Αφηρημένο

Στόχος

Τα microRNAs (miRNAs) έκφραση μεταβάλλεται σε καρκινικά κύτταρα και miRNAs θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως διαγνωστικοί και προγνωστικοί βιοδείκτη για τους ασθενείς με καρκίνο. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να αναλύσει κυκλοφορούν έκφραση miRNAs στην κακοήθη πλευριτική συλλογή (MPE) και την ένωσή τους με την επιβίωση των ασθενών με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC).

Μέθοδοι

Υπεζωκοτική συλλογή από 184 ασθενείς με NSCLC και MPE συλλέχθηκαν. Mirna μικροσυστοιχιών και της βιοπληροφορικής ερμηνεία χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της έκφρασης των miRNAs σε 10 ασθενείς με NSCLC με διαφορετική πρόγνωση επιβίωσης. Σύλλογοι επικυρώθηκαν σε 184 ασθενείς (που ταξινομούνται τυχαία στην εκπαίδευση και την επικύρωση που με ίσο αριθμό σε κάθε ομάδα) χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. βαθμολογίες κίνδυνο διατυπώθηκαν με βάση την υπογραφή έκφραση των miRNAs. Τα κλινικά δεδομένα, όπως η επιβίωση των ασθενών, συλλέχθηκαν για ανάλυση συσχέτισης.

Αποτελέσματα

Τριάντα-τρεις miRNAs βρέθηκαν να μεταβάλλεται περισσότερο από δύο φορές από μικροσυστοιχιών σε κακοήθεις συλλογές μεταξύ των πιο επιβίωσης και ομάδες μικρότερης επιβίωσης, και τα επίπεδα των πέντε miRNAs (miRNA-93, miRNA-100, miRNA-134, miRNA-151 και miRNA-345) ήταν σημαντικά σχετίζεται με τη συνολική επιβίωση. Υψηλή έκφραση του miR-100 και χαμηλή έκφραση των miRNA-93, miRNA-134, miRNA-151 και miRNA-345 συνδέθηκαν με κακή επιβίωση τόσο στην εκπαίδευση και την ομάδα επικύρωσης. Οι ασθενείς με βαθμολογίες υψηλού κινδύνου είχε συνολική κακή επιβίωση σε σύγκριση με τους ασθενείς με χαμηλές βαθμολογίες κίνδυνο. βαθμολογία κίνδυνος ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης επιβίωσης των ασθενών.

Συμπεράσματα

πρότυπα έκφρασης των miRNAs συστηματικά μεταβληθεί σε MPE των ασθενών με NSCLC. Οι πέντε miRNA υπογραφή από την συλλογή μπορεί να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης για τη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Wang Τ, Lv M, Shen S, Zhou S, Wang P, Chen Y, et al . (2012) Cell-Δωρεάν προφίλ έκφρασης microRNA σε κακοήθη διάχυσης συνδεδεμένες με την επιβίωση των ασθενών με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (8): e43268. doi: 10.1371 /journal.pone.0043268

Επιμέλεια: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 18, 2012? Αποδεκτές: 18 Ιουλ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 24, Αύγ, 2012

