Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την έναρξη του όγκου και υποτροπή μετά τη χημειοθεραπεία. Στόχευση ΚΕΠ και μη-ΚΕΠ με συγκεκριμένες ενώσεις μπορεί να είναι μια αποτελεσματική προσέγγιση για τη μείωση της ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα και των μεταστάσεων. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η επίδραση της σαλινομυκίνη, ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΚΕΠ, με ή χωρίς συνδυασμό με πακλιταξέλη, σε μία μεταστατική μοντέλο. Για να αξιολογηθεί η επίδραση αυτών των φαρμάκων σε μετάσταση και στο μικροπεριβάλλον του όγκου πήραμε πλεονέκτημα της ανοσοεπαρκών και εξαιρετικά μεταστατικό μοντέλο LLC ποντίκι. Aldefluor προσδιορισμοί χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των ALDH +/- πληθυσμούς σε LLC ποντικού και ανθρώπου Η460 και Η1299 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Salinomycin μείωσε το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ + ΚΕΠ σε κύτταρα LLC, ενώ το paclitaxel αυξήθηκε ο πληθυσμός. Το ίδιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε για τις κυτταρικές σειρές Η460 και Η1299. Salinomycin μείωσε την ικανότητα σχηματισμού tumorsphere της LLC κατά περισσότερο από 7 φορές, αλλά πακλιταξέλη έδειξε καμία επίδραση. Στις

in vivo

πειράματα, η πακλιταξέλη μειωμένη πρωτογενή όγκο του όγκου αλλά αύξησε τον αριθμό των μεταστατικών οζιδίων (ρ & lt? 0,05), ενώ η σαλινομυκίνη είχε καμία επίδραση στην πρωτοπαθών όγκων αλλά μειωμένη μετάσταση πνεύμονα (ρ & lt? 0,05). Συνδυασμός των δύο φαρμάκων δεν βελτίωσε την επίδραση των θεραπειών απλού. επίπεδα ALDH1A1, SOX2, CXCR4 και SDF-1 mRNA ήταν υψηλότερη σε μεταστατικές βλάβες σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους, και ήταν σημαντικά αυξημένα σε δύο θέσεις με αγωγή με πακλιταξέλη. Αντίθετα, τα επίπεδα αυτά μειώθηκαν (ή σε ορισμένες περιπτώσεις δεν άλλαξε), όταν τα ποντίκια χορηγήθηκαν με σαλινομυκίνη. Ο αριθμός των F4 /80 + και CD11b + κυττάρων μειώθηκε επίσης κατά τη χορήγηση των δύο φαρμάκων, αλλά κυρίως στη μετάσταση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η σαλινομυκίνη στοχεύει ΑΙ_ϋΗ + πνεύμονα ΚΕΠ, η οποία έχει σημαντικές θεραπευτικές επιδράσεις

in vivo

με τη μείωση μεταστατικών βλαβών. Σε αντίθεση, η πακλιταξέλη (αν και η μείωση πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου) προωθεί την επιλογή των ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα που ενδέχεται να τροποποιήσει το μικροπεριβάλλον του πνεύμονα για την προώθηση της μετάστασης

Παράθεση:. Larzabal L, El-Nikhely Ν, Redrado Μ, Seeger W, Savai R, Calvo Α (2013) Διαφορική επιπτώσεις των ναρκωτικών στόχευσης των καρκινικών βλαστοκυττάρων (CSC) και μη-CSC πληθυσμοί των πνευμόνων πρωτοπαθών όγκων και μεταστάσεων. PLoS ONE 8 (11): e79798. doi: 10.1371 /journal.pone.0079798

Επιμέλεια: Ilya Ulasov, University of Chicago, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Μάρτη 2013? Αποδεκτές: 25 Σεπτεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 του Νοέμβρη του 2013

Copyright: © 2013 Larzabal et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει χρηματοδοτηθεί από το «έργο UTE CIMA», ISCIII-RTICC RD06 /0020/0066 επιχορήγησης, PIUNA (ref. 12028402) και Gobierno de Navarra (ref. 2179) (στο AC). LL υποστηρίχθηκε από μια υποτροφία Gobierno Vasco. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις κύριες αιτίες θνησιμότητας σε όλο τον κόσμο και η πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες και τις γυναίκες [1]. Οι περισσότερες των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα ανήκουν στον καρκίνο μη-μικρών κυττάρων του πνεύμονα (NSCLC) τύπου (85% από αυτούς). Η πρόγνωση για περισσότερο από το 60% των ασθενών με NSCLC είναι κακή, εν μέρει επειδή προχωρημένο στάδιο κατά τη διάγνωση αποκλείει θεραπευτική χειρουργική επέμβαση, και εν μέρει επειδή ιατρικές θεραπείες είναι αναποτελεσματικές. Το 2007, τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών για τους άνδρες και τις γυναίκες διαγιγνώσκονται με καρκίνο του πνεύμονα ήταν 16%. Δυστυχώς, τα ποσοστά αυτά δεν έχουν αλλάξει ουσιαστικά εδώ και πολλές δεκαετίες, παρά τις σημαντικές προόδους στη διάγνωση και θεραπευτικές επιλογές [2]. Αν και η χρήση των στοχευμένων θεραπειών για τον καρκίνο του πνεύμονα έχει μια σημαντική ανακάλυψη στην έρευνα για τον καρκίνο, μόνο ένα μικρό ποσοστό των ασθενών επωφεληθούν από αυτές. Συνεπώς, υπάρχει μια σαφής ανάγκη για νέες θεραπευτικές εναλλακτικές λύσεις για μια πιο αποτελεσματική θεραπεία αυτού του τύπου όγκου. Μία νέα θεραπευτική λεωφόρο που αυτή τη στιγμή δοκιμάζεται σε προκλινικές πειράματα για μια ποικιλία των συμπαγών όγκων στοχεύει καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ). Η υπόθεση ΚΕΠ αναφέρει ότι τα ΚΕΠ είναι υπεύθυνοι για την έναρξη του όγκου, η επιβίωση των κυττάρων μετά τη θεραπεία, μεταστατική εξάπλωση και υποτροπής του όγκου [3]. Αν και πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι ανθρώπινοι καρκίνοι του πνεύμονα, όπως και άλλους όγκους, μπορεί επίσης να φιλοξενούν πληθυσμούς CSC, ταυτοποίησης των ανθρώπινων ΚΕΠ πνεύμονα έχει παρεμποδιστεί από την έλλειψη αξιόπιστων δεικτών των βλαστικών κυττάρων. Έκφραση και τη δραστηριότητα των δεϋδρογενασών αλδεΰδης (ALDH) χρησιμεύουν ως δείκτες CSC στο μητρικό [4] και του πνεύμονα [5] όγκους. Επιπλέον, η αυξημένη δραστηριότητα ALDH έχει βρεθεί σε βλαστοκυττάρων πληθυσμούς σε διαφορετικούς τύπους όγκων συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπινου πολλαπλού μυελώματος, οξεία μυελοειδή λευχαιμία, εγκεφάλου, του μαστού, του ήπατος, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος [6], [7] και, πιο πρόσφατα, στον πνεύμονα, όπου ALDH1A1 έκφραση συνδέεται με κακή επιβίωση σε μία ομάδα από το στάδιο Ι NSCLC ασθενών [8]. Το κλάσμα ΑΙ_ϋΗ + είναι εμπλουτισμένο σε καρκινικά κύτταρα έναρξης με αυξημένη μετανάστευση, την ικανότητα προσκόλλησης και μεταστατικό δυναμικό [9]. Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η μέτρηση των επιπέδων ALDH ή ενζυματική δραστικότητα μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης του πνεύμονα CSC.

