Αφηρημένο

Ιστορικό

Κανονική ομοιόσταση των ιστών συντηρείται από δυναμικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων και μικροπεριβάλλον τους. Διατάραξη αυτής της ομοιόστασης μπορεί να προκαλέσει ανώμαλο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την προσκόλληση, τη λειτουργία και τη μετανάστευση που θα μπορούσαν να προάγουν κακοήθη συμπεριφορά. Πράγματι, παρεκκλίνουσα στρωματικά-επιθηλιακών αλληλεπιδράσεις συμβάλλουν στην πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (PDAC) διάδοση και τη μετάσταση, και αυτό αυξάνει την πιθανότητα ότι νέες θεραπείες στρώμα στοχευμένες αντιπροσωπεύουν επιπλέον προσεγγίσεις για την καταπολέμηση αυτής της κακοήθους νόσου. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η επίδραση των ανθρώπινων στρωματικών κυττάρων που προέρχονται από το λιπώδη ιστό (ADSC) επί του πολλαπλασιασμού παγκρεατικών κυττάρων του όγκου.

Principal Εκτίμηση

συνκαλλιέργεια παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με ADSC και ADSC-ρυθμισμένο μέσο δείγμα από διαφορετικούς δότες ανέστειλε τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό. ADSC μεσολάβηση ανασταλτική επίδραση επεκτάθηκε περαιτέρω σε άλλους επιθηλιακού καρκίνου που προέρχεται από κυτταρικές σειρές (ήπαρ, του παχέος εντέρου, του προστάτη). ADSC κλιματιζόμενο προκαλούμενη μέσο καρκίνο νέκρωση των κυττάρων μετά τη σύλληψη G1 φάσης, χωρίς αποδεικτικά στοιχεία της απόπτωσης.

In vivo

, ένα ενιαίο ενδονεοπλαστική ένεση ADSC σε ένα μοντέλο αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος προκάλεσε μια ισχυρή και μακράς διαρκείας αναστολή της ανάπτυξης του όγκου.

Συμπέρασμα

Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ADSC αναστέλλουν ισχυρά τον πολλαπλασιασμό PDAC, τόσο

in vitro

και

in vivo

και προκαλεί κυτταρικό θάνατο καρκινικών μεταβάλλοντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Ως εκ τούτου, ADSC μπορεί να αποτελέσει ένα δυναμικό που βασίζεται σε κύτταρα θεραπευτική εναλλακτική για τη θεραπεία της PDAC για τα οποία δεν αποτελεσματική θεραπεία είναι διαθέσιμη

Παράθεση:. Ξάδελφος Β, Ravet Ε, Poglio S, De Toni F, Bertuzzi Μ, Lulka H, et al. (2009) Ενηλίκων στρωματικά κύτταρα που προέρχονται από τα ανθρώπινα λιπώδη ιστό τηλέφωνα προκαλούν καρκίνο του παγκρέατος Θάνατος τόσο

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 4 (7): e6278. doi: 10.1371 /journal.pone.0006278

Επιμέλεια: Ειρήνη Oi-Lin Ng, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 24 Φεβρουαρίου 2009? Αποδεκτές: 31 Μαΐου 2009? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιουλίου 2009

Copyright: © 2009 Ξάδελφος et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από επιχορηγήσεις από περιφέρεια Midi-Pyrenees, Ligue Nationale Contre Καρκίνος le και Cancrople το Grand Sud-Ouest (EMERGEANCE). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κανονική ομοιόσταση των ιστών συντηρείται από δυναμικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος τους. Το μικροπεριβάλλον αποτελείται από εξωκυτταρική μήτρα, τα στρωματικά κύτταρα, τα μεταναστευτικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και των νευρικών στοιχείων υποστηρίζεται από ένα αγγειακό δίκτυο, όλα μέσα σε ένα περιβάλλον κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων. Κύτταρα αλληλεπιδρούν με το μικροπεριβάλλον μέσω πολύπλοκων αυτοκρινείς και παρακρινείς μηχανισμούς. Πολλαπλές αποδείξεις δείχνουν ότι διαταράσσουν αυτή την ομοιόσταση μπορεί να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρεκκλίνουσα, προσκόλληση, τη λειτουργία και τη μετανάστευση που θα μπορούσαν να προάγουν κακοήθη συμπεριφορά [1] – [3]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αλλάξει την αντίληψη των στρωματικών κυττάρων που περιβάλλουν επιθηλιακών όγκων. Αυτά τα κύτταρα δεν είναι σε αδράνεια τους παρευρισκομένους, αλλά ενεργοί συμμετέχοντες που διαμορφώνουν τη συχνότητα και τα χαρακτηριστικά των όγκων. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα οι ίδιοι μπορούν να μεταβάλλουν παρακείμενο στρώμα τους για να σχηματίσουν ένα επιτρεπτικό και υποστηρικτικό περιβάλλον για την εξέλιξη του όγκου [1] – [3].

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα και ινοβλάστες στρωματικά εκτενώς αποδειχθεί για την υποστήριξη νεοπλασματική διαδικασία [4 ] – [11], όταν οστών που προέρχονται μυελό μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (ΒΜ-MSC) ευνοούν έμμεσα την ανάπτυξη του όγκου μετά από συστημική ανοσοκαταστολή [12], ή την παραγωγή των προ-αγγειογενετική κυτταροκίνες [13] – [15]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της BM-MSCs επί του πολλαπλασιασμού των όγκων διαφέρουν ανάλογα με τον τύπο του όγκου: BM-MSCs προώθηση του μαστού, το μελάνωμα και τον καρκίνο του παχέος εντέρου που προέρχονται κύτταρα πολλαπλασιασμού [16], [17], όταν αναστέλλουν τη