Copyright: © Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81101552), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (BK2011571), Εξειδικευμένες Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης (20100091120002), και των θεμελιωδών Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια (1118021418 και 1118021406). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι ένα από τα πιο γνωστά αίτια θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Δεκαπέντε τοις εκατό των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα μπορεί να έχει κακοήθη πλευριτική συλλογή (MPE) κατά το χρόνο της αρχικής διάγνωσης και ένα δεύτερο αναπτύξει πλευρική έκχυση σε ένα μεταγενέστερο στάδιο της ασθένειας [1]. MPE είναι κακό προγνωστικό σημάδι για τους ασθενείς με NSCLC. Tumor διάδοση μέσω επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων σε πλευριτικό εξίδρωμα αποτελεί μία σημαντική οδό μετάστασης και μια συχνή αιτία νοσηρότητας σε NSCLC. Παρά τις προόδους στη τρόπους θεραπείας, η μέση επιβίωση είναι πολύ μικρή. Το πρότυπο θεραπεία φαίνεται να είναι μέγιστη εκκένωση των πλευριτικό υγρό που ακολουθείται από ενδοφλέβια χημειοθεραπεία ή ενδοπλευρική χημειοθεραπεία [2] .Ωστόσο, διαπιστώθηκε ότι δεν είναι όλοι οι ασθενείς ωφελήθηκαν από την προσθήκη της χημειοθεραπείας, ιδιαίτερα σε ασθενή με σύντομο συνολικό χρόνο επιβίωσης . Ως εκ τούτου, προγνωστική εκτίμηση του ασθενούς είναι απαραίτητη για την επιλογή των καλύτερων θεραπευτικών στρατηγικών. Hsu et al. αποδειχθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης της αγγειογενετική βιοδείκτη συσχετίζονταν σημαντικά με την επιβίωση των ασθενών και του υπεζωκότα ελέγχου συλλογή [3]. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες μοριακών και γενετικών χαρακτηριστικών θα μπορούσε να εντοπίσει αρκετές δείκτες και μοναδικές υπογραφές ως διαγνωστικοί και προγνωστικοί παράγοντες του NSCLC. Αυτά τα ευρήματα ανοίγουν δυνατότητες για μη επεμβατική διάγνωση του καρκίνου και πρόβλεψης. Μερικά από τα ευρήματα είναι στα πρόθυρα του να μεταφράζονται σε κλινική χρήση.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι 18 έως 25 νουκλεοτίδια, μη-κωδικοποίησης μόρια RNA που ρυθμίζουν την έκφραση πολλών γονιδίων. Από την ανακάλυψή τους, έχει βρεθεί miRNAs να ρυθμίζουν μια ποικιλία κυτταρικών διεργασιών συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης, διαφοροποίησης και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [4], [5]. Οι Ανώμαλη εκφράσεις των συγκεκριμένων miRNAs εμπλέκεται στην παθογένεση διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων, και χαρακτηριστικών έκφραση miRNA ανθρώπινων όγκων έχει εντοπίσει υπογραφές που συνδέονται με τη διάγνωση, σταδιοποίηση, την εξέλιξη, την πρόγνωση και την ανταπόκριση στη θεραπεία. Η προγνωστική δυναμικό των miRNA έχει καταδειχθεί για χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [6], τον καρκίνο του πνεύμονα [7], [8], του καρκίνου του μαστού [9], και νευροβλαστώματα [10]. Στον καρκίνο του πνεύμονα, τα υψηλά επίπεδα της προ-miR-155 και τα χαμηλά επίπεδα ας-7 αναφέρθηκε να συσχετίζεται με κακή πρόγνωση [11], ενώ miR-34a θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης της υποτροπής σε χειρουργικά NSCLC [12 ]. Πρόσφατα, αρκετές αναφορές δείχνουν ότι ελεύθερο κυττάρων που κυκλοφορούν miRNAs είναι ανιχνεύσιμα στον ορό /πλάσμα και τα επίπεδα των miRNAs προέρχονται από όγκους αυξημένα σε ασθενείς με καρκίνους του πνεύμονα [13], [14], οι οποίες υποδηλώνουν ότι miRNAs με βάση το αίμα θα μπορούσε να προκύψει ως επαναστατική πηγές βιοδείκτη για τη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα και την πρόγνωση. Ωστόσο, μια υπογραφή miRNA στην MPE που μπορεί να προβλέψει την κλινική έκβαση σε ασθενείς με NSCLC δεν είχε βρεθεί μέχρι σήμερα.

Σε προηγούμενες μελέτες μας, έχουμε απομονώσει επιτυχώς ελεύθερο κυττάρων νουκλεϊκών οξέων σε κακοήθεις συλλογές και απέδειξε ότι κυττάρου -δωρεάν BIRC5 mRNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα ισχυρό διαγνωστικό βιοδείκτη για MPE [15]. Βρήκαμε επίσης ότι miR-24 και miR-30d έχουν διαφορετικά εκφράζονται σε καλοήθεις και κακοήθεις διαχύσεις, ενώ το ελεύθερο κυττάρων miR-152 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προβλεφθεί η χημειοευαισθησία να docetaxel [16], [17]. Λαμβάνοντας υπόψη την προγνωστική δυνατότητα για miRNAs στον καρκίνο, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν ελεύθερο κυττάρων miRNA στην υπεζωκοτική συλλογή θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη του χρόνου επιβίωσης των ασθενών με κακοήθη πλευριτική συλλογή δευτερογενών με NSCLC.