ΚΕΠ είναι ανθεκτικά σε πολλά τρέχοντα θεραπείες για τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων των χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία [10], [11]. Αυτό υποδηλώνει ότι πολλές θεραπείες του καρκίνου, ενώ σκοτώνοντας το μεγαλύτερο μέρος του όγκου, μπορεί τελικά να αποτυγχάνουν επειδή δεν εξαλείφουν τα ΚΕΠ, τα οποία καταφέρνουν να επιβιώσουν και να αναγεννούν νέους όγκους. Πρόσφατα πειραματικά στοιχεία δείχνουν επίσης μια μεγάλη πλαστικότητα των δύο CSC και πληθυσμών-μη CSC [12]. Αυτό έχει οδηγήσει κάποιους συγγραφείς να υποθέτουν ότι η στόχευση τόσο CSC και μη-CSC πληθυσμοί είναι πιθανό να είναι αναγκαία για μια πιο αποτελεσματική θεραπεία, αν και αυτό το θέμα δεν έχει ακόμη δοκιμαστεί πειραματικά.

σαλινομυκίνη, ένα ιονοφόρο κάλιο, ήταν πρόσφατα αναγνωριστεί ως εκλεκτικός αναστολέας της ανθρώπινης καρκίνου του μαστού βλαστοκυττάρων

in vitro

[13]. Αν και ο μηχανισμός δράσης της σαλινομυκίνη δεν είναι ακόμη σαφής, φαίνεται να δρα ως ισχυρός αναστολέας της αντοχής σε πολλαπλότητα φαρμάκων Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp /MDR1 /ABCB1) [14].

μετανάστευση καρκινικών κυττάρων και μετάσταση, ως σημαντικά χαρακτηριστικά του μετοχικού της βιολογίας των όγκων πολλές ομοιότητες με την εμπορία των λευκοκυττάρων, το οποίο κριτικά ρυθμίζεται από χημειοκίνες και τους υποδοχείς τους. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι CXCR4 (CXC χημειοκίνη υποδοχέα-4) και SDF1 (στρώμα που προέρχεται από κύτταρα παράγοντα-1, ή CXCL12) θα μπορούσε να ρυθμίζει τη μετανάστευση και τη μετάσταση σε μια ποικιλία από πνεύμονα, του μαστού και του προστάτη καρκινικών κυττάρων [15]. Επιπλέον, CXCR4 υπερέκφραση συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε πολλούς τύπους όγκων [16]. ΚΕΠ εκφράζουν τον υποδοχέα CXCR4 και να απαντήσετε σε μια χημειοτακτική βαθμίδα των ειδικών του συνδέτη SDF-1 [17], γεγονός που υποδηλώνει ότι ΚΕΠ πιθανώς αντιπροσωπεύουν ένα υποπληθυσμό την ικανότητα έναρξης μετάσταση [18]. Η καλύτερη κατανόηση των μεταναστευτικών μηχανισμού που περιλαμβάνει καρκινικά κύτταρα και ΚΕΠ θα παρέχει πιο κατάλληλα εργαλεία για την ανάπτυξη νέων θεραπειών για τη μείωση τόσο σε τοπικό όσο και απομακρυσμένες υποτροπές.

ΚΕΠ αλληλεπιδρούν με περιβάλλοντα μη-κακοήθη κύτταρα και οι δύο τύποι κυττάρων είναι συν- ρυθμίζεται εντός μικροπεριβάλλον του όγκου [19]. Κύτταρα από το μικροπεριβάλλον του όγκου όχι μόνο θα μπορούσε να ενισχύσει την ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου, αλλά επίσης να διευκολύνει τη διάδοση μεταστατικό του σε απομακρυσμένα όργανα. Επιτυχής μεταστατική έκφυση εξαρτάται συνεπώς από την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να επωφεληθούν από την περιβάλλουσα μικροπεριβάλλοντος σε κάθε βήμα της μεταστατικής διαδικασίας. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου περιλαμβάνει πολυάριθμα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων ενδοθηλιακών κυττάρων, στρωματικά ινοβλάστες και μια ποικιλία από κύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών (BMDCs) όπως μας μακροφάγα, μυελοειδή προερχόμενα καταστολείς κύτταρα, Tie2 εκφράζουν μονοκύτταρα και μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων [20]. Όταν τα κύτταρα του όγκου φθάνουν στο σημείο της μετάστασης που πρέπει να πάρει προσαρμοστεί σε μια νέα μικροπεριβάλλον που είναι διαφορετική από εκείνη του πρωτογενούς όγκου [21]. Οι ακριβείς αλληλεπιδράσεις όγκου-στρώματος σε πρωτοπαθή όγκο και το site μετάσταση είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

Προηγούμενη δημιουργική εργασία έχει δείξει ότι η σαλινομυκίνη και πακλιταξέλη παρουσίασαν διαφορετικούς τρόπους δράσης σε ένα μοντέλο ποντικού του καρκίνου του μαστού, με σαλινομυκίνη διαθέτουν CSC-ειδική ανασταλτικές δραστηριότητες [13]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα ΚΕΠ μπορεί να είναι μεσολαβητές κλειδιά της μετάστασης, υποθέσαμε ότι ΚΕΠ που στοχεύουν ειδικά με σαλινομυκίνη θα μείωνε το μεταστατικό δυναμικό των υπολειμματικών κυττάρων όγκου. Για την αντιμετώπιση αυτής της υπόθεσης, διερευνήσαμε την αποτελεσματικότητα της εικαζόμενης CSC-ειδικό σαλινομυκίνη φαρμάκου στην ανάπτυξη και μεταστατική εξάπλωση NSCLC. Αναφέρουμε εδώ ότι σαλινομυκίνη επηρεάζει διαφορικά τον ρυθμό ανάπτυξης πρωτογενούς όγκου NSCLC και μεταστατικό δυναμικό σε σχέση με εκείνες του συμβατικού paclitaxel χημειοθεραπευτικό παράγοντα, βιολογικές δραστηριότητες συσχετίζοντας με τα μέτρα της CSC γνωρίσματα. Επίσης, χρησιμοποιώντας το καρκίνωμα πνεύμονα Lewis (LLC) μοντέλο ποντικού, αναφέρουμε πως οι ενώσεις αυτές επηρεάζουν το μικροπεριβάλλον του όγκου τόσο στην πρωτοβάθμια όσο και μεταστατικές θέσεις όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και οι Ενώσεις

Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη περιλαμβάνονται καρκίνωμα ποντικού Lewis πνεύμονα (LLC) και Η460 ανθρώπου και Η1299. Όλες οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) και διατηρήθηκαν σε RPMI (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Lonza, Basel, Switzerland), στους 37 ° C και 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Σαλινομυκίνη και πακλιταξέλη ελήφθησαν από τη Sigma (St Louis, ΜΟ, USA) και διαλύθηκαν σε 20% DMSO σε PBS (όχημα). Οι τελικές συγκεντρώσεις του σαλινομυκίνη και paclitaxel που χρησιμοποιείται σε όλα

in vitro

δοκιμασίες ήταν 1 μg /mL για σαλινομυκίνη και 40 ng /mL για την πακλιταξέλη. Κύτταρα κατεργασμένα με φορέα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Αυτές οι δόσεις που χρησιμοποιούνται βασίζονται σε προηγούμενες εκδόσεις [13].

Σφαίρα Δοκιμασία Σχηματισμού

Για το σχηματισμό σφαίρα, τα κύτταρα αναπτύσσονται σε μέσο καλλιέργειας ελεύθερο ορού DMEM /F12 + GlutMAX ™ (Gibco, Paisley, UK ) συμπληρωμένο με αυξητικούς παράγοντες (MEGM SingleQuots, Lonza, Βασιλεία, Ελβετία) και Β27 (Gibco, Paisley, UK). Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 6-φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως (Corning, Lowell, MA, USA) σε πυκνότητα 1000-5000 κυττάρων ανά φρεάτιο, ανάλογα από την κυτταρική σειρά και καλλιεργήθηκαν για 7-10 ημέρες. Για να εκτιμηθεί το δυναμικό αυτο-ανανέωση των κυττάρων αυτών, η πρώτη γενιά των σφαιρών συλλέχθηκε με ήπια φυγοκέντρηση, διαχωρίστηκαν σε μονοκύτταρους εναιωρήματα, και καλλιεργήθηκαν κάτω από τις συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω για άλλες 7 έως 10 ημέρες. Για να δοκιμαστεί η επίδραση των φαρμάκων στην ικανότητα σχηματισμού σφαίρα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία 20% DMSO (όχημα), σαλινομυκίνη (1 μg /mL) ή πακλιταξέλη (40 ng /mL) κατά την έναρξη του πειράματος, χωρίς περαιτέρω προσθήκη του φαρμάκου. Μετά από 7 ημέρες, οι πλάκες αναλύθηκαν για τον σχηματισμό tumorspheres πνεύμονα και ο αριθμός των σφαιρών ανά φρεάτιο προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus, Αμβούργο, Γερμανία). Για να αξιολογηθεί η επίδραση της θεραπείας φαρμάκου στο ΑΙ_ϋΗ + πληθυσμό LLC προερχόμενα σφαίρες, τα σχηματισμένα σφαιρίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πακλιταξέλη (40 ng /mL) ή όχημα για 72 ώρες. Μετά την επώαση, Aldefluor δοκιμασίες διεξήχθησαν με κυτταρομετρία ροής.

ALDH χρώση και ταξινόμηση κυττάρων

Το κιτ Aldefluor (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) χρησιμοποιήθηκε για την περιγραφή και ξεχωριστά κύτταρα με υψηλή και ενζυματική δραστηριότητα χαμηλής ALDH. Τα πειράματα έγιναν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 × 10

6 κύτταρα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό Aldefluor που περιέχει το υπόστρωμα πρωτεΐνη ΑΙ_ϋΗ (ΒΑΑΑ, ΒΟϋΙΡΥ-αμινοακεταλδεΰδης, 1 mmol /L) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα που θα μπορούσαν να καταλύουν ΒΑΑΑ φθορισμού των προϊόντων της (ΒΑΑ) θεωρήθηκαν ΑΙ_ϋΗ +. Διαλογή πύλες για FACS καταρτίστηκαν σε σχέση με την αρχική τιμή των κυττάρων φθορισμού, η οποία προσδιορίστηκε με την προσθήκη της ΑΙ_ϋΗ ειδικής diethylaminobenzaldehyde αναστολέα (ϋΕΑΒ) κατά τη διάρκεια της επώασης. 7-αμινοακτινομυκίνης D (7-AAD? Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε για την απαρίθμηση βιώσιμων, αποπτωτικών και τα νεκρά κύτταρα (Σχήμα S1A). Τα κύτταρα διαχωρίζονται σε μια FACSAria ΔΜΦ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) και την καθαρότητα του διαλεγμένων κυττάρων προσδιορίστηκε μετά η διαδικασία ολοκληρωθεί (Σχήμα S1B). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με Cell Quest Pro (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) και FlowJo λογισμικά (Ashland, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

CXCR4 κυτταρομετρίας ροής

Μετά την επώαση των κυττάρων LLC με όχημα, σαλινομυκίνη (1 μg /mL) ή πακλιταξέλη (40 ng /mL) για 72 ώρες τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και στη συνέχεια συλλέχθηκαν με 0.05% θρυψίνη /0,025% EDTA. Πωλείται κύτταρα πλύθηκαν με PBS /EDTA /BSA (ρυθμιστικό πλύσης) και επαναιωρήθηκαν στο ρυθμιστικό πλύσης (10

6 κύτταρα /100 μΙ). CXCR4 αντίσωμα (Sigma) ή των αντίστοιχων ισοτυπικού ελέγχου της προστέθηκε στο κυτταρικό εναιώρημα στις 1:50 συγκέντρωση και επωάστηκε στους 4 ° C για 30 λεπτά. Τα σημασμένα κύτταρα πλύθηκαν πάλι και το δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με FITC (BD Bioscience) προστέθηκε και επωάστηκε στους 4 ° C στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν και αναλύθηκαν σε ένα FACSCalibur (BD Biosciences).

κλωνογονική δοκιμασία

Για την αξιολόγηση του δυναμικού των κλωνογόνο ALDH θετικών και αρνητικών πληθυσμούς κυττάρων LLC μετά από διαλογή, 500 κύτταρα ανά φρεάτιο καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε προσκολλημένα συνθήκες. Μετά από 10 ημέρες σε καλλιέργεια, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 4% ρυθμισμένη φορμαλίνη (Panreac, Βαρκελώνη, Ισπανία) και χρωματίστηκαν με 2% κρυσταλλικό ιώδες. Προσδιορίστηκε ο αριθμός των αποικιών ανά φρεάτιο.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ (Roche, Palo Alto, USA). Ταξινόμηση ALDH θετικά και αρνητικά πληθυσμούς κυττάρων LLC ή μη ταξινομημένα κύτταρα LLC σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων (1000 κύτταρα ανά φρεάτιο) σε 100 μΙ μέσου. 24, 48, 72 και 96 ώρες αργότερα προστέθηκαν 10 μΐ ΜΤΤ. Φασματοφωτομετρική απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm.

Για την δοκιμασία κυτταροτοξικότητας, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε LLC προσκολλημένα ή σε anoikis ανθεκτικά (σχηματισμού σφαίρας) συνθήκες επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (1000 κύτταρα ανά φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αραιώνονται σειριακά paclitaxel (0-100 ηΜ). Εβδομήντα δύο ώρες μετά την επώαση, οι προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων κανονικοποιήθηκε διαιρώντας την τελική απορρόφηση των δειγμάτων αντιμετωπίζονται από εκείνη του χωρίς επεξεργασία ελέγχου, και το IC

50 υπολογίστηκε.

RNA Εκχύλιση και Ποσοτική Real Time PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα, σφαιρίδια σφαίρα που περιέχουν, ή τα δείγματα κατεψυγμένου ιστού χρησιμοποιώντας QIAamp RNeasy MINIKIT (Qiagen, Chatsworth, CA). Μετά την κατεργασία ϋΝάσης Ι, αντίστροφη μεταγραφή διεξήχθη με αντίστροφη μεταγραφάση Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) για τη δημιουργία συμπληρωματικού DNA (cDNA). qRT-PCR διεξήχθη σε ένα Applied Biosystems 7900 Real-time PCR μηχάνημα. Αντιδράσεις qRT-PCR διεξήχθησαν με SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA) και τα επίπεδα GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Η μέση τιμή κατωφλίου κύκλου (Ct) για το γονίδιο ενδιαφέροντος, κανονικοποιημένη με την αξία Ct του γονιδίου καθαριότητα (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των τιμών γονιδιακής έκφρασης. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων mRNA του ποντικού και /ή την ανθρώπινη ALDH1A1, SOX2, CXCR4, SDF-1, CD11b, VEGF και VEGFR1 γονίδια. Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα S1. Τα δεδομένα δίνονται ως 2

-ΔΔCt ή 2

-ΔCt.

Δοκιμασία Μετανάστευσης (Boyden τμήμα)

δοκιμασίες Μετανάστευση διεξήχθησαν σε ένα θάλαμο Boyden. 20.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μέσο χωρίς ορό σπάρθηκαν στο άνω transwell των πλακών 24 φρεατίων (Costar) με την παρουσία του οχήματος, σαλινομυκίνη (1 μg /mL) ή πακλιταξέλη (40 ng /mL). Medium με 10% ορού, που χρησιμοποιείται ως χημειοελκτικό, τοποθετήθηκε στο κάτω διαμέρισμα. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα στον άνω θάλαμο σκουπίστηκαν με ένα κομμάτι βαμβάκι και τα κύτταρα στο κάτω διαμέρισμα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλίνη και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες. Ο αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων αξιολογήθηκε με ένα μικροσκόπιο Leica DMIL LED με τη χρήση του λογισμικού LAS EZ (Leica Microsystems).

