Αφηρημένο

Ιστορικό

Ακράτεια βιοδείκτες έχουν τη δυνατότητα να βελτιώσουν την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Τα περισσότερα από τα διάφορα γνωστά δείκτες, ωστόσο, έχουν μόνο αξιολογηθεί σε μελέτες με το σχεδιασμό διατομής. Για τη σωστή επικύρωση μια διαχρονική σχεδίαση θα ήταν προτιμότερο. Χρησιμοποιήσαμε τον υποψήφιο UroScreen μελέτη για την αξιολόγηση survivin, μια πιθανή βιοδείκτη που έχει πολλαπλές λειτουργίες στην καρκινογένεση.

Μέθοδοι /Αποτελέσματα

Σουρβιβίνης αναλύθηκε σε 5.716 δείγματα ούρων από 1.540 χημικές εργαζόμενοι προηγουμένως εκτεθεί σε αρωματικά αμίνες. Οι εργαζόμενοι συμμετείχαν σε πρόγραμμα επιτήρησης με ετήσιες εξετάσεις μεταξύ 2003 και 2010. Το RNA που εξάγεται από ουρική κύτταρα και survivin προσδιορίστηκε από την Real-Time PCR. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, 19 όγκοι της ουροδόχου κύστης ανιχνεύθηκαν. Πολυμεταβλητή γενικευμένη εξίσωση εκτίμησης (GEE) μοντέλα έδειξαν ότι η β-ακτίνη, που αντιπροσωπεύει την απόδοση και την ποιότητα του RNA, είχε την ισχυρότερη επιρροή στην survivin θετικότητα. Φλεγμονή, αιματουρία και το κάπνισμα δεν συγχέουν τα αποτελέσματα. Survivin είχε ευαισθησία 21,1% για το σύνολο και 36,4% για όγκους υψηλής ποιότητας. Ειδικότητα ήταν 97,5%, η θετική προγνωστική αξία (PPV) 9,5%, και η αρνητική προγνωστική αξία (NPV) 99,0%.

Συμπεράσματα

Σε αυτή την προοπτική και μέχρι τώρα μεγαλύτερη μελέτη σχετικά με survivin, ο δείκτης παρουσίασε καλό NPV και εξειδίκευση αλλά χαμηλή PPV και ευαισθησία. Αυτό οφείλεται εν μέρει στο χαμηλό αριθμό των περιπτώσεων, γεγονός που περιορίζει την εγκυρότητα των αποτελεσμάτων. Η συμμόρφωση, την ποιότητα των ούρων, τα προβλήματα με την δοκιμασία, και η σταθερότητα του mRNA επηρέασε την απόδοση της survivin. Ωστόσο, τα περισσότερα προβλήματα θα μπορούσαν να αντιμετωπιστούν με μια πιο αξιόπιστη δοκιμασία για το μέλλον. Ένα σημαντικό εύρημα είναι ότι survivin δεν επηρεάστηκε από συγχυτικούς παράγοντες όπως η φλεγμονή και παρουσίασαν ένα σχετικά χαμηλό αριθμό των ψευδώς θετικών. Ως εκ τούτου, παρά τη χαμηλή ευαισθησία, η survivin μπορεί να εξακολουθεί να θεωρείται ως ένα συστατικό ενός πάνελ multimarker

Παράθεση:. Johnen G, Gawrych Κ, Bontrup Η Pesch Β, Taeger D, Banek S, et al. (2012) Απόδοση του Survivin mRNA ως βιοδεικτών για καρκίνο της ουροδόχου κύστης στη μελέτη προγνώσεων UroScreen. PLoS ONE 7 (4): e35363. doi: 10.1371 /journal.pone.0035363

Επιμέλεια: Όλγα Γ Gorlova, το Πανεπιστήμιο του Τέξας Μ D. Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4, Ιανουαρίου, 2012? Αποδεκτές: 14 Μαρ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 του Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Johnen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Fujirebio Diagnostics , Inc. (ΑΞΕ? Malvern, ΡΑ? https://www.fdi.com) έδωσε αντιδραστήρια survivin σε κανένα κόστος. Μέρος της μελέτης υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση (FB093 για AS) του γερμανικού Κοινωνικής Ασφάλισης Ατυχημάτων (DGUV? Sankt Augustin, Γερμανία? https://www.dguv.de), από την Abbott Laboratories (Abbott Park, IL? Http: //www.abbottmolecular.com) που παρέχονται κιτ UroVysion, και Matritech /Alere GmbH (Κολωνία, Γερμανία? https://www.alere.com) που παρέχονται κιτ NMP22 ELISA. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Ο συγγραφέας GL είναι ένας υπάλληλος της Currentâ GmbH & amp? Co. OHG. FE και MN είναι υπάλληλοι της BASF SE. AS λάβει δωρεάν κιτ δοκιμασίας από την Abbott Laboratories και Matritech /Alere GmbH. AS έλαβε επίσης τα ταξίδια επιχορηγήσεις από Matritech /Alere. GJ λάβει δωρεάν αντιδραστήρια ανάλυσης από την Fujirebio Diagnostics, Inc. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι συγγραφείς δηλώνουν καμία άλλη ανταγωνιστικών συμφερόντων.

Εισαγωγή

καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι μία από τις κορυφαίες καρκίνων στις ΗΠΑ και στην Ευρώπη. Στη Γερμανία, η συχνότητα εμφάνισης είναι περίπου 29.000 περιπτώσεις ανά έτος [1]. Λόγω του υψηλού ποσοστού υποτροπής του όγκου, η στενή παρακολούθηση και επαναλαμβανόμενη χρήση των θεραπειών είναι απαραίτητες. Κατά συνέπεια, καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι το πιο δαπανηρό νόσος καρκίνος [2]. Οι όγκοι της ουροδόχου κύστης μπορεί να προκληθεί από επαγγελματική έκθεση σε αρωματικές αμίνες, αλλά το κάπνισμα θεωρείται ότι είναι η ισχυρότερη συμβολή στην ανάπτυξη αυτών των κακοηθειών [3].

