Αφηρημένο

Ιστορικό

Mincle, μακροφάγων επαγόμενο λεκτίνη τύπου C , είναι ένα μέλος των υποδοχέων λεκτίνης τύπου C. Παίζει σημαντικό ρόλο στην αντι-μυκοβακτηριακά και αντι-μυκητιασική ανοσία. Επιπλέον, ανιχνεύει τα νεκρά κύτταρα με πρωτογενή SAP130 συνδέτη του.

Υλικά και Ευρήματα

Εξετάσαμε δέκα urothelial όγκους της ουροδόχου κύστης των βοοειδών. Οκτώ από αυτούς που εκφράζονται Ε5 cDNA ιών θηλώματος βοοειδών τύπου 2 (BPV-2) και τον τύπο 13 (BPV-13) που ανήκουν στο γένος Deltapapillomavirus. Δύο από αυτά δεν εξετάστηκαν για την ανίχνευση της Ε5 cDNA. έκφραση Mincle φάνηκε να συμβεί μόνο σε ουροθηλιακό νεοπλασματικά κύτταρα. Δεν έκφραση mincle ανιχνεύθηκε σε urothelial κύτταρα από υγιή βοοειδή. Mincle έκφραση χαρακτηρίστηκε από μεμβρανώδη μοτίβο σε θηλώδες ουροθηλιακό καρκίνους? απομονωμένες ή /και συγκεντρωμένα ουροφόρων κύτταρα δείχνουν μια ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα παρατηρήθηκαν κυρίως σε επεμβατικές ουροφόρων καρκίνους.

Συμπέρασμα

Αυτή είναι η πρώτη μελέτη για την έκφραση των mincle στην κτηνιατρική ογκολογία και την πρώτη έκθεση η οποία περιγράφει την έκφραση του λειτουργικού υποδοχέα mincle σε νεοπλασματικά κύτταρα στην ιατρική βιβλιογραφία. Όπως έχει δειχθεί ότι urothelial τα καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να λειτουργούν ως κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου (APC), είναι κατανοητό ότι η έκφραση mincle εμπλέκεται στην παρουσίαση αντιγόνων καρκινικών κυττάρων σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Επιπλέον, δεδομένου ότι η έκφραση του mincle συμβάλλει στον έλεγχο του

Mycobacterium bovis BCG

λοίμωξη, αυτή η μελέτη έχει συναρπαστική κλινικές επιπτώσεις στα συγκριτικά φύλαξη ιατρική κατά νου ότι Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ανοσοθεραπεία είναι σήμερα η πιο αποτελεσματική θεραπεία της μη-μυϊκή καρκίνος της ουροδόχου κύστης επεμβατική στον άνθρωπο. Mincle έκφραση σε ουροφόρων καρκινικά κύτταρα εγγυάται την περαιτέρω μελέτη για την καλύτερη κατανόηση του ρόλου, ενδεχομένως, αυτού του υποδοχέα στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Μελλοντικές μελέτες θα προσφέρουν πληροφορίες στο ρόλο του υποδοχέα mincle των ουροφόρων καρκινικών κυττάρων στην αντικαρκινική ανοσοθεραπεία

Παράθεση:. Roperto S, Russo V, Esposito Ι, Ceccarelli DM, Paciello O, Avallone L, et al. (2015) Mincle, μια ανοσοποιητικού Receptor Έμφυτη, εκφράζεται στον Καρκίνο ουροθηλιακά κύτταρα των Θηλωμάτων-Associated ουροθηλιακά όγκοι των βοοειδών. PLoS ONE 10 (10): e0141624. doi: 10.1371 /journal.pone.0141624

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: May 22, 2015? Αποδεκτές: 28 του Σεπτέμβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 29 Οκτωβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Roperto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

υποδοχείς Εισαγωγή

λεκτίνη τύπου C (CLRs) περιλαμβάνουν ένα μεγάλο υπεροικογένεια των πρωτεϊνών που εκφράζονται κυρίως σε μυελοειδή κύτταρα όπου λειτουργεί αποτελεσματικά ως υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRRs) [1]. ΚΕΑ περιλαμβάνουν περισσότερα από χίλια ταυτοποιημένα μέλη από διάφορα ζωικά είδη [2] και πιστεύεται ότι είναι η τέταρτη οικογένεια υποδοχέων μοτίβο αναγνώρισης [3]. CLRs αναγνωρίζει ένα ευρύ φάσμα των υποκαταστατών από «ξένου» (μοριακή μοτίβα-PAMPs παθογόνο που σχετίζεται), «κατεστραμμένα εαυτό» (ζημιές που σχετίζονται με μοριακή μοτίβα-DAMPS) ή «αλλοιωθεί εαυτού» (που σχετίζεται με όγκο μοριακή μοτίβα-tamps) [1 ].