in vivo

αύξηση των κυττάρων σάρκωμα Kaposi [18]. Λιπώδη ιστό, όπως μυελός των οστών, περιέχει στρωματικά κύτταρα ονομάζονται ADSCs για λιπώδη που προέρχονται από στρωματικά κύτταρα. Αυτός ο πληθυσμός μερίδια πολλά από τα χαρακτηριστικά του BM-MSCs, συμπεριλαμβανομένων ανοσορρυθμιστικά αποτελέσματα [19], και σε πολλαπλές δυνατότητες διαφοροποίησης [20] – [29]. Μετά την έγχυση

in vivo

, ADSCs παρουσιάζει αναγεννητικές ιδιότητες, είτε με άμεση συμμετοχή στην νεοσυσταθείσα ιστούς ή /και μέσω της παραγωγής των αυξητικών παραγόντων που στηρίζουν αυτή την αναγέννηση [23], [25], [30]. Αν και στρωματικά κύτταρα από μυελό των οστών και το λιπώδη ιστό φαίνεται να σχετίζεται στενά, αξιοσημείωτες διαφορές έχουν αναφερθεί [19], [31] – [34]. Η ικανότητα των ADSCs να υποστηρίξει τον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων σε μεγάλο βαθμό συζητηθεί.

In vitro

, επεκτάθηκε ADSCs μεσολάβηση καταστολή των αλλογενών πολλαπλασιασμού λεμφοκυττάρων [35]. Αντιφατικά αποτελέσματα ελήφθησαν

in vivo

, όταν συν-ένεση του ADSCs με καρκίνο του μαστού, του παχέος εντέρου, του προστάτη, μη μικροκυτταρικό πνεύμονα ή γλοιοβλαστώματος καρκίνος προερχόμενα κύτταρα οδήγησε σε αρχική υποστήριξη της ανάπτυξης του όγκου [36] – [38]. Για να διευκρινιστεί τέτοια διαφορά, μελετήσαμε την επίδραση της ADSCs επί κύτταρα παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα προέλευσης. Μεταξύ των συμπαγών όγκων, πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (PDAC) χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά πυκνά δεσμοπλαστικού διείσδυση του [39], [40]. PDAC είναι μια ιδιαίτερα επιθετική νόσο χωρίς θεραπευτική λύση, και εξακολουθεί να είναι η πέμπτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις δυτικές χώρες [41]. Επειδή παρεκκλίνουσα στρωματικά-επιθηλιακών αλληλεπιδράσεις συμβάλλουν στην PDAC εξάπλωση και μετάσταση, υποθέτουμε ότι η στόχευση του στρώματος του όγκου μπορεί να αντιπροσωπεύει μια επιπλέον προσέγγιση για την αντιμετώπιση PDAC. Εδώ, αποδεικνύουν την ικανότητα της ανθρώπινης ADSCs (hADSCs) για τη μείωση PDAC προερχόμενα ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων,

in vitro

και

in vivo

, και να επάγουν τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων μετά τη σύλληψη G1 φάσης .

Αποτελέσματα

Ανθρώπινο ADSCs ασκούν ανασταλτική επίδραση στην PDAC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές

Κατ ‘αρχάς, hADSC φαινότυπος προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής (Συμπληρωματική Κείμενο S1) για να επιβεβαιώσει ότι τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται εμφανίζονται φαινοτυπικά χαρακτηριστικά συνήθως περιγράφεται για ADSCs [22], [23]. Πράγματι, FACS αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι ADSC ήταν CD34, CD90, CD73 και HLA ABC θετική, ενώ CD45 και CD31 αρνητικό (Συμπληρωματική Εικόνα S1). Στη συνέχεια προσδιορίζεται το

in vitro

επίδραση της hADSCs στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων PDAC. Καλλιεργήσαμε PDAC προερχόμενα κύτταρα Capan-1 παρουσία του ADSCs απομονώθηκαν από 25 διαφορετικούς υγιείς δότες χρησιμοποιώντας μεμβράνες μεταξύ φρεατίων για την πρόληψη κυττάρου προς κύτταρο επικοινωνία. Μετά από 48 ώρες συν-καλλιέργειες, ADSC εμφάνισε μια ισχυρή εξαρτώμενη από τη δόση ανασταλτική επίδραση στην PDAC προερχόμενο αριθμό κυττάρων, όπως καταδεικνύεται στο σχήμα 1Α. Πράγματι, ο αριθμός των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ήταν σημαντικά μειώθηκε κατά 36,5% ± 4,8% με την παρουσία 1:01 αναλογία ADSCs, σε σύγκριση με τον έλεγχο.

A. Αύξηση αναλογίες ADSC και κυττάρων Capan-1 συν-καλλιεργήθηκαν παρουσία του transwell επί 48 ώρες σε πλήρες μέσο ανάπτυξης. Capan-1 κύτταρα πολλαπλασιασμός ποσοτικοποιήθηκε στη συνέχεια με μέτρηση των κυττάρων. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± S.E. από τρία ξεχωριστά πειράματα με ADSCs από διαφορετικούς δότες. κύτταρα Β Καρκίνος από διαφόρων προελεύσεων καλλιεργήθηκαν παρουσία ρυθμισμένου μέσου ADSC (CM) για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με MTS χρησιμοποιώντας το One Λύση CellTiter 96® Υδατικό Δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό των τιμών που λαμβάνονται σε συνθήκες ελέγχου. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± S.E. από τρία ξεχωριστά πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με ADSC-CM από διαφορετικούς δότες. C. κύτταρα Capan-1 καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες με Capan-1, BM-MSC ή ADSC-CM. αριθμό κυττάρων Capan-1 ποσοτικοποιήθηκε όπως στο Α Οι τιμές είναι μέσοι ± S.E. από τρία ξεχωριστά πειράματα με ADSCs και MSCs από διαφορετικούς δότες. *: P & lt? 0,05. ***? p & lt?. 0.001

