Αφηρημένο

κινάσες θυμιδίνης (ΤΚ) έχουν θεωρηθεί ένας από τους πιθανούς στόχοι για αντικαρκινικές θεραπευτικές λόγω των αυξημένων εκφράσεις τους σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, νουκλεοβάση ανάλογα στόχευσης ΤΚ έχουν δείξει φτωχή εκλεκτική κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα παρά αποτελεσματική αντι-ιική δράση. 3′-δεοξυθυμιδίνη συζυγούς φαινυλοκινοξαλινο (άΤ-QX) σχεδιάστηκε ως νέο ανάλογο νουκλεοβάσης να στοχεύουν ΤΚ σε καρκινικά κύτταρα και αντιγραφή μπλοκ κύτταρο μέσω συζευγμένο ήμισυ κινοξαλίνη παρεμβολής DNA. In vitro διαλογή κυττάρων έδειξε ότι η DT-QX σκοτώνει επιλεκτικά μία ποικιλία καρκινικών κυττάρων συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του ήπατος, αδενοκαρκινώματος μαστού και του εγκεφάλου γλοιώματος κύτταρα? ενώ είχε χαμηλή κυτταροτοξικότητα σε φυσιολογικά κύτταρα όπως τα φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπινου ήπατος. Η αντικαρκινική δράση του DT-QX αποδόθηκε στην επιλεκτική αναστολή της σύνθεσης του DNA με αποτέλεσμα εκτεταμένη μιτοχονδριακή σουπεροξειδίου στρες στα καρκινικά κύτταρα. Έχουμε αποδείξει ότι η ομοιοπολική σύνδεση με 3′-δεοξυθυμιδίνη ήμισυ μοναδικά κατευθύνονται κυτταροτοξικά φαινυλοκινοξαλινο περισσότερο προς τα καρκινικά κύτταρα από τα φυσιολογικά κύτταρα. Προκαταρκτική μελέτη ποντικού με μοντέλο όγκου υποδόρια ήπατος έδειξαν ότι dT-QX ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των όγκων. dT-QX είναι το πρώτο μόριο του είδους με ιδιαίτερα τροποποιήσιμα συστατικά που παρουσιάζει αυτή η επιλεκτική κυτταροτοξικότητα στα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Wei Q, Zhang D, Yao Α, Μάι L, Zhang Ζ, Zhou Q (2012 ) Σχεδιασμός, Synthesis, και in vitro και in νίνο βιολογική Μελέτες ενός 3′-δεοξυθυμιδίνη συζεύγματος που σκοτώνει Δυνητικά Τα καρκινικά κύτταρα επιλεκτικά. PLoS ONE 7 (12): e52199. doi: 10.1371 /journal.pone.0052199

Επιμέλεια: Kamyar Afarinkia, Πανεπιστήμιο του Μπράντφορντ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 2, Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 12 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Δεκ 2012

Copyright: © 2012 ZHOU et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (2011CB933100), τα Θεμελιώδη Κονδυλίων Έρευνας για την κεντρική πανεπιστήμια (HUST: 2010ZD023), και τα σημαντικά National Science & amp? Τεχνολογία Ειδικά Έργα (2009ZX09301-014). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

με καρκίνους είναι η κύρια αιτία θανάτου σε παγκόσμιο επίπεδο, την ανάπτυξη ασφαλών και αποτελεσματικών αντικαρκινικών παραγόντων παραμένει σε επείγουσα ανάγκη. Μοριακά στοχευμένη θεραπεία ήταν η πρόσφατη επίκεντρο για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων, όπως φαίνεται στο παράδειγμα του Sorafenib [1], [2]. Sorafenib είναι ένας αναστολέας της κινάσης της τυροσίνης πολλαπλών που μπορούν δυνητικά να ελαχιστοποιούνται οι αρνητικές επιδράσεις όπως ηπατοτοξικότητα που προκαλείται από άλλα αντικαρκινικά φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων των 5-φθοριοουρακίλη και δοξορουβικίνη [3], [4]. Παρόμοια με κινάσες τυροσίνης, οι κινάσες θυμιδίνης (ΤΚ) έχουν θεωρηθεί ένας άλλος δυνητικός αντικαρκινικός στόχος [5] – [8]. ΤΚ είναι τα πρώτα ένζυμα φωσφορυλίωσης στην οδό θυμιδίνης διάσωσης μετατροπή θυμιδίνης σε μορφή 5′-φωσφορικής της για τη σύνθεση του DNA. Σε φυσιολογικά κύτταρα θηλαστικών, κυτοσολικά ΤΚ είναι παρόντα μόνο σε χαμηλό επίπεδο στη φάση S των κυττάρων? ενώ έχουν παρατηρηθεί αυξημένα επίπεδα ΤΚ σε κύτταρα μολυσμένα με ιό και ταχέως πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα [5] – [8]., π.χ., όγκους του πνεύμονα και τους ιστούς του καρκίνου του μαστού [9], [10]

νουκλεοτιδικών βάσεων αναλόγων στόχευσης ΤΚ όπως το ΑΖΤ και την ακυκλοβίρη έχει αποδειχθεί αποτελεσματική αντιϊκή δραστηριότητα [11], [12]. Ωστόσο, η κακή καρκίνο επιλεκτικότητα και ισχυρή παρενέργειες έχουν συσχετιστεί με αναλόγων νουκλεοβάσεων συμπεριλαμβανομένων νετρονίων παράγοντα σύλληψης 5-θυμιδίνης συζυγούς βόριο και ραδιοϊσοτοπική ιωδιωμένα δεοξυουριδίνη [13], [14]. Πρόσφατα, μια θεραπεία συνδυασμού χρησιμοποιώντας predelivered κινάσης θυμιδίνης ακολουθούμενο από αναλόγων νουκλεοβάσεων έχει διερευνηθεί σε ασθενείς από καρκίνο του ήπατος με περιορισμένη αποτελέσματα που επιτυγχάνονται [15]. Αυτό είναι πιθανό να οφείλεται στην εν λόγω ΤΚ προσανατολισμένη αναλόγων νουκλεοβάσεων όπως ΑΖΤ απομακρύνονται γρήγορα με διαδικασίες επιδιόρθωσης νουκλεοβάσεων μετά ενσωματώνονται στη σύνθεση του DNA των καρκινικών κυττάρων μέσω της οδού διάσωσης θυμιδίνης [16] – [18]. Η 5-φθοροουρακίλη, ένα άλλο ανάλογο θυμίνη, είναι ένας διυδροφολική αναστολέα αναγωγάσης και προκαλεί άμεσα κυτταροτοξικότητα σε φυσιολογικά ηπατοκύτταρα [3], [19]. Κατά συνέπεια, χρειάζεται εναλλακτική σχεδίαση περισσότερο αποτελεσματικών αναλόγων νουκλεοβάσεων στόχευση ΤΚ.