Mincle, μακροφάγων επαγόμενο λεκτίνη τύπου C (που ονομάζεται επίσης ως CLEC4E), είναι μέλος της CLRs. Αρχικά ταυτοποιήθηκε ως ένας μεταγραφικός στόχος του NF-ιντερλευκίνης-6 (IL-6) που εκφράζεται κυρίως σε επαγγελματικά κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου (APC), όπως είναι τα μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα (DCs), Β κύτταρα και τα ουδετερόφιλα [4]. Το επίπεδο έκφρασης της mincle στην κατάσταση σταθερής κατάστασης είναι πολύ χαμηλό? Ωστόσο, είναι έντονα προς τα πάνω ρυθμισμένη μετά την έκθεση σε διαφορετικές φλεγμονώδη σήματα [5]. Mincle φαίνεται να σχετίζεται επιλεκτικά με τον υποδοχέα Fc γάμμα (ΡογΚ) και ενεργοποιεί τα μακροφάγα να παράγουν φλεγμονώδεις κυτοκίνες και χημειοκίνες [6]. Mincle αποτελεί βασικό υποδοχέας για τον διμυκολική τρεαλόζη παράγοντας μυκοβακτηριακά μυελό (TDM) με αποτέλεσμα να είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής του αντιμικροβιακού ανοσίας [7,8]. Mincle έχει έναν κρίσιμο ρόλο στην αντιμυκητιακή ανοσία καθώς αναγνωρίζει κάποια παθογόνους μύκητες όπως

Candida albicans

,

Malassezia

ειδών και

Fonsecaea pedrosoi

, ο αιτιολογικός παράγοντας της χρωμοβλαστομυκητίασης [9 -11]. Επιπλέον, mincle ανιχνεύει τα νεκρά κύτταρα μέσω της πρωτογενούς SAP130 του συνδέτη (σωμάτια συναρμογής που σχετίζεται με πρωτεΐνη 130), ένα μικρό ριβονουκλεοπρωτεΐνης απελευθερώνεται από νεκρωτικό κύτταρα μόνο [6]. Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι η brartemicin φυσικό προϊόν, ένας αναστολέας της εισβολής καρκινικών κυττάρων, είναι ένα υψηλής συνάφειας συνδετήρα του τομέα υδατανθράκων αναγνώρισης (CRD) του υποδοχέα mincle [12].

Mincle βρέθηκε πρόσφατα να εκφράζεται σε μη-άνοσα κύτταρα όπως νευρώνες και ενδοθηλιακά κύτταρα μετά ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο και στα δύο ποντίκια και ανθρώπους? Ως εκ τούτου, έχει προταθεί ότι mincle και SAP130 συνδέτη του συμμετέχουν στην παθογένεση της εγκεφαλικής ισχαιμίας κινώντας φλεγμονής [13, 14].

όγκους της ουροδόχου κύστης είναι πολύ σπάνιες σε βοοειδή που αντιπροσωπεύουν 0,01% του συνόλου των κακοηθειών των βοοειδών [15]. Αντίθετα, νεοπλάσματα της ουροδόχου κύστης είναι κοινές στα ενήλικα βοοειδή που έχουν βόσκουν σε βοσκοτόπια είναι πλούσια σε φτέρη φτέρη (

Pteridium

spp.) [16-19]. Ptaquiloside, μια φτέρη sesquiterpenoid, και μολυσματικών παραγόντων πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για το μετασχηματισμό των κυττάρων της ουροδόχου κύστης. Παρά το γεγονός ότι πολλά βακτήρια έχουν βρεθεί στο μικροχλωρίδα ούρα των ζώων που πλήττονται από όγκους της ουροδόχου κύστης [20], ιοί των ανθρωπίνων θηλωμάτων των βοοειδών (BPVs) της Delta γένους φαίνεται να είναι οι πιο σημαντικές μολυσματικούς παράγοντες που εμπλέκονται στις etio-παθογενετικών μηχανισμών της καρκινογένεσης της ουροδόχου κύστης. Ειδικότερα, βοοειδών θηλωμάτων τύπου 2 (BPV-2) και πληκτρολογήστε 13 (BPV-13) φαίνεται να είναι η επικρατέστερη ιού που είναι υπεύθυνος για την όγκων της ουροδόχου κύστης σε βοοειδή [17, 21-26].

Ο στόχος της η παρούσα εργασία είναι να αναφέρουν την έκφραση του υποδοχέα mincle σε ουροφόρων καρκινικά κύτταρα των φυσικών θηλωμάτων που σχετίζονται με όγκους ουροφόρων στα βοοειδή.

Υλικό και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

αυτή η μελέτη δεν είχαμε εκτελούν πειράματα με ζώα. Συλλέξαμε τα δείγματα απευθείας από ιδιωτικά και δημόσια σφαγεία? τα ζώα θανατώθηκαν μετά από υποχρεωτική κλινική εξέταση πριν από τη σφαγή, όπως απαιτείται από τη νομοθεσία της Ευρωπαϊκής Ένωσης (ΕΕ).

δείγματα όγκων

Δέκα βοοειδών ουροθηλιακά δείγματα όγκων και πέντε δείγματα της ουροδόχου κύστης από φαινομενικά υγιείς αγελάδες ήταν συλλέγονται με την άδεια των ιατρικών αρχών στα σφαγεία που ονομάζεται «Barbara Rocco sas» της Simbario (Καλαβρία Περιφέρεια), «Macello Κομουνάλε» του Muro Lucano (Basilicata Περιφέρεια), «Cestari Carni srl» της Montesano sulla Marcellana (περιφέρεια της Καμπανίας), «Frigo Sud srl» του Nocera Superiore (περιφέρεια της Καμπανίας), «Real srl Beef» της Flumeri (περιφέρεια της Καμπανίας).