Η

Το εμπλουτισμένο μέσο από ADSCs αναστέλλει τη βιωσιμότητα πολλών καρκινικών κυττάρων

Η απουσία της άμεσης επαφής των κυττάρων-να-κυττάρων σε πειραματικό περιβάλλον μας, μας ώθησε να ελέγξετε αν ADSCs -conditioned μέσο (CM) μπορεί επίσης να επηρεάσει τη βιωσιμότητα του καρκίνου-κυττάρων. Πράγματι, διαλυτούς παράγοντες έχουν προηγουμένως καταδειχθεί ότι προκαλεί την ανοσοκατασταλτική επίδραση της ανθρώπινης ADSCs [19]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, ADSC-CM από μόνη της ανέστειλε σημαντικά όχι μόνο η βιωσιμότητα αρκετών παγκρεατικών κυττάρων αδενοκαρκινώματος προερχόμενα (Capan-1, Capan-2, BxPC3, MIAPaCa-2), αλλά και η βιωσιμότητα των κυττάρων ηπατοκαρκινώματος προερχόμενων ( ΗυΗ7, HepG2), του παχέος εντέρου που λαμβάνεται από καρκίνο-κύτταρα (Caco-2), και του καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή (PC3). Σε αντίθεση, ADSC υπερκείμενο καλλιέργειας είχε μικρό, εάν υπάρχει, επίδραση στα κύτταρα Hela που προέρχονται από καρκίνο του τραχήλου ή MCF-7, μία κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού. Επειδή, οι παρατηρούμενες αποκρίσεις μπορεί να αντανακλούν εξάντληση των θρεπτικών συστατικών από τα μέσα ενημέρωσης και /ή μη ειδική συσσώρευση των τοξικών μεταβολιτών, χρησιμοποιήσαμε ρυθμισμένο μέσο από μόνο του ως μάρτυρας καρκινικά κύτταρα, μαζί με BM-MSC-CM. Σε αντίθεση με ADSC-CM, θεραπεία του καρκίνου κυττάρων είτε με Capan-1 ή BM-MSC-CM δεν περιορίζουν σημαντικά την βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων αν και μια τάση μείωση παρατηρήθηκε με το τελευταίο (σχήμα 1C).

ADSC-ρυθμισμένο μέσο αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και επάγει τον κυτταρικό θάνατο καρκινικών

για να αναλυθεί το δυναμικό αποτέλεσμα του ADSC-CM επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, Capan-1 επωάστηκαν σε παρουσία BrdU με ή χωρίς ADSC-CM. FACS ανάλυση πραγματοποιήθηκε μετά από κύτταρο μετουσίωση και επώαση με ιωδιούχο προπίδιο. BrdU ενσωματώνεται κατά τη φάση S (πύλη Ρ4) ενώ χρώση με ιωδιούχο προπίδιο επιτρέπει διάκριση μεταξύ 2Ν (Ο0 /Ο1, πύλη Ρ2) και 4Ν (G2 /M, πύλη Ρ3) χρωμοσώματα (Σχήμα 2Α). Dot οικόπεδα περίφραξη σε μονά κύτταρα έδειξαν ότι ο αριθμός των Capan-1 κύτταρα σε φάση G0 /G1 έτεινε να αυξάνει όταν τα κύτταρα στη φάση S μειώθηκε σημαντικά κατά 10% με την παρουσία ADSC-CM (σχήμα 2Β).

Α. κύτταρα Capan-1 καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς ADSCs προστέθηκε ρυθμισμένο μέσο. 48 ώρες αργότερα, τον πολλαπλασιασμό και το DNA περιεχόμενο αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ενσωμάτωσης BrdU και ιωδιούχο προπίδιο όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Dot οικόπεδα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν με ADSCs δείγματα από διαφορετικούς δότες. Β Ποσοτικοποίηση της ανάλυσης του κυτταρικού κύκλου με τη χρήση του λογισμικού ModFit. Capan καλλιεργούνται σε συνθήκες ελέγχου εκπροσωπήθηκαν σε μαύρες μπάρες σε αντίθεση με Capan αντιμετωπίζονται με ADSC-CM εκπροσωπούνται στο ανοικτό μπαρ. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± S.E. από τρία ξεχωριστά πειράματα με ADSCs από διαφορετικούς δότες. C. κύτταρα Capan-1 σπάρθηκαν σε πλάκες 4 θαλάμων για 48 ώρες με ή χωρίς ADSC-CM. κατάτμηση DNA μετρήθηκε με TUNEL (αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων). D. Capan-1 καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελέγχου (μαύρες στήλες) ή σε επεξεργασία με υπερκείμενα ADSC (ανοικτές ράβδοι) προσδιορίστηκαν για Αννεξίνη και προπίδιο επισήμανση ιωδιούχο όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± S.E. από τρία ξεχωριστά πειράματα με ADSCs από διαφορετικούς δότες. ***: P & lt? 0.001

Η

επόμενο καθορίσει αν ADSC-CM θα μπορούσαν να επηρεάσουν τον κυτταρικό θάνατο.. Για το σκοπό αυτό, θα παρακολουθείται πρώτα κατάτμηση του DNA σε κύτταρα Capan-1 με προσδιορισμό TUNEL. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2C, PDAC προερχόμενο κατακερματισμού του DNA των κυττάρων ήταν έντονα επάγεται από ADSC-CM. Είμαστε δίπλα ποσοτικά τον αριθμό των καρκινικών κυττάρων που εισέρχονται απόπτωση ή /και νεκρωτικές μετά από έκθεση σε ADSC-CM. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εικόνα 2D δείχνουν ότι ADSC-CM προκάλεσε μία 3-πλάσια αύξηση στην ιωδιούχο προπίδιο-θετικά, νεκρωτικών κυττάρων, χωρίς ενδείξεις πρώιμης απόπτωσης παρακολουθούνται από την επισήμανση αννεξίνης. Και πάλι, CM από BM-MSC ήταν αναποτελεσματικό σε σημαντική μεταβολή της βιωσιμότητας των κυττάρων του όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