Αναφέρουμε εδώ ένα νέο 3′-δεοξυθυμιδίνη συζυγούς φαινυλοκινοξαλινο (dT-QX, Εικόνα 1) που σκοτώνει επιλεκτικά μία ποικιλία καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι φυσιολογικά ηπατοκύτταρα. Δομικά, dT-QX είναι ένα 3′-τριαζολο-3′-δεοξυθυμιδίνη συνδεδεμένο με μία μερίδα κινοξαλίνη παρεμβολής DNA. dT-QX σχεδιάστηκε για να στοχεύουν το μονοπάτι θυμιδίνης διάσωσης βασίζεται στο γεγονός ότι οι 3′-τριαζολίου θυμιδίνης που αναγνωρίζονται από ανθρώπινα κινάσες θυμίνη [20], [21]. Ο σκοπός της προσθήκης του ημίσεως κινοξαλίνης σε δομή dT-QX ήταν να εμποδίσει την κυτταρική απομάκρυνση των αναλόγων θυμιδίνης [16] – [18] μέσω DNA παρεμβολή στη σύνθεση του DNA των καρκινικών κυττάρων, επειδή ήμισυ κινοξαλίνη είναι ένας γνωστός παράγοντας παρεμβολής του DNA [22]. Επιπλέον, η δομή κινοξαλίνης μπορούν να συντεθούν εύκολα με ένα βήμα συμπύκνωσης μιας ένωσης δικετόνης 1 [23] και ένα ορθο-φαινυλενοδιαμίνης (Σχήμα 1). Το πιο σημαντικό, η δομή κινοξαλίνης είναι ιδιαίτερα τροποποιήσιμα για χημικές τροποποιήσεις με μια ποικιλία υποκαταστατών για την προηγμένη μελέτη δομής-δραστικότητας για τη βελτιστοποίηση του δυναμικού βιολογική δραστικότητα. Η αντικαρκινική δράση του DT-QX στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πάνελ καρκινικών κυττάρων. Οι επιδράσεις του DT-QX για αναστολή της σύνθεσης του DNA και επάγουν κυτταρικό οξειδωτικό στρες ερευνήθηκαν επίσης. Τέλος, η αναστολή της ανάπτυξης όγκου από την DT-QX αξιολογήθηκε σε ποντίκια που φέρουν υποδόριους όγκους του ήπατος.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Σύνθεση

Όλα τα χημικά αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (WI, USA), η J & amp? Κ Scientific Ltd (Πεκίνο, Κίνα), ή Sinopharm χημικό αντιδραστήριο Co, Ltd (Σαγκάη, Κίνα) και χρησιμοποιήθηκε χωρίς περαιτέρω καθαρισμό. Τα φάσματα NMR καταγράφηκαν με φασματόμετρο Bruker Avance-400 NMR (Madison, WI, USA). Συντομογραφίες που χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό πρότυπα σήματα πρωτονίου NMR είναι: απλή (s), διπλή (d), τριπλή (t), τετραπλή (q), κουιντέτο (qui), πολλαπλή (m) και ευρεία σήματος (br). φασματοσκοπία μάζας ιονισμού ηλεκτροψεκασμού ανάλυση (ESI-MS) πραγματοποιήθηκε με ένα Thermo Fisher TSQ Quantum Max τριπλό τετραπλό φασματόμετρο μάζας (MA, USA). Η ένωση 1 ελήφθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [23]

6-βρωμο-

N

-.. (Προπ-2-υνυλο) εξαναμίδιο (2)

Σε ένα διάλυμα 6-βρωμοεξανοϊκό οξύ (694 mg, 3.56 mmol) σε ξηρό CH

2Cl

2 (50 mL) προστέθηκαν υδροχλωρική προπαργυλαμίνης (300 mg, 3.28 mmol), τριαιθυλαμίνη (332 mg, 3.28 mmol) και 1- (3-διμεθυλαμινοπροπυλ) -3-αιθυλοκαρβοδιιμίδιο (630 mg, 3.28 mmol). Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε υπό Ν

2 για 16 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Το προκύπτον διάλυμα εκχυλίσθηκε με CH

2Cl

2 (150 mL χ 3). Οι οργανικές στιβάδες συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με άλμη (250 mL), αποξηράνθηκε με θειικό μαγνήσιο

4 και συμπυκνώθηκε. Ένα φλας χρωματογραφικό διαχωρισμό (0-40% EtOAc σε εξάνιο) έδωσε 2 ως 1:01 syn /anti-αμιδίου μίγμα ως ένα άχρωμο έλαιο (390 mg, 1.68 mmol) σε απόδοση 51%.

1 NMR (ΟϋΟ

3, 400 MHz, 1:01 syn /anti):

δ

= 5,71 (br s, 1? ΝΗ), 4,05 (dd,

3J

(Η, Η) = 5,2 Hz,

4J

(Η, Η) = 2,5 Hz, 2Η? CH

2), 3,53 (t,

3

J

(Η, Η) = 6,6 Hz, 1Η? 0.5CH

2), 3,40 (t,

3

J

(Η, Η) = 6,7 Hz, 1Η? 0.5CH

2), 2.24 – 2.19 (m, 3Η? CH, CH

2), 1,87 (qui,

3J

(Η, Η) = 7,2 Hz, 1? 0.5CH

2), 1,79 (qui,

3J

(H, H) = 7,0 Hz, 1? 0.5CH

2), 1,67 (qui,

3J

(Η, Η) = 7,52 Ηz, 2Η? CH

2), 1,50 – 1,41 ppm (m, 2Η? CH

2)?