Για να αποτρέψετε πιθανή επαναμολύνσεις, τόσο νεοπλασματικά και φυσιολογικά δείγματα της ουροδόχου κύστης αμέσως διαιρείται σε αρκετά μέρη . Μερικά μέρη καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για μεταγενέστερη ανάλυση μοριακής βιολογίας. Τα υπόλοιπα μέρη σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη για μικροσκοπική ερευνών.

Ιστοπαθολογία

Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη ρουτίνας ενσωματωμένο σε κηρό παραφίνης. Ιστολογική διάγνωση αξιολογήθηκε σε 5-μm πάχους αιματοξυλίνη-ηωσίνη (ΗΕ) -stained τμήματα χρησιμοποιώντας μορφολογικά κριτήρια που προτείνονται στην έκθεση για το νέο ιστολογική ταξινόμηση των ουροφόρων όγκων της ουροδόχου κύστης των βοοειδών [19].

RNA

εκχύλιση

Ολικό RNA εξήχθη από ουροδόχους κύστεις των αγελάδων με τη χρήση του RNeasy Mini Kit (Qiagen, Μιλάνο, Ιταλία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσότητα και η ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την NanoVue Plus και ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης 1%. Γενωμικό DNA απομακρύνθηκε από RNA παρασκευάσματα χρησιμοποιώντας RNase-free DNase Ι Fermentas Life Sciences (Dasit, Μιλάνο, Ιταλία).

αντίστροφης μεταγραφής (RT) -PCR για BPV-2, ΒΡν-13 Ε5, Mincle, ΡογΚ και CXCL2

Ολικό RNA μεταγράφηκε χρησιμοποιώντας το iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Μιλάνο, Ιταλία) και η αντίδραση επωάστηκε στους 25 ° C για 5 λεπτά, 42 ° C για 30 λεπτά, 85 ° C για 5 λεπτά, και κατόπιν διατηρήθηκε στους 4 ° C για 5 λεπτά. Το συντεθέν cDNA αναλύθηκε με PCR με ειδικούς εκκινητές για το BPV-2 Ε5 ORF (προς τα εμπρός, 5′-CACTGCCATTTGTTTTTTTC-3 ‘? Αντίστροφη, 5′-GGAGCACTCAAAATGATCCC-3’), για την BPV-13 Ε5 ORF (προς τα εμπρός, 5 «- CACTGCCATTTGGTGTTCTT-3 ‘? αντίστροφη 5′-AGCAGTCAAAATGATCCCAA-3′), για Mincle (πρόσθιος εκκινητής, 5’-GACTGAGGGTCAGTGGCAAT -3 ‘? αντίστροφος εκκινητής, 5′-GTCCCTTATGGTGGCACAGT-3’), για ΡογΚ (προς τα εμπρός, 5 ‘ – TTTGGTTGAACAAGCAGCGG-3 ‘? αντίστροφη 5′-TGCAACTTGAGTCGGCAGTA -3′) και για CXCL2 (προς τα εμπρός, 5’-GCCGCTCCCATGGTTAAGAA-3 ‘? αντίστροφη 5′-TCTGTAGGGGCAGGGTCTAC -3′). Για να αξιολογηθεί η καταλληλότητα των δειγμάτων cDNA, ένας έλεγχος PCR για τα βοοειδή β-ακτίνη αλληλουχία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα σύνολο εκκινητών σχεδιάστηκε από Primer λογισμικό BLAST (προς τα εμπρός, 5’-GAGCGTGGCTACAGCTTCAC-3 ‘? Αντίστροφη, 5′-CATTGCCGATGGTGATGA-3’ ). Η RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα μίγμα αντίδρασης 25 μL που περιέχει 2,5 μί ρυθμιστικού διαλύματος 10 Χ, 2 mM MgCl

2, 2.5 U AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Life Technologies, Μόντσα, Ιταλία), 480 ηΜ του κάθε εκκινητή και 200 mM από κάθε dNTP και 50 ng εκχύλισμα DNA. Το πρόγραμμα PCR ήταν 95 ° C για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους αποδιάταξης στους 95 ° C για 30 s, ανασύνδεση στους 60 ° C για 30 s και επέκταση στους 72 ° C για 1 λεπτό. Ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 72 ° C για 7 λεπτά διεξήχθη σε κάθε δοκιμασία PCR. Ηλεκτροφόρηση πηκτής του 20 μί ενισχυμένου DNA κατέδειξε ένα προϊόν του αναμενόμενου μεγέθους. Σε κάθε πείραμα, συμπεριλήφθηκε ένα τυφλό δείγμα που αποτελείται από μείγμα αντίδρασης χωρίς DNA. Όσον αφορά BPV Ε5 cDNA ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν ένα θετικό δείγμα που αποτελείται από κλωνοποιημένα BPV-2 (ένα ευγενές δώρο από τον Dr. Α Venuti) και ένα θετικό δείγμα BPV-13 (ένα είδος δώρο από τον Dr Α Α Alfieri). Ενισχυμένο DNA καθαρίστηκε μέσω μεμβρανών σίλικαζελ με χρήση του κιτ QIAquick ποσοτικοποίηση PCR σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Qiagen, Μιλάνο, Ιταλία). Τα προϊόντα RT-PCR, μετά από διαχωρισμό με ηλεκτροφόρηση γέλης, υποβλήθηκαν σε αλληλούχιση χρησιμοποιώντας αυτόματο αλληλουχητή Sanger μέθοδος που βασίζεται (ΑΒΙ PRISM 3100 Genetic Analyzer, Life Technologies, Μόντσα, Ιταλία). Επιπλέον, το ενισχυμένο DNA Mincle από υγιείς και παθολογικές κύστεις κλωνοποιήθηκε σε φορέα ρΟΕΜ-Τ με τη χρήση του Easy Vector System ρΟΕΜ-Τ (Promega, Μιλάνο, Ιταλία) και προσδιορίστηκε η αλληλουχία στο αυτοματοποιημένη συσκευή (ΑΒΙ PRISM 3100 Genetic Analyzer, Life Technologies).