Αποτελέσματα

Ανίχνευση miRNAs συλλογής και της βιοπληροφορικής ερμηνεία των λειτουργικών miRNAs

Όλοι οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν μέχρι 16 Σεπτέμβρη, 2011 ή κατά την ημερομηνία του θανάτου. Όλα τα 184 ασθενείς επιβίωσαν για ένα μέσο όρο 6 μήνες (εύρος: 1-33 μήνες). Το συνολικό σωρευτικό ποσοστό των ασθενών που επιβιώνουν στους 3 μήνες ήταν 0,70, στους 6 μήνες ήταν 0,45, και στους 12 μήνες ήταν 0,11.

Για την ανίχνευση διαφορετικές miRNAs μεταξύ της ομάδας πλέον, την επιβίωση και την ομάδα μικρότερης επιβίωση, αναπτύχθηκε μικροσυστοιχιών σε 10 ασθενείς. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, 5 ασθενείς στην ομάδα μεγαλύτερης επιβίωσης και 5 ασθενείς στην ομάδα μικρότερης επιβίωση αντιστοιχούσαν ακριβώς στις συχνότητες του τύπου ιστολογικές και το στάδιο, ενώ η ηλικία, το κάπνισμα, και το φύλο δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο ομάδες. 113 miRNAs ανιχνεύθηκαν σε αυτούς τους 10 ασθενείς με miRNA μικροσυστοιχιών (S1 αρχείου). Χρησιμοποιώντας την ανάλυση τάξη σύγκριση, 33 ανεξάρτητοι miRNAs ταυτοποιήθηκαν να εκφράζονται διαφορικά σε δύο ομάδες με πολλαπλές μεταβολές & gt? 2 (Πίνακας S1). Ένα οικόπεδο ηφαίστειο παρέχονται περαιτέρω πληροφορίες σχετικά με τη σημασία και το μέγεθος των εκφραστικών αλλοίωση αυτών των επιλεγμένων miRNAs (Σχήμα S1), το οποίο ήταν χρήσιμο κατά την εκτίμηση των σημαντικότερων υποψήφιοι για τις μελέτες παρακολούθησης.

Η γονιδιακή σχολιασμό

David χρησιμοποιήθηκε για να ερμηνεύσει τη βιολογική επίδραση των miRNAs φιλτράρεται από οικόπεδο ηφαίστειο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της εξόρυξης δεδομένων, 31 ΚΟ ταξινομήθηκαν με βάση αυτούς τους στόχους miRNA (Σχήμα S2A). Μια άλλη λειτουργική ανάλυση των miRNAs με KEGG αποκάλυψαν ότι 9 μονοπάτια μεταγωγής σήματος έδειξαν να συμμετάσχουν στο διαφορετικό χρόνο επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα (Σχήμα S2B). Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν νέα στοιχεία για τη ρυθμιστική επίδραση των miRNAs για τον καρκίνο του πνεύμονα μέσω των γονιδίων στόχων και σηματοδοτικό μονοπάτι. Επιπλέον, το δίκτυο miRNA-mRNA και ολοκληρωμένη αξιολόγηση των miRNAs και mRNA από περιγράφει τις αλληλεπιδράσεις των miRNA και στοχευμένα γονίδια (Σχήμα S3). Ληφθούν αυτά τα βιοπληροφορικής ερμηνείες των λειτουργικών miRNAs μαζί, 5 miRNAs (miRNA-93, miRNA-100, miRNA-134, miRNA-151 και miRNA-345) επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

Σύνδεσης μεταξύ της έκφρασης των miRNAs στη συλλογή και την επιβίωση των ασθενών

στη συνέχεια εξετάστηκαν τα προγνωστικά αποτελέσματα αυτών των πέντε miRNAs στην επιβίωση του καρκίνου του πνεύμονα μεταξύ των 184 ασθενών, τυχαία ομαδοποιούνται σε μια εκπαίδευση κοόρτης (n = 92) και ομάδα επικύρωσης (n = 92). Τα χαρακτηριστικά αυτών των ασθενών με NSCLC φαίνονται στον πίνακα 1. Από την κοόρτη εκπαίδευση, τα επίπεδα έκφρασης υψηλή διάχυση του miR-100 (διάμεσος, 0,02) και χαμηλά επίπεδα έκφρασης του miR-134 (διάμεσος, 0.50), miR-345 (διάμεσος , 0,09) miR-151 (διάμεσος, 0.05), και miR-93 (μέσος όρος 0,03) ήταν όλα ξεχωριστά που συνδέεται με χαμηλότερο MSTS (7,1 μήνες έναντι 4,3 μηνών για miR-134, 7,1 μήνες έναντι 3,9 μηνών για miR-151, 8.2 μήνες έναντι 2,9 μηνών για miR-345, 9,2 μήνες έναντι 5,5 μηνών για miR-93, και 8,0 μήνες έναντι 5,2 μηνών για miR-100? Πίνακας 2 και Εικόνα 1Α). Όταν αυτές οι τιμές κατωφλίου εφαρμόστηκαν στο σύνολο επικύρωσης, παρατηρήθηκαν συγκρίσιμες log-rank