όγκου κυτταρικού θανάτου που επάγεται από ADSC ρυθμισμένο μέσο μεσολαβείται μέσω της αναστολής της προόδου του κυτταρικού κύκλου

επόμενη διερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο καρκινικών κυττάρων κύκλου συλλαμβάνεται από ADSC-CM. Μετρήσαμε την έκφραση των κύριων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Βρήκαμε ότι ADSC-CM προκαλείται από μια βαθιά αναστολή της Rb φωσφορυλίωσης σε κύτταρα Capan-1, χωρίς καμία επίδραση στην έκφραση της πρωτεΐνης (Σχήμα 3Α, 3Β). Αισθητά έκφραση της CDK4 και Κυκλίνη D1, οι οποίες είναι κρίσιμες για το Rb φωσφορυλίωσης, μειωμένη ταυτόχρονα. Έκφραση της κυκλίνης Ε, η οποία δεν εμπλέκεται στη μετάβαση G1-S, παρέμεινε αμετάβλητος (Σχήμα 3Α? 3Β). Σπουδαιότητας, Δεν βρέθηκαν αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης διασπασμένη κασπάση 3, κασπάση-8, κασπάση-9, κασπάσης-6, caspase-7, και PARP μετά από αγωγή των κυττάρων με ADSC-CM (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επίσης, τα επίπεδα έκφρασης του κυτοχρώματος C, BclXl και Bcl2 παρέμεινε σχετικά αμετάβλητος σε πειραματικές ρυθμίσεις μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

A. κύτταρα Capan-1 καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς ADSC-CMfor 48 ώρες. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια εκχυλίζεται και υποβάλλεται σε ανοσοκηλίδωση για τις υποδεικνυόμενες πρωτεϊνών όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. B. Η ποσοτικοποίηση της ανοσοαποτύπωσης πυκνότητας σε καλλιέργειες ελέγχου (μαύρες μπάρες) ή καλλιέργειες που έλαβαν θεραπεία με ADSC-CM (ανοιχτό μπαρ). Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± S.E. από τρία ξεχωριστά πειράματα με ADSCs από διαφορετικούς δότες. *: P & lt? 0,05? **: P & lt? 0,01

Η

ADSCs μειώσει το

in vivo

ανάπτυξη των ανθρώπινων παγκρεατικών όγκων

επόμενο επεκταθεί ADSCs αντιπολλαπλασιαστική δραστηριότητες στην αναστολή της παγκρεατικής όγκων. ,

in vivo

. Έτσι, οι ανθρώπινοι όγκοι PDAC καθορίστηκαν σε αθυμικούς ποντικούς μετά την υποδόρια ένεση των Capan-1 κύτταρα ως ένα πολύ επιθετικό μοντέλο PDAC [42], [43]. Δεκατέσσερις έως δεκαεπτά ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου, μία μόνο δόση ADSCs, που αντιστοιχεί σε 10

3 ADSCs /mm

3 του όγκου μεταφέρθηκε

in vivo

σε αναπτυσσόμενους όγκους. όγκοι ελέγχου ενέθηκαν είτε με φορέα ή με παραφορμαλδεΰδη (PFA) στερεωμένο ADSCs. Οι καρκίνοι μάρτυρες αναπτύχθηκαν ταχέως, με μέσο όρο 4,076 ± 556 mm

3 σε μέγεθος από 28 ημέρες μετά την εμφύτευση (Σχήμα 4Α, 4Β). Σε αντίθεση, η ανάπτυξη των Capan-1 όγκων λαμβάνουν ένεση ADSC αναστάλθηκε ισχυρώς (2556 ± 232 mm

3? Σχήμα 4Α, 4Β). Η αναστολή της παγκρεατικής την εξέλιξη του όγκου ανάπτυξη έφθασε -58% ± 8,9% (ρ & lt? 0.001), δύο εβδομάδες μετά από μία μόνο ένεση εντός του όγκου ADSCs (σχήμα 4C). βάρος του όγκου μειώθηκε επίσης σημαντικά μετά την εμφύτευση ADSCs (έλεγχος: 4,6 g ± 0,8 vs ADSCs έλαβαν 2,2 g ± 0,2, p & lt? 0,05). Όπως φαίνεται στο σχήμα 4D, ανάπτυξη των όγκων ένεση είτε με όχημα ή PFA αγωγή ADSCs ήταν συγκρίσιμα, δείχνοντας ότι η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου δεν οφειλόταν σε μη ειδική επίδραση της διάσχισης του όγκου και εξαρτάται από την έκκριση ADSC, αντίστοιχα.

όγκοι Capan-1 εμφυτεύθηκαν σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς (τέσσερις να έξι ζώα ανά ομάδα), όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Δύο εβδομάδες αργότερα, ADSC εγχύθηκαν εντός του όγκου, και η πρόοδος στη συνέχεια παρακολουθούνται. Α Εκπρόσωπος εκτομή των όγκων από αθυμικά γυμνά ποντίκια 15 ημέρες μετά την παραλαβή καμία θεραπεία (αριστερά) ή ένα μόνο εντός του όγκου δόση των 5 × 10