η ποσοτική ανάλυση πραγματικού χρόνου-PCR (qRT-PCR) για Mincle

για ανάλυση qRT-PCR, 500 ng ΚΝΑ μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Μιλάνο , Ιταλία) και η αντίδραση επωάστηκε στους 25 ° C για 5 λεπτά, 42 ° C για 30 λεπτά, 85 ° C για 5 λεπτά, και κατόπιν διατηρήθηκε στους 4 ° C για 5 λεπτά. Πραγματικές αντιδράσεις Ώρα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Μιλάνο, Ιταλία). Για την ανίχνευση των ειδικών εκκινητών Mincle (όπως περιγράφηκε παραπάνω) χρησιμοποιήθηκαν. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο (εμπρόσθιος εκκινητής 5′-TAGCACAGGCCTCTCGCCTTCG-3 ‘? Αντίστροφος εκκινητής 5′-GCACATGCCGGAGCCGTTGT-3’)

ανάλυση Western blot σε δείγματα της ουροδόχου κύστης. για πρωτεΐνη mincle

υγιών και ασθενών κύστεις διαλυτοποιήθηκαν για 2 ώρες στους 4 ° C σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100. Αμέσως πριν από τη χρήση, προστέθηκαν τα ακόλουθα αντιδραστήρια: 1 mM DTT, 2 mM PMSF, 1.7 mg /ml απροτινίνη, 25 mM NaF, 1 mM Na

3νο

4 (Sigma-Aldrich, Μιλάνο, Ιταλία).

τα λύματα διευκρινιστεί σε 15000 rpm για 30 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad Laboratories, Μιλάνο, Ιταλία). Για στύπωμα Western, 100 μα πρωτεϊνών κυτταρολύματος θερμάνθηκαν στους 100 ° C σε 4Χ Laemmli προαναμιγνύονται ρυθμιστικό δείγματος (Bio-Rad Laboratories, Μιλάνο, Ιταλία). Οι πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλ θειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) κάτω από αναγωγικές συνθήκες.

Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες ηθμού νιτροκυτταρίνης (GE Healthcare Life Sciences, Chalfont St Giles, UK) για 1 ώρα σε 10 V σε 192 mM γλυκίνη /25 mM Tris-HCl (ρΗ 7,5) /10% μεθανόλη χρησιμοποιώντας ένα Trans-Blot SD Semi ξηρό κύτταρο (Bio-Rad Laboratories, Μιλάνο, Ιταλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με αλβουμίνη 5% βόειου ορού (BSA) σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS, ρΗ 7.5) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκε με TBS-0.1% Tween. Στη συνέχεια, τα φίλτρα ανιχνεύθηκαν με αντι-Mincle (CLEC4E (Ρ-15): SC-161486, (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) αραιωμένο 1: 1000 σε 5% BSA για μια ολονύκτια επώαση στους 4 ° C Μετά από τρεις πλύσεις. σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα, μεμβράνες επωάστηκαν με συζευγμένη με ραφανιδική υπεροξειδάση αντι-κατσίκας IgG (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από κατάλληλα στάδια έκπλυσης, συνδεδεμένο αντίσωμα οπτικοποιήθηκε με ένα σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Δυτική Λεκιάζοντας Αντιδραστήριο λουμινόλη, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). οι εικόνες ελήφθησαν με την έκδοση Εργαστήριο Εικόνα Λογισμικό 2.0.1 (Bio-Rad Laboratories, Μιλάνο, Ιταλία).

Η ανοσοϊστοχημεία

Όλα τα παθολογικά δείγματα ανοσοχρωματίστηκαν και τομές φυσιολογικού βόειου ουροδόχου βλεννογόνο κύστη ελέγχθηκαν παραλλήλως ως έλεγχος με τη χρήση της μεθόδου αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (ABC) με το κιτ Vectastain ABC (Vector Laboratories, Inc., CA, USA). εν συντομία, τομές παραφίνης αποπαραφινοποιήθηκαν, και αποκλείστηκαν για ενδογενούς υπεροξειδάσης σε 0,3% Η