P

αξίες και HRs (Πίνακας 2 και Εικόνα 1Β).

Α) 92 ασθενείς στο σύνολο δεδομένων εκπαίδευσης . Β) 92 ασθενείς στο σύνολο δεδομένων επικύρωσης. Γ) βαθμολογία κινδύνου και τη συνολική επιβίωση σε σύνολο δεδομένων εκπαίδευσης D) βαθμολογία κινδύνου και τη συνολική επιβίωση σε σύνολο δεδομένων επικύρωσης.

Η

Cox ανάλογη ανάλυση παλινδρόμησης κίνδυνο για όλα τα 184 δείγματα έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης από τις πέντε miRNAs συσχετίστηκε σημαντικά με τον θάνατο του καρκίνου (

P

= 0.004 για το miR-134,

P

= 0.01 για το miR-151,

P

= 0,008 για το miR -345,

P

= 0.03 για το miR-93, και

P

= 0.02 για το miR-100, Πίνακας 3). Υπήρχαν τέσσερις miRNAs που ήταν προστατευτικό και ένα miRNA που ήταν επικίνδυνο με βάση την αντιστοιχία των εκφράσεων τους και συσχέτιση με την επιβίωση των ασθενών.

Η

Φύση 5 miRNA υπογραφή έκφραση

Αυτά τα 5 miRNAs ήταν τότε χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει μια υπογραφή υπολογίζοντας μια βαθμολογία κινδύνου για κάθε ασθενή. Σύμφωνα με τις βαθμολογίες κινδύνου, οι ασθενείς στην κοόρτη εκπαίδευση χωρίστηκαν σε ομάδες υψηλού και χαμηλού ρίσκου χρησιμοποιώντας το διάμεσο σκορ κινδύνου αποκοπής. Οι ασθενείς που ανήκουν σε ομάδα υψηλού κινδύνου είχε μια μικρότερη μέση επιβίωση από τους ασθενείς με βαθμολογία χαμηλού κινδύνου (9,4 μήνες έναντι 4,0 μηνών,

P

= 0,003). Το ίδιο τύπο κινδύνου βαθμολογία και αποκοπής σημείο που λαμβάνεται από την ομάδα κατάρτισης που εφαρμόζονται για τις 92 ασθενείς στην ομάδα επικύρωσης. Παρόμοια με τα ευρήματα από το σύνολο εκπαίδευσης, η επιβίωση ήταν μεγαλύτερη στην ομάδα χαμηλού κινδύνου από ό, τι στην ομάδα υψηλού κινδύνου σε ολόκληρη την παρακολούθηση (Πίνακας 4, Εικόνα 1Γ).

Η

ΥΣ miRNA υπογραφή έκφραση είναι ανεξάρτητα από την κατάσταση του καπνίσματος

για να εξακριβωθεί αν η 5 miRNA υπογραφή έκφρασης βαθμολόγηση κινδύνου βασίζεται είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης επιβίωσης καρκίνο του πνεύμονα του ασθενούς, θα πραγματοποιηθεί ανάλυση Cox παλινδρόμησης. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 5, το κάπνισμα, η ηλικία και η βαθμολογία κινδύνου ήταν στατιστικά σημαντικοί παράγοντες επιβίωσης χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μονοπαραγοντική παλινδρόμησης Cox. Ωστόσο, όταν εφαρμόστηκε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο παλινδρόμησης Cox, βαθμολόγηση κινδύνου (

P

= 0,01) και το κάπνισμα (

P

= 0.04) ήταν και οι δύο ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες της επιβίωσης των ασθενών (Πίνακας 5).