5 ADSCs (δεξιά). B. Ο όγκος του ελέγχου (μαύρα σύμβολα) ή ADSC κατεργασία (ανοιχτά σύμβολα) όγκους παρακολουθήθηκε κάθε 2 ημέρες, έως και 28 ημέρες μετά την εμφύτευση (13 ημέρες μετά την ένεση ADSCs). Γ Ποσοστό ελέγχου (μαύρες μπάρες) ή ADSC αγωγή (ανοιχτό μπαρ) την εξέλιξη του όγκου μετρήθηκε κατά το χρόνο που αναφέρεται παρακάτω

in vivo

ADSCs ένεση. D. Οι όγκοι εγχύθηκαν είτε με έκδοχο, PFA σταθερό ADSCs ή ADSCs και την πρόοδο τους μετρήθηκε 6 ημέρες μετά την παράδοση εντός του όγκου των κυττάρων. Ε ιστολογικές τομές παγκρεατικών όγκων εγχέεται ή όχι με ADSC αναλύθηκαν για πολλαπλασιασμό με Κί67 ανοσοχρώση (δείκτης σήμανσης Ki67, άνω πλαίσιο) ή για κατάτμηση DNA με TUNEL δοκιμασίας (κάτω πίνακας), 6 ημέρες μετά την ένεση ADSC. Το ποσοστό των επισημασμένων πυρήνων μετρήθηκε σε 15 πεδία σε υψηλή μεγέθυνση (χ 400) με τη χρήση του συστήματος ανάλυσης visiolab 2000. Όλα τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά των 3 έως 4 ανεξάρτητα πειράματα (3 έως 5 όγκων ανά ομάδα) πραγματοποιήθηκε με ADSCs δείγμα από διαφορετικούς υγιείς δότες. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± S.E. *: P & lt? 0,05? **: P & lt? 0,01? ***: P & lt? 0,01

Η

Στη συνέχεια ερευνήσαμε τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στις επιπτώσεις της ανθρώπινης ADSCs για PDAC όγκους

in vivo

.. Οι όγκοι αντιμετωπίζονται ή όχι με ADSCs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία για τον πυρηνικό αντιγόνο Κί67 με σκοπό τον εντοπισμό πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα (σχήμα 4Ε, άνω πλαίσιο), ή υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανάλυση TUNEL να ποσοτικοποιηθεί νεκρά κύτταρα (σχήμα 4Ε, κάτω πλαίσιο), 6 ημέρες μετά την έγχυση . Ποσοτικοποίηση της ανοσοχρώσης έδειξε μια σημαντική μείωση στον αριθμό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, σε όγκους ADSCs μεταφερόμενης σε σύγκριση με τον έλεγχο (-66,5% ± 3,8%? Ρ & lt? 0,01). Επιπλέον, ADSCs προκάλεσε μία 5-πλάσια αύξηση στον κυτταρικό θάνατο σε παγκρεατικά καρκινώματα, όπως μετράται με τη δοκιμασία TUNEL.

Συζήτηση

αποδεικνύεται στην παρούσα μελέτη ότι τα ανθρώπινα ADSCs δείγμα από ένα μεγάλο πάνελ διαφορετικούς υγιείς δότες εξασθενημένη αποτελεσματικά την ανάπτυξη ενός πολύ επιθετικό καρκίνο, δηλαδή PDAC, τόσο

in vitro

και

in vivo

με αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την προώθηση θάνατο των καρκινικών κυττάρων εξής G

1 -φάση μπλοκ. Το τελευταίο ανασταλτική επίδραση επεκτάθηκε σε κακοήθεις κυτταρικές σειρές από διαφορετικές προελεύσεις.

Αρκετοί από μας

in vitro

παρατηρήσεις που αναφέρονται εδώ δείχνουν ότι ADSCs έχουν την ικανότητα να παρεμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου με μεταβολή εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η

in vitro

μοριακά δεδομένα έδειξαν ότι τα καρκινικά κύτταρα που είχαν έρθει σε επαφή με ADSC-CM ήταν σε κατάσταση ηρεμίας (G

0 /G

1), και προς τα κάτω ρύθμιση CDK4 και cyclinD1. Είναι ενδιαφέρον, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει είτε εξωγενή ή ενδογενή μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο με απόπτωση μετά την έκθεση των καρκινικών κυττάρων να ADSCs ρυθμισμένο μέσο. Αυτή η ικανότητα να παρεμβαίνει με κυτταρικό κύκλο έχει ήδη περιγραφεί για τα στρωματικά κύτταρα ποικίλης προέλευσης [44], [45]. Ανωμαλίες του G

ρυθμιστές μετάβαση 1-S, και πιο συγκεκριμένα της οδού Rb, έχουν αναγνωρισθεί ως σημαντικοί παράγοντες στην ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκίνων. Κατά συνέπεια, η ρύθμιση της CDK είναι ένα σημαντικό στόχο για την πρόληψη και τη θεραπεία των όγκων που μπορεί να εξηγήσει γιατί ADSCs αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προέρχονται από πολλαπλούς επιθηλιακούς καρκίνους.

Η χρήση του ADSC ως όχημα στη γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου έχει πρόσφατα προτείνει [36], [46], [47]. Πράγματι ADSCs γενετική μηχανική για να μετατρέψει αντικαρκινική προφάρμακο μπορεί να είναι αποδοτικά οχήματα να αναστέλλει ισχυρώς την ανάπτυξη των ξενομοσχευμένων ανθρώπινου κόλου ή προστάτη όγκους [36], [46]. Ωστόσο, λίγες μόνο μελέτες που δείχνουν αντικρουόμενα αποτελέσματα έχουν διεξαχθεί με την αφελή κύτταρα που απομονώνονται από το λιπώδη ιστό [36] – [38], [48]. Αυτές οι αποκλίσεις μπορεί να εξηγηθεί από τη διαδικασία της απομόνωσης και πέρασμα ADSC, ο αριθμός των κυττάρων που εγχέονται και οι διαδικασίες που χρησιμοποιούνται για