2O

2 σε μεθανόλη για 20 λεπτά. Το αντιγόνο ενίσχυση διεξήχθη με προκατεργασία με θέρμανση με μικροκύματα (δύο φορές για 5 λεπτά η κάθε μία 750 W) σε κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 6,0. Τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS? ΡΗ 7,4, 0,01 Μ), στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με φυσιολογικό ορό κουνελιού (Vector Laboratories Inc., CA, USA) αραιωμένο σε 20%. Πολυκλωνικά αντι-CLEC 4Ε, αντι-Fc ε RIγ, αντι-Card9 και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-δγκ (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA) πρωτογενή αντισώματα αραιωμένα σε 1 στα 200, 1 σε 400, 1 στα 300 και 1 σε 50, αντίστοιχα, σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), εφαρμόστηκαν για όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου σε υγρό θάλαμο. Τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, μετά επωάστηκαν για 30 λεπτά με τις κατάλληλες βιοτινυλιωμένο αντι-κατσίκας δευτερογενές αντίσωμα (Vector Laboratories Inc., CA, USA) σε αραίωση 1 σε 200 σε PBS. Τα τμήματα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και μετά επωάστηκαν με αντιδραστήριο Vectastain ABC (Vector Laboratories Inc., CA, USA) σε έναν υγρό θάλαμο σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανάπτυξη του χρώματος ελήφθη με κατεργασία με 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη (Vector Laboratories Inc., CA, USA) για 2-10 λεπτά. Τα τμήματα βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη Mayer του. Το πρωτογενές αντίσωμα παραλείφθηκε και αντικαταστάθηκε από αραιωτικό αντισωμάτων σε αρνητικούς ελέγχους στα οποία ανιχνεύθηκε καμία χρώση φόντο.

Αποτελέσματα

Όπως άκαρπη λοιμώξεις του BPV-2 και BPV-13 συνήθως σχετίζεται με ουροφόρων όγκοι της ουροδόχου κύστης των βοοειδών, πρώτον, μελετήσαμε εάν μεταγραφές του Ε5 πρωτεΐνης, τον ιό μείζονος ογκοπρωτεΐνη, ήταν παρόντες στους όγκους. RT-PCR έδειξε αμφότερες τις BPV-2 και BPV-13 Ε5 μεταγραφές σε μόνο καρκινικά κύτταρα? Δεν μεταγραφές E5 ανιχνεύθηκαν σε υγιή δείγματα της ουροδόχου κύστης. Η παρουσία του BPV-2 και BPV-13 Ε5 RNA επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση του αμπλικονίων σύμφωνα με BPV-2 M20219.1 ακολουθία και να BPV-13 JQ798171.1 αλληλουχίας (Σχήματα 1 και 2). Μικροσκοπικά πρότυπα ουροθηλιακά καρκίνων και ανίχνευση των μεταγραφημάτων Ε5 θηλώματος συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Αξιολόγηση του BPV-2 Ε5 cDNA με αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφάσης (RT-PCR). Μ: 50 bp μοριακό δείκτη (HyperLadder II Bioline)? 2-3: υγιή δείγματα ουροδόχου κύστης? 4-6: δείγματα όγκων της ουροδόχου κύστης? 7: θετικός έλεγχος (κλωνοποιημένο BPV-2 DNA)? 8: αρνητικός έλεγχος (όχι DNA προστεθεί). Το βέλος δείχνει την θέση του 154 bp BPV-2 E5 προϊόν PCR.

Η

Αξιολόγηση της BPV-13 Ε5 cDNA με αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφάσης (RT-PCR). Μ: 50 bp μοριακό δείκτη (HyperLadder II Bioline)? 2-3: υγιή δείγματα ουροδόχου κύστης? 4-6: δείγματα όγκων της ουροδόχου κύστης? 7: θετικός έλεγχος (BPV-13 DNA)? 8: αρνητικός έλεγχος (όχι DNA προστεθεί). Το βέλος δείχνει τη θέση του 153 bp BPV-13 Ε5 PCR προϊόν

Η

Mincle πρωτεΐνης αποκαλύφθηκε τόσο σε υγιή και παθολογικά δείγματα από την έρευνα κηλίδος western.? η πρωτεΐνη φάνηκε να υπερεκφράζεται σε δείγματα όγκων συγκριτικά με τα υγιή δείγματα (Σχήμα 3). RT-PCR αποκάλυψε την παρουσία μεταγραφημάτων mincle τόσο υπό κανονικές συνθήκες και τον καρκίνο δείγματα. Μετά την κλωνοποίηση και αλληλούχιση, μεταγραφές mincle έδειξε 98% και 99% ταυτότητα, αντιστοίχως, με Bos taurus γονίδιο mincle κατατεθεί σε GenBank υπό τον αριθμό πρόσβασης XM_010827920.1 (Σχήμα 4). qRT-PCR ανίχνευσε μια στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων mRNA mincle σε παθολογικές δείγματα (Σχήμα 5).

(x) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει μια στατιστικά σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης σε Mincle κύστεις όγκου. Οι διαδρομές 1-3: ουροδόχο κύστη από υγιή ζώα. Λωρίδες 4-6: νεοπλασματικό ιστό από αντιπροσωπευτικές τρία ζώα με θηλωματοϊό τους όγκοι της ουροδόχου κύστης. Ακτίνης επίπεδα πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν να εξασφαλιστεί η ίση πρωτεΐνη φόρτωσης. (Y) Ποσοτική πυκνομετρική ανάλυση των φίλτρων πραγματοποιήθηκε με λογισμικό Lab εικόνας (ChemiDoc? Bio-Rad Laboratories) και προσδιορίστηκε η σημασία από το T-test Student (*, p ≤ 0,05)

Η

Lane. Μ, Μοριακή δείκτης μάζας (DNA Ladder 1 kb, Microtech). Λωρίδες 2-4: Τέσσερις φυσιολογικό (έλεγχος) δείγματα από υγιείς βοοειδή. Λωρίδες 5-7: εννέα αντιπροσωπευτικά δείγματα όγκων. Λωρίδα 8: αρνητικός έλεγχος (όχι DNA προστεθεί). Τα άνω και κάτω τμήματα του σχήματος δείχνουν 99% και 98% ομολογία, αντίστοιχα, μεταξύ της αλληλουχίας των αμπλικονίων, μετά την κλωνοποίηση και η αλληλουχία του βόειου MINCLE κατατεθεί στην GenBank (XM_010827920.1).