13C NMR (ΟϋΟ

3, 100,6 MHz, 1:01 syn /anti):

δ

= 172,3, 172,2, 79,5, 71,6, 44,8, 36,1, 36,1, 33,5, 32,4, 32,2 , 29.1, 27.7, 26.4, 24.7, 24.5 ppm (Σχήμα S1)? HRMS υπολογισμένο για C

9Η

15BrNO [Μ + Η]

232,0337 και [Μ + 2 + H]

234.0316, βρέθηκε 232.0324 και 234.0413.

N

-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-9,10-dioxo-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octahydrophenanthren-2-yloxy)hexanamide (3).

Σε ένα διάλυμα του 2 (390 mg, 1.68 mmol) σε ξηρό DMF (50 mL) προστέθηκαν 1 (355 mg, 1.30 mmol) και ανθρακικό κάλιο (1.8 g, 13.0 mmol). Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε υπό Ν

2 για 16 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια οξυνίζεται σε ρΗ 5 με 5 Ν HCI. Το προκύπτον διάλυμα εκχυλίσθηκε με CH

2Cl

2 (150 mL χ 3). Οι οργανικές στιβάδες συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με άλμη (250 mL), αποξηράνθηκε με θειικό μαγνήσιο

4 και συμπυκνώθηκε. Ένα φλας χρωματογραφικό διαχωρισμό (0-40% EtOAc σε εξάνιο) έδωσε 3 ως ένα κίτρινο έλαιο (320 mg, 0.76 mmol) σε απόδοση 58%.

1 NMR (ΟϋΟ

3, 400 MHz):

δ

= 7.53 (d,

4J

(H, H) = 2,9 Hz, 1? CH ), 7,35 (d,

3J

(Η, Η) = 8,8 Hz, 1Η? CH), 7.21 (dd,

3J

(Η, Η) = 8,7 Hz,

4J

(Η, Η) = 2,7 Hz, 1Η? CH), 5.94 (br s, 1Η? ΝΗ), 4,04 (dd,

3J

(Η, Η) = 5,3 Hz,

4J

(Η, Η) = 2,6 Hz, 2Η? CH

2), 4,00 (t,

3J

(Η, Η) = 6,4 Hz, 2Η? CH

2), 2,65 (s, 1Η? CH), 2.53 (d,

3J

(Η, Η) = 14,3 Hz, 1, CH), 2.24 (t,

3J

(Η, Η) = 7,6 Ηz, 2Η? CH

2), 2,21 (d,

4J

(Η, Η) = 2,5 Hz, 1Η? CH), 1,82-1,70 (m, 4Η? 2CH

2), 1,56 – 1,31 (m, 7Η? 3CH

2, CH), 1.18 (s, 3Η? CH

3), 0,95 (s, 3Η? CH

3), 0,38 ppm (s, 3Η? CH

3)?

13C NMR (ΟϋΟ

3, 100,6 MHz):

δ

= 199.0, 181.3, 172.4, 158.1, 142.6, 134.6, 126.1, 124.2, 112.6, 71.7, 68.9, 68.1, 41.9, 39.2, 39.0, 36.3, 36.3, 35.5, 31.4, 29.7, 29.2, 28.9, 25.7, 25.2, 24.3, 18.8 ppm (Εικόνα S2)? HRMS υπολογισμένο για C

26Η

34NO

4 [Μ + Η]

424.2488, βρέθηκε 424.2487.

N

-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)-hexanamide (4).

Σε ένα διάλυμα της 3 (320 mg, 0.76 mmol) σε τολουόλιο (25 mL) προστέθηκαν

o

φαινυλενοδιαμίνη (103 mg, 0.95 mmol) και πυριτική πηκτή ( 300 mg). Το μίγμα της αντίδρασης ανέρρευσε υπό N

2 για 18 ώρες και στη συνέχεια συμπυκνώθηκε. Ένα φλας χρωματογραφικό διαχωρισμό (0-40% EtOAc σε εξάνιο) έδωσε 5 ως ένα κίτρινο στερεό (230 mg, 0.46 mmol) σε απόδοση 61%.

1Η NMR (ΟϋΟ

3, 400 MHz):

δ

= 8.9 έως 8.7 (m, 3Η? 3CH), 7,73-7,67 (m, 2Η? 2CH), 7,30 (d,

3J

(H, H) = 8,8 Hz, 1? CH), 7.02 (dd,

3J

(H, H) = 8,4 Hz,

4J

(Η, Η) = 2,8 Hz, 1Η? CH), 5.71 (br s, 1Η? ΝΗ), 4.14 – 4.6 (m, 4Η? 2CH

2), 2,88 (s, 1Η? CH), 2.56 (br d,

3J

(Η, Η) = 14 Ηζ, 1, CH), 2.28 – 2.23 (m, 3Η? CH

2, CH) , 1,89 – 1,73 (m, 4Η? 2CH

2), 1.59-1.47 (m, 7Η? 3CH

2, CH), 1.02 (s, 3Η? CH

3), 0,99 (s, 3Η? CH

3), 0,16 ppm (s, 3Η? CH

3)?

13C NMR (ΟϋΟ

3, 100,6 MHz):

δ

= 172,4, 158,0, 154,8, 148,4, 141,9, 141,3, 137,6, 134,8, 129,2, 129,1, 129,0, 128,6, 125,0, 118,1, 111,2, 79,6, 71,6, 67,7, 59,7, 42,0, 37,3, 36,3, 36,1, 36,0, 34,8, 31,5, 29,2, 29,1, 25,8, 25,3, 22,1, 19,0 ppm (Σχήμα S3)? HRMS υπολογισμένο για C

32H

38N

3Ο

2 [Μ + Η]

496.2964, βρέθηκε 496.2964.

N

-((1-(2-(Hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-tetrahydrofuran-3-yl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)hexanamide (DT-QX).

Σε ένα διάλυμα της 4 (100 mg, 0,2 mmol) σε 5 mL DMF και 10 mL CH

2Cl

2 προστέθηκαν 3′-αζιδο-3′- δεοξυθυμιδίνη (54 mg, 0.20 mmol) και ένα υδατικό διάλυμα ασκορβικού νατρίου (40 mM, 15 mL). Το μίγμα της αντίδρασης καθαρίστηκε με Ν

2 για 10 λεπτά, και CuSO

4 · 5Η

προστέθηκε 2O (8 mg, 0.03 mmol). Το μίγμα της αντίδρασης στη συνέχεια αναδεύτηκε κάτω από N

2 σε θερμοκρασία δωματίου για 12 ώρες. Το προκύπτον διάλυμα εκχυλίσθηκε με CH

2Cl

2 (150 mL χ 3). Οι οργανικές στιβάδες συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με άλμη (200 mL), αποξηράνθηκε με θειικό μαγνήσιο

4 και συμπυκνώθηκε. Ένα φλας χρωματογραφικό διαχωρισμό (0-7% MeOH σε CH

2Cl

2) έδωσε dT-QX ως ένα λευκό στερεό (114 mg, 0.15 mmol) σε απόδοση 75%.