in vivo

ή

in vitro

μελέτες. Πράγματι, σε ορισμένες μελέτες, ADSC εγχύθηκαν

in vivo

μαζί με τα καρκινικά κύτταρα, έτσι ώστε είναι δύσκολο να συγκριθούν τα αποτελέσματα των ADSC επί εγκατεστημένα όγκων (σε αυτή τη μελέτη) έναντι αναπτυσσόμενο όγκο [36] – [38 ]. Επιπλέον, ορισμένα δεδομένα ελήφθησαν με κύτταρα ποντικού [38], ενώ το μοντέλο μας είναι φτιαγμένο από ανθρώπινα κύτταρα, και καρκινικά κύτταρα από διαφόρων προελεύσεων χρησιμοποιήθηκαν, αν και αποδείξαμε ότι ADSC-CM δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων στην ίδια έκταση. Τελευταίο και όχι λιγότερο σημαντικό, η φύση του ADSC ποικίλλει ανάλογα με τις διάφορες μελέτες, δεδομένου ότι στις περισσότερες περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν [36] – [38], [48], ενώ πραγματοποιήσαμε πειράματα με πρωτογενείς καλλιέργειες. Αυτό μπορεί να είναι σημαντικό ως ADSC φαινότυπο και δυνητικά λειτουργία τροποποιούνται με διόδους [49]. Αυτή η μεταβλητότητα στις πιθανές επιδράσεις των στρωματικών κυττάρων επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων έχει επίσης περιγραφεί σε μελέτες με μυελό των οστών μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα [16] – [18], υποδηλώνοντας ότι διαφορετικοί μηχανισμοί μπορεί να ενέχονται σύμφωνα με διάφορους παράγοντες που απομένουν να προσδιοριστεί. Για παράδειγμα, έχουμε αποδείξει ότι εδώ κύτταρο σε επαφή κύτταρο δεν είναι πλήρως αναγκαίο, όπως παρατηρήθηκαν αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα τόσο σε μελέτες άμεσης συν-καλλιέργειας χρησιμοποιώντας Transwell (καμία επαφή κύτταρο) και σε πειράματα χρησιμοποιώντας ADSCs ρυθμισμένο μέσο. Σε αντίθεση, Khakoo

κ.ά.

απέδειξαν πρόσφατα ότι BM-MSCs που εξασκείται μία ισχυρή antioncogenic επίδραση στο σάρκωμα Kaposi μέσω κύτταρο σε επαφή κυττάρου και Akt αδρανοποίηση [18]. Αυτό ήταν αργότερα επιβεβαιώθηκε

in vitro από

Ramasamy

et al

[45].

Ο προσδιορισμός των μηχανισμών που εμπλέκονται στην στρωματικά και τα καρκινικά κύτταρα αλληλεπιδράσεις και ιδιαίτερα το εκκρίνονται παράγοντα υπεύθυνα για την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του ADSC βρίσκεται υπό έρευνα. Πολλοί υποψήφιοι που εκκρίνεται από ADSCs (όπως ΤΟΡ β1, SDF1, RANTES), ιντερλευκίνες (όπως IL6, IL1 β, IL8, GSF, IL11) ή προσταγλανδίνες (PGE2, PGI2, PGJ2) είναι γνωστό ότι ασκούν ένα αντι-πολλαπλασιαστική /pro -apoptotic αποτέλεσμα. Τα μεταναστευτικά μελέτες που πραγματοποιήθηκαν με Capan αποκάλυψε ότι ADSC-CM δεν παρουσιάζουν δραστηριότητα χημειοελκτική (Συμπληρωματική Εικόνα S2, και κείμενο S1), υποδηλώνοντας ότι ο παράγοντας που εμπλέκεται στην ADSC αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση δεν είναι μια χημειοκίνη. Πρόσφατα, PGs έχουν αποδειχθεί να μεσολαβούν ADSCs μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση αναστολής [35]. Κατά την προετοιμασία αυτού του χειρογράφου, μια μελέτη πρότεινε ότι DKK-1 μπορεί να είναι ένας από αυτούς τους παράγοντες (48). Η IL-6 έχει εμπλακεί πρόσφατα στην προστασία των φυσιολογικών και προκακοήθεις επιθηλιακά κύτταρα από την απόπτωση σε κολίτιδα που σχετίζεται με καρκίνο (50). Αυτό υποδηλώνει ότι αυτή η ιντερλευκίνη μπορεί να παίξει απέναντι ρόλους ανάλογα με τη φλεγμονώδη κατάσταση, το στάδιο του όγκου και /ή τον τύπο.

In vivo

, πήραμε ένα ακόμη αποτελεσματικό, αλλά παροδική αντι-πολλαπλασιαστική δράση επί της προόδου των όγκων. GFP-επισημασμένο ADSCs ανιχνεύθηκαν γύρω περιφερικά αγγεία του όγκου και εντός του κεντρικού και περιφερικού ακυτταρικό και νεκρωτικές περιοχές του όγκου, μέχρι 5 ημέρες μετά την ένεση (Σχήμα Συμπληρωματική S3 και κείμενο S1). Με βάση αυτή την παρατήρηση, η συγκέντρωση και /ή την ημιζωή των διαλυτών παραγόντων που ευθύνονται για την αντι-πολλαπλασιαστική /καταπολέμησης των όγκων είναι πιθανόν να μην επαρκούν για να διατηρήσουν τα καρκινικά κύτταρα σε κατάσταση ηρεμίας για μεγάλο χρονικό διάστημα, αλλά είναι επαρκείς για να αρχικά ανταγωνίζονται τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Τέτοια παροδική επίδραση μπορεί να διασωθεί από πολλαπλά, ενδοογκική ένεση ADSCs. Παρέχοντας τα ανθρώπινα κύτταρα σε ένα ξενομόσχευμα ποντικού με ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να οδηγήσει σε μια μη-ειδική ανοσολογική απόκριση ξενογενή εντός του αποδέκτη για την εξουδετέρωση