Η

Η σχετική έκφραση των επιπέδων MINCLE σε νεοπλαστικούς ιστούς. Σχετικά επίπεδα mRNA, που υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCT, αντιπροσωπεύουν φορές οι αλλαγές σε σύγκριση με τα δείγματα της ουροδόχου κύστης από υγιή βοοειδή. Όλες οι τιμές ομαλοποιήθηκαν για τον εσωτερικό έλεγχο της β-ακτίνης. Αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. (*, P ≤ 0,05, εναντίον της ουροδόχου κύστης από υγιή ζώα).

Η

Μορφολογικά, πρωτεΐνη mincle ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημική διαδικασιών σε ουροφόρων καρκινικά κύτταρα και όχι σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ουροδόχου κύστης. Ένα μεμβρανώδη πρότυπο mincle ανοσοαντιδραστικότητα παρατηρήθηκε σε νεοπλασματικά κύτταρα τόσο χαμηλής και υψηλής ποιότητας θηλώδεις urothelial όγκοι (Σχήμα 6)? Επιπλέον, διάσπαρτα και συγκεντρωμένα νεοπλασματικά κύτταρα ουροφόρων τόσο χαμηλής και υψηλής ποιότητας επεμβατική ουροφόρων καρκίνο έδειξε μια ισχυρή ανοσολογική αντίδραση για mincle, κατά κύριο λόγο σε ένα κυτταροπλασματικό εμφάνιση μοτίβο. έκφραση Mincle ανιχνεύθηκε επίσης σε φλεγμονώδη κύτταρα διάσπαρτα ανάμεσα καρκινικά κύτταρα? ειδικότερα, η έκφραση του υποδοχέα παρατηρήθηκε σε μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) (Εικόνα 7).

Ένα μεμβρανώδη πρότυπο έκφρασης mincle παρατηρήθηκε σε ενδοαυλικό urothelial τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (βέλη). Ένθετο: Μη ανοσοαντιδραστικότητα παρατηρήθηκε σε φυσιολογικά ουροθηλιακό κύτταρα. Mag. 40Χ? Bar:. 100 μm

Η

συμπλέγματος των νεοπλασματικών κυττάρων έδειξαν μια ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα για mincle (μαύρα βέλη). Απομονωμένες ανοσοαντιδραστικές νεοπλασματικών κυττάρων παρατηρήθηκαν επίσης διάσπαρτα σε τοίχωμα της ουροδόχου κύστης. Ανοσολογική αντίδραση ήταν επίσης εμφανής σε μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) (κόκκινο βέλος). Mag. 40X. Bar: 100 μm

Η

Είναι γνωστό ότι Mincle συνεργάτες με την πρωτεΐνη προσαρμογέα ΡογΚ που απαιτείται για την έναρξη της σηματοδότησης μέσω δέσμευσης Syk η οποία, με τη σειρά του, ενεργοποιεί έναν καταρράκτη σηματοδότησης μέσω Card9 και αυτό οδηγεί συμβάν. στην επαγωγή κυτοκίνης και χημειοκίνης όπως CXCL2 [5, 6]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την έκφραση ΡογΚ mRNA τόσο σε φυσιολογικές και παθολογικές δείγματα της ουροδόχου κύστης με RT-PCR. Αμπλικόνια, αλληλούχιση του οποίου αποκαλύπτεται για να είναι ΡογΚ μεταγραφές που δείχνει μία ταυτότητα 97% με Bos taurus ΡεγΚΙ (αριθμός πρόσβασης GenBank: AF316499.1), ανιχνεύθηκαν σε δείγματα μόνο του καρκίνου (Σχήμα 8). Μορφολογικά, μια ισχυρή κυτταροπλασματική και μεμβρανώδη ανοσοαντιδραστικότητα αποκαλύπτοντας ένα μη αναμενόμενο, παρεκκλίνουσα έκφραση του ΡογΚΙ ήταν εμφανής σε urothelial καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 9). Στη συνέχεια, διερευνήσαμε κατά πόσον μια μορφολογική έκφραση του άξονα Syk-Card9 μπορούσε να ανιχνευθεί σε urothelial κύτταρα των υγιών και νεοπλαστικών δείγματα. Μια ισχυρή ανοσοαντιδραστικότητα αποκαλύπτοντας μια εμφανή έκφραση Syk ήταν σαφώς ανιχνεύθηκαν σε μόνο urothelial καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 10). Περαιτέρω, επίσης η έκφραση της πρωτεΐνης Card9 ήταν ανοσοϊστοχημικά φαίνεται στο ουροθηλιακό καρκινικά κύτταρα. Αριθ ανοσοαντιδραστικότητα για Card9 ήταν πρόδηλη σε urothelial κύτταρα των υγιών δειγμάτων (Σχήμα 11).

Εκτίμηση της έκφρασης mRNA ΡογΚ με αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφάσης (RT-PCR). Μ: μοριακό δείκτη (HyperLadder II Bioline)? 2-4: υγιή δείγματα ουροδόχου κύστης? 5-7: δείγματα όγκων της ουροδόχου κύστης? 8: αρνητικός έλεγχος (όχι DNA προστεθεί). Το κάτω μέρος του σχήματος δείχνει μια ταυτότητα 97% με Bos taurus FcγR1 (αριθμός πρόσβασης GenBank: AF316499.1).

Η

Μια ισχυρή κυτταροπλασματική και μεμβρανώδη ανοσολογική αντίδραση που δείχνει μια παρεκκλίνουσα έκφραση ΓογΚ παρατηρήθηκε σε ουροθηλιακό καρκινικά κύτταρα. Ένθετο: έκφραση Δεν ΡογΚ ανιχνεύθηκε σε κανονικό ουροθηλιακό κύτταρα. Mag. 40Χ? Bar: 100 μm

Η

Μια ισχυρή ανοσολογική αντίδραση που δείχνει μια προφανή έκφραση της Syk παρατηρήθηκε σε ουροφόρων καρκινικά κύτταρα.. Ένθετο: Όχι ανοσοαντιδραστικότητα για Syk ανιχνεύθηκε σε κανονικό ουροθηλιακό κύτταρα. Mag. 40Χ? Bar:. 100 μm

Η

Μια ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσολογική αντίδραση που δείχνει μια σαφή έκφραση της Card9 παρατηρήθηκε σε ουροφόρων καρκινικά κύτταρα. Ένθετο: Όχι ανοσοαντιδραστικότητα για Card9 παρατηρήθηκε σε φυσιολογικά ουροθηλιακό κύτταρα. Mag. 40Χ? Bar:. 100 μm

Η

Τέλος, μελετήσαμε την έκφραση του mRNA της CXCL2, ένα προ-φλεγμονωδών χημειοκινών. RT-PCR αποκάλυψε παρουσία cDNA σε μόνο δείγματα καρκίνου? ακολουθίες που λαμβάνονται από τα αμπλικόνια επιβεβαίωσε ότι είναι μεταγραφές CXCL2 η οποία έδειξε μια ταυτότητα 98% με Bos taurus CXCL2 (αριθμός πρόσβασης GenBank: NM_174299.3). (Σχήμα 12)

Η αξιολόγηση της έκφρασης CXCL2 mnRNA από αλυσίδας πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης αντίδραση (RT-PCR). Μ: μοριακό δείκτη (HyperLadder II Bioline)? 2-4: υγιή δείγματα ουροδόχου κύστης? 5-7: δείγματα όγκων της ουροδόχου κύστης? 8: αρνητικός έλεγχος (όχι DNA προστεθεί). Το κάτω μέρος του σχήματος δείχνει μία ταυτότητα 98% με Bos taurus CXCL2 (αριθμός πρόσβασης GenBank: NM_1742993).

Η

Συζήτηση

Διαπιστώσαμε mincle έκφραση σε θηλωμάτων που σχετίζονται με όγκους ουροφόρων της η ουροδόχος κύστη σε βοοειδή. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση της έκφρασης mincle στην κτηνιατρική ογκολογία και την πρώτη παρατήρηση που περιγράφει την έκφραση του λειτουργικού υποδοχέα mincle σε νεοπλασματικά κύτταρα στην ιατρική βιβλιογραφία. Μορφολογικά, mincle πρωτεΐνη παρατηρήθηκε σε urothelial νεοπλασματικά κύτταρα μόνο, αλλά όχι σε φυσιολογικά ουροθηλιακό κύτταρα, τα οποία ενδέχεται να σημαίνει ότι το επίπεδο της έκφρασης mincle είναι τόσο χαμηλό σε σταθερή κατάσταση κατάσταση ώστε να μην ανιχνεύεται από ανοσοϊστοχημικές διαδικασίες. Εμείς δεν αποκλείουν ότι mincle ανιχνευθεί σε υγιή ουροδόχου κύστης προέρχεται από σμήνη των λεμφικών και μακροφάγα κύτταρα που συνήθως υπάρχουν στο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης των υγιών αγελάδων.

Είναι πιθανό ότι γονιδιωματικής μεταβολές που οδηγούν σε απορύθμιση ορισμένων γονιδίων CLR μπορεί να είναι υπεύθυνη για mincle καθώς και έκφραση ΡογΚΙ σε urothelial καρκινικά κύτταρα? Είναι επίσης κατανοητό ότι mincle έκφραση θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί από κάποια ενδογενή προσδέματα επειδή πολλές νεκρωτικές εστίες, που μπορούν να προκαλέσουν την απελευθέρωση του αυτο-συστατικά εμφανίζονται σε urothelial όγκους της ουροδόχου κύστης των βοοειδών. Ως εκ τούτου, mincle μπορεί να εμπλέκεται στην επαγωγή ενός προ-φλεγμονώδη απόκριση μετά την ανίχνευση συστατικών που απελευθερώνεται από τα νεκρά κύτταρα. Σύμφωνα με Suzuki et al. [13], πολλοί ενδογενείς συνδέτες για υποδοχέα mincle εξακολουθούν να αναγνωρίζονται.

Έχει προταθεί ότι urothelial κύτταρα (συμπεριλαμβανομένων της κύστης οι ίδιοι τα καρκινικά κύτταρα) είναι ικανά να παράγουν κυτοκίνες και χημειοκίνη και εμπλέκονται στην παρουσίαση του καρκινικό κύτταρο αντιγόνων σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος [27]. Πράγματι, ορισμένοι υποδοχείς χημειοκινών έχουν ανιχνευθεί σε urothelial καρκινικά κύτταρα [28]. Πρόσφατα, κάποιοι συνδέτες για υποδοχείς χημειοκινών CXCR4 και CXCR7, έχουν βρεθεί ότι εκκρίνονται από ουροθηλιακό καρκίνο του ανθρώπινου ουροδόχου κύστης [29]. Ως εκ τούτου, έχει προταθεί ότι urothelial τα καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να λειτουργούν ως κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου (APC). Αυτή η ικανότητα φαίνεται να είναι κλινικά σημαντική, δεδομένου ότι θα επηρεάσει υποτροπή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [30].

Αν και mincle έκφραση σε ουροφόρων καρκινικά κύτταρα εγγυάται περαιτέρω μελέτη για να κατανοήσουν το ρόλο αυτού του υποδοχέα στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης καλύτερα, αυτή η έκθεση έχει συναρπαστικό κλινικές επιπτώσεις στο συγκριτικό φάρμακο. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ανοσοθεραπεία είναι σήμερα η πιο αποτελεσματική θεραπεία της μη-επεμβατική μυός καρκίνο της ουροδόχου κύστης στον άνθρωπο [31]. Αν και BCG έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης για σχεδόν 40 χρόνια, ο τρόπος με τον οποίο επιτυγχάνει θεραπευτικό αποτέλεσμα της παραμένει ένα θέμα έρευνας [27]. Έχει αποδειχθεί ότι ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης κυτταρικές γραμμές είναι σε θέση να εσωτερικεύουν BCG [32]. Έχει υποτεθεί ότι η εσωτερίκευση του BCG από καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης διέπεται από την παρουσία ορισμένων άγνωστη ογκογόνους εκτροπές που ενεργοποιούν μακροπινοκυττάρωσης [27]. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα όγκου κύστης μπορεί να έχει κάποιο ρόλο στην αρχική αναγνώριση και την επεξεργασία των BCG, οδηγώντας σε ανοσοποιητικό σύστημα πρόσληψης? Ωστόσο, παθογενετικός μηχανισμός (ες) πρέπει να διασαφηνιστεί [27]. Οι Τοίΐ υποδοχέων έχουν βρεθεί σε καλλιεργημένα φυσιολογικά και ουροθηλιακά καρκινικά κύτταρα και θα μπορούσε να έχει ένα ρόλο στην ανοσία κατά του όγκου των nonmuscle επεμβατική όγκων [33].

Πολλά ερωτήματα παραμένουν ακόμα αναπάντητα και πολλές περιοχές απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση, όπως μελέτες έχουν δεν έχει ακόμα αξιολογηθεί ο ρόλος της εσωτερίκευσης του BCG με καρκινικά κύτταρα κύστης

in vivo

[27]. Η μελέτη μας μας επιτρέπει να υποθέσουμε ότι το λειτουργικό υποδοχέα mincle νεοπλασματικών ουροθηλιακά κύτταρα μπορούν να έχουν καθοριστικό ρόλο στην αναγνώριση και εσωτερίκευσης BCG. Η πρότασή μας φαίνεται να επιβεβαιώνεται από τις πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν ότι η έκφραση της mincle συμβάλλει στον έλεγχο του

Mycobacterium bovis BCG

μόλυνση [34].

ελπίζουμε Μελλοντικές μελέτες θα είναι πολύ χρήσιμο να παρέχει γνώσεις σε ο ρόλος του υποδοχέα mincle των ουροφόρων καρκινικών κυττάρων στην αντικαρκινική ανοσοθεραπεία. Σε αυτό το πλαίσιο, ο υποδοχέας mincle μπορεί να ερευνηθεί σε βάθος σε φυσικώς ενυπάρχοντα βοοειδών urothelial όγκους και τα βοοειδή μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα φυσικό ζωικό μοντέλο. Έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει ένας υψηλός βαθμός ταυτότητας αλληλουχίας μεταξύ της μορφής του ανθρώπου και των βοοειδών mincle και που αλληλεπιδρούν με συνδεσμικά σε ένα πολύ παρόμοιο τρόπο [35].

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Σχ. αλληλουχίας S1 μετά την κλωνοποίηση της Mincle από ρείκια δείγματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0141624.s001

(PDF)

S2 Εικ. αλληλουχίας S2 μετά την κλωνοποίηση της Mincle από παθολογικά δείγματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0141624.s002

(PDF)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Καθηγητής Α Venuti , Istituto dei Tumori «Regina Elena», Ρομά, για να δοθεί το πλασμίδιο DNA BPV-2? Καθ Α.Α. Alfieri, Εργαστήριο Ιολογίας Ζώων, Τμήμα Κτηνιατρικής Προληπτικής Ιατρικής, Universidade Estadual de Londrina, Βραζιλία για την παροχή των BPV 13-δείγματα DNA-απόκρυψης και της Δρ Γ Salvatore, Regione Basilicata, και ο Δρ Φ Luposella για την τεχνική βοήθειά τους.