Μελέτες σε ζώα

Οι μελέτες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις δεοντολογικές κατευθυντήριες γραμμές που συστάθηκε με μας ιδρύματα (Πανεπιστήμιο της Navarra), στο πλαίσιο εγκεκριμένου πρωτοκόλλου ζώων από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πανεπιστημίου της Ναβάρα (069/11). Όλα τα ζώα στεγάστηκαν σε κλουβιά μικροαπομονωτικά και σε συνθήκες SPF. Όλες οι διαδικασίες χειρουργική επέμβαση πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων.

Για την αξιολόγηση του όγκου έναρξη ικανότητα της CSC, έξι εβδομάδων NSG (NOD SCID IL2Rg ποντίκια από το The Jackson Laboratory, USA) χρησιμοποιήθηκαν. Χίλια ή πέντε χιλιάδες ALDH θετική ή αρνητική ταξινομημένα κύτταρα LLC ενέθηκαν υποδορίως στα πλευρά των ποντικών σε PBS. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε μετά από 3 εβδομάδες με ένα ηλεκτρονικό παχύμετρο. Στο τέλος του πειράματος τα ζώα θανατώθηκαν με CO

2 εισπνοή. Χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις ποντικοί ανά ομάδα.

Για να δοκιμαστεί η επίδραση του σαλινομυκίνη και paclitaxel

in vivo,

5 × 10

5 κύτταρα LLC εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό του ηλικίας 8 εβδομάδων C57BL /6 ποντίκια. Η φαρμακευτική αγωγή άρχισε 6 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου, χρόνος κατά τον οποίο ο πρωτογενής όγκος έφθασε περίπου 50 mm

3. Στα ζώα χορηγήθηκε είτε με 20% DMSO σε PBS (όχημα), σαλινομυκίνη (5 mg /kg), πακλιταξέλη (5 mg /kg), ή ένας συνδυασμός των δύο φαρμάκων κάθε 2 ημέρες, με ενδοπεριτοναϊκή ένεση, για 5 εβδομάδες. επιλέγεται Αυτές οι δόσεις και προγράμματα αγωγής βασίστηκαν σε προηγούμενες δημοσιεύσεις [13]. Οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε 2 ημέρες με ένα ηλεκτρονικό παχύμετρο. Όταν οι πρωτογενείς όγκοι έφθασαν περίπου 300 mm

3, οι όγκοι αφαιρέθηκαν χειρουργικά και οι τομές ράβονται. Η διαδικασία πραγματοποιήθηκε με αναισθητοποιημένους ποντικούς χρησιμοποιώντας ισοφλουράνιο (Esteve, Βαρκελώνη, Ισπανία) και σε άσηπτες συνθήκες. Προκειμένου να μειωθεί η ταλαιπωρία των ζώων που χορηγήθηκαν με κετοπροφέν (5 mg /kg) κάθε 24 ώρες για 3 ημέρες μετά την επέμβαση. Τρεις εβδομάδες αργότερα, τα ζώα θυσιάστηκαν με CO

2 εισπνοή και οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν για περαιτέρω ανάλυση των μεταστατικών οζιδίων. Κάθε ομάδα περιελάμβανε 5 ποντικούς και το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές, προκειμένου να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα.

χρώσης και ανάλυσης εικόνας

Τομές ιστού σταθεροποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη, και τομές (5 μm σε πάχος). Τα πλακίδια χρωματίστηκαν με Η &? Ε. Για πνευμονική μετάσταση ποσοτικοποίηση, ψηφιακές εικόνες από τα τμήματα του πνεύμονα από κάθε ένα από τα ζώα (n = 5 ανά ομάδα) αποκτήθηκαν με ένα Axioplan 2 μικροσκόπιο (Zeiss, Γερμανία) χρησιμοποιώντας ένα in-house Metamorph macro (Molecular Devices, USA), η οποία επιτρέπει να συνθέσει μωσαϊκό εικόνες που έχουν ληφθεί σε 2.5x, με αυτόματη εστίαση και τη διόρθωση σκιά. Εικόνες αυτόματα αναλύθηκαν με ImageJ και η περιοχή που καταλαμβάνεται από οζίδια του όγκου σε σχέση με μη κακοήθη περιοχή του πνεύμονα ήταν ποσοτικά.

ανοσοϊστοχημείας και ανοσοφθορισμού

Για να λεκιάσουν τα μαστοκύτταρα, ένα διάλυμα τολουϊδίνης μπλε ( 0,1%) εφαρμόστηκε στις τομές ιστού μετά αποπαραφινώσεως και επανυδάτωση.

για CD31 ανοσοϊστοχημεία, ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη με διαφάνειες θέρμανση σε φούρνο μικροκυμάτων για 20 λεπτά σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα σε ρΗ 6. ιστοί στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT με πρωτογενές αντι-CD31 αντίσωμα (Dianova, Αμβούργο, Γερμανία) σε αραίωση 1:20. Στη συνέχεια, τα πλακίδια επωάστηκαν για 30 min σε RT με ένα αντίσωμα αντι-αρουραίου κουνελιού δευτερογενή (Dako) σε αραίωση 1:50 εντός αραιωτικού Dako Πραγματικό αντίσωμα (Dako). Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά σε RT με το σύστημα EnVision ™ αντι-κουνελιού ανιχνεύσεως (Dako). δραστικότητα υπεροξειδάσης εμφανίσθηκε με DAB όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα δείγματα βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται και τοποθετείται με DPX (VWR, Leicestershire, UK). Για ποσοτικοποιήσεις, 150 τυχαίες εικόνες (200χ) ανά πειραματική ομάδα (30 ανά ζώο) συλλήφθηκαν με ένα μικροσκόπιο Leica (Wetzlar, Γερμανία) εξοπλισμένο με το λογισμικό Analysis ™. Θετική ανοσοχρώση διηθήθηκε από το μη χρωματισμένο ιστού και ποσοτικοποιούνται με Image J (ΝΙΗ Image, Bethesda, USA).

Για ανοσοφθορισμό, τομές ιστών ενυδατώθηκαν και επωάστηκαν με θρυψίνη για 10 λεπτά για ανάκτηση αντιγόνου. Στη συνέχεια, οι ιστοί βυθίστηκαν σε 5% BSA με 0,1% Triton-X σε PBS για 1 h σε RT, για να αποφευχθεί μη ειδική πρόσδεση των αντισωμάτων. Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την επισήμανση ανοσοφθορισμού: αντι-F4 /80 (1:200? Abd Serotec, Raleigh, North Carolina, USA) και αντι-CD11b (1:100? Abcam, Cambridge, UK). Μετά την επώαση με τα πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα, τα πλακίδια επωάστηκαν με AlexaFluor 488-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα (Molecular Probes, Invitrogen, Paisley, UK), αντίθετα με τα πυρηνικά 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) χρώση και τοποθετείται με Dako φθορισμού τοποθέτηση μέσων (Dako). Ποσοτικοποίηση των CD11b, F4 /80 και τολουϊδίνης μπλε θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με ανάλυση εικόνας με τη βοήθεια υπολογιστή, χρησιμοποιώντας Leica DMLA και συστημάτων QWin 500IW (Leica Instruments). Σε πρωτογενείς όγκους, κάθε δείγμα αναλύθηκε σε 5-10 τυχαία επιλεγμένα οπτικά πεδία και το ποσοστό των θετικών κυττάρων σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ υπολογίστηκε. Σε οζίδια πνεύμονα, θετικά κύτταρα μετρήθηκαν με το χέρι, επειδή βρήκαμε πιο αξιόπιστη σε αυτούς τους τύπους των μικρών αλλοιώσεων, και τα δεδομένα εκφράστηκαν ως ποσοστό της περιοχής του όγκου (mm

2).

Για ALDH1A1 ανοσοχρώση, κύτταρα Η460 αναπτύχθηκαν σε πλακίδια θαλάμου (BD Biosciences) και, όταν συρροή, μονιμοποιήθηκαν διαφάνειες /διαπερατά σε ακετόνη /μεθανόλη 1:01 για 5 λεπτά. Η ενδογενής υπεροξειδάση αποσβέστηκε με ένα διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3% και μη ειδικές θέσεις δέσμευσης αποκλείστηκαν για 30 λεπτά με 5% κανονικό ορό κατσίκας. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα αντι ALDH1A1 (BD), στους 1:100 αραίωση, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και ξεπλύθηκαν σε TBS. Ανίχνευση πρωτογενούς αντισώματος διεξήχθη με το σύστημα αντι-ποντικού Envision (Dako, Glostrup, Δανία). δραστικότητα υπεροξειδάσης εμφανίσθηκε με DAB (3,3′-διαμινοβενζιδίνη? Dako) και τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη. Τέλος, διαφάνειες ήταν συγκάλυψη γλίστρησε με γλυκερίνη στερέωσης-μέσο.

Στατιστικές Μέθοδοι

Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εξετάστηκαν με το Μαθητή

t

τεστ ή ANOVA για αταίριαστο παραμετρικές μεταβλητές , και το Mann-Whitney

U

δοκιμών ή Kruskal-Wallis για αταίριαστα μη παραμετρικές μεταβλητές. Ομαλότητα αναλύθηκε με το τεστ Shapiro-Wilk. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το στατιστικό λογισμικό SPSS (έκδοση 17.0 για Windows SPSS) και GraphPad Prism 5 λογισμικού (GraphPad). Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SEM ή SD, και η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως Ρ & lt? 0,05 (*), η P & lt? 0.01 (**), και η P & lt?. 0.001 (***)

Αποτελέσματα

αναγνώριση της ΑΙ_ϋΗ + CSC-όπως Πληθυσμός LLC κύτταρα

Εμείς και άλλοι έχουν δείξει στο παρελθόν ότι η μέτρηση της δραστηριότητας ALDH είναι η κατάλληλη μέθοδος για τον εντοπισμό του καρκίνου του πνεύμονα βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) [22] , [23], αλλά αν ο δείκτης αυτός θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση και χαρακτηρισμό του πληθυσμού LLC CSC ήταν άγνωστη. Για να εκτιμηθεί η παρουσία αυτού του πληθυσμού στο LLC κυτταρική γραμμή βασίζεται ALDH ενζυματική δραστηριότητα τους, Aldefluor δοκιμασία ακολουθούμενη από ανάλυση FACS πραγματοποιήθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η κυτταρική γραμμή LLC είχαν κατά μέσο όρο 11,43 ± 0,38% ΑΙ_ϋΗ θετικά κύτταρα, τα οποία είναι σύμφωνη με προηγουμένως δημοσιευμένα αποτελέσματα για άλλες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές και πρωτογενή κύτταρα από ασθενείς [5]. Η χρήση της ϋΕΑΒ (ένας ειδικός αναστολέας ΑΙ_ϋΗ) χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος.