in vivo

ογκογένεση. Ωστόσο, επειδή (i) κύτταρα Capan-1 δεν εκφράζουν MHC από τάξης Ι και II (τα δεδομένα δεν φαίνονται), και (ii) αθυμικά ποντίκια ανοσοποιητικό σύστημα (μόνο μέσω κυττάρων ΝΚ) είναι λιγότερο σημαντική από ό, τι σε ανοσοποιητικού ζώων, μπορούμε λογικά αποκλείουν μη-ειδική ανοσολογική απόκριση στην παρατηρούμενη επίδραση. Λαμβάνοντας υπόψη την ικανότητα του ADSC να συμμετάσχουν στο σχηματισμό αγγειακών δομή που μοιάζει με [23], δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ένα ειδικό προ-αγγειογενετική δράση του ADSC στο πλαίσιο της ανάπτυξης παγκρεατικού όγκου. Ωστόσο, αυτή η επίδραση, αν υπάρχει, φαίνεται να είναι ήσσονος σημασίας κατά το στάδιο της νόσου, δηλαδή κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης της ανάπτυξης του όγκου, όπως εξετάσαμε σε αυτό το έργο. Επιπλέον, δεν μπορέσαμε να προσδιοριστούν οι αλλαγές στην αγγειακή πυκνότητα, είτε από ποντικό ή ανθρώπινης προέλευσης, μετά ένεση εντός του όγκου ADSCs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εναλλακτικές αλλαγές στη ADSCs φαινότυπο μετά από ενδοογκική ένεση θα πρέπει να παρακολουθούνται προσεκτικά. Πράγματι, έχουμε πρόσφατα έδειξαν ότι ADSCs απέκτησε ταχέως και μαζικά υψηλές φαγοκυτταρική δραστηριότητα και το δείκτη, όταν εγχέεται μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα γυμνών ποντικών [51].

Συνολικά, το έργο μας αντιπροσωπεύει την πρώτη μελέτη χρησιμοποιώντας μη τροποποιημένα κύτταρα να θεραπεία PDAC. Αυτή η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του ADSC επί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα διαμεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει από ένα εκκρινόμενο παράγοντα αλλά είναι επίσης δελεαστικό να υποθέσουμε ότι

in vivo

ADSC μπορεί να τροποποιήσει το μικροπεριβάλλον του όγκου και έτσι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό του . Εν κατακλείδι, ADSCs ικανότητα να μπλοκάρουν G

μεταβατική φάση 1-S και στη συνέχεια για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων

in vitro

και

in vivo

μπορεί να είναι μια αποτελεσματική και εφικτή προσέγγιση για την επεξεργασία του 85% των ασθενών PDAC που δεν μπορεί να λειτουργήσει σε μια θεραπευτική τρόπο οφείλεται σε τοπικά προχωρημένη νόσο.

ηθική Δήλωση Υλικά και Μέθοδοι

η

λιπώδη ιστό του Ανθρώπου ήταν λαμβάνεται ως απόβλητα από αισθητικές επεμβάσεις. Όλοι οι ασθενείς έδωσαν την έγγραφη συγκατάθεσή τους. Οι διαδικασίες αυτές εγκρίθηκαν από το περιφερειακό ηθική επιτροπή «Comité de προστασία des personnes Sud Ouest et Outre Mer Ι».

Χημικά

Για την πέψη του λιπώδους ιστού, κολλαγενάση αγοράστηκε από την Roche (Roche Diagnostic, Γερμανία). αλβουμίνη βόειου ορού (BSA), δεξαμεθαζόνη, φωσφορικό ασκορβικό-2, παντοθενικό οξύ, και συμπλήρωμα σεληνικό ινσουλίνη-τρανσφερίνης-νάτριο αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St. Quentin Fallavier, France). Εμβρύου ορό μόσχου (FCS), θρυψίνη, DMEM, RPMI-1640, fungizone, πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη, και PBS παρασχέθηκαν από την Invitrogen (Cergy Pontoise-Γαλλία). Εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) για τον πολιτισμό ADSC αγοράστηκε από την Perbio (Παρίσι, Γαλλία). Ο πράκτορας antimycoplasma, Plasmocin ™ παρέχεται από InvivoGen (Τουλούζη, Γαλλία).

καλλιέργεια κυττάρων του όγκου

Capan-1, Capan-2, BxPC-3, ΜΙΑΡΑΟΑ-2 και Panc-1 κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ανθρώπινα PDAC καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [52]. ΗυΗ7 και HepG2 κύτταρα, που προέρχονται από ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται αλλού [53]. PC3 (ανθρώπινος καρκίνος του προστάτη) και κυττάρων Caco-2 (ανθρώπινο καρκίνωμα κόλου) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ 1 g μέσου γλυκόζης /λίτρο συμπληρωμένο με 10% FCS. HeLa (ανθρώπινο τραχηλικό καρκίνωμα), καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ 4,5 g /l μέσου γλυκόζη συμπληρωμένο με 10% FCS. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με fungizone, αντιβιοτικά, L-γλουταμίνη, και αντιδραστήριο antimycoplasma (Plasmocin ™, InvivoGen). Τα κύτταρα διατηρούνται σε θερμοκρασία 37 ° C και 5% CO2.

Ανθρώπινο ADSCs προετοιμασία και τον πολιτισμό

Ανθρώπινο ADSCs ελήφθησαν δείγματα από 20 υγιείς δότες. Stroma αγγειακό κλάσμα απομονώθηκε από ανθρώπινο λιπώδη ιστό που λαμβάνεται από δερμολιπεκτομή του κοιλιακού τοιχώματος στο τμήμα χειρουργική πλαστικό του Rangueil Hospital (Τουλούζη, Γαλλία) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Εν συντομία, SVF κύτταρα τοποθετήθηκαν σε φιάλες Τ75 τη διάρκεια της νύχτας σε DMEM-F12 (1:01) μέσο συμπληρωμένο με 5% FBS, 100 μg /ml παντοθενικό οξύ, 100 μΜ ασκορβικό οξύ, 16 μΜ βιοτίνη, 250 μg /ml αμφοτερικίνη, 5 μg /ml στρεπτομυκίνη και 5 U /ml πενικιλίνη. Μετά από 24 ώρες, οι καλλιέργειες πλύθηκαν εκτενώς με τη χρήση PBS για να απομακρυνθεί η απομένουσα μη προσκολλημένα κύτταρα. ανάπτυξη HADSC συνεχίστηκε έως ότου τα κύτταρα έφθασαν το 75% συμβολή (διέλευση 0).