Η διαθεσιμότητα αποτελεσματικών θεραπειών, η πρόσβαση προς τη οργάνων στόχων μέσω των ούρων, και η σχετικά καλή συνολική επιβίωση κάνει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης έναν υποψήφιο για τα προγράμματα προσυμπτωματικού ελέγχου σε πληθυσμούς υψηλού κινδύνου [4]. Δυστυχώς, κυστεοσκόπηση, το οποίο είναι το τρέχον πρότυπο χρυσού για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, είναι μια επεμβατική και μάλλον επώδυνη μέθοδο. Σε ορισμένες χώρες υψηλού κόστους μπορούν επίσης να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο [4]. Αυτά τα γεγονότα εμποδίζουν κυστεοσκόπηση από το να χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο ομάδες. Σε αντίθεση, οι δείκτες του ουροποιητικού όγκου είναι μη επεμβατικές εργαλεία για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Τυπικές δείκτες είναι πρωτεΐνες, RNA, DNA, μεταβολίτες, ή κυτταρική χαρακτηριστικά, τα οποία έχουν το πλεονέκτημα ότι μπορούν να προσδιορίζονται σε δείγματα ούρων [5], [6]. Από τα πολυάριθμα γνωστά δείκτες, όμως, μόνο λίγοι έχουν δοκιμαστεί σε προοπτικές μελέτες ή μελέτες και ήταν επιτυχής πρέπει να εγκριθεί από το FDA. Ως εκ τούτου, πιο μακροχρόνιες μελέτες είναι απαραίτητες για να αποδείξει την αξία αυτών των δεικτών για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου και των κλινικών αποφάσεων [7].

Survivin είναι μια σχετικά μικρή πρωτεΐνη 16,4 kDa που κωδικοποιείται από το γονίδιο

BIRC5

[8], [9]. τρισδιάστατη δομή της επιλύθηκε και πρότεινε μια λειτουργία προσαρμογέα ή σύνδεσης [10], [11]. Δέσμευση σε μια σειρά άλλων μακρομορίων έχει πράγματι αποδειχθεί και survivin προέκυψε ως κεντρικός κόμβος πολλαπλά κυψελοειδή δίκτυα [9], [12] – [14]. Ενώ survivin ανήκει στην αναστολέας της οικογένειας γονιδίων απόπτωσης (ΙΑΡ) λειτουργίες του δεν περιορίζεται σε ένα ρυθμιστικό ρόλο στην απόπτωση. Άλλες λειτουργίες είναι ο έλεγχος της κυτταρικής διαίρεσης και χρωμόσωμα διαχωρισμού, προαγωγή του πολλαπλασιασμού, αντίδραση στο στρες και την αγγειογένεση, και αυτό παίζει ένα ρόλο στη μετάσταση [9], [15] – [19]. Δυσλειτουργία του survivin ήταν επομένως να επηρεάσει τέσσερις από τις έξι λεγόμενη «χαρακτηριστικά γνωρίσματα του καρκίνου» στο μοντέλο της ογκογένεσης περιγράφεται από Hanahan και Weinberg, γεγονός που υποδηλώνει μια κεντρική λειτουργία της survivin στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου [20].

οι πολλαπλές μηχανιστική ρόλους της survivin αντικατοπτρίζονται επίσης σε ευρεία εμφάνισή της σε όλα τα στάδια της ανάπτυξης του όγκου, αν και με προτεραιότητα σε μεταγενέστερα στάδια σε διάφορες καρκίνους [21] – [25]. Σουρβιβίνης υπερεκφράζεται στους περισσότερους ανθρώπινους καρκίνους, αλλά σπανίως ανιχνεύσιμη σε υγιείς ιστούς ενηλίκων [8], [26]. Έχει, ως εκ τούτου, έχουν προταθεί ως πιθανός δείκτης όγκου και στόχος για θεραπεία [8], [27]. Λόγω του γεγονότος ότι η μη επεμβατική ανίχνευση σε δείγματα ούρων είναι δυνατό, η survivin μπορεί να χρησιμοποιηθεί ειδικά για τη διαλογή των ουρογεννητικών κακοηθειών. Αρκετές μελέτες, κυρίως του σχεδιασμού της διατομής και με ένα σχετικά περιορισμένο αριθμό περιπτώσεων, έχουν αποδείξει ότι η survivin είναι ένας υποσχόμενος υποψήφιος για περαιτέρω επικύρωση σε μακροχρόνιες μελέτες [28] – [34]. Shariat

et al.

Πραγματοποιηθεί μια μεγαλύτερη προοπτική μελέτη σχετικά με υποτροπιάζοντα καρκίνο της ουροδόχου κύστης, που βασίστηκε στην ανοσοϊστοχημική χρώση των δειγμάτων όγκου. Στο παρόν, survivin βελτίωσε την πρόβλεψη της υποτροπής και της επιβίωσης σε μια υποομάδα ασθενών [21]

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε survivin στην προοπτική ομάδα ελέγχου UroScreen [35] -. [37] χρησιμοποιώντας ένα mRNA- με βάση δοκιμασία προκειμένου να επικυρώσει τη λειτουργία του ως καρκινικός δείκτης για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Αποτελέσματα

Οι συμμετέχοντες της κλάσης UroScreen ήταν εν ενεργεία ή συνταξιούχοι χημική εργαζομένων με τον πρώην έκθεση σε αρωματικές αμίνες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35] – [37]. Εξετάστηκαν μεταξύ Σεπτεμβρίου 2003 και Ιουνίου 2010. Τα δείγματα ούρων συλλέχθηκαν για την κατάσταση των ούρων, κυτταρολογική εξέταση, τον προσδιορισμό των NMP22®, χρωμοσωμικές ανωμαλίες (UroVysion ™), και – αν υπάρχει αρκετό υλικό ήταν διαθέσιμο – για survivin [36], [37] . Για μετρήσεις survivin θα μπορούσαν να ληφθούν 5.716 δείγματα ούρων από 1.540 συμμετέχοντες (Πίνακες 1 και 2). Η μέση ηλικία του ομάδα ήταν 62 έτη (εύρος 27-90 έτη). Από τα 1540 άτομα, 18 ανέπτυξαν όγκους, συμπεριλαμβανομένου ενός ατόμου που ανέπτυξε δύο όγκων κατά τη διάρκεια της μελέτης με αποτέλεσμα σε 19 όγκους στο σύνολο για τη διερεύνηση της survivin. Για άλλες δύο περιπτώσεις που δεν υπάρχει κατάλληλο δείγμα ούρων ήταν διαθέσιμη για τον προσδιορισμό survivin. Από τους 19 όγκους, τρεις ήταν θηλώματα, έντεκα υψηλής ποιότητας, και πέντε όγκοι χαμηλού βαθμού (Πίνακας 3). Κυτταρολογική εξέταση ανιχνεύθηκε οκτώ όγκους. Η δοκιμασία survivin ανιχνεύθηκαν τέσσερις όγκους, όλα από τα οποία ήταν υψηλής ποιότητας. Τρεις από αυτές που ανιχνεύθηκαν επίσης με κυτταρολογία και άλλους δείκτες? ένας ανιχνεύθηκε με survivin και NMP22 μόνο (Σχήμα 1).