A. Η ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων του κλάσματος (μετρούμενη με Aldefluor προσδιορισμούς) αντιπροσωπεύει ~ 11% των συνολικών κυττάρων στην κυτταρική γραμμή LLC. B. Μεμονωμένες LLC ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα έχουν την ικανότητα αυτο-ανανέωσης, όπως φαίνεται από την ικανότητά τους να παράγουν δύο ALDH +/- πληθυσμούς μετά από 8 ημέρες σε καλλιέργεια, ενώ ALDH- κύτταρα δίνουν μόνο αφορμή για αρνητικά κύτταρα. Γ Αριθμός κλώνων που παράγονται από κύτταρα LLC ΑΙ_ϋΗ + και ALDH- μετά τη διαλογή. Ο πληθυσμός ΑΙ_ϋΗ + εμφανίζει υψηλότερη κλωνογονικού χωρητικότητα από ό, τι αρνητικό ομόλογό τους. Δ Αριθμός των σφαιρών που παράγεται από τα κύτταρα LLC ALDH +/-. ανάλυση Ε qRT-PCR των επιπέδων ALDH1A1 mRNA σε κύτταρα LLC καλλιεργήθηκαν σε προσκολλημένη συνθήκες, πρωτογενή τομέα (S1) και τις σφαίρες της δεύτερης γενιάς (S2). ΣΤ χημειοαντίσταση στην πακλιταξέλη από LLC αναπτύσσονται είτε προσκολλημένα συνθήκες ή σε σφαίρες (S1) μετρήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ. IC

50 για προσκολλημένα κύτταρα LLC: 35,8 nM? IC

50 για LLC S1 σφαίρες: & gt? 93,6 nM. Δεδομένων και οι ράβδοι σφάλματος: μέση τιμή ± SD. * P & lt? 0,05. ** P & lt? 0,01. *** P & lt? 0.001. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 ανεξάρτητες φορές (το καθένα από αυτά εις τριπλούν).

Η

Οι τυπικές ιδιότητες της CSC περιλαμβάνουν τις ικανότητές τους για την αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης,

in vivo

ογκογόνο potencial και αντίσταση στη χημειοθεραπεία [24]. Για να επαληθεύσετε αυτά τα χαρακτηριστικά σε κύτταρα LLC, εξετάσαμε για πρώτη φορά την ικανότητα αυτο-ανανέωσης της ΑΙ_ϋΗ + πληθυσμού. Μετά ΑΙ_ϋΗ ταξινόμηση κυττάρων, τόσο θετικές όσο και αρνητικές κλάσματα κυττάρων απλώνονται χωριστά. Μετά από 8 ημέρες σε καλλιέργεια, δοκιμασία Aldefluor διεξήχθη για να αναλυθεί η φαινοτύπου του προκύπτοντος κυτταρικού πληθυσμού. Καλλιεργημένα ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων ήταν σε θέση να αναγεννηθούν τόσο θετικές όσο και αρνητικές κυτταρικών πληθυσμών ALDH. Αντιθέτως, τα καλλιεργημένα κύτταρα ALDH- δεν ήταν σε θέση να δημιουργήσει το ΑΙ_ϋΗ + πληθυσμού (Σχήμα 1Β). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι τα κύτταρα μόνο ΑΙ_ϋΗ + είναι σε θέση να ανασυστήσει το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων, μια τυπική ιδιότητα του ΚΕΠ. προσδιορισμοί ΜΤΤ έδειξε ότι δεν υπήρχαν διαφορές στα ποσοστά ανάπτυξης μεταξύ ΑΙ_ϋΗ + και των πληθυσμών ALDH- κυττάρων (Σχήμα S1c). Δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ του αδιαχώριστα γονική πληθυσμού και ΑΙ_ϋΗ + ή ALDH- πληθυσμών (τα δεδομένα δεν δείχνουν).

Για να συγκρίνετε το ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων ΑΙ_ϋΗ + και ALDH- LLC, NSG ποντικοί έλαβαν υποδόρια ένεση με 1 × 10

3 ή 5 × 10

3 κύτταρα. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, η ανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε σε 3 από τους 4 ποντικούς μετά τον εμβολιασμό με 1 χ 10

3 ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία ανάπτυξη του όγκου στα ALDH- κύτταρα. Μετά την ένεση του 5 × 10

3 ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων, 3/4 ποντίκια παρουσίασε μια μάζα όγκου με ένα μέσο όγκο του όγκου των 235,3 ± 64,6 mm

3, ενώ μόνο 2/4 ποντίκια ανέπτυξαν ένα μικρό όγκο μετά την ένεση του ALDH- πληθυσμό (με όγκο του όγκου του 27,45 ± 5,47 mm

3).

η

στη συνέχεια αναλύσαμε την κλωνογόνο δυναμικό των κλασμάτων των κυττάρων LLC ΑΙ_ϋΗ + και ALDH- με επίστρωση 500 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μια πλάκα 6 φρεατίων και καλλιέργεια αυτών σε κλωνική πυκνότητα για 10 ημέρες. ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων οδήγησε σε σημαντικά υψηλότερο αριθμό αποικιών από ALDH- κυττάρων (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 1C), δείχνοντας έτσι ότι ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη κλωνογονικότητας. Η κλωνογονική ικανότητα της γονικής κυτταρικής σειράς ήταν ενδιάμεσος μεταξύ των ΑΙ_ϋΗ + και ALDH- κλάσματα (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται)

ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα που παράγονται μεγαλύτερο αριθμό σφαιρών από ALDH- κύτταρα. (Ρ & lt? 0,01? Σχήμα 1Δ). Αναλύσαμε επίσης την ικανότητα του συνόλου του πληθυσμού LLC για να σχηματίσουν σφαίρες και να αυτο-ανανέωση, δίνοντας αφορμή για ένα δευτερεύον πληθυσμό σφαίρα (S2). Μετά από 7 ημέρες σε ορό και προσκολλημένα ελεύθερη κατάσταση, κύτταρα LLC σχηματίζονται πρωτογενή σφαίρες (S1). Ανάλυση της σφαιρών S1 και καλλιέργεια υπό τις ίδιες συνθήκες κατέδειξε τον σχηματισμό ενός δευτερεύοντος (S2) πληθυσμός σφαίρα. Για να επιβεβαιώσετε ότι οι σφαίρες ήταν εμπλουτισμένο σε ΚΕΠ, εμείς ποσοτικά επίπεδα ΑίϋΗ mRNA σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε προσκολλημένα και μη προσκολλημένα (S1 και S2 σφαίρες) συνθήκες. Με ανάλυση qRT-PCR παρατηρήσαμε ότι S1 σφαίρες είχαν σημαντικά υψηλότερη (ρ & lt? 0.001) επίπεδα ΑίϋΗ mRNA από κύτταρα καλλιεργημένα σε προσκολλημένα συνθήκες, και ότι S2 σφαίρες επίσης εμπλουτισμένα σε έκφραση ΑΙ_ϋΗ (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με S1 σφαίρες (Εικόνα 1Ε). Επιπλέον, η ανάλυση έδειξε ένα Aldeflour μεγαλύτερο αριθμό ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων σε σφαίρες (34,2% ± 6,56%) σε σχέση με κύτταρα που αναπτύσσονται σε προσκολλημένα συνθήκες (11,43 ± 0,38%) (Σχήμα Suplemmentary 1D και Σχήμα 1Α). Ως εκ τούτου, αυτά τα πειράματα επιβεβαίωσαν ότι οι anoikis ανθεκτικά σφαίρες περιείχε μια εμπλουτισμένη ΑΙ_ϋΗ + CSC-όπως πληθυσμού που ήταν σε θέση να υποβληθούν σε αυτο-ανανέωση.

Ένα άλλο χαρακτηριστικό των ΚΕΠ είναι η αντοχή τους σε συμβατικούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Έτσι, χρησιμοποιείται η πακλιταξέλη, ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται συχνά κατά NSCLC, για την αξιολόγηση των χημειοαντίσταση κύτταρα LLC αναπτύχθηκαν σε σφαίρες ή σε προσκολλημένα συνθήκες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1F, κύτταρα LLC καλλιεργήθηκαν όπως σφαίρες εμφάνισαν υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης όταν έλαβαν θεραπεία με διαφορετικές δόσεις πακλιταξέλης από ότι τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε προσκολλημένα συνθήκες. Το IC

50 και για τις δύο κυτταρικών πληθυσμών ήταν σημαντικά (p & lt? 0,01) διαφορετικά: IC

50 για προσκολλημένα κύτταρα LLC ήταν 38,5 nM και & gt? 93,6 nM για LLC προέρχονται από σφαίρες (Σχήμα 1 F). Για την αντιμετώπιση είτε S1-προερχόμενα κύτταρα αντιστοιχεί στην ΑΙ_ϋΗ + πληθυσμό με αυξημένη αντίσταση στην πακλιταξέλη, αναλύσαμε με Aldefluor το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων σε σφαιρίδια μετά τη θεραπεία φαρμάκου. Απροσδόκητα, δεν παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση του ποσοστού των ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων σε απόκριση σε paclitaxel στο μοντέλο LLC σε συνθήκες σφαίρα καλλιέργειας. Ωστόσο, όπως θα περιγράψουμε πιο κάτω, αυτό το φαινόμενο ήταν εμφανές σε μοντέλα ανθρώπινου NSCLC, που υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η S1 που προέρχονται από κύτταρα περιλαμβάνουν πακλιταξέλη ανθεκτικά ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα. Στο σύνολό τους, όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι η ΑΙ_ϋΗ + κλάσμα κυττάρων LLC αντιστοιχεί σε ανθεκτικά στα φάρμακα πληθυσμού CSC.

διαφορική επίδραση της σαλινομυκίνη και πακλιταξέλη για στόχευση CSC εναντίον μη-CSC πληθυσμοί

αφού αποδείχθηκε ότι η LLC κυτταρική σειρά έχει ένα ΑΙ_ϋΗ + υπο-πληθυσμού με ΚΕΠ χαρακτηριστικά, θελήσαμε να μελετήσουμε την επίδραση της σαλινομυκίνη, ένα πρόσφατα εντοπίστηκαν ένωση που αναστέλλει επιλεκτικά τα καρκινικά ανθρώπινα βλαστικά κύτταρα του μαστού

in vitro

[13] . Συγκρίναμε την επίδραση της σαλινομυκίνη με εκείνη του paclitaxel σε πληθυσμούς CSC έναντι μη-CSC.

Για τις επόμενες

in vitro

πειραμάτων, κατεργασμένα κύτταρα LLC με 1 μg /mL σαλινομυκίνη ή 40 ng /mL πακλιταξέλης, επιτρέποντας τους να ανακτήσουν για 24 ώρες σε απουσία του φαρμάκου. Για τον προσδιορισμό των συγκεκριμένων συνεπειών της σαλινομυκίνη και πακλιταξέλη για ΑΙ_ϋΗ κυτταρικών πληθυσμών +/-, Aldefluor δοκιμασίες που ακολουθείται από ανάλυση FACS διεξήχθη. Μετά διαλογής κυττάρων, ALDH θετικά και αρνητικά κύτταρα επιστρώθηκαν ξεχωριστά και χορηγήθηκαν με σαλινομυκίνη (1 μg /mL) ή πακλιταξέλη (40 ng /mL) για 72 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασίες ΜΜΤ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, η επιβίωση των ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων μετά σαλινομυκίνη θεραπείας ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων ALDH- (ρ & lt? 0,05). Αντίθετα, μετά την επιβίωση αγωγή με πακλιταξέλη της ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα δεν επηρεάστηκε, ενώ μόνο το 67,7% ALDH- κύτταρα ήταν ζωντανοί (p & lt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι salinomycin είναι εξαιρετικά κυτταροτοξική για ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα, αλλά πακλιταξέλη επηρεάζει την αρνητική πληθυσμού ALDH.

Α. * P & lt? 0,05. * P & lt? 0,05. * P & lt? 0,05. ** P & lt? 0,01. ** P & lt? 0,01.