Αφηρημένο

Ιστορικό

Σχεδόν το 20% των ανθρώπινων καρκίνων σε όλο τον κόσμο έχουν μία μολυσματική αιτιολογία με τα πιο σημαντικά παραδείγματα είναι η ηπατίτιδα Β και C που συνδέονται με ιούς ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και ανθρώπινου θηλώματος που συνδέονται με ιούς καρκίνου του τραχήλου. Υπάρχει επείγουσα ανάγκη να βρεθούν νέες προσεγγίσεις για τη θεραπεία και την πρόληψη των καρκίνων που συνδέονται με ιούς.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Viral αντιγόνα δεν έχουν προηγουμένως θεωρούνταν ως στόχοι για τη θεραπεία ή την πρόληψη του ιού -associated καρκίνους. Υποθέσαμε ότι ήταν δυνατό για τη θεραπεία της πειραματικής HPV16 που σχετίζεται καρκίνου του τραχήλου (CC) και της ηπατίτιδας Β που σχετίζεται με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) με στοχοθέτηση ιογενή αντιγόνα που εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα με ραδιοεπισημασμένα αντισώματα προς ιικά αντιγόνα. Θεραπεία των πειραματικών CC και όγκων HCC με

188Re-ετικετοποιημένα mAbs σε ιικές πρωτεΐνες Ε6 και HBx, αντίστοιχα, οδήγησε σε σημαντική και εξαρτώμενη από τη δόση επιβράδυνση της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με τα μη θεραπευμένα ποντίκια ή ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με μη επισημασμένα αντισώματα.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή η στρατηγική είναι ριζικά διαφορετική από τις προηγούμενες χρήσεις ραδιοανοσοθεραπεία στην ογκολογία, που στοχεύουν ανθρώπινα αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους και τις υποσχέσεις αυξημένη ειδικότητα και ελάχιστη τοξικότητα της θεραπείας. Θέτει, επίσης, μια συναρπαστική δυνατότητα για την πρόληψη των καρκίνων που συνδέονται με ιούς σε χρονίως μολυσμένους ασθενείς με την εξάλειψη κύτταρα μολυσμένα με ογκογόνων ιών προτού μεταμορφωθεί σε καρκίνο

Παράθεση:. Wang XG, Revskaya Ε, Bryan RA, Strickler HD, Burk RD, Casadevall A, et al. (2007) Θεραπεία του καρκίνου ως μια μεταδοτική ασθένεια-ιικά αντιγόνα όπως Μυθιστόρημα Στόχοι για Θεραπεία και Πιθανές πρόληψη των όγκων του Viral αιτιολογίας. PLoS ONE 2 (10): E1114. doi: 10.1371 /journal.pone.0001114

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Μιχαήλ Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5, Οκτωβρίου 2007? Αποδεκτές: 10 Οκτώβρη του 2007? Δημοσιεύθηκε: 31 Οκτώβρη 2007

Copyright: © 2007 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Ε. Dadachova υποστηρίζεται από το AI60507 επιχορήγηση ΝΙΗ? Α Casadevall – οι επιχορηγήσεις NIH AI33774, AI33142, AI52733, HL59842 και U54 AI157158? Κ.Ο. Burk από την CA078527 επιχορήγηση NIH. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Albert Einstein College of Medicine Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου και το Κέντρο Έρευνας για το AIDS στο Albert Einstein College of Medicine και Montefiore Medical Center χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH AI-51519).

Αντικρουόμενα συμφέροντα: η αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας για την τεχνολογία αυτή έχει κατατεθεί με τις ΗΠΑ PTO

Εισαγωγή

έχει υπολογιστεί ότι σχεδόν το 20% των ανθρώπινων καρκίνων έχουν σε όλο τον κόσμο μια λοιμώδους αιτιολογίας [1]. Οι περισσότεροι από αυτούς τους όγκους είναι ιικής προέλευσης, και περιλαμβάνουν εδραιωθεί ενώσεις του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV) και τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα? και των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) -με καρκίνους του τραχήλου της μήτρας, του πρωκτού, του αιδοίου, του κόλπου? καθώς και τις ενώσεις του στοματοφάρυγγα ο ιός Epstein-Barr (EBV) με λέμφωμα και καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα? ανθρώπινου Τ λεμφοτροπικού ιού τύπου 1 (HTLV-1) -με λευχαιμίας ενηλίκων Τ-κυττάρων /λεμφώματος, και του ανθρώπινου ιού έρπητα 8 (HHV-8) -με σάρκωμα Kaposi [2] – [7]. Σε συνδυασμό, οι όγκοι αυτοί που συνδέονται με ιούς αποτελούν επιβάρυνση περίπου 1,3 εκατομμύρια περιπτώσεις καρκίνου κάθε χρόνο, με HBV /HCV που σχετίζεται καρκίνο του ήπατος που αντιπροσωπεύουν 523.000 περιπτώσεις, και οι όγκοι HPV-συνδέονται αντιπροσωπεύουν 561.000 περιπτώσεις [8]. Η ανάγκη για την εξεύρεση νέων προσεγγίσεων για τη θεραπεία και την πρόληψη των καρκίνων που συνδέονται με ιούς είναι προφανής και επείγουσα.

Ραδιοανοσοθεραπεία (RIT) χρησιμοποιεί δεσμευτικός χορήγηση κυτταροτοξικών δόσεων σωματιδιακού ακτινοβολίας σε κύτταρα όγκου [9] αντιγόνου-αντισώματος, [10]. RIT, για παράδειγμα, έχει χρησιμοποιηθεί για την επιτυχή θεραπεία πυρίμαχων και επαναλαμβανόμενες λεμφώματα, με δύο ραδιοεπισημασμένα μονοκλωνικά αντισώματα (mAb) που στοχεύουν ενάντια CD20 (Zevalin® και Bexxar®) έχουν λάβει έγκριση FDA για το σκοπό αυτό. Είναι πιθανό, στην πραγματικότητα, ότι RIT θα γίνει μια θεραπεία πρώτης γραμμής για οζώδες λέμφωμα [11]. Αυτό το «παραδοσιακό» RIT καρκίνο στόχους «αυτο» αντιγόνα. Πρόσφατα, αποδείξαμε ότι RIT έχει επίσης ευρείες δυνατότητες για τη θεραπεία μυκητιασικών και βακτηριακών λοιμώξεων μέσω της στόχευσης των μικροβιακών αντιγόνων με ραδιοεπισημασμένο mAbs σε πειραματικά μοντέλα των μυκητιακών και βακτηριακών μολύνσεων [12], [επανεξετάζονται σε 13]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ο HIV-1 μολυσμένα κύτταρα θα μπορούσαν να εξαλειφθούν in vitro και in vivo με στόχευση gp120 και gp41 ιικές γλυκοπρωτεΐνες που εκφράζονται στην επιφάνεια των μολυσμένων κυττάρων με ραδιοεπισημασμένη πρωτεΐνη ιού-ειδική mAbs [14].