Συνολικά 19 όγκοι ανιχνεύθηκαν σε 18 περιπτώσεις. Σουρβιβίνη, κυτταρολογία, NMP22, και UroVysion ανιχνεύθηκαν 13 των όγκων. * Για δύο επιπλέον όγκους (αριθμός 1 και 12), κανένα δείγμα δεν ήταν διαθέσιμη για τον προσδιορισμό survivin.

Η

Η

Η survivin δείκτης όγκου προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία mRNA που βασίζεται δεν ήταν εμπορικά διαθέσιμες. Κατά τη διάρκεια των επτά χρόνια αυτής της διαχρονικής μελέτης, απρόβλεπτα γεγονότα σχετικά με την αξιοπιστία και τη διαθεσιμότητα των στοιχείων προσδιορισμού (κιτ απομόνωσης RNA από Qiagen και Invitek, αντιδραστήρια survivin από ΑΞΕ και IPA) μας ώθησε να τροποποιήσει το σχέδιο δοκιμασία δύο φορές, οδηγώντας σε τρεις διαφορετικές παραλλαγές ανάλυσης (Qiagen /ΑΞΕ, Invitek /ΑΞΕ, Invitek /ΙΡΑ). Έχουμε τυποποιηθεί η survivin αντιγράψετε αριθμούς και θα μπορούσε να αποδείξει με τη χρήση ενός πολυμεταβλητή γενικευμένη εξίσωση εκτίμησης (GEE) μοντέλο που οι παραλλαγές δοκιμασία δεν συγχέουν τα αποτελέσματα των δοκιμών κατά την εφαρμογή των τυποποιημένων αριθμό αντιγράφων survivin (Πίνακας 4). Όλα τα άλλα αποτελέσματα, ως εκ τούτου, προκύπτουν από τις τυποποιημένες τιμές.

Η

Πιθανά προγνωστικοί θετικού αποτελέσματος survivin διερευνήθηκαν όπως φαίνεται στον Πίνακα 4. Οι δείκτες μόλυνσης και φλεγμονής (λευκοκύτταρα), αιματουρία, ή παράγοντες όπως η ηλικία, το κάπνισμα, ή το προηγούμενο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης δεν έδειξε σημαντική επίδραση στα επίπεδα survivin. Η «συγκέντρωση» (ειδική πυκνότητα) του δείγματος ούρων, η οποία αντανακλάται στην ουρική συγκέντρωση κρεατινίνης, έτειναν προς μια αντίστροφη συσχέτιση με survivin, αλλά η επιρροή αυτή δεν ήταν σημαντική. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης που παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια UroScreen ήταν ένας προάγγελος της θετικής δοκιμές survivin (OR 2,54, 95% CI 1,02 – 6,33). β-ακτίνης (OR 3.11, 95% CI 2,51 – 3,85) ήταν ένας τροποποιητής επίδραση, υποδεικνύοντας μία ισχυρή επιρροή της ποσότητας και της ποιότητας του ανακτημένου mRNA στην απόδοση PCR. Μία δεκαπλάσια αύξηση του αριθμού αντιγράφων του β-ακτίνης σχετίστηκε με τριπλάσια υψηλότερη πιθανότητα μιας θετικής δοκιμασίας survivin. Ελέγξαμε εάν β-ακτίνης συσχετίστηκε με την πυκνότητα των ούρων από τον υπολογισμό του συντελεστή βαθμό συσχέτισης του Spearman του. Υπήρξε μια σημαντική, αλλά μόνο ασθενή συσχέτιση του αριθμού αντιγράφων του β-ακτίνης με ουρική κρεατινίνης ως πληρεξούσιος της πυκνότητας των ούρων (r

s 0,17, 95% CI 0,12 – 0,23).

Τα καρκινικά-προγνωστική αξία για survivin παρατίθενται στον πίνακα 5. οι υπολογισμοί έγιναν με βάση τα αποτελέσματα των δοκιμών που λαμβάνονται σε δείγματα ούρων από τον τελευταίο γύρο διαλογής πριν από τη διάγνωση. Survivin φτάσει ευαισθησία 21,1% για όλες τις οντότητες του όγκου, 25,0% για όλους τους όγκους, αλλά χωρίς θηλώματα, και 36,4% μόνο για όγκους υψηλής ποιότητας. Δεν ανιχνεύει οποιοδήποτε από τα πέντε όγκους χαμηλής ποιότητας. Η ειδικότητα ήταν 97.5% σε όλα τα (υπο) ομάδες (όλοι οι όγκοι, όγκοι χωρίς θηλώματα, υψηλής ποιότητας, και οι όγκοι χαμηλού βαθμού). Η θετική προγνωστική αξία (PPV) ανήλθε σε 9,5% σε όλες τις ομάδες, ενώ η αρνητική προγνωστική αξία (NPV) κυμάνθηκε μεταξύ 99,0 και 99,7%.