In vitro

εκτίμηση του αριθμού των κυττάρων

50 × 10

3 Capan-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI για 24 ώρες σε πιάτα 35-mm, πριν από ασιτία ορού για 16 ώρες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν με την παρουσία ή όχι του ADSCs ή BM-MSCs ρυθμισμένο μέσο για άλλες 48 ώρες. Τα κύτταρα ελέγχου καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 (1:01) μέσο συμπληρωμένο με 5% FBS. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με μέτρηση κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα Coulter μετρητή μοντέλο ΖΜ. Για δοκιμασίες συν-καλλιέργεια, τα κύτταρα Capan-1 πρώτα επιστρώθηκαν σε κυτταρική καλλιέργεια ένθετα με 4 μm πόρους (BD Biosciences) σε πλήρες μέσο για 24 ώρες. Μετά από ένα βήμα στέρηση από 16 ώρες, τα κύτταρα Capan-1 μεταφέρθηκαν σε πιάτα 35-mm με την παρουσία ADSCs σε διαφορετικές αναλογίες. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν με ADSCs και MSCs καθαρίστηκαν από διαφορετικούς υγιείς δότες.

In vitro

κυτταρικής βιωσιμότητας δοκιμασία

Τα κύτταρα στόχοι (15 × 10

3) καλλιεργήθηκαν σε πλήρες θρεπτικό μέσο σε επίπεδο πυθμένα πλάκες των 96 φρεατίων για 24 ώρες, πριν από την ασιτία ορού για 16 ώρες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν με την παρουσία ή όχι του ADSC-ρυθμισμένο μέσο για άλλες 48 ώρες. Τα κύτταρα ελέγχου καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 (1:01) μέσο συμπληρωμένο με 5% FBS. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία MTS, σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (υδατικό Δοκιμασία CellTiter96, Promega Γαλλία, Charbonnieres, France). Τα πειράματα διεξήχθησαν με ADSCs καθαρίζεται από διαφορετικούς υγιείς δότες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό των τιμών που λαμβάνονται σε συνθήκες ελέγχου.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου

Capan-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ADSCs-CM, όπως περιγράφεται στο

«in vitro εκτίμηση του αριθμού των κυττάρων»

ενότητα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ BrdU (Sigma Aldrich) για 4 ώρες στους 37 ° C. Capan συλλέχθηκαν, πλύθηκαν μία φορά σε PBS στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο 70% αιθανόλη 1 ώρα στους 4 ° C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 600 g, πλένονται σε PBS που περιέχει BSA 0,5% και Tween-20 0.5%, και επαναιωρήθηκε σε HCl 2Ν και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό βορικού νατρίου (0,1 Μ, ρΗ 9) για την εξουδετέρωση υπολειμματικό οξύ. Τα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-BrdU μονοκλωνικό αντίσωμα (Becton Dickinson) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύσεις, τα κύτταρα Capan-1 επαναιωρήθηκαν σε προπιδίου διάλυμα χρώσης ιωδίδιο (5 μg /ml) πριν από την ανάλυση επί cyotmeter ροής (CantoII, Becton Dickinson). Για αννεξίνης-V και ιωδιούχο προπίδιο ανίχνευση, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με είτε αννεξίνη-FITC (Apoptotest FITC, DakoCytomation) ή ιωδιούχου προπιδίου (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας BD FACS Calibur (Beckton Dickinson) και Cell Quest Pro λογισμικού (Beckton Dickinson).

ΤΟΥΝΕΛ

δοκιμασίες

Ανίχνευση του κυτταρικού θανάτου από TUNEL δοκιμασία επί Capan-1 όγκων έγινε όπως περιγράφεται αλλού [42]. Για

In vitro

προσδιορισμούς κυτταρικού θανάτου, 50 × 10

3 Capan-1 κύτταρα σπάρθηκαν σε γυάλινα πλακίδια σε 4 φρεατίων (slide θάλαμος Lab-Tek II, Nalge Nunc International, Naperville IL) σε πλήρες μέσο για 24 ώρες. Μετά ασιτία ορού για 16 ώρες, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν με την παρουσία ή όχι του ADSC-CM για άλλες 48 ώρες. Τα κύτταρα ελέγχου καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 (1:01) μέσο συμπληρωμένο με 5% FBS. Η ανίχνευση των αρχικών σταδίων της κατανομής χρωμόσωμα πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Apopdetek, σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (ApopDETEK, Enzo επιστήμες της ζωής, Farmingdale, NY, USA).

Western Blot ανάλυση

Οι πρωτεΐνες που προέρχονται από το κύτταρα Capan-1, διαχωρίστηκαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές, και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης όπως περιγράφεται αλλού [53]. Μετά τον αποκλεισμό για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, κηλίδες επωάστηκαν με αντισώματα που αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc (Χαϊδελβέργη, Γερμανία) που διατυπώθηκαν κατά cyclinD1 (sc-124), CDK4 (sc-260), κυκλίνη (sc-247), βactin (SC-8432) ή γλυκεραλδεΰδες-3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) (sc-24778). Rb και phosphospecific αντισώματα Rb ήταν από την Cell Signaling Technology (Ozyme, St Quentin en Yvelines, Γαλλία). Προστέθηκαν Δευτερογενής συζευγμένο με HRP αντισώματα (Perbio Science, Erembogdegem-Aalist, Βέλγιο), και τα στυπώματα επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου.