάχιστον 4 εβδομάδων, ανεξαρτήτως του συνδυασμού στρωμάτων ή κυτταρικό τύπο (Σχήμα 2). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το αλγινικό μικροσφαιρίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να αυξηθεί επιθηλιακών ή στρωματικών κυττάρων σε διαμερίσματα σε διαφορετικά στρώματα

in vitro

για τουλάχιστον ένα μήνα.

BS, μικροκάψουλες με κενό εσωτερικό πυρήνα και στρωματικά κύτταρα σε εξωτερικο στρώμα. PS, μικροκάψουλες με κύτταρα C4-2 ΡΚϋ1 στο εσωτερικό πυρήνα και στρωματικά κύτταρα σε εξωτερικό στρώμα. Green, ζωντανά κύτταρα σε εσωτερικό πυρήνα. Κόκκινο, ζωντανά κύτταρα σε εξωτερικό στρώμα. Μπλε, τα νεκρά κύτταρα. μπαρ κλίμακα, 100 μm.

Η

Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε μικροσφαιρίδια αποδειχθεί εκκριτική λειτουργία

Για να αποδείξει ότι βιώσιμα κύτταρα σε μικροσφαιρίδια, επίσης, να παραμείνει λειτουργική, μετρήθηκε η συγκέντρωση του διαλυτού κλάσματος E-cadherin (sE-cad, ή φέρον γείσα Ε-καδερίνης) στο ρυθμισμένο μέσο ως δείκτης της εκκριτικής λειτουργίας. E-cadherin είναι ένα σημαντικό μόριο προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου διαμεμβρανική που απορυθμίζεται σε αρκετούς ανθρώπινους καρκίνους [3,34]. Το εξωκυτταρικό πεδίο της Ε-καδερίνης διασπάται από αρκετές εξωκυτταρικές πρωτεάσες. Η διάσπαση οδηγεί σε αποβολή ενός θραύσματος περίπου 80 kDa, η οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα βιοδείκτη επιθετικών φαινοτύπου σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του προστάτη [25,27,28,29,30]. Οι προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι απορύθμιση της PKD1 επηρεάζει Ε-καδερίνης απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [24]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα C4-2 ΡΚϋ1 να ποσοτικοποιηθεί φέρον γείσα επίπεδο Ε-καδερίνης. Προκειμένου να περιλαμβάνουν μια ποικιλία θετικών και αρνητικών μαρτύρων, ελέγξαμε το επίπεδο SE-CAD σε ρυθμισμένα μέσα από διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των φυσιολογικών και νεοπλασματικών κυττάρων. Ενώ μερικοί τύποι κυττάρων δεν έδειξε πολλά στοιχεία του E-CAD σκόρπισμα προκύπτουν από το επίπεδο χαμηλό /ίχνος του Se-Cad, άλλοι εκκρίνονται υψηλά επίπεδα SE-CAD στο ρυθμισμένο μέσο (Σχήμα 3). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μεταστατικές κυτταρικές γραμμές (MCF-7, PC3 και LNCaP κύτταρα) έχουν υψηλό επίπεδο SE-Cad, και καλοήθεις κυτταρικές γραμμές (κύτταρα ΗΕΚ293Τ, κύτταρα 3Τ3 και κύτταρα MS1) έδειξαν χαμηλή /επίπεδο ίχνους SE-Cad. Υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των επιπέδων SE-Cad των μεταστατικών κυττάρων και καλοήθη κύτταρα, τα οποία επιβεβαιώθηκαν με t-test του Student (Σχήμα 3). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με τη δημοσιευμένη βιβλιογραφία ότι το επίπεδο SE-CAD συσχετίζεται με κυτταρικές εισβολής [25].

επίπεδο SE-Cad μετρήθηκε με ELISA και ομαλοποιήθηκε να αντικατοπτρίζει την έκκριση της 10

7 κελιά για κάθε κυτταρική σειρά. Se-Cad επίπεδο των μεταστατικών κυτταρικών γραμμών (MCF-7, LnCap και PC3) συγκρίθηκαν με ΗΕΚ293Τ (ως αντιπροσωπευτικό των κανονικών κυτταρικών γραμμών) και τιμές Ρ υπολογίστηκαν με τεστ t Student. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών παράλληλων πειραμάτων. μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα.

Η

Συν-καλλιέργεια των επιθηλιακών και στρωματικών κυττάρων επιρροές αποβάλλονται έκκριση E-cadherin ως απόδειξη της παρακρινούς λειτουργία

Για να ελέγξετε παρακρινικές αλληλεπίδραση μεταξύ δύο διαφορετικών κυττάρων γραμμές, στρωματικά κύτταρα, C4-2 φορέα κύτταρα και κύτταρα C4-2 PKD1 αναπτύχθηκαν σε μικροκάψουλες σε μια ποικιλία συνδυασμών και sE-CAD στο ρυθμισμένο μέσο ποσοτικοποιήθηκε. Όταν ένα μοναδικό τύπο κυττάρων αναπτύσσονται είτε σε εσωτερικό πυρήνα ή εξωτερικό στρώμα των μικροκαψουλών, στρωματικά κύτταρα δεν εκκρίνουν Se-cad, ενώ και οι δύο C4-2 φορέα κύτταρα και κύτταρα C4-2 ΡΚϋ1 έκανε όταν ενθυλακώνονται μαζί σε ξεχωριστά διαμερίσματα (Σχήμα 4Α ). Ποσοτικοποίηση της SE-Cad διεξήχθη για κύτταρα καλλιεργούνται σε 2D περιβάλλον και παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν (Σχήμα 4Β). Τα αποτελέσματα επικυρώνουν την αξιοπιστία του μοντέλου να διακρίνει τα επιθηλιακά από λειτουργίες στρωματικά κύτταρα ».

Ένα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 3D περιβάλλον για 6 ημέρες. BS, μικροκάψουλες με κενό εσωτερικό πυρήνα και στρωματικά κύτταρα σε εξωτερικό στρώμα. BV, μικροκάψουλες με κενό εσωτερικό πυρήνα και τον φορέα κύτταρα C4-2 σε εξωτερικό στρώμα. ΒΡ, μικροκάψουλες με κενό εσωτερικό πυρήνα και των κυττάρων C4-2 PKD1 σε εξωτερικό στρώμα. επίπεδο SE-Cad μετρήθηκε με ELISA. Β, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε περιβάλλον 2D (τρυβλίο Petri). επίπεδο SE-Cad μετρήθηκε με ELISA και κανονικοποιούνται ώστε να αντικατοπτρίζει την έκκριση του 10

7 κυττάρων για κάθε κυτταρική σειρά τιμές Ρ υπολογίστηκαν με τεστ t Student. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών (καλλιέργεια 2D) ή τέσσερα (3D καλλιέργειας) παράλληλα πειράματα. μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα.

Η

C4-2 PKD1 κύτταρα αυξημένη έκκριση SE-CAD σύγκριση με τα κύτταρα C4-2 φορέα (έλεγχος) (Εικόνα 4), η οποία είναι συνεπής με προηγούμενες δημοσιεύσεις μας [ ,,,0],24]. Εχουμε επίσης προηγουμένως αποδειχθεί ότι PKD1 up-ρυθμιζόμενη έκφραση Ε-καδερίνης [24]. Υπό τις παρούσες πειραματικές μοντέλο κύτταρα C4-2 PKD1 αλλά όχι C4-2 φορέα κύτταρα συσσωματώνονται για να σχηματίσουν συμπαγείς αποικίες (μετά καλλιεργήθηκαν για τρεις εβδομάδες σε μικροκάψουλες) (Σχήμα 5), η οποία είναι μια καθιερωμένη φαινότυπο αυξημένης έκφρασης Ε-καδερίνης. Όταν επιθηλιακά και στρωματικά κύτταρα συνκαλλιεργήθηκαν σε ανεξάρτητες στρώσεις εντός της ίδιας της μικροκάψουλας, η ποσότητα του Se-CAD που εκκρίνεται από τα κύτταρα C4-2 (τόσο του φορέα και ΡΚϋ1 επιμολυσμένα κύτταρα) ήταν μειωμένη, υποδεικνύοντας τα στρωματικά κύτταρα επηρεάζουν σε επιθηλιακά έκκριση SE-CAD (Σχήμα 6). Επειδή η στρωματικά και επιθηλιακά κύτταρα είναι σε διαμερίσματα και σε θέση να αλληλεπιδρούν άμεσα, έχουμε υποθέτουν ότι στρωματικά κύτταρα επηρεάζουν επιθηλιακά κυτταρική λειτουργία εκκριτική μέσω παρακρινούς μηχανισμού.

Οι μικροκάψουλες επωάζονται για 23 ημερών θα εμφανιστούν. PB, μικροκάψουλες με κύτταρα C4-2 ΡΚϋ1 στο εσωτερικό πυρήνα και το εξωτερικό στρώμα κενό. VB, μικροκάψουλες με C4-2 κύτταρα φορέα σε εσωτερικό πυρήνα και το εξωτερικό στρώμα κενό. Πράσινο, βαφή CFDA για τα ζωντανά κύτταρα. Κόκκινο, ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση για νεκρά κύτταρα. Τα βέλη δείχνουν αποικίες κυττάρων. μπαρ κλίμακα, 100 μm.

Η

επίπεδο SE-CAD μετρήθηκε με ELISA μετά από συν-καλλιέργεια για 30 ημέρες. SB, μικροκάψουλες με στρωματικά κύτταρα σε εσωτερικό πυρήνα και το εξωτερικό στρώμα κενό. BV, μικροκάψουλες με κενό εσωτερικό πυρήνα και τον φορέα κύτταρα C4-2 σε εξωτερικό στρώμα. ΒΡ, μικροκάψουλες με κενό εσωτερικό πυρήνα και των κυττάρων C4-2 PKD1 σε εξωτερικό στρώμα. SV, μικροκάψουλες με στρωματικά κύτταρα στο εσωτερικό πυρήνα και τον φορέα κύτταρα C4-2 σε εξωτερικό στρώμα. SP, μικροκάψουλες με στρωματικά κύτταρα στο εσωτερικό πυρήνα και C4-2 PKD1 επιμολυσμένα κύτταρα σε εξωτερικό στρώμα. Οι τιμές Ρ υπολογίστηκαν με τεστ t Student. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των τεσσάρων παράλληλα πειράματα. μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα.

Η

Συζήτηση

Η διπλή στρώση μοντέλο μικροσφαιριδίων περιγράφονται στη μελέτη αυτή είναι ένα 3D περιβάλλον το οποίο προσομοιώνει την

in vivo

μικροπεριβάλλον, επιδέχονται στην εύκολη και κλιμακούμενη παραγωγή υλικού, τον καθαρισμό και την επεξεργασία, δεν διαπιστώνεται η κυτταροτοξικότητα, και είναι χημικώς συμβατή με υδατικά διαλύματα και φυσιολογικές συνθήκες. Σε αντίθεση με άλλες σήμερα διαθέσιμες 3D

in vitro

μοντέλο, το μοντέλο μικροσφαίρα στη μελέτη αυτή επιτρέπει να αναλύουν ειδικά παρακρινή αλληλεπίδραση μεταξύ των διαφόρων τύπων κυττάρων. Ωστόσο, το μοντέλο αυτό παρουσιάζει επίσης ορισμένους περιορισμούς. Η ποσότητα ποσοτικώς έκκριση SE-CAD των κυττάρων που αναπτύσσονται σε εσωτερικό πυρήνα είναι μικρότερη από εκείνη του ίδιου αριθμού και του τύπου των κυττάρων που αναπτύσσονται σε εξωτερικό στρώμα της μικροκάψουλας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτή η μειωμένη έκκριση μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι η Se-CAD που εκκρίνεται από τα κύτταρα στον εσωτερικό πυρήνα πρέπει να διαχυθεί μέσα από δύο στρώματα υδρογέλης πριν την εισαγωγή του ρυθμισμένα μέσα. Είναι επίσης πιθανό ότι η εκλεκτικότητα διαπερατότητας του ΟΑΠ παλτό μείωσε την έκκριση της SE-Cad. Για τη βελτιστοποίηση αυτού του μοντέλου για την ανίχνευση άλλων ειδικών πρωτεϊνών, τα χημικά χαρακτηριστικά του διασυνδεδεμένη παλτό ΟΑΠ μπορεί να χρειαστεί να βελτιστοποιηθεί για συγκεκριμένες ανάγκες της μελέτης. Πρέπει επίσης να ληφθεί η επίδραση της Εξώσωμα υπόψη, όπως ταυτοποιήθηκε Ε-καδερίνης σε μικροκυστίδια καθαρίζονται από κανονικούς δενδριτικά κύτταρα ποντικού και ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [35,36]. Παραμένει πιθανό ότι SE-Cad θα μπορούσαν να παγιδευτούν στα εξωσώματα, αλλά λίγα είναι γνωστά για το πώς μικροκυστίδια ρυθμίζουν την αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου στο παρακρινικές σύστημα.

Μια άλλη ανησυχία είναι η παρατεταμένη μηχανική ιδιότητα του αλγινικού υδρογέλης, όπως ιοντικά διασυνδεδεμένη αλγινικά έδειξαν μειωμένη αντοχή γέλης μετά από 90 ημέρες

in vitro

[37]. Για να λυθεί αυτό το πρόβλημα, σταθερό ομοιοπολικό διασυνδέσεις μπορούν να εισαχθούν σε αλγινικό υδρογέλες χρησιμοποιώντας διλειτουργικά σταυροδεσμών. Επίσης, είναι πιθανό ότι μια εκτεταμένη χρονική

in vitro

επωάσεις μπορεί να οδηγήσει σε μια ανισορροπία στις επικρατούσες συγκεντρώσεις ιόντων (η οποία είναι αναγκαία για τη διατήρηση της σταθερότητας μικροκάψουλας), αλλά όχι κάτω από το

in vivo

συνθήκες, καθώς δεν αποικοδόμηση αυτών των μικροσφαιρών αλγινικού παρατηρήθηκε για τουλάχιστον τρεις μήνες σε πρόσφατο μας

in vivo

μελέτες (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Παρά τους περιορισμούς αυτούς, το μοντέλο που περιγράφεται μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά για να μελετηθεί η αλληλεπίδραση παρακρινή επιθηλιακά-στρωματικά.

Τα επιθηλιακά-στρωματικά αλληλεπιδράσεις παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην κανονική ανάπτυξη και νεοπλασματικό μετασχηματισμό. Σε φυσιολογικό ανθρώπινο προστάτη τα στρωματικά κύτταρα που αποτελείται κυρίως από κύτταρα λείων μυών και ινοβλάστες, ενώ το υπόλοιπο είναι κατασκευασμένα από ενδοθηλιακά κύτταρα, περικύτταρα, λεμφοκύτταρα και μακροφάγα [38]. Έχει αναφερθεί ότι το στρώμα καρκίνωμα που συνδέεται (CAS) θα μπορούσε να αλλάξει την κυτταρική μορφολογία /ρυθμό ανάπτυξης /επιθετικότητα των νεοπλαστικών ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη, αλλά όχι σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη [39]. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί με χρήση κυττάρων καρκινώματος προστάτη σε συγκαλλιέργεια με τα κύτταρα των οστών pleuripotent στρωματικά [40]. Φυσιολογικούς ινοβλάστες δεν αποδεικνύουν τέτοια μετασχηματιστική επίδραση σε επιθηλιακά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει μια χαρακτηριστική αλληλεπίδραση επιθηλιακά-στρωματικά κατά την διάρκεια της διαδικασίας νεοπλασματικών κυττάρων [39]. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι ένας πιθανός μηχανισμός στρωματικών επίδραση στην επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα είναι μέσω ενός παρακρινούς μηχανισμού. Ως απόδειξη της αρχής που επέδειξε μείωση στην έκκριση SE-CAD με καρκινικά κύτταρα του προστάτη παρουσία στρωματικά κύτταρα και το μοντέλο θα μπορούσε πιθανώς να χρησιμοποιηθεί για να μελετήσει άλλες κυτταρικές λειτουργίες επηρεάζονται από παρακρινούς μηχανισμού. Πολλαπλασιασμό

αλληλεπίδραση στρωματικά επιρροές, απόπτωση και μετάσταση των επιθηλιακών κυττάρων. Στον καρκίνο του παγκρέατος, ένας ανταγωνιστής του Hedgehog (Hh) ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου μόνο όταν υπάρχει καρκίνος που σχετίζεται με στρώμα, υποδεικνύοντας οδό σηματοδότησης που εξαρτώνται από την στρώματος [41]. Σε προστάτη, αναφέρθηκε ότι τα στρωματικά παράγοντες, όπως caveolin-1 και φωσφορυλάσης θυμιδίνης σχετίζονταν με την επιθετικότητα του όγκου [42]. Άλλες νέες πρωτεΐνες που παίζουν ρόλο σε αλληλεπίδραση επιθηλιακά-στρωματικά εντοπίστηκαν από μεταγραφικού προφίλ σε προστάτη [43]. Ένας από αυτούς, Decorin, ήταν μειωτικά στον καρκίνο του προστάτη [43]. Μειωμένη Decorin οδήγησε σε σημαντική μείωση της Ε-καδερίνης και

in vivo

και

in vitro

, και φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ Decorin και Ε-καδερίνης επιβεβαιώθηκε με συν-ανοσοκαταβύθιση [34]. έκφρασης ντεκορίνης περιορίζεται αυστηρά σε μεσεγχυματικά /στρωματικά κύτταρα, αλλά όχι στα επιθηλιακά κύτταρα στον προστάτη [43], και η έκφρασή του μειώνεται σημαντικά σε στρώμα καρκίνωμα που συνδέεται με [43]. Είτε Decorin παίζει επίσης ένα ρόλο στην αποβολή της E-cadherin παραμένει άγνωστη.

Μια άλλη σημαντική ομάδα των πρωτεϊνών εξωκυττάριας ουσίας, MMPs, θα μπορούσε να είναι δυνατό οι υποψήφιοι των ρυθμιστικών αρχών στρωματικών που επηρέασαν την αποβολή E-cad. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι PKD1 επαγόμενη έκκριση της ΜΜΡ-2 και -9 αυξήσεις Ε-καδερίνης απόπτωση και καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [24].

Εν περιλήψει, η μελέτη καταδεικνύει τη σκοπιμότητα και χρησιμότητα της χρήσης μοντέλο μικροσφαιρίου 3D αλγινικό για τη μελέτη παρακρινή λειτουργία των κυττάρων. Ειδικότερα, χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο για να διερευνήσει την αλληλεπίδραση επιθηλιακά-στρωματικά και απέδειξαν ότι κανονικά στρωματικά κύτταρα προστάτη επηρεάζει την έκκριση του Se-Cad από επιθηλιακά κύτταρα καρκίνου του προστάτη κατά παρακρινούς αλληλεπίδραση. Το μοντέλο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την επικύρωση επιπλέον κυτταρικές γραμμές και παρακρινή αλληλεπίδραση των διαφορετικών τύπων κυττάρων.