Η

λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη (ROC) αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τυποποιημένες survivin επίπεδα από τον τελευταίο γύρο διαλογής πριν από τη διάγνωση και προσαρμόζονται για τον log

10 (β-ακτίνη) και την ηλικία των κλάσεων 10 ετών. Είχαν ως αποτέλεσμα στην περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) 0,74 (95% CI 0,61 – 0,86) για όλες τις οντότητες του όγκου (Σχήμα 2), 0,75 (95% CI 0,60 – 0,89) για όλους τους όγκους χωρίς θηλώματα, 0.80 (95% CI 0,66 -0.94) για όγκους υψηλής ποιότητας, και 0,66 (95% CI 0,36 – 0,96) μόνο για τους όγκους χαμηλής ποιότητας. Να κρίνει την απόδοση των παραλλαγών ανάλυσης, υπολογίσαμε προσαρμοσμένο καμπύλες ROC για κάθε παραλλαγή. Οι προκύπτουσες τιμές AUC ήταν 0.70 (95% CI 0,34 – 1,00) για Qiagen /ΑΞΕ, 0.80 (95% CI 0,54 – 1,00) για Invitek /ΑΞΕ, και 0,79 (95% CI 0,67 – 0,91) για την παραλλαγή δοκιμασία Invitek /ΙΡΑ.

η ανάλυση πραγματοποιήθηκε για όλους τους όγκους οντότητες. Η προκύπτουσα περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) ήταν 0,74 με 95% CI (διάστημα εμπιστοσύνης) των 0,61 – 0,86.

Η

Οι πιθανοί λόγοι για αρνητικά αποτελέσματα δοκιμών σε περιπτώσεις συγκεντρώνονται στον Πίνακα 6. Τα τελευταία δείγματα των περιπτώσεων 5 και 10 ελήφθησαν 26 και 18 μήνες πριν από τη διάγνωση των όγκων, αντίστοιχα. Περίπτωση 8 παρουσίασαν θετικό αποτέλεσμα δοκιμασίας 14 μήνες πριν από τη διάγνωση, αλλά το δείγμα λίγο πριν από τη διάγνωση ήταν αρνητική. Όλα τα άλλα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα ήταν σε υποθέσεις με θηλώματα και τους όγκους χαμηλής ποιότητας? 31% συσχετίστηκαν με χαμηλή πυκνότητα των συλλεγμένων ούρων που υποδεικνύεται από χαμηλή κρεατινίνης (& lt? 0,50 g /l), και ένα άλλο 20% ήταν παρομοίως συνδέεται με ακεραιότητα χαμηλό RNA όπως υποδεικνύεται από β-ακτίνης επίπεδα & lt? 2.500 αντίγραφα. Σε σύγκριση, 15% και 11% όλων των αληθινών αρνητικών δειγμάτων στον τελευταίο γύρο διαλογής συσχετίστηκαν με χαμηλή κρεατινίνης και χαμηλή β-ακτίνη, αντίστοιχα.

Η

Συζήτηση

Αν και πολυάριθμες οι εν δυνάμει δείκτες έχουν περιγραφεί για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, κανένας μέχρι στιγμής έχουν εφαρμοστεί στις κλινικές κατευθυντήριες γραμμές για τον έλεγχο ή την κλινική παρακολούθηση για υποτροπή. Ιδανικά, δοκιμασίες δείκτη κατάλληλο για την κλινική πρακτική θα πρέπει να είναι ισχυρή και φθηνή καθώς και γρήγορη και σε μορφή εύκολο στη χρήση, π.χ., ένα τεστ point-of-care [38]. Ωστόσο, πριν μπορεί να βελτιστοποιηθεί το σχήμα δοκιμασίας, η απόδοση του δείκτη η ίδια πρέπει να αξιολογηθεί. Για μοριακούς δείκτες, όπως survivin την ανάπτυξη σταθερών και απλών δοκιμασιών μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενη αν την απόδοσή τους με το παρόν διαθέσιμες δοκιμασίες στον έλεγχο για καρκίνο της ουροδόχου κύστης έχει αποδειχθεί να είναι συγκρίσιμα με ή καλύτερα από εγκεκριμένες δοκιμές. Σε UroScreen, προσδιορίσαμε survivin μια σχετικά πολύπλοκη δοκιμασία όπου θετικά αποτελέσματα των δοκιμών δεν παρακολουθήθηκαν με κυστεοσκόπηση. Συνολικά, survivin ανιχνεύτηκε συγκεκριμένα σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης υψηλής ποιότητας και την απόδοσή του ήταν συγκρίσιμες με τις άλλους δείκτες που εξετάστηκαν. Ωστόσο, mRNA ακεραιότητα ήταν ένας σημαντικός τροποποιητής των θετικών αποτελεσμάτων της εξέτασης, και ως εκ τούτου θα πρέπει να αναπτυχθεί μια πιο ισχυρή δοκιμασία.

Για να αποδείξει την αξία των νέων δεικτών για τη λήψη κλινικών αποφάσεων, οι επιδόσεις τους πρέπει να αξιολογείται κατά τη διαμήκη μελέτες και κλινικές δοκιμές [7]. UroScreen ήταν μια προοπτική μελέτη κοόρτης με περισσότερες από 1.500 χημικές εργαζομένων με στόχο να αξιολογήσει NMP22, UroVysion, και survivin όπως καρκινικών δεικτών [36], [37]. Ήταν η πρώτη προοπτική μελέτη που διερεύνησε την απόδοση του survivin στην πρώιμη ανίχνευση καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Για 19 από τους όγκους της ουροδόχου κύστης που εντοπίστηκαν κατά τη διεξαγωγή της μελέτης επαρκές υλικό δείγμα αφέθηκε για survivin αποφασιστικότητα. Η χαμηλή συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε UroScreen καθώς και στο γενικό πληθυσμό είναι ένα κρίσιμο ζήτημα για τη διαλογή καρκίνου της ουροδόχου κύστης [4]. UroScreen ιδρύθηκε ως επέκταση ενός ήδη καθιερωμένο πρόγραμμα επιτήρησης στη χημική εργαζομένων [35]. Οι αρχικούς υπολογισμούς ισχύος βασίστηκαν σε πρώην στοιχεία που δείχνουν εκείνη την εποχή μια υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης όγκων στον πληθυσμό της μελέτης [39]. Επί του παρόντος, η συχνότητα εμφάνισης σε αυτό το πρωτότυπο ομάδα υψηλού κινδύνου έχει φτάσει σε ένα επίπεδο πιο κοντά σε εκείνο του γενικού πληθυσμού, λόγω της απαγόρευσης των καρκινογόνων αρωματικών αμινών από τη χρήση στις δεκαετίες χημική βιομηχανία πριν. Είναι επίσης πιθανό ότι η τεχνολογική πρόοδος και τα μέτρα για τη βελτίωση της ασφάλειας στην εργασία συμβάλλει στη μείωση της συχνότητας εμφάνισης καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε αυτή την ομάδα των εργαζομένων από δύο μεγάλες εταιρείες χημικών. Επιπλέον, η μέση ηλικία της κλάσης UroScreen το 2010 ήταν 62 έτη, ενώ η μέση ηλικία για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης για τους άνδρες στη Γερμανία ήταν 72 ετών [1].

Έχει αποδειχθεί ότι η έκφραση πριν από survivin είναι υψηλότερη και συχνότερα σε όγκους υψηλής ποιότητας ή μεταγενέστερα στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου [21], [23] – [25]. Σύμφωνα με αυτή την παρατήρηση, survivin δεν εντόπισε περιπτώσεις με θήλωμα ή καρκίνο της ουροδόχου κύστης χαμηλού βαθμού UroScreen, ενώ η ευαισθησία ήταν καλύτερη για όγκους υψηλής ποιότητας. Αν αυτό μπορεί να επιβεβαιωθεί, survivin μπορεί να είναι ένα χρήσιμο συμπλήρωμα για την παρακολούθηση των ασθενών με ταχύτερα αναπτυσσόμενους όγκους, όπου η ανίχνευση θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν νωρίτερα. Εδώ, μια μη επεμβατική πάνελ ενδεικτών θα ήταν μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την ανίχνευση υποτροπής νωρίτερα και να μειώσει τον αριθμό των κυστεοσκοπήσεων [40]. Παρ ‘όλα αυτά, μεμονωμένα μοριακών δεικτών που σήμερα δεν υπάρχει επαρκής ευαισθησία για την αντικατάσταση κυστεοσκόπηση [38].

Ο μικρός αριθμός των περιπτώσεων περιστατικό περιορίζεται η ισχύς της μελέτης για την αξιολόγηση της απόδοσης των δεικτών όγκου και συνέβαλε στη χαμηλή PPVs τους. Προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες έδειξαν ειδικότητες μεταξύ 88% και 100% και ευαισθησίες μεταξύ 53% και 100% [28] – [30], [32] – [34]. Ενώ τα αποτελέσματα μας έδειξαν παρόμοια ειδικότητα (98%) της ευαισθησίας (21%) ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε αυτήν την μελέτη κοόρτης. Εν μέρει, αυτό μπορεί να οφείλεται στις διαφορετικές δοκιμασίες που εφαρμόζονται. Ο κύριος λόγος για τις διαφορές πιθανότερο είναι, ωστόσο, η εγκάρσια τομή του σχεδιασμού μελέτη των άλλων μελετών [41]. Σημαντικές ελλείψεις είναι η έλλειψη υπόψη η διάσταση του χρόνου, προκειμένου να υπολογίσει προγνωστική αξία, καθώς και μια πιθανή προκατάληψη επιλογής επειδή οι περιπτώσεις και οι έλεγχοι έχουν προσληφθεί από διαφορετικούς πληθυσμούς. Η διαμήκης και έτσι υποψήφιους σχεδιασμός της μελέτης UroScreen αποφεύγει αυτό προκατάληψη. Αντιπροσωπεύει επίσης μια ρύθμιση που είναι πιο κοντά στην κλινική πρακτική.

Παρατηρήσαμε διάφορους λόγους που μπορεί να ευθύνονται για το γεγονός ότι οι υποθέσεις δεν διαπιστώθηκαν στη μελέτη κοόρτης μας. Η έλλειψη συμμόρφωσης σε μια μελέτη εθελοντική προσυμπτωματικού ελέγχου είναι ένα τυπικό πρόβλημα που επηρεάζει την έγκαιρη ανίχνευση των περιπτώσεων. Για τους περισσότερους από τους συμμετέχοντες της μελέτης, τα δείγματα δεν ήταν διαθέσιμες για κάθε συνεχή χρονιά. Σε αρκετές περιπτώσεις, η διαφορά μεταξύ απόκτηση δείγματος και διάγνωση των όγκων ήταν περισσότερο από δώδεκα μήνες, σε μία περίπτωση ακόμη και 26 μήνες. Μπορεί να αναμένεται ότι η αύξηση των επιπέδων δείκτη είναι λιγότερο πιθανό με ένα αυξανόμενο χρονικό διάστημα μεταξύ της συλλογής και τη διάγνωση του δείγματος. Ένα άλλο πρόβλημα ήταν ότι οι συμμετέχοντες ακυρώνεται συχνά ούρα λίγο πριν από την άφιξή τους για ένα ραντεβού και, επομένως, τα ούρα συλλέγονται επί τόπου ήταν ανεπαρκής ως προς την ποιότητα ή /και την ποσότητα για μερικές από τις δοκιμές δείκτη. Αυτό το είδος των ούρων που συνήθως συνδέονται με χαμηλή κρεατινίνη, ένα μικρό αριθμό των ιζημάτων των κυττάρων, και το χαμηλό της β-ακτίνης.

Από την άποψη της σύγχυσης, survivin ήταν λιγότερο επηρεασμένος από NMP22 και UroVysion από την κατάσταση των ούρων [36], [37]. Σύμφωνα με το GEE μοντέλο, η κρεατινίνη και λευκοκύτταρα δεν επηρεάζουν τα αποτελέσματα των δοκιμών για survivin. Καθώς οι λοιμώξεις της ουροδόχου κύστης που παρατηρήθηκε συχνά στους ηλικιωμένους, είναι σημαντικό ότι φλεγμονώδεις διαδικασίες δεν επηρεάζουν μια δοκιμή όγκου. Αυτό είναι ένα πλεονέκτημα η δοκιμασία survivin έχει ειδικότερα πάνω NMP22, το οποίο είναι γνωστό ότι είναι συχνά ψευδώς θετικά όταν οι συμμετέχοντες υποφέρουν από λοιμώξεις. Αυτό αντανακλάται στην μείωση του αριθμού των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων της δοκιμασίας survivin σε σύγκριση με την NMP22 δοκιμασία [37]. Παρά την περιορισμένη ευαισθησία η σχετικά υψηλή ειδικότητα μπορεί να επιτρέψει survivin να προστεθούν σε έναν πίνακα δείκτη. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι δοκιμές θετική survivin δεν οδηγήσει σε σύσταση για κυστεοσκόπηση. Ως αποτέλεσμα, υπάρχει μια πιθανότητα ότι μερικές όγκοι μπορεί να έχουν παραμείνει απαρατήρητα και ότι υποτιμήσαμε την απόδοση της survivin. Αυτό βλάπτει την σύγκριση με την απόδοση των FDA-εγκεκριμένων δοκιμών, δηλαδή NMP22 και UroVysion. Η δοκιμασία survivin ήταν θετική για μία περίπτωση (4β) που δεν είχε ανιχνευθεί από κυτταρολογική ή UroVysion. Survivin ήταν επίσης θετικό για τον αριθμό υπόθεση 8, το οποίο δεν ανιχνεύθηκε με τους προσδιορισμούς που βασίζονται σε κύτταρα 14 μήνες πριν από τη διάγνωση. Και οι δύο περιπτώσεις επιπλέον δοκιμαστεί θετικά από NMP22. Ωστόσο, περισσότερες περιπτώσεις θα πρέπει να αποδείξει το σημείο ότι η έκφραση που βασίζονται σε δείκτες όπως η survivin μπορεί να συμπληρώνει το κύτταρο-based δοκιμασίες UroVysion και κυτταρολογική εξέταση.

Ένα ειδικό θέμα με την ποσοτικοποίηση των survivin ήταν η δυσκολία να διατηρηθεί η ποιότητα μιας ακόμα σε πειραματικό στάδιο δοκιμασία για μια περίοδο αρκετών ετών. Αυτό μπορεί να είναι ένα σχέδιο-ειδικό πρόβλημα προοπτικές μελέτες κοόρτης σε σύγκριση με μελέτες διατομής. Προβλήματα που οφείλονται σε μεταβολές του αρχικού κιτ απομόνωσης RNA και τη διακοπή της παραγωγής των αντιδραστηρίων προσδιορισμού από τον αρχικό προμηθευτή οδήγησε σε τρεις παραλλαγές δοκιμασία που οδήγησε σε διαφορετικές τιμές αποκοπής για survivin θετικότητα. Οι ασυνέχειες εμπόδισε τον προσδιορισμό μιας βέλτιστης συνολικής cut-off για το πλήρες σύνολο δεδομένων. Εμείς ομαλοποιηθεί τους αριθμούς αντιγράφου και υλοποίησε την δοκιμασία στο μοντέλο GEE ως εν δυνάμει παράγοντας σύγχυσης για να ελέγξετε εάν η υπολειμματική σύγχυση θα μπορούσαν να βρεθούν με τα τυποποιημένα στοιχεία survivin. Η δοκιμασία δεν επηρέασε τα αποτελέσματα του τεστ, αλλά β-ακτίνης κατέληξε να είναι ένας σημαντικός τροποποιητής των αποτελεσμάτων των δοκιμών. Φαίνεται πιθανό ότι η εξειδίκευση της survivin μειώθηκε εάν περισσότερα από τα δείγματα ούρων ήταν υψηλότερο συμπυκνώθηκε. Ωστόσο, η συγκέντρωση της β-ακτίνης δεν ήταν απλώς μια συνάρτηση της πυκνότητας των ούρων, επειδή η συσχέτιση με κρεατινίνη ήταν ασθενής, υποδεικνύοντας ότι άλλοι παράγοντες όπως η ακεραιότητα του mRNA μπορεί να συνέβαλαν στην απόδοση του β-ακτίνης στις αντιδράσεις PCR.

Εκτός από αυτές τις απρόβλεπτες μεθοδολογικά τους παράγοντες που επηρέασαν τη δοκιμασία, η ευρέως χρησιμοποιούμενη μορφή του mRNA για τον εντοπισμό survivin συνέβαλε επίσης στη συνολική απόδοση της δοκιμασίας. Η ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε με αντίγραφα του β-ακτίνης αξιολογήθηκε ως η ισχυρότερη επίδραση στα αποτελέσματα των δοκιμών. Η λογική πίσω από τη χρήση ενός mRNA που βασίζεται δοκιμασίας για survivin ήταν να είναι σε θέση να ανιχνεύσει ακόμη και ασθενή σήματα από survivin που είναι παρούσες στα μικρούς αριθμούς απολέπιση ουροθηλιακό κυττάρων. PCR και RT-PCR είναι κομψά και καλά καθιερωμένες μεθόδους για την ενίσχυση και τον ποσοτικό προσδιορισμό πολύ μικρών ποσοτήτων νουκλεϊνικών οξέων. Παρ ‘όλα αυτά, η χαμηλή σταθερότητα του mRNA σε γενικές γραμμές, ακόμη και με την προσθήκη αναστολέων RNase, περιορίζει τη δυνατότητα εφαρμογής αυτών των δοκιμασιών για δείγματα που συλλέγονται εκτός των ελεγχόμενες συνθήκες ενός εργαστηρίου ρύθμιση. Υπάρχουν καλύτεροι αναστολείς της RNase διαθέσιμες σήμερα που θα απαλλάξει ακόμη και με την αναγκαιότητα του δείγματος κατάψυξη [42]. Όμως, η προσθήκη αυτών των συντηρητικών στο δείγμα πρέπει να είναι άμεση. Ένας πιθανός τρόπος για να αποφευχθούν οι καθυστερήσεις θα είναι ένα ειδικό σωλήνα συλλογής, παρόμοιες με εκείνες που χρησιμοποιούνται για τη συλλογή αίματος, το οποίο περιέχει ήδη το συντηρητικό. Ένα άλλο πρόβλημα σύμφυτο με την δοκιμασία survivin που χρησιμοποιήθηκε ήταν η μη γραμμικότητα που προκαλείται από τα δύο στάδια ενισχύσεως PCR-based που περιόριζε την ακρίβεια του ποσοτικού προσδιορισμού και στρατηγικές για την κανονικοποίηση. Ακόμη και εφαρμόζοντας β-ακτίνης, η οποία χρησίμευσε ως εσωτερικός μάρτυρας, για διόρθωση δεν ήταν πάντοτε επαρκής για να αντισταθμίσει τις μεγάλες διακυμάνσεις στην περιεκτικότητα mRNA στα δείγματα, πιθανώς λόγω του επιπλέον στάδιο προ-ενίσχυσης του προσδιορισμού survivin. Για το λόγο αυτό, για κλινικές ρυθμίσεις υπό πραγματικές συνθήκες, περισσότερο σταθερά μόρια όπως οι πρωτεΐνες μπορεί να είναι καλύτερη στόχους. Ενώ ένα PCR-σαν ενίσχυση των πρωτεϊνών δεν είναι δυνατόν, οι δοκιμασίες ELISA που βασίζονται μπορεί να επιτύχει πολύ καλές ευαισθησίες και είναι τώρα διαθέσιμα για survivin σε καλύτερη ποιότητα από κατά την έναρξη της μελέτης UroScreen.

Μέχρι σήμερα, UroScreen είναι η μεγαλύτερη προοπτική μελέτη για την αξιολόγηση survivin για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε μία ομάδα ασυμπτωματικών συμμετεχόντων. Παρά τον μικρό αριθμό των περιπτώσεων περιστατικό, πολύτιμες πληροφορίες έχει αποκτηθεί σχετικά με την απόδοση του mRNA που βασίζεται σε ανάλυση των survivin, τεχνικές προκλήσεις, η επιρροή της συγχυτικούς παράγοντες, και του καρκίνου προγνωστική αξία. Μια πιο ισχυρή δοκιμασία θα επωφελούνταν σημαντικά τον δείκτη και τη χρήση της στην κλινική πρακτική. Survivin μπορεί να έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει την ανίχνευση, ειδικά όγκων υψηλής ποιότητας? ευαισθησία της, ωστόσο, στηρίζεται σε μόνο τέσσερις όγκους (19), που ανιχνεύθηκαν με τρεις διαφορετικές παραλλαγές του προσδιορισμού. Η υψηλή εξειδίκευση σημαίνει ότι survivin μπορεί να θεωρηθεί για να χρησιμεύσει ως μέρος ενός πίνακα multimarker να συμπληρώσει άλλους δείκτες, αλλά περαιτέρω επικύρωση σε μια προοπτική μελέτη με περισσότερες περιπτώσεις είναι δικαιολογημένη. Δοκιμές survivin μέσα σε μία ομάδα των ασθενών με υψηλό κίνδυνο υποτροπής όγκων θα ήταν μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση.

Υλικά και Μέθοδοι

πληθυσμού Μελέτη και διάγνωση των όγκων

Οι συμμετέχοντες είχαν προσληφθεί από την ODIN (Organisationsdienst für nachgehende Untersuchungen) ομάδα στο πλαίσιο του προγράμματος επιτήρησης της υποχρεωτικής ασφάλισης ατυχήματος της χημικής βιομηχανίας που προσφέρει ετήσιες εξετάσεις των ενεργών και των συνταξιούχων οι οποίοι έχουν εκτεθεί σε αρωματικές αμίνες. Από Σεπτέμβριος 2003 – Ιούνιος 2010 1.609 άνδρες εργαζόμενους σε δύο μεγάλες χημικές τοποθεσίες στη Γερμανία (subcohort Α: BASF, Ludwigshafen? Subcohort Β: Bayer, Leverkusen) συμμετείχαν στη μελέτη UroScreen. 1.540 από αυτές που προβλέπονται επαρκές δείγμα υλικού για μετρήσεις survivin. Ένα ερωτηματολόγιο εφαρμόστηκε για να τεκμηριώσουν τις καπνιστικές συνήθειες και τις σχετικές ασθένειες. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Tübingen (Νο 1 /2003V).

Όπως και στις άλλες δοκιμασίες του όγκου (κυτταρολογική εξέταση, NMP22®, UroVysion ™) εφαρμόστηκε σε UroScreen εγκρίθηκαν σε αντίθεση με survivin , είχε χαμηλότερη προτεραιότητα όταν υλικό δείγματος ήταν περιορισμένη. Ως εκ τούτου, μόνο 5.716 από τα 7.091 δείγματα ούρων ήταν διαθέσιμα για τις μετρήσεις survivin. Τα χαρακτηριστικά της σειράς ασθενών συνοψίζονται στους Πίνακες 1-2 και περιγράφονται με περισσότερες λεπτομέρειες αλλού (Pesch et al., που υποβλήθηκε και [37]). Θετικά αποτελέσματα δοκιμών για κυτταρολογική εξέταση, NMP22®, ή UroVysion ™ οδήγησε σε μια σύσταση για την εξέταση κυστοσκοπικές, ενώ θετικά αποτελέσματα για τη δοκιμασία μη εγκεκριμένη survivin δεν το έκανε.

Από το Νοέμβριο του 2011, 21 όγκοι σε 20 άτομα ανιχνεύθηκαν με κυστεοσκόπηση και επιβεβαιώθηκε με παθολογία αναφοράς. Για 18 από τις περιπτώσεις (19 όγκοι) δείγματα ούρων ήταν διαθέσιμα για τον προσδιορισμό survivin. Μία περίπτωση είχε δύο όγκους (4α και 4β στον Πίνακα 3). Τα ιστοπαθολογικά ευρήματα όλων των 21 όγκους και τις παραμέτρους των αντίστοιχων δειγμάτων ούρων (στρογγυλό τελευταίο έλεγχο πριν από τη διάγνωση ενός όγκου) απεικονίζεται στον Πίνακα 3 και στο [37].

συλλογή ούρων

Τα δείγματα ούρων συλλέχθηκαν επί τόπου στα χημικά εργοστάσια στο Ludwigshafen και Λεβερκούζεν. Για τον προσδιορισμό survivin, δείγματα 40-50 ml αυθόρμητα ακυρώνεται ούρα φυγοκεντρήθηκαν σε ένα δρομέα αιωρούμενου κάδου στα 500 χ g για 10 λεπτά στους 10 ° C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε προσεκτικά και τα σφαιρίδια κυττάρων αναμίχθηκαν με 500 μΐ Διαλύματος Λύσης R (Invitek, Βερολίνο, Γερμανία), που περιέχει αναστολείς ΚΝάσης. Τέλος, το δείγμα των κυττάρων καταψύχθηκε στους -20 ° C και αποστέλλεται στο εργαστήριο σε Μπόχουμ όπου είχαν αποθηκευθεί μέχρι την απομόνωση του RNA. Χειρισμός δειγμάτων για τον προσδιορισμό της κατάστασης των ούρων και άλλους δείκτες περιγράφονται παρακάτω.

κατάσταση ούρων και την αξιολόγηση της αιματουρίας

Σε όλα τα δείγματα η κατάσταση ούρων προσδιορίσθηκε σε φρέσκο ​​ούρα (πριν από τη φυγοκέντρηση) όπως περιγράφεται προηγουμένως [36]. Ακράτεια κρεατινίνης προσδιορίστηκε με την CREA Plus® δοκιμασία (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Ερυθροκύτταρα, αιμοσφαιρίνη (Hb), λευκοκύτταρα, λευκωματίνη και άλλες παράμετροι προσδιορίστηκαν με Combur 10 ταινίες test® (Roche). Επιπλέον, τα ερυθροκύτταρα και τα λευκοκύτταρα προσδιορίστηκαν επίσης ημι-ποσοτικά σε ίζημα ούρων. μετρήσεις κρεατινίνης ήταν διαθέσιμα για subcohort Ένα μόνο (4806 δείγματα). Για 4546 δείγματα αυτά, πλήρεις πληροφορίες σχετικά με όλες τις παραμέτρους (ερυθροκύτταρα, λευκοκύτταρα, κ.λπ.) ήταν διαθέσιμο.

NMP22®, UroVysion ™, και κυτταρολογική εξέταση

πρωτεΐνης πυρηνικής μήτρας 22 (NMP22) ήταν προσδιορίζονται ποσοτικά με το κιτ NMP22® ELISA (Matritech /Alere GmbH, Köln, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η αποκοπή για θετικά αποτελέσματα ορίστηκε σε 10 μονάδες /ml. Χρωμοσωμική αστάθεια σε καθιζάνουν urothelial κύτταρα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το UroVysion ™ καρκίνο της ουροδόχου κύστης Kit (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Η δοκιμή θεωρείται θετικό εάν τουλάχιστον τέσσερις πυρήνες είχαν τρία σήματα από δύο ή τρία χρωμοσώματα (3, 7, και 17) ή τουλάχιστον 12 πυρήνες έδειξε ένα σήμα για το 9p21 τόπο. Ακράτεια κυτταρολογική εξέταση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36], [43].

απομόνωση RNA και survivin προσδιορισμών

Η ποσοτικοποίηση της survivin βασίστηκε σε Real-Time PCR με mRNA που απομονώθηκε από απολέπιση ουροθηλιακά κύτταρα ούρο. Για τον προσδιορισμό της survivin χρησιμοποιήθηκαν τρεις παραλλαγές της δοκιμασίας mRNA που βασίζεται. Οι διακυμάνσεις ήταν συνέπεια των αλλαγών από τους κατασκευαστές των κιτ απομόνωσης RNA και τα αντιδραστήρια RT-PCR, αντίστοιχα. Αρχικά, το πρωτόκολλο και τα αντιδραστήρια για τον προσδιορισμό survivin δόθηκαν από Fujirebio Diagnostics, Inc. (ΑΞΕ, Malvern, ΡΑ). Το πρωτόκολλο ΑΞΕ συνέστησε την RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία) για την απομόνωση του RNA. Αυτό το σετ, ωστόσο, δεν έχει βελτιστοποιηθεί για την πολύ μικρή ποσότητα RNA που συνήθως ανακτάται από τον μικρό αριθμό κυττάρων που λαμβάνονται από 40-50 ml ούρων, που οδηγεί σε ως επί το πλείστον χαμηλές αποδόσεις. Μια μικρή αλλαγή σε ένα από τα συστατικά του κιτ σε 2005 οδήγησε σε περαιτέρω μείωση της απόδοσης RNA. Για το λόγο αυτό, αντικαταστάθηκε από ένα εναλλακτικό κιτ απομόνωσης (InviTrap® Spin κυττάρων RNA Mini Kit) που παράγονται καλύτερη και πιο συνεπείς αποδόσεις.

Το 2007, οι ΑΞΕ διέκοψε την παραγωγή των αντιδραστηρίων για το Real-Time PCR χημική δοκιμή. Αυτό ώθησε μια άλλη αλλαγή στη διαδικασία προσδιορισμού του 2008. Επειδή δεν υπάρχει άλλη πηγή ήταν διαθέσιμη, θα έπρεπε να σχεδιάζουν και να παράγουν μερικά από τα συστατικά της δοκιμασίας τους εαυτούς μας (στο εξής ονομάζεται «δοκιμασία ΙΡΑ»). Μικρές διαφορές στις εκκινητές και ανιχνευτές της δοκιμασίας PCR Πραγματικού χρόνου οδήγησε συνέπεια σε μεγαλύτερους αριθμούς αντιγράφων από survivin σε σύγκριση με την αρχική δοκιμασία FDI. Οι τρεις παραλλαγές προσδιορισμού έχουν ως εξής:

Περίπτωση 1 (Qiagen κιτ /δοκιμασία ΑΞΕ)

Αυτή η παραλλαγή είχε χρησιμοποιηθεί από τον Σεπτέμβριο του 2003 μέχρι τον Οκτώβριο του 2005. απομόνωση του RNA έγινε με RNeasy μίνι κιτ (Qiagen ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η αντίστροφη μεταγραφή του mRNA, προενίσχυση, και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR έγιναν όπως περιγράφεται από τους Kenney et al., Εκτός του ότι οι όγκοι της αντιδράσεως του κάθε βήματος κόπηκαν στο μισό σε 25 μl [33]. Αστάρια, αντιδραστήρια, και θετικοί μάρτυρες δόθηκαν από άμεσες ξένες επενδύσεις χωρίς χρέωση. Σε αντίθεση με το δημοσιευμένο προσδιορισμό, αντί μιας ΑΒΙ PRISM Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας Χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα LightCycler II (Roche). Για να είναι σε θέση να χρησιμοποιήσει τα τριχοειδή αγγεία του συστήματος LightCycler ήταν απαραίτητο να προστεθεί αλβουμίνη βόειου ορού (BSA, Applichem, Darmstadt, Γερμανία) με την αντίδραση TaqMan, με μια τελική συγκέντρωση 0,16 μg /μl.