Υποθέσαμε ότι RIT στοχεύουν έναντι ιικών αντιγόνων μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην αγωγή ενός ευρέως φάσματος των ιογενών μολυσματικών ασθενειών και των όγκων που συνδέονται με ιούς [15], [16]. Πολλοί καρκίνοι συνδέονται με ιούς εκφράζουν ιικά αντιγόνα είτε εσωτερικά είτε στην επιφάνειά τους. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι ακόμη και ιικά αντιγόνα εκφράζεται ενδοκυτταρικά είναι πιθανοί στόχοι για RIT, αφού ο κύκλος εργασιών των καρκινικών κυττάρων είναι πιθανό να οδηγήσει στην απελευθέρωση αυτών των πρωτεϊνών μέσα στο διάμεσο χώρο του όγκου. Αυτή η προσέγγιση είναι θεμελιωδώς διαφορετική από τις προηγουμένως περιγραφείσες χρήσεις RIT που στοχεύουν αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους που είναι «αυτο» (δηλαδή άνθρωπο) πρωτεΐνες. Στοχεύοντας ιογενείς και όχι «εαυτό» πρωτεΐνες, ελπίζεται ότι ραδιοεπισημασμένη mAbs μπορεί να είναι πιο συγκεκριμένα συμπυκνώνεται μέσα στον ιστό του όγκου, με αποτέλεσμα μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα και μικρότερη τοξικότητα. Εδώ περιγράφουμε τα πειράματα απόδειξη της αρχής με στόχο την επίδειξη της σκοπιμότητας θεραπεία πειραματικής HPV16 που σχετίζονται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (CC) και της ηπατίτιδας Β που σχετίζονται με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) στοχεύοντας ιικών αντιγόνων που εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα με ραδιοεπισημασμένα αντισώματα έναντι ιικών αντιγόνων .

Αποτελέσματα

η επιλογή ενός συνδυασμού line-αντιγόνο κύτταρο να δρα ως ένα πειραματικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (CC) μοντέλο

για την αξιολόγηση του δυναμικού της RIT να στοχεύουν ιικών αντιγόνων σε καρκίνους του ιικού αιτιολογία, έπρεπε να προσδιορίσει καρκινικές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν το αντιγόνο-στόχο και θα μπορούσαν επίσης να εμφυτεύονται σε γυμνούς ποντικούς. Έχουμε επιλέξει γραμμές HPV16 και HPV18 κυττάρων, δεδομένου ότι αυτοί οι δύο τύποι του HPV αντιπροσωπεύουν περίπου το 70% των καρκίνων του τραχήλου και ένα σημαντικό τμήμα του κεφαλιού και του λαιμού όγκους [17], [18]. Οι ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7 θεωρήθηκαν τα καλύτερα δυνητικών αντιγονικών στόχων, αφού αυτές οι πρωτεΐνες εκφράζονται σε ουσιαστικά όλα τα κύτταρα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, ενώ άλλα ιικά γονίδια μπορεί να χαθούν. Μεταλλακτική ανάλυση έχει δείξει ότι τα ιικά ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7 είναι αναγκαίες και επαρκείς για την αθανατοποίηση των ανθρώπινων κυττάρων από τον HPV. Ως εκ τούτου, αξιολογήθηκε με στύπωμα Western της έκφρασης του Ε6 και Ε7 σε τρεις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος του τραχήλου της μήτρας-HPV16-θετικές κυτταρικές σειρές CaSki και SiHa και HPV 18-θετική κυτταρική σειρά HeLa S3. Ενώ τα κύτταρα CaSki εκφράζεται τόσο αντιγόνα Ε6 και Ε7 (Εικ. 1a, b), κυτταρικές σειρές SiHa και HeLa S3 δεν είχε μετρήσιμη έκφραση του αντιγόνου Ε6 (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται), αλλά δεν εκφράζουν πρωτεΐνη Ε7 (Σχήμα 1 d, e.)? αν και, το επίπεδο της έκφρασης Ε7 ήταν χαμηλή σε κύτταρα SiHa

α) Ε6 από πρωτεΐνη εκχυλίσματα κυττάρων CaSki σε επεξεργασία με MG132 για 3 ώρες (Εικόνα 1δ.).? β) Ε7 από πρωτεΐνη εκχυλίσματα κυττάρων CaSki σε επεξεργασία με MG132 για 3 ώρες? γ) Ε6 από πρωτεΐνη εκχυλίσματα κυττάρων CaSki σε επεξεργασία με MG132 για 6 ώρες? δ) Ε7 από εκχυλίσματα πρωτεΐνης των κυττάρων SiHa σε επεξεργασία με MG132 για 3 ώρες? ε) Ε7 από πρωτεΐνη εκχυλίσματα κυττάρων HeLa S3 σε επεξεργασία με MG132 για 3 ώρες? στ) HBX από εκχυλίσματα πρωτεΐνης των κυττάρων Hep 3B2.1-7 σε επεξεργασία με MG132 για 3 ώρες.

Η

Ο αναστολέας πρωτεασώματος MG132 μειώνει την αποικοδόμηση της ουμπικουϊτίνης-συζευγμένες πρωτεΐνες στα κύτταρα των θηλαστικών χωρίς να επηρεάζει ΑΤΡάσης ή isopeptidase δραστηριότητες. MG132 έχει αναφερθεί να έχει ως αποτέλεσμα αυξημένα επίπεδα πρωτεϊνών Ε6 και Ε7 σε αυχενικό καρκινικά κύτταρα [19], [20]. Ως υψηλότερες ποσότητες αντιγόνων-στόχων μπορεί ενδεχομένως να βελτιώσει τα αποτελέσματα RIT, διερευνήσαμε την επίδραση της προεπεξεργασίας του CC κυττάρων με αναστολέα πρωτεασώματος MG132 για τα επίπεδα έκφρασης Ε6 και Ε7. Σύκο. 1α και β δείχνει ότι σε κύτταρα CaSki προεπεξεργασίας με MG132 προκάλεσε αύξηση στην έκφραση τόσο Ε6 και Ε7, με το μεγαλύτερο επίπεδο έκφρασης που επιτυγχάνεται με τη χρήση των 2 και 5 μg /mL του MG132 που υποχωρήσει όταν χρησιμοποιήθηκαν υψηλότερες δόσεις. Παράταση της περιόδου επώασης των κυττάρων CaSki με MG132 δεν είχε ως αποτέλεσμα μεγαλύτερη έκφραση Ε6. Στην πραγματικότητα, παρατηρήσαμε μειωμένη έκφραση Ε6 με την παρατεταμένη έκθεση CaSki κυττάρων να MG132 (Σχ. 1γ), η οποία μπορεί να αντανακλά μία αύξηση της υποβάθμισης πρωτεΐνης μετά από περισσότερο από 3 ώρες επώασης. Παρόμοια πειράματα πραγματοποιήθηκαν για Ε7 πρωτεΐνης σε SiHa και HeLa κυτταρικές σειρές S3 (Εικ. 1d, ε). SiHa κύτταρα δεν επιδεικνύουν σημαντική αύξηση στα επίπεδα Ε7 (Σχήμα 2δ.)? ότι, τα επίπεδα Ε7 έκανε αύξηση ελαφρώς για τα κύτταρα HeLa S3 επεξεργασία με 1 και 2 μg /mL MG132 (Εικ. 1ε). Δεδομένου αξιόπιστη και υψηλή έκφραση του Ε6 στα κύτταρα CaSki καθώς και την ικανότητά τους να παράγουν όγκους σε γυμνούς ποντικούς-εμείς επιλεγμένα κύτταρα CaSki και πρωτεΐνη Ε6 για περαιτέρω in vitro και in vivo πειράματα.

α, β) ανοσοφθορισμό του σταθερό και διαπερατών κυττάρων όγκου. Αριστερά πλαίσια δείχνουν φως εικόνες μικροσκοπίας των κυττάρων. είναι σε μεγάλο βαθμό κατεστραμμένα κύτταρα σημειώνονται με βέλη. Δεξιά πλαίσια δείχνουν ανοσοφθορισμού εικόνες των ίδιων διαφάνειες που έλαβαν θεραπεία με πρωτεΐνη ιού-ειδική mAbs ακολουθούμενο από FTIC-συζευγμένο πολυκλωνικό αντίσωμα ποντικού IgGs: κύτταρα a-CaSki και Ε6-ειδικό C1P5 mAb, β-Hep 3B2.1-7 κύτταρα και HBx- συγκεκριμένες 4H9 mAb? γ) ανοσοϊστοχημεία όγκων CaSki. Αριστερό πλαίσιο δείχνει δέσμευση του Ε6 ειδικά C1P5 mAb. Δικαίωμα πλαίσιο δείχνει έλλειψη δέσμευσης του ελέγχου mAb 18B7? δ) Στύπωμα Western Hep 3B2.1-7 όγκου με HBx-ειδικό mAb 4H9.

Η

Επιλογή μιας γραμμής-αντιγόνου συνδυασμός κύτταρο να δρα ως ένα πειραματικό ηπατίτιδας Β που σχετίζεται με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) μοντέλο

Εμείς αξιολογήθηκαν δύο ηπατίτιδας Β που σχετίζονται με ιικές πρωτεΐνες ως πιθανοί στόχοι για την RIT-HBx και PreS2. HBx υπάρχει υποψία ότι έχει ένα ρόλο στη ηπατοκαρκινογένεσης και, σε αντίθεση με άλλες πιθανές επιλογές, HBx δεν έχει καμία ομολογία να φιλοξενήσει πρωτεΐνες. Περαιτέρω, το γονίδιο που κωδικοποιεί για HBx διατηρείται ακόμη και όταν το γονιδίωμα HBV ενσωματώνεται σε HCC, ενώ άλλα γονίδια HBV μπορεί να χαθεί [21], [22]. PreS2 επίσης υπόνοιες ότι έχει ένα ρόλο στην ηπατοκαρκινογένεσης (δηλαδή, μέσω μετενεργοποίηση των κυτταρικών γονιδίων σημαντικών για τον έλεγχο της ανάπτυξης) [22]. HBx πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με συνέπεια από Western blot του HCC κυτταρική γραμμή Hep 3B2.1-7 χρησιμοποιώντας 4H9 mAb, και η έκφρασή του ήταν ανεξάρτητη από προ-αγωγή με αναστολέα πρωτεασώματος MG132 (Σχ. 1f), ενώ preS2 δεν ανιχνεύθηκε (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται ). Ως εκ τούτου, έχουμε επιλέξει το συνδυασμό κυτταρική σειρά Hep 3B2.1-7 και πρωτεΐνη HBx για περαιτέρω πειράματα.

Η σύνδεση των αντισωμάτων σε αντιγόνα του ιού σε μη βιώσιμα κύτταρα

Για να μάθετε αν τα αντισώματα για να ιικές πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν ως στόχοι για RIT θα είναι σε θέση να δεσμεύονται σε πρωτεΐνες του ιού σε μη βιώσιμα κύτταρα όγκου, πραγματοποιήσαμε ανοσοφθορισμό των σταθερών και διαπερατών κυττάρων CaSki και Hep 3B2.1-7 με mAbs C1P5 να Ε6 και 4H9 με τις πρωτεΐνες HBx , αντίστοιχα, που ακολουθείται από συζευγμένο με FITC πολυκλωνικό αντίσωμα IgG ποντικού. Ενώ η πρόσδεση του mAb C1P5 στα κύτταρα τα οποία ήταν σχεδόν ανέπαφα ήταν αδύναμη, τα βαριά κατεστραμμένα κύτταρα με διαπερατή μεμβράνες έδειξαν έντονο φθορισμό δείχνοντας δέσμευση του C1P5 να Ε6 (Εικ. 2α). Η στερέωση και διαπερατοποίηση έκανε επίσης δυνατή για mAb 4H9 να δεσμεύεται με HBx πρωτεΐνη (Εικ. 2b). Δεν δέσμευση του ελέγχου IgG1 mAb σε σταθερά και διαπερατά CaSki ή ηπατίτιδα 3B2. 1-7 κυττάρων παρατηρήθηκε (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται).

Η έκφραση ιικών πρωτεϊνών στους όγκους

Για να επιβεβαιωθεί ότι CaSki και Hep 3B2.1-7 κύτταρα συνέχισαν να εκφράζουν Ε6 και HBx ιική αντιγόνα, αντίστοιχα, στους όγκους που επάγεται σε γυμνούς ποντικούς, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημεία και ανοσοκηλίδος για Ε6 και HBx, αντίστοιχα. κηλίδα Western επιλέχθηκε για Hep 3B2.1-7 επαγόμενη όγκους με βάση τις δυσκολίες αναφοράς βιβλιογραφίας σε αξιόπιστα ανίχνευση HBx πρωτεΐνη σε όργανα με ανοσοϊστοχημεία [23]. Υπήρχε έντονη χρώση του Ε6 με συγκεκριμένες C1P5 mAb σε όγκους CaSki (Εικ. 2γ, αριστερό πάνελ) χωρίς χρώση παρατηρήθηκε με έλεγχο IgG1 mAb (Σχ. 2c, δεξί πάνελ). Western blot του Hep 3B2.1-7 επαγόμενης όγκων αποκάλυψε την παρουσία HBx πρωτεΐνης (Εικ. 2d). Έτσι, η παρουσία των ιικών πρωτεϊνών στόχων σε CC και HCC πειραματικούς όγκους παρέχεται η δυνατότητα στόχευσης αυτά τα αντιγόνα in vivo με ραδιοσημασμένο mAbs για σπινθηρογραφική απεικόνιση και θεραπεία.

Βιοκατανομή του ραδιοσημασμένου mAbs να ιικών πρωτεϊνών σε CaSki και Hep 3B2.1-7-γυμνά ποντίκια με όγκους

Πραγματοποιήσαμε πειράματα απεικόνισης και βιοκατανομής με

188Re-ραδιοσημασμένου C1P5 και 4H9 mAbs στην CaSki και Hep 3B2.1-7-γυμνά ποντίκια με όγκους, αντίστοιχα, για να εξακριβωθεί η εντόπιση των mAbs στους όγκους. Σε 24 ώρες μετά την ένεση ο όγκος CaSki ήταν ορατή στην σπινθηρογραφική εικόνα ενός ποντικού εγχύθηκε με

188Re-C1P5 mAb (Σχ. 3α), σε αντίθεση με την εικόνα ενός ποντικού εγχύθηκε με άσχετο

188Re-18B7 mAb (Εικ. 3b). Υπολογίσαμε επίσης το λόγο όγκου προς μυών από τα αποτελέσματα 48 ώρες βιοκατανομής που ήταν 10:01 για

188Re-C1P5 έναντι 3:01 για

188Re-18B7. Η συνολική πρόσληψη

188Re-C1P5 mAb στους όγκους στις 48 ώρες μετά την ένεση ήταν 2,0 (± 0,3)% της εγχυθείσας δόσης ανά γραμμάριο όγκου. Άλλα όργανα όπως ήπαρ, σπλήνα και το αίμα έδειξε τα επίπεδα πρόσληψης χαρακτηριστικό της IgG1 mAbs. Για Hep 3B2.1-7 χρησιμοποιήσαμε μια άλλη προσέγγιση για να αποδείξει την ιδιαιτερότητα της πρόσληψης mAb στον όγκο, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο, όταν ένα ποντίκι φέρει δύο διαφορετικά όγκων-ένα ο όγκος του ενδιαφέροντος και ένα άλλο, άσχετο όγκου ελέγχου. Γυμνά ποντίκια πραγματοποιείται Α2058 ανθρώπινα μεταστατικού όγκου μελανώματος στο δεξί πλευρό και Hep 3B2.1-7 στα αριστερά (Σχ. 3c). Οι ποντικοί εγχύθηκαν με

188Re-4H9 mAb και απεικονίζεται scintigraphically στις 24 ώρες μετά την ένεση. Το αντίσωμα εντοπίζεται στον όγκο Hep 3B2.1-7 σε αντίθεση με το άσχετο όγκου μελανώματος ελέγχου (Σχ. 3d). Η ικανότητα των ραδιοσημασμένων mAbs να ιικά αντιγόνα να εντοπίζεται σε αυτούς τους όγκους σε ποντικούς που δικαιολογούνται αξιολόγηση των RIT σε αυτά τα in vivo μοντέλα καρκίνου.

Η

RIT του CaSki και Hep 3B2.1-7 φέρουν όγκο nude ποντίκια

Για να αξιολογηθεί το θεραπευτικό αποτέλεσμα της

188Re-C1P5 mAb σε CaSki που φέρουν όγκο ποντικών, τα ζώα εγχύθηκαν με είτε 350 μCi

188Re-C1P5 mAb, ή που ταιριάζουν ποσότητες (30 μg ανά ποντικού) μη επισημασμένου ( «ψυχρή») C1P5 mAb ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Σύκο. 4α παρουσιάζει την μεταβολή σε όγκο του όγκου σε υπό θεραπεία και ελέγχου ομάδες. RIT με 350 μCi

188Re-C1P5 mAb συλληφθεί τελείως την ανάπτυξη του όγκου και οδήγησε σε μείωση του όγκου του (Σχ. 4α και β), ενώ χωρίς θεραπεία όγκοι αναπτύχθηκαν επιθετικά (Σχ. 4α και γ) και χωρίς θεραπεία ποντικών ελέγχου έπρεπε να θυσιαστούν για ημέρα 20 μετά τη θεραπεία (P & lt? & lt? 0,01). Είναι ενδιαφέρον ότι, η χορήγηση του «κρύο» C1P5 mAb οδήγησε επίσης σε σημαντική καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου, η οποία μπορεί να οφείλεται στην επαγωγή της φλεγμονής και συμπληρώνουν καταρράκτες από το mAb

α) μεταβολές στο μέγεθος του όγκου.? β) ποντίκι που έλαβαν θεραπεία με 350 μCi

188Re-C1P5 mAb? γ) ποντίκι έλεγχος (και οι δύο ποντίκια παρουσιάζονται κατά την ημέρα 20 μετά την αγωγή).

Η

Για RIT του Hep 3B2.1-7 όγκων σε γυμνούς ποντικούς που αρχικά χρησιμοποιείται τον ίδιο πειραματικό σχεδιασμό όπως για όγκους CaSki με χρησιμοποιώντας 350 μCi

188Re-4H9 mAb, «κρύο» mAb επεξεργασμένου ελέγχου και χωρίς θεραπεία ομάδες. Η χορήγηση των 350 μΟ

188Re-4H9 mAb οδήγησε σε επιβράδυνση της ανάπτυξης του όγκου, αλλά δεν το συλλάβει, όπως στην περίπτωση των όγκων CaSki. «Cold» 4H9 mAb δεν είχε επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου. Για να βρούμε την πιο αποτελεσματική δόση ραδιοεπισημασμένης mAb για την επιβράδυνση της ανάπτυξης πολύ επιθετική Hep 3B2.1-7 ένα πείραμα δόσης απόκρισης έγινε. Το θεραπευτικό αποτέλεσμα των

188Re-4H9 mAb άρχισε να εκδηλώνεται σε μια δόση των 280 μCi και η επίδραση αυξάνεται με κάθε επακόλουθη αύξηση της δόσης (Σχήμα 5α). (Ρ & lt? 0,02). Με την ολοκλήρωση του πειράματος οι όγκοι από τους ποντικούς ελέγχου άνευ αγωγής και ποντικούς στην υψηλότερη ομάδα 600 μCi αναλύθηκαν ιστολογικά. Ο όγκος ελέγχου αποτελείτο από μετρίως διαφοροποιημένων hepatoid κύτταρα με διάσπαρτες μικρές εστίες νέκρωσης, θρόμβωση ινώδες, και αιμορραγία. Νεοπλασματικά κύτταρα είχαν άφθονη ηωσινοφιλική σε λεπτή κενοτόπια κυτταρόπλασμα και μεσαίες πυρήνες σε πολύ μεγάλες και αναπλαστικό πυρήνες που περιέχουν πολλαπλές μεγάλο ηωσινοφιλική πυρηνίσκους με πολυπύρηνα περιστασιακά εμφανής. Ο μιτωτικός δείκτης ήταν υψηλό και υπήρχαν διάσπαρτα αποπτωτικά κύτταρα (Σχ. 5β). Σε αντίθεση, οι RIT-αγωγή όγκοι είχαν σημαντικά περισσότερο νέκρωση και αιμορραγία από παρατηρείται στους μάρτυρες. Η μορφολογική εμφάνιση των κυττάρων του όγκου είχαν συχνά μια πιο κυτταρόπλασμα με κενοτόπια που υποδηλώνει τον εκφυλισμό (Σχήμα 5γ.)

α) μεταβολές στο μέγεθος του όγκου.? β) τον έλεγχο των μη επεξεργασμένων ποντίκι? γ) ποντίκι που έλαβαν 600 μCi

188Re-4H9 mAb. Και τα δύο ποντίκια παρουσιάζεται την ημέρα 18 μετά τη θεραπεία. Στο β και γ κάτω πάνελ δείχνουν H & amp? Ε βάφονται όγκους κατά την ολοκλήρωση του πειράματος

Η

Συζήτηση

Πραγματοποιήσαμε απόδειξη της αρχής in vitro και in vivo πειράματα για τη δημιουργία. το εφικτό της στόχευσης ιικών αντιγόνων σε όγκους ιικών αιτιολογίας με ραδιοεπισημασμένα αντισώματα για θεραπεία. Για το σκοπό αυτό, μελετήσαμε πειραματικά τραχηλικού καρκινώματος (CC) και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) μοντέλα, δεδομένου ότι αυτοί οι καρκίνοι είναι αιτιολογικά σχετίζεται με τον ιό HPV και HBV /HCV, αντίστοιχα, και έχουν σημαντικές επιπτώσεις στη δημόσια υγεία σε παγκόσμιο επίπεδο.

η πρώτη πρόκληση ήταν η επιλογή των ιικών αντιγόνων στόχων σε CC και HCC. Σε HPV που σχετίζονται με CC εντοπίσαμε ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7 ως πιθανοί στόχοι για RIT, επειδή πιστεύεται ότι εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας? ενώ, άλλα ιικά γονίδια μπορεί να χαθεί κατά τη διάρκεια της διαδικασίας πολλαπλών σταδίων της ογκογένεσης. Ομοίως, σε HCC, η έκφραση HBx πιστεύεται ότι πρέπει να διατηρηθεί. Υπάρχει, ωστόσο, μια σημαντική ανησυχία στην στόχευση αυτών των τριών πρωτεϊνών με ραδιοσημασμένο mAbs-τους υποκυτταρική τοποθεσία. Τόσο Ε6 και Ε7 βρίσκονται εντός του πυρήνα, και HBx βρίσκεται στον πυρήνα και περιστασιακά στο κυτταρόπλασμα. Κατά συνέπεια, τα ραδιοεπισημασμένα mAbs προς αυτές τις πρωτεΐνες μπορούν να δεσμεύονται μόνο για τα αντίστοιχα αντιγόνα τους όταν απελευθερώνονται από τα νεκρά κύτταρα ή όταν τα κύτταρα όγκου διαπερατά. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων αυτών, εμείς επιλέξαμε την κυτταρική σειρά CaSki ως πρότυπο CC, αφού βρήκαμε εκφράζεται Ε6 και Ε7 σε υψηλά επίπεδα in vitro και οι όγκοι αναπτύχθηκαν επιθετικά σε γυμνούς ποντικούς μετά τη λανθάνουσα περίοδο. Η κυτταρική γραμμή Hep 3B2.1-7 επελέγη ως μοντέλο HCC, αφού παρατηρήσαμε ότι εκφράζεται HBx σε υψηλά επίπεδα και να εμφανίζεται ταχεία ανάπτυξη του όγκου σε ποντίκια.

Ο ανοσοφθορισμού των κυττάρων του όγκου και ανοσοϊστοχημεία και Western blot των όγκων αποκάλυψε άφθονες ποσότητες Ε6 και HBx αντιγονικών στόχων στην CasKi- και Hep 3B2.1-7 επαγόμενη όγκων, αντίστοιχα (Εικ. 2). Η παρουσία των προσβάσιμο αντιγόνου για ραδιοσημασμένων mAbs είναι πιθανώς αποτέλεσμα της απελευθέρωσης πρωτεΐνης από τα καρκινικά κύτταρα που υφίστανται ταχεία κύκλου εργασιών. Κατά συνέπεια, οι ραδιοεπισημασμένα αντισώματα συσσωρευτεί στον ιστό του όγκου, έτσι ώστε να μπορούν να απεικονιστούν scintigraphically (Εικ. 3). Ένα από τα πλεονεκτήματα της στόχευσης ιικών αντιγόνων στους όγκους που βρίσκονται μόνο σε κακοήθη κύτταρα. Αντίθετα, Chen και συνεργάτες παρατηρήθηκαν διαφορές στην πρόσληψη από τον όγκο και για τις δύο ειδικές και μη ειδικές ραδιοεπισημασμένα αντισώματα σε πειράματα βιοκατανομής τους όταν στοχευμένη intranuclear ιστόνες [24].

Η ικανότητα των ραδιοσημασμένων mAbs έναντι ιικών πρωτεϊνών σε παραδώσει κυτταροτοξικών ραδιονουκλίδιο 188-ρηνίου στα κύτταρα του όγκου διευκόλυνε των επιτυχημένων αποτελεσμάτων RIT με αυτά τα mAbs σε ποντίκια που φέρουν όγκο. Η χορήγηση 350 μCi δόσης του Ε6 δέσμευσης

188Re-C1P5 mAb προς CaSki ποντικούς που φέρουν όγκο σταμάτησε εντελώς την ανάπτυξη του όγκου και ακόμη και οδήγησε σε υποχώρηση του (Εικ. 4). Είναι επίσης πιθανό ότι υπήρχε κάποια προστιθέμενη θεραπευτικό όφελος από το ίδιο το αντίσωμα ως μη επισημασμένα αντισώματα μπορεί να μεσολαβήσει φλεγμονώδεις αντιδράσεις και να ενεργοποιήσετε φιλοφρόνηση. Στο μέλλον, θα είναι χρήσιμο να διερευνηθεί κατά πόσον θα μπορούσε να επιτευχθεί αυξημένη κυτταρική επίπεδα Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών με χρήση προεπεξεργασία του MG132 in vivo, και αν αυτό οδηγεί σε ένα θεραπευτικό όφελος. Τα πειράματα απόκρισης δόσης σε ποντικούς που φέρουν Hep 3B2.1-7 HCC-όγκων έδειξαν σαφώς μια εξάρτηση από τη δόση για το θεραπευτικό αποτέλεσμα (Εικ. 5). Το γεγονός ότι οι υψηλότερες δόσεις του ραδιοεπισημασμένου mAb ήταν αναγκαίες για την παραγωγή ενός θεραπευτικού αποτελέσματος σε σχέση με το HCC τραχηλικό όγκο μπορεί να αντανακλά την επιθετικότητα των Hep 3B2.1-7 και τη γνωστή ραδιοαντοχή των όγκων του ήπατος σε σύγκριση με τις σχετικά ακτινοευαίσθητα του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα [25] . Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η θεραπευτική αύξηση και στις δύο πειραματικών όγκων επιτεύχθηκαν με δόσεις ραδιενέργειας που είναι πολύ κάτω από τη μέγιστη ανεκτή δόση περίπου 800 μCi για

188Re σημασμένο IgG1s σε ποντικούς [26], και όπως χρησιμοποιούνται τέτοιες οι δόσεις ήταν δεν αναμένεται να προκαλέσει οποιεσδήποτε βραχυπρόθεσμες ή μακροπρόθεσμες τοξικές επιδράσεις.

είναι σημαντικό να τονιστεί ότι κατά τη θεραπεία καρκίνων ιούς που σχετίζονται με τη στόχευση ιογενή δεν αντιγόνο σε κάθε κύτταρο στον όγκο πρέπει να εκφράζουν ιικά αντιγόνα για ένα θεραπευτικό αποτέλεσμα . Long εκπομπούς σειρά όπως

188Re (εύρος εκπομπής σε ιστό 10 mm) εκπέμπουν ακτινοβολία σε μια σφαίρα 360 ° και, κατά συνέπεια, μπορεί να σκοτώσει τα κύτταρα στη γειτονία της θέσης αντιγόνου. Επιπλέον, μια υψηλή συγκέντρωση του στοχευόμενου ιικού αντιγόνου είναι πιθανόν να μην απαιτείται για την παροχή της θεραπευτικής δόσης στον όγκο, σύμφωνα με πρόσφατες μοντέλο μας RIT για το μελάνωμα (που στοχεύουν ενάντια μελανίνη η οποία είναι επίσης ένα ενδοκυτταρικό αντιγόνο). Αυτό το μοντέλο έδειξε ότι η δόση ακτινοβολίας που παραδίδεται στον όγκο είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητη από τη μελανίνη συγκέντρωσης (αντιγόνο) [27].

Αυτή η προσέγγιση έχει επίσης την υπόσχεση για την πρόληψη των καρκίνων που σχετίζονται με ιική σε χρονίως μολυσμένα άτομα-για παράδειγμα, επιμονή της HPV λοίμωξης σε ασθενείς με HIV-μολυσμένα άτομα τους θέτει σε σημαντικό κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνων HPV-συνδέονται. Ενώ υπάρχει ανοσοθεραπεία για HBV και HCV, πολλοί ασθενείς δεν επιτυγχάνουν ιική κάθαρση και η θεραπεία συνδυάζεται με σημαντική νοσηρότητα. Επίσης, δεν υπάρχει εμβόλιο για HCV, και πολλά εκατομμύρια άνθρωποι παγκοσμίως έχουν μολυνθεί με HBV, παρά την ύπαρξη ενός αποτελεσματικού εμβολίου. Κύτταρα επίμονα μολυσμένα με HPV, HBV, HCV ή άλλοι ιοί θα μπορούσαν δυνητικά να εξαλειφθεί με RIT στοχεύουν σε ιικά αντιγόνα, πριν μετατραπούν σε κακοήθη φαινότυπο.

Εν κατακλείδι, εκτελέσαμε in vitro και in vivo πειράματα για να αξιολογηθεί μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία όγκων που σχετίζονται με τη χρήση του ιού ραδιοσημασμένο mAbs στοχευμένη έναντι ιικών πρωτεϊνών. Αυτή η στρατηγική είναι θεμελιωδώς διαφορετική από πριν χρήσεις των RIT στην ογκολογία που στοχεύουν ανθρώπινα αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους με αποτέλεσμα σημαντική πρόσληψη ραδιενεργού αντισώματος σε φυσιολογικούς ιστούς, οδηγώντας σε τοξικότητα. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν ότι με τη στόχευση αντί ιογενείς και δεν αυτο-πρωτεΐνες μπορεί να είναι δυνατόν για ραδιοσημασμένο mAbs να επικεντρωθεί πιο συγκεκριμένα εντός του ιστού του όγκου, με αποτέλεσμα μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα και μικρότερη τοξικότητα. Η στρατηγική αυτή θέτει επίσης μια συναρπαστική πρόσθετη δυνατότητα για την πρόληψη των καρκίνων που συνδέονται με ιούς σε χρονίως μολυσμένους ασθενείς με την εξάλειψη κύτταρα μολυσμένα με ογκογόνων ιών προτού μετατραπεί σε καρκίνο.

Μέθοδοι

Αντισώματα

ποντίκι μονοκλωνικά αντισώματα από Abcam C1P5 να HPV16 Ε6 + HPV18 Ε6 και TVG 701Y να HPV16 Ε7 χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα CC. Mouse mAb 4H9 στον HBV HBx (Aviva, Cat # AVAMM2005) και ποντικού mAb S26 στον HBV πρωτεΐνη HBS (Gene Tex Inc. Cat # GTX18797), η οποία αντιδρά εγκάρσια με το αντιγόνο HBsAg preS2 χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα HCC. Ποντικού 18B7 mAb (IgG1) στο

C. neoformans

[28] χρησιμοποιήθηκε ως ένα άσχετο ελέγχου για όλα τα ειδικά αντισώματα. Κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση για να ποντικού IgG Η &? L αγοράστηκε από Abcam και χρησιμοποιήθηκε ως δευτερογενές αντίσωμα σε Western blot

Κυτταρικές γραμμές και καλλιέργεια κυττάρων

τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές τραχηλικού καρκινώματος:. Hela S3, SiHa και CaSki αγοράσθηκαν από την ATCC (Manassas, VA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σαν ρουτίνα σε ϋΜΕΜ /ΗΑΜ F-12K (Sigma, 1:01) που περιείχε 10% FBS (Sigma) και 1% διάλυμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης (Sigma, πενικιλλίνη 10.000 U και στρεπτομυκίνη 10 mg /ml) στους 37 ° C σε 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Η κυτταρική σειρά Hep 3B2.1-7 (

Homo sapiens

hepatatocellular καρκίνωμα) αγοράστηκε από την ATCC. Περιέχει ένα ολοκληρωμένο γονιδίωμα του ιού της ηπατίτιδας Β και προέρχεται από το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα ιστό του 8 ετών μαύρο αγόρι. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σαν ρουτίνα σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Eagle (ΕΜΕΜ) (ATCC) που περιείχε 10% FBS (Sigma) στους 37 ° C σε

2 επωαστήρα 5% CO. στρώματα κυττάρων σε φιάλη των 75 ml διασπείρονται με την προσθήκη 2 ml 1 × διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ (Sigma, 0,25% (β /ο) τρυψίνη-0.53 mM EDTA) σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Α2058 κυτταρική σειρά που προέρχεται από ένα μετάσταση λεμφαδένα από ασθενή με κακόηθες μελάνωμα ελήφθη από την ATCC. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σαν μονοστιβάδες σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco με 4 mM Ε-γλουταμίνη, 4,5 g /γλυκόζη L, 1,5 g /L διττανθρακικό νάτριο, συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 5% διάλυμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης στους 37 ° C και 5% CO

2, και συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 0.25% (w /v) διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ. Τακτική συντήρηση όλων των κυτταρικών γραμμών πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τα πρωτόκολλα ATCC.

κηλίδες Western

Τα κυτταρικά ιζήματα εναιωρούνται στο ρυθμιστικό λύσης (4% SDS, 20% γλυκερόλη, 0.5 Μ TrisHCl (ρΗ 6.8), 0.002% κυανό βρωμοφαινόλης και 10% β-μερκαπτοαιθανόλη). Τα δείγματα πρωτεΐνης βράσθηκαν σε νερό για 15 λεπτά πριν από την εκτέλεση SDS-PAGE. Είκοσι πεντέμιση μΙ διαλύματος πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε κάθε φρεάτιο 12% προκατασκευασμένων SDS-PAGE γέλης (Bio-Rad). SDS-PAGE χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση των σχετικών ποσοτήτων πρωτεΐνης στα δείγματα. Δώδεκα τοις εκατό SDS-PAGE γέλη χρησιμοποιήθηκε για ξεχωριστές πρωτεΐνες, και η ηλεκτροφόρηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας μίνι-Protean® 3 κυτταρικό σύστημα (Bio-Rad). Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή μεταφέρθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς PVDF (25 mM Tris, 190 mM γλυκίνη και 2,5% (ν /ν) μεθανόλη) για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν από το πήκτωμα στη μεμβράνη Immun-Blot ™ PVDF (Bio-Rad) σε ημι-ξηρές ηλεκτροφορητική μεταφορά κυττάρων (Bio-Rad) στα 15 V για 17 λεπτά. Η μεμβράνη διαβράχηκε με ρυθμιστικό μπλοκαρίσματος (25 mM TrisHCl (ρΗ 7.6), 1 mM EDTA και 150 mM NaCl) για 5 λεπτά, και στη συνέχεια μεταφέρεται εντός του διαλύματος αποκλεισμού (5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος) , ανακινώντας ήπια για μια ώρα. Η μεμβράνη επωάστηκε σε διάλυμα TBST (0,1% Tween-20, 25 mM TrisHCl (ρΗ 7.6) και 500 mM NaCl) που περιείχε 1:3000 αραιωμένο πρωτογενές αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με ήπια ανακίνηση. Στη συνέχεια, η μεμβράνη πλύθηκε με TBST τρεις φορές (10 λεπτά ανά πλύση). Η μεμβράνη υβριδοποιήθηκε με το δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση (Rabbit πολύκλωνα να ποντικού IgG Η &? L (αλκαλική φωσφατάση)) σε TBST με αραίωση 1:100,000. Μετά από τρεις πλύσεις με TBST, η μεμβράνη επωάστηκε σε CDP-Star ™ χημιφωταύγειας διάλυμα υποστρώματος (Sigma) για 5 λεπτά, και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε φιλμ CL-XPosure ™ (Pierce). Το φιλμ αναπτύχθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

θεραπεία MG132 κυττάρων

MG132 (Ζ-LLL-CHO, ΜΒ = 457,6) που αγοράστηκε από την Calbiochem είναι ένας ισχυρός, αναστρέψιμος και κύτταρο-διαπερατό πρωτεασώματος αναστολέα (Κί = 4 ηΜ). MG132 διαλύθηκε πρώτα σε μια σταγόνα αιθανόλης 100% ακολουθούμενο από μέσο DMEM /ΗΑΜ F-12K χωρίς προσθήκη FBS, και το απόθεμα διαλύματος αποθηκευμένο στους 4 ° C. Κυτταρική καλλιέργεια συλλέχθηκε και μεταφέρθηκε σε 6 αποστειρωμένους δοκιμαστικούς σωλήνες. Κάθε σωλήνας περιείχε 0,5-1 ml κυτταρικής καλλιέργειας (συγκέντρωση κυττάρων ήταν ~ 10

6 κύτταρα /ml), και τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν στους 37 ° C σε 5% CO

2 επωαστήρα όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια, διάλυμα MG132 προστέθηκε στα σωληνάρια για τις τελικές συγκεντρώσεις των 0, 1, 2, 5, 10 ή 25 μg /ml (0, 2.1, 4.2, 10.5, 21 ή 52 μΜ, αντίστοιχα). Τα κύτταρα επωάστηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες για άλλες 3 ή 6 ώρες. Τέλος, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και διευκρινίζεται από πλύση με PBS.

ραδιοϊσοτόπων και ραδιοεπισήμανσης των αντισωμάτων

Η βήτα-εκπομπού

188Re με μια ημιζωή 16,9 ωρών εκλούεται σε η μορφή υπερρηνική νατρίου Na

188ReO

4 από ένα

188W /

γεννήτρια 188Re (Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, ΤΝ). Αντισώματα σημάνθηκαν με

188Re απευθείας με δεσμευτική μειωμένης

188Re στην ομάδα που δημιουργείται-SH επί των αντισωμάτων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11].

ανίχνευση ανοσοφθορισμού των ιικών αντιγόνων σε καρκινικά κύτταρα

τα κύτταρα όγκου καλλιεργήθηκαν σε θαλάμους αντικειμενοφόρου στους 37 ° C για 12 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές. Καθ ‘όλη τη διαδικασία, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με PBS μετά από κάθε θεραπεία. Είχαν σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά που ακολουθείται από διαπερατοποίηση με 0.3% Triton-X100 σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Σταθερή και διαπερατά κύτταρα αποκλείσθηκαν με 5% BSA συν 0.1% Triton Χ-100 σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Viral αντιγόνα-ειδικά mAbs αραιώθηκαν 1:200 με το παραπάνω BSA και Triton διάλυμα Χ-100 και επωάστηκαν με τα κύτταρα σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά. FTIC-συζευγμένο πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι IgG ποντικού σε 1:300 αραίωση προστέθηκαν στα κύτταρα για 60 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Οι πλάκες αντιμετωπίζεται με ένα μικροσκόπιο Olympus AX70 (Melville, Νέα Υόρκη) είναι εξοπλισμένα με ένα φίλτρο FITC.

μοντέλα όγκων

Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Ινστιτούτου Ζώων σπουδές στο Albert Einstein College of Medicine. κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκινώματος του τραχήλου CaSki και τα ανθρώπινα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος Hep 3B2.1-7 επιλέχθηκαν ως τα μοντέλα όγκων με βάση την έκφραση του Ε6 και HBx, αντίστοιχα, και tumorigenecity τους σε γυμνά ποντίκια. Έξι εβδομάδων θηλυκών Νυ /Νυ CD1 γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από Charles River εγχύθηκαν στο δεξί πλευρό με 10

7 CaSki ή Hep 3B2.1-7 κύτταρα σε 0,1 ml μέσου ϋΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. CaSki όγκοι άρχισαν να εμφανίζονται περίπου 60 ημέρες μετά την ένεση, Hep 3B2.1-7 όγκων-10 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων. Για βιοκατανομή HBx-ειδικό mAb, γυμνοί ποντικοί εμβολιάστηκαν με 10

7 Α2058 ανθρώπινα μεταστατικά κύτταρα μελανώματος και 10

7 κύτταρα Hep 3B2.1-7 στο δεξί και αριστερό λαγόνες, αντίστοιχα. Πειράματα βιοκατανομής και θεραπεία άρχισαν όταν οι όγκοι έφθασαν 0.3-0.7 cm σε διάμετρο.

Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του HPV Ε6 πρωτεΐνη σε CaSki όγκους

Οι όγκοι που λαμβάνονται από CaSki ποντίκια που φέρουν όγκο σταθεροποιήθηκαν σε