1 NMR (DMSO

d

6

, 400 MHz):

δ

= 11,35 (s, 1? ΟΗ), 8,34 (t,

3

J

(Η, Η) = 5,5 Hz, 1Η? CH), 8.14 έως 8.11 (m, 2Η? 2CH), 8.6 έως 8.4 (m, 1? CH), 7.96 (d,

4

J

(Η, Η) = 2,8 Hz, 1Η? CH), 7.79 (m, 3Η? 2CH, ΝΗ), 7,39 (d,

3

J

(Η, H) = 8,7 Hz, 1Η? CH), 7.11 (dd,

3

J

(Η, Η) = 8,5 Hz,

4

J

(Η, Η ) = 2,8 Hz, 1Η? CH), 6.40 (t,

3

J

(Η, Η) = 6,6 Hz, 1Η? CH), 5,36 – 5,33 (m, 1? CH), 5.28 (t,

3

J

(Η, Η) = 5,2 Hz, 1Η? ΝΗ), 4,31 (d,

3

J

(Η, Η) = 5,5 Hz, 2Η? CH

2), 4,18 (m, 1? CH), 4,06 (t,

3

J

(Η, Η) = 6,4 Hz, 2Η? CH

2), 3,67-3,60 (m, 2Η? CH

2), 2,85 (s, 1Η? CH), 2.67-2.57 (m, 2Η? CH

2), 2.16 (t,

3

J

(Η, Η) = 7,4 Hz, 2Η? CH

2), 1,79-1,62 (m, 5Η? CH

3, CH

2), 1.56-1.43 (m, 10Η? 5CH

2), 0,93 (s, 3Η? CH

3), 0,91 (s, 3Η? CH

3), 0,07 ppm (s, 3Η? CH

3 )?

13C NMR (DMSO

d

6

, 100,6 MHz):

δ

= 172,0, 163,6, 157,4, 154,2, 150,4, 147,5, 145,2, 141,1, 140,9, 137,1, 136,1, 134,1, 129,5, 129,4, 128,9, 128,4, 125,3, 122,4, 117,7, 110,8, 109,5, 84,4, 83,8, 67,4, 60,6, 59,0, 58,5, 41,2, 37,0, 36,8, 35,5, 35,1, 34,9, 34,4, 34.0, 31.3, 28.5, 25.2, 24.9, 21.6, 18.5, 12.2 ppm? HRMS υπολογισμένο για C

42H

51N

8Ο

6 [Μ + Η]

763.3932, βρέθηκε 763.3959 (Εικόνες S4 και S5).

4β, 8, 8-τριμεθυλ-9,10-διοξο-4b, 5,6,7,8,8a, 9,10-octahydrophenanthren-2-υλ 4-μεθυλ-πιπεραζινο-1-καρβοξυλικό (5).

σε ένα διάλυμα του 1 (650 mg, 2.39 mmol) σε DMF (30 mL) προστέθηκαν υδροχλωρική 4-μεθυλ-1πιπεραζίνη χλωρίδιο (630 mg, 3.16 mmol) και ανθρακικό κάλιο (3,4 g, 24 mmol). Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε υπό Ν

2 για 18 ώρες και στη συνέχεια οξινίστηκε σε ρΗ 5 με 5 Ν HCI. Το προκύπτον διάλυμα εκχυλίσθηκε με CH

2Cl

2 (150 mL χ 3). Οι οργανικές στιβάδες συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με άλμη (250 mL), αποξηράνθηκε με θειικό μαγνήσιο

4 και συμπυκνώθηκε. Ένα φλας χρωματογραφικό διαχωρισμό (0-25% EtOAc σε εξάνιο) έδωσε 5 ως ένα κίτρινο έλαιο (730 mg, 1.83 mmol) σε απόδοση 77%.

1Η NMR (ΟϋΟ

3, 400 MHz):

δ =

7,86 (s, 1Η? CH), 7.49 (s, 2Η? 2CH), 3.71 (br s, 2Η? CH

2), 3,61 (br s, 2Η? CH

2), 2,69 (s, 1Η? CH), 2.58 (d,

3

J

(Η, Η) = 13.3 Hz, 1Η? CH), 2.49 (br s, 4Η? 2CH

2), 2,37 (s, 3Η? CH

3), 1,47-1,42 (m, 5Η? 2CH

2, CH ), 1,23 (s, 3Η? CH

3), 0,98 (s, 3Η? CH

3), 0,41 ppm (s, 3Η? CH

3)?

13C NMR (ΟϋΟ

3, 100,6 MHz): δ 198.2, 180.6, 152.5, 149.8, 147.4, 134.6, 129.4, 126.3, 122.5, 68.7, 53.7, 53.6, 41.7, 39.5, 38.7, 36.2, 36.1 , 35.5, 31.2, 26.9, 24.2, 24.2, 18.7 ppm (Σχήμα S6)? HRMS υπολογισμένο για C

23Η

31N

2O

4 [Μ + Η]

299,2284, βρέθηκε 299,2294.

4β, 8,8-τριμεθυλ-4β, 5,6,7,8,8a-εξαϋδροδιβενζο [a, c] φαιναζινο-2-υλ 4-μεθυλοπιπεραζινο-1-καρβοξυλικό (Ρίρ-QX).

σε ένα διάλυμα της 5 (330 mg, 0,83 προστέθηκαν mmol) σε τολουόλιο (25 mL)

o

φαινυλενοδιαμίνη (100 mg, 0.92 mmol) και πυριτική πηκτή (300 mg). Το μίγμα της αντίδρασης ανέρρευσε υπό N

2 για 18 ώρες και στη συνέχεια συμπυκνώθηκε. Ένα φλας χρωματογραφικό διαχωρισμό (0-3% MeOH σε CH

2Cl

2) έδωσε Pip-QX ως ένα κίτρινο έλαιο (310 mg, 0.66 mmol) σε 79% απόδοση.

1 NMR (DMSO

d

6

, 400 MHz):

δ

= 8.14 έως 8.5 (m, 3Η? 3CH), 7,81 – 7,79 (m, 2H ? 2CH), 7,49 (d,

3

J

(H, H) = 8,4 Hz, 1? CH), 7.29 (dd,

3

J

(H , Η) = 8,4 Hz,

4

J

(Η, Η) = 2,4 Hz, 1Η? CH), 3.63 (br s, 2Η? CH

2), 3,46 (br s , 2Η? CH

2), 2,88 (s, 1Η? CH), 2.58 (m, 1? CH

2), 2.38 (br s, 4Η? 2CH

2), 2,16 (s, 3Η? CH

3), 1,51 – 1,38 (m, 5Η? 2CH

2, CH), 0.96 (s, 3Η? CH

3), 0,90 (s, 3Η? CH

3 ), 0,06 ppm (s, 3Η? CH

3)?

13C NMR (DMSO

d

6

, 100,6 MHz):

δ

= 154,4, 153,3, 150,5, 147,5, 142,3, 141,6, 134,7, 130,2, 130,2, 129,4, 129,0, 125,7, 125,2, 119,3, 58,9, 54,7, 54,6, 46,2, 44,6, 44,0, 41,6, 37,7, 36,1, 35,4, 34,7, 31,8, 22,2, 19,0 ppm (Σχήμα S7)? HRMS υπολογισμένο για C

29Η

35N

4O

2 [Μ + Η]

471,2760, βρέθηκε 471,2767.

Βιολογικές Μελέτες

Το ζώο πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Αξιολόγησης της Ακαδημίας Επιστημών και Τεχνολογίας ζωής στη Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας. Καρκινικές κυτταρικές γραμμές HepG2, Hep3B, MCF-7 και C6 ελήφθησαν από την ATCC (VA, USA). ανθρώπινα ηπατικά κύτταρα HL-7702 και του καρκίνου του ποντικού ηπατικά κύτταρα Η22 ήταν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Life Science Cell Culture Center (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης ή μέσο RPMI-1640 (Invitrogen, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS), 25 mM HEPES, 2 mM L-γλουταμίνη, 0,1 mM μη απαραίτητα αμινοξέα, 1.0 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 50 U /mL πενικιλλίνη, και 50 μg /mL στρεπτομυκίνη στους 37 ° C και 5% CO

2. Στοκ διαλύματα του DT-QX, Pip-QX ή ΑΖΤ παρασκευάστηκαν σε DMSO, και υδροχλωρική δοξορουβικίνη άλας διαλύθηκε απευθείας σε νερό. Όλα τα βιολογικά χημικά ελήφθησαν από την Sigma Aldrich (WI, USA) εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Όλα τα πειράματα ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται τουλάχιστον τρεις φορές.

ΜΤΤ δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας.

Τα κύτταρα (5000 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε μέσο ανάπτυξης για όλη τη νύχτα πριν από κάθε θεραπεία σε τριπλούν. dT-QX, Pip-QX ή ΑΖΤ ήταν σε μία τελική συγκέντρωση 0, 0.1, 1, 10, 20, 50, 100, ή 200 μΜ με συνολική DMSO μικρότερη από 0,2%. Η δοξορουβικίνη χρησιμοποιήθηκε ως σύγκριση σε μια τελική συγκέντρωση 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 ή 2.0 μΜ. Μετά από 72 ώρες, ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη όπως αναφέρθηκε [23]. Η κυτταρική βιωσιμότητα της κάθε θεραπείας σχεδιάστηκαν με πρόγραμμα GraphPad Prism, και IC

50 τιμές ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ανάλυση σιγμοειδή δόσης-απόκρισης που παρέχεται από το λογισμικό (έκδοση 4.00, GraphPad Software, CA, USA).

Anti-BrdU δοκιμασία φθορισμού.

Hep3B, HepG2 ή HL-7702 κύτταρα (50.000 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε μέσο ανάπτυξης για όλη τη νύχτα σε πλάκες 48 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0, 10 ή 50 μΜ dT-QX για 5 h. δοκιμασία Αντι-BrdU διεξήχθη σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (BD Biosciences, NJ, USA). Εν συντομία, διάλυμα BrdU (0.1 mg /mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 3 ώρες. κυτταρικό μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη σε PBS. Τα κύτταρα διαπερατά με 0,1% Triton-100 σε PBS και αποκλείστηκαν με 3% FBS σε διάλυμα PBS. Cellular DNA μετουσιώθηκε με DNaseI (0.3 mg /mL) σε διάλυμα PBS. Το ενσωματωμένο BrdU χρωματίστηκε με Alexa Fluor®488 αντι-BrdU μονοκλωνικού αντισώματος (BD Biosciences, NJ, USA). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με Hoechst λύση 33342. εικόνες των κυττάρων της κάθε θεραπείας συνελήφθησαν με την Olympus IX71 ανεστραμμένο μικροσκόπιο εξοπλισμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή σύμφωνα με τις κατάλληλες φώτα. Οι επιπτώσεις της Pip-QX και ΑΖΤ επί της σύνθεσης DNA σε Hep3B αξιολογήθηκαν παρομοίως όπως περιγράφεται παραπάνω.

φθορισμού μελέτη των μιτοχονδριακών παραγωγής υπεροξειδίου.

Hep3B ή HL-7702 κύτταρα (50.000 ανά φρεάτιο ) σπάρθηκαν σε μέσο ανάπτυξης για όλη τη νύχτα σε πλάκες 48 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0 ή 50 μΜ dT-QX για 8 ώρες και στη συνέχεια το μέσο απομακρύνθηκε. Ένα διάλυμα MitoSOX Red μιτοχονδριακής υπεροξειδίου δείκτης (Invitrogen, CA, USA) σε PBS προστέθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C για 20 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά με PBS και αντι-βάφτηκαν με Hoechst 33342 διάλυμα. Φθορίζουσες εικόνες συλλήφθηκαν με την Olympus IX71 ανεστραμμένο μικροσκόπιο υπό κατάλληλες φώτα. Η μελέτη με 100 μΜ Mn (III) τετράκις (1-μεθυλ-4-πυριδυλ) πορφυρίνης υδροξείδιο tetratosylate (MnTmPyP, EMD Chemicals, Inc., USA) ως θετικός έλεγχος σε κύτταρα Hep3B διεξήχθη παρομοίως.

Υποδόρια συκώτι μελέτη όγκου σε ποντίκια.

ποντικού κύτταρα καρκίνου του ήπατος Η22 αρχικά διατηρήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης RPMI-1640 και στη συνέχεια αναπτύσσονται στα ποντίκια BALB /c (Hubei Provincial Laboratory Κέντρο ζώων, Κίνα) ενδοπεριτοναϊκά. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία μετά από 4 ημέρες και Η22 κύτταρα συλλέχθηκαν με διάλυμα PBS. κύτταρα Η22 πλύθηκαν μία φορά με αποστειρωμένο PBS και ενέθηκαν υποδορίως (3×10

6 κύτταρα ανά ποντικό) στο κάτω μέρος της πλάτης του naive ποντικούς BALB /c. Μόλις οι όγκοι έφθασαν μέσο μέγεθος (8×8 mm, 340 mm

3), εννέα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (3 ανά ομάδα) και ενέθηκαν με 100 μL αλατούχου διαλύματος (με 0,1% DMSO), το ΑΖΤ (50 μΜ σε στείρο PBS με 0,1% DMSO) ή dT-QX (50 μΜ σε αποστειρωμένο PBS με 0,1% DMSO) για την θέση του όγκου την ημέρα 1 και την ημέρα 7. η ανάπτυξη και το σωματικό βάρος του όγκου παρακολουθούνταν καθημερινά. Την ημέρα 12 μετά την πρώτη ένεση, όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και καταγράφηκαν εικόνες των όγκων. Στατιστική ανάλυση (ένας τρόπος ANOVA με δοκιμή πολλαπλής συγκρίσεως του Tukey) για τις θεραπείες διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Σύνθεση του DT-QX επιτεύχθηκε με σύζευξη ΑΖΤ με 4 φαινυλοκινοξαλινο μέσω χαλκού (Ι) καταλυθείσες αντίδραση κλικ (Σχήμα 2). Ενδιάμεσο 3 ελήφθη από πυρηνόφιλη υποκατάσταση bromoalkyne 2 με οξειδωμένη terpenone 1. φαινυλοκινοξαλινο 4 ελήφθη με συμπύκνωση με

o

-diaminobenzene και γέλη πυριτίου υπό αντιρροή σε τολουόλιο, το οποίο ήταν πολύ καλύτερη από ακετονιτρίλιο, DMF ή αιθανόλη. Η σύζευξη του ΑΖΤ με φαινυλοκινοξαλινο 4 έως dT-QX επιτεύχθηκε σε 75% απόδοση με τη χρήση του in situ αναγωγή του χαλκού (II) με ασκορβικό [20], [21]. Φαινυλοκινοξαλινο 4, ένα μόριο αναφοράς, βρέθηκε να είναι ελάχιστα διαλυτό σε υδατικό διάλυμα 1% DMSO και ως εκ τούτου τροποποιήθηκε ώστε να α

N

-μεθυλοπιπεραζίνη παράγωγο Pip-QX, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2. Pip-QX συντέθηκε με τρόπο παρόμοιο με dT-QX μέσω μετατροπής του 1 με το παράγωγο πιπεραζίνης 5, που ακολουθείται από συμπύκνωση με το

o

-diaminobenzene σε συνολική απόδοση 61%. Pip-QX υπηρέτησε ως μία από τις ενώσεις αναφοράς ακόλουθες βιολογικές μελέτες. Πολλαπλές παρτίδες του DT-QX και οι ενώσεις ελέγχου συντέθηκαν, και όλες οι παρτίδες που εκτελούνται με συνέπεια όχι μόνο στη χημεία, αλλά και σε βιολογικές μελέτες.

Η

Η βιολογική δραστικότητα του DT-QX αξιολογήθηκε πρώτα χρησιμοποιώντας την κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορισμού σε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων ανθρώπινου ήπατος HepG2 καρκίνωμα και Hep3B, καρκίνωμα ήπατος ποντικού Η22, αδενοκαρκινώματος μαστού MCF-7, και κύτταρα γλοιώματος C6 εγκεφάλου αρουραίου. Ανθρώπινο ήπαρ HL-7702 κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως αντιπροσωπευτική των φυσιολογικών κυττάρων στη μελέτη. Τα HL-7702 κύτταρα μετασχηματισμένα ανθρώπινα φυσιολογικά ηπατοκύτταρα με χαμηλή έκφραση των δεικτών του καρκίνου [24]. Θεραπεία της HL-7702 με dT-QX δεν οδήγησε σε οποιαδήποτε σημαντική κυτταροτοξικότητα σε συγκεντρώσεις τόσο υψηλές όσο 200 μΜ (Σχήμα 3α). Η ΕΚ

50 του DT-QX σε όλα τα καρκινικά κύτταρα βρέθηκε να κυμαίνεται από 6,6 έως 42,1 μΜ. Η πιο έντονη κυτταροτοξικότητα παρατηρήθηκε σε ανθρώπινα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος Hep3B με το θάνατο πάνω από το 80% των κυττάρων σε 20 μΜ, που ακολουθείται από αδένωμα του μαστού MCF-7 και κύτταρα γλοιώματος C6 εγκεφάλου. Σε πλήρη αντίθεση, Pip-QX μη επιλεκτικά σκοτώθηκαν όλες τις κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων HL-7702 στα 50 μΜ (σχήμα 3β). Η δεύτερη ένωση αναφοράς, ΑΖΤ ως 3′-δεοξυθυμιδίνη ανάλογο, βρέθηκε να εμφανίζουν χαμηλή κυτταροτοξικότητα έναντι αυτών των κυτταρικών γραμμών (Σχήμα 3γ), ενώ συν-θεραπεία του ΑΖΤ συν Pip-QX επίσης μη επιλεκτικά σκοτώθηκαν όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3d ), παρόμοια με εκείνη της θεραπείας Pip-QX μόνο. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων έναντι των φυσιολογικών κυττάρων του ήπατος από την DT-QX οφειλόταν στη μοναδική ομοιοπολική σύζευξη του ημίσεως φαινυλοκινοξαλινο κυτταροτοξικών με 3′-δεοξυθυμιδίνη. Σε σύγκριση, το αντικαρκινικό φάρμακο δοξορουβικίνη βρέθηκε ιδιαίτερα τοξικές για όλα αυτά τα κύτταρα. Στην πραγματικότητα, η δοξορουβικίνη ήταν ακόμη πιο τοξική προς τα κανονικά επίπεδα ηπατικών 7702 κύτταρα από καρκίνο του ήπατος Hep3B ή Η22 κύτταρα σε συγκεντρώσεις πάνω από 0,5 μΜ (Εικόνα 3e).

Ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών (μαύρο χρώμα) και ένα φυσιολογικό ήπαρ ηπατοκυττάρου κυτταρική γραμμή (κόκκινο χρώμα) υποβλήθηκαν σε αγωγή με α) dT-QX? β) Pip-QX? γ) ΑΖΤ? δ) Pip-QX συν ΑΖΤ και ε) δοξορουβικίνη, αντιστοίχως. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από 72 ώρες επώασης με δοκιμασία ΜΤΤ. Η επί τοις εκατό βιωσιμότητα υπολογίστηκε και εφοδιασμένο με καμπύλες δόσης-απόκρισης χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism. Όλες οι αγωγές έγιναν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Η

Για να κατανοήσουμε περαιτέρω την εκλεκτική κυτταροτοξικότητα του DT-QX προς τα καρκινικά κύτταρα, ερευνήσαμε πρώτα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με χρήση του προσδιορισμού του φθορισμού αντι-BrdU. BrdU (5-βρωμο-3′-δεοξυουριδίνης) είναι ένα ανάλογο της θυμιδίνης που ενσωματώνεται εντός του γονιδιώματος κυττάρου καθώς αντιγράφει [25]. Έτσι, το επίπεδο της BrdU σε κυτταρικό πυρήνα αντανακλά το επίπεδο της κυτταρικής διαίρεσης και του πολλαπλασιασμού. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω αποτελέσματα βιωσιμότητας κυττάρων, τα ανθρώπινα HL-7702, HepG2 και τα κύτταρα Hep3B ερευνήθηκαν ως εκπρόσωποι των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. Η δοκιμασία αντι-BrdU εκτελέστηκε σε 5 ώρες μετά την αγωγή dT-QX να δοθεί επαρκής συσσώρευση της ένωσης σε κύτταρα και να προσδιορίσει τις επιπτώσεις της στην σύνθεση κυτταρικού DNA. Το επίπεδο της BrdU σε πυρήνες κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον σύζευγμα αντι-BrdU [25] (πράσινο χρώμα) με κυτταρικούς πυρήνες αντι-βάφτηκαν με Hoechst 33342 (μπλε χρώμα), όπως φαίνεται στο Σχήμα 4.

δοκιμασία BrdU διεξήχθη αφού τα κύτταρα σε επεξεργασία με ενώσεις για 5 ώρες. Το ενσωματωμένο BrdU χρωματίστηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-BrdU Alexa Fluor®488 (πράσινο χρώμα) με κυτταρικούς πυρήνες αντι-χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 (μπλε χρώμα). α) ενσωμάτωση BrdU σε HL-7702, HepG2 ή Hep3B κύτταρα κατεργασμένα με DMSO ή dT-QX? β) κύτταρα ενσωμάτωσης BrdU inHep3B αγωγή με DMSO, ΑΖΤ ή Pip-QX.

Η

Στην κανονική ανθρώπινη HL-7702 κύτταρα, θεραπείες DMSO και dT-QX οδήγησε σε παρόμοια επίπεδα ενσωμάτωσης BrdU σε πυρήνες κυττάρων , η οποία έδειξε την παρουσία του dT-QX δεν παρεμβαίνει με την κυτταρική διαίρεση και τον πολλαπλασιασμό. Ωστόσο, σημαντική απώλεια πράσινου φθορισμού παρατηρήθηκε σε καρκινικά κύτταρα HepG2 και Hep3B με θεραπεία dT-QX σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου DMSO (Σχήμα 4α). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι dT-QX ανέστειλε εκλεκτικά τη σύνθεση κυτταρικού DNA των κυττάρων HepG2 και Hep3B στα πρώτα στάδια της θεραπείας με αποτέλεσμα επιλεκτική θανάτωση τόσο των καρκινικών κυττάρων. Η αναστολή της ενσωμάτωσης BrdU ήταν πολύ πιο έντονη σε κύτταρα Hep3B με την πλήρη απώλεια του πράσινου φθορισμού σε πυρήνες κυττάρων (Σχήμα 4α). Αυτό ήταν σύμφωνο με τα αποτελέσματα κυτταρικής βιωσιμότητας ότι η DT-QX ήταν πιο αποτελεσματική στην θανάτωση Hep3B από τα κύτταρα HepG2. Η πιο έντονη κυτταροτοξικότητα σε Hep3B κυττάρων από HepG2 μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι η Hep3B προέρχεται από την ηπατίτιδα Β [26].

Για να διαλευκανθεί η οποία chemophore του DT-QX ήταν υπεύθυνος για την αναστολή της σύνθεσης του DNA, η δοκιμασία φθορισμού αντι-BrdU διεξήχθη με ΑΖΤ ή Pip-QX σε κύτταρα Hep3B (Σχήμα 4β). Θεραπεία της ΑΖΤ δεν οδήγησε σε σημαντική αναστολή της σύνθεσης του DNA, ενώ Pip-QX ανέστειλε σημαντικά την σύνθεση του DNA σε κύτταρα, παρόμοια με εκείνη του DT-QX, υποδεικνύοντας phenylquaxinoline chemophore ήταν υπεύθυνος για την αναστολή της σύνθεσης του DNA που παρατηρήθηκαν. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα κυτταρικής βιωσιμότητας, αυτό πρότεινε ότι η σύζευξη με 3′-δεοξυθυμιδίνη τροποποιημένα μοναδικά την κυτταροτοξική φαινυλοκινοξαλινο chemophore να καταστεί περισσότερο επιλεκτική προς τα καρκινικά κύτταρα από τα φυσιολογικά ηπατοκύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν επίσης ότι σύζευξη του ημίσεως κινοξαλινο με 3′-τριαζολο-3′-deoxythymine οδήγησε σε επιλεκτική στόχευση καρκινικών κυττάρων αναστέλλοντας τη σύνθεση του DNA τους.

Η επιλεκτική αναστολή της σύνθεσης πυρηνικού DNA από την DT-QX στον καρκίνο κύτταρα οδήγησε στην υπόθεση ότι η dT-QX ίσως αναστέλλουν εκλεκτικά τη σύνθεση μιτοχονδριακού DNA και να προκαλέσει δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων, καθώς και. Δυστυχώς, ο αντι-BrdU δοκιμασία φθορισμού δεν ήταν αρκετά ευαίσθητη για να παρατηρήσουμε αυτή την αναστολή σε κύτταρα. Εναλλακτικά, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία λόγω της εξάντλησης του DNA από τα νουκλεοσιδικά ανάλογα έχει αναφερθεί ότι συμβαίνουν ταυτόχρονα με αυξημένα επίπεδα υπεροξειδίου σε μιτοχόνδρια μετά από θεραπεία για 4 ημέρες [27]. Ως εκ τούτου, η επίδραση του DT-QX στην μιτοχονδριακή λειτουργία εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία απεικόνισης μιτοχονδριακό υπεροξειδίου φθορισμό βάση. κύτταρα Hep3B ερευνήθηκαν ως εκπρόσωπος του μοντέλου καρκινικών κυττάρων λόγω της έντονης αναστολής της σύνθεσης του DNA σε πρώιμο στάδιο από την DT-QX που παρατηρείται σε αντι-BrdU δοκιμασία (Σχήμα 4α).

Σημαντικές κόκκινου φθορισμού ενδεικτικό της παραγωγής υπεροξειδίου ανιχνεύθηκε σε κύτταρα Hep3B μετά από θεραπεία 50 μΜ dT-QX για 8 ώρες σε σύγκριση με εκείνη DMSO (Σχήμα 5). Το κυτοσολικό παρουσία ερυθρών χρώση υπεροξειδίου επιβεβαιώθηκε με αντι-χρώση των κυτταρικών πυρήνων με χρωστική Hoechst. Διαπιστώθηκε επίσης ότι η θεραπεία των κυττάρων Hep3B με dT-QX για μικρότερο χρονικό διάστημα, όπως 3 ή 5 ώρες δεν προκάλεσε σημαντικές κόκκινο φθορισμό, υποδεικνύοντας την παραγωγή του μιτοχονδριακού υπεροξειδίου ήταν αθροιστικά και ήταν πιθανό να οφείλεται στην αναστολή της σύνθεσης του κυτταρικού DNA. Επιπλέον, ένας θετικός έλεγχος με Mn (III) -chelator ενεργεί ως ΝΑϋΡΗ /GSH: O

2

– οξειδορεδουκτάσης σε κύτταρα [28] είχε ως αποτέλεσμα ένα παρόμοιο επίπεδο των ερυθρών φθορισμού σε κύτταρα Hep3B με εκείνη αγωγή με dT-QX (βλέπε Σχήμα S8). Σε αντίθεση, χαμηλό υπόβαθρο κόκκινου φθορισμού παρατηρήθηκε σε ανθρώπινη φυσιολογική HL-7702 κύτταρα κατεργασμένα με dT-QX, παρόμοια με εκείνη που έλαβαν θεραπεία με DMSO (Σχήμα 5). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι dT-QX θα μπορούσαν να προκαλέσουν δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων επάγοντας μιτοχονδριακό στρες υπεροξειδίου σε καρκινικά κύτταρα μετά από την αναστολή της σύνθεσης του DNA.

κυτταρική γραμμή Hep3B Cancer ή κανονική HL-7702 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 50 μΜ dT-QX για 8 ώρες. Το επίπεδο της μιτοχονδριακής υπεροξειδίου ανιχνεύθηκε με MitoSOX μιτοχονδριακή δείκτης υπεροξειδίου (κόκκινο χρώμα). Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν αντίθετα με βαφή Hoechst (μπλε χρώμα).

Η

Μια προκαταρκτική in vivo αντικαρκινική μελέτη με dT-QX διεξήχθη σε ένα μοντέλο ποντικού. Υποδόρια όγκοι καθορίστηκαν με μυϊκό καρκίνο Η22 κύτταρα του ήπατος [29]. Οι όγκοι αφέθηκαν να φθάσουν σε ένα μέσο μέγεθος 8,8 × 8,8 mm. Η σχετική χαμηλή διαλυτότητα του DT-QX σε διάλυμα PBS περιορίζεται η οδός χορήγησης να είναι ενδο-ογκικές ενέσεις. Έτσι, ΑΖΤ ή dT-QX (100 μL × 50 μΜ το καθένα) εγχύθηκε κατευθείαν σε όγκους την ημέρα 1 και την ημέρα 7. Ανεξάρτητα από θεραπείες, ούτε ποντίκια πέθαναν ούτε υπήρξε μια σημαντική απώλεια σωματικού βάρους που παρατηρείται κατά τη διάρκεια της μελέτης των 12 ημερών. Το προφίλ της ανάπτυξης του όγκου επί 12 ημέρες μετά την πρώτη ένεση φαίνεται στο Σχήμα 6α. Οι όγκοι σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με ΑΖΤ αυξήθηκαν γρήγορα, παρόμοιες με εκείνες του αρνητικού ελέγχου (αλατούχο διάλυμα)? λαμβάνοντας υπόψη ότι η ανάπτυξη των όγκων ανεστάλη σημαντικά σε άΤ-QX αγωγή ποντίκια (Σχήμα 6α). Την ημέρα 12 μετά την πρώτη ένεση, τα μεγέθη των όγκων σε ποντικούς που ενέθηκαν με dT-QX ήταν σαφώς μικρότερες από εκείνες με ΑΖΤ ή φυσιολογικό ορό (Σχήμα 6β). Στατιστική ανάλυση επιβεβαίωσε επίσης ότι η θεραπεία του DT-QX ήταν σημαντικά διαφορετική από τις άλλες δύο (

P

& lt? 0,01). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι ενδοογκική ένεση του DT-QX σε χαμηλή δοσολογία (ισοδύναμο με 0,13 mg /kg ανά ποντίκι) ήταν αρκετά αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης των υποδόριων όγκων σε ένα μοντέλο ποντικού.

υποδόριος όγκος ήταν ιδρύθηκε με την έγχυση των κυττάρων Η22 στο κάτω μέρος της πλάτης ποντικών BALB /c υποδορίως (3 χ 10

6 κύτταρα ανά ποντικό).