Συζήτηση

Χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση δείγμα-διάσπαση, ένα 5 miRNA υπογραφή έκφρασης που μπορεί να προβλέψει την επιβίωση τόσο στον τομέα της κατάρτισης και επικύρωσης σύνολα προσδιορίστηκε σε αυτή τη μελέτη. Το πιο σημαντικό, η υπογραφή έκφραση 5 miRNA ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη κακής χρόνου επιβίωσης σε πολυπαραγοντική ανάλυση. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση της υπογραφής έκφρασης των miRNAs στην κακοήθη πλευριτική συλλογή που θα μπορούσε να προβλέψει NSCLC την επιβίωση των ασθενών.

Συνηθίζαμε miRNA μικροσυστοιχιών για την ανίχνευση διαφορετικά εξέφρασε miRNAs. Σε σύγκριση με την ομάδα μικρότερης επιβίωση, 21 miRNAs ήταν επάνω ρυθμισμένη και 12 miRNAs ήταν ρυθμισμένη προς τα κάτω στην ομάδα μεγαλύτερης επιβίωσης. Οι περισσότερες προηγούμενες μελέτες που έχουν επιλεγεί miRNAs με βάση τις

τιμές P και Διπλώστε αλλαγές. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε επιπλέον βιοπληροφορικής ερμηνεία της λειτουργικής miRNAs να επιλέξετε miRNAs. GO όρος και KEGG μονοπάτι σχολιασμό εφαρμόστηκαν στην πισίνα γονίδιο στόχο τους. Ως αποτέλεσμα, KEGG σχολιασμό έδειξε ότι σημαντικό πολλαπλασιαστική (ΜΑΡΚ και Wnt), επιβίωση (ΤΟΡ-β και mTOR), κόλλα, ογκογόνο και μεταβολικών μονοπατιών σηματοδότησης ήταν άφθονα μεταξύ των σημαντικά εμπλουτισμένη αυτά. Οι περισσότεροι από αυτούς έχουν ήδη αναφερθεί να λάβουν μέρος στην προώθηση του καρκίνου του πνεύμονα. Το ΕΠ που σχετίζονται με μεταγωγή σήματος, την ανάπτυξη των κυττάρων, την απόπτωση και το μεταβολισμό αντιπροσωπεύονται τα περισσότερα από τα σημαντικά εμπλουτισμένη όρους GO, το οποίο ήταν σύμφωνα με την ανάλυση KEGG. Αυτή η λειτουργική ταυτότητα επιβεβαίωσε μια συστηματική αλλαγή στο miRNAs και γονίδια στόχους τους κατά τη διάρκεια του σχηματισμού όγκων και την προώθηση. Η ανάλυση του δικτύου αλληλεπίδρασης miRNA-mRNA ενσωματωθεί περαιτέρω το εύρημα της βιοπληροφορικής, και στη συνέχεια περιγράφονται τα σημαντικότερα στόχους της miRNAs. Το κέντρο του δικτύου ήταν αντιπροσωπεύει κατά βαθμό, που σημαίνει ότι η συμβολή ενός miRNA με τα γονίδια περίπου. Επελέγησαν miRNAs με υψηλότερους βαθμούς για περαιτέρω ανάλυση. Ως εκ τούτου, η βιοπληροφορική ερμηνεία μπορεί να μας βοηθήσει να πάρει miRNAs με σημαντικές λειτουργίες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα.

Η υπογραφή πέντε miRNA που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη συμπεριέλαβε ένα miRNA (miRNA-100), η οποία ήταν επικίνδυνη και τέσσερις miRNAs (miRNA-93 , miRNA-134, miRNA-151 και miRNA-345) που ήταν προστατευτικά σε σχέση με την ένωσή τους μεταξύ τους έκφραση και την επιβίωση των ασθενών. Το προστατευτικό και επικίνδυνη φύση αυτών των miRNAs υποδηλώνει τις λειτουργίες τους είναι είτε ανασταλτική ή την προώθηση των διαφόρων ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων, όπως πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή. Αυξημένη miR-100 έχει βρεθεί σε καρκίνωμα των ωοθηκών [18], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [19], [20]. Σε καλή συσχέτιση με τα δεδομένα μας, miR-100 έκφραση συσχετίστηκε με την εξέλιξη και πρόγνωση του γαστρικού καρκίνου [21]. Zheng et al. απέδειξαν ότι miR-100 ρυθμίζει κυτταρική διαφοροποίηση και την επιβίωση με τη στόχευση RBSP3, μία φωσφατάση σαν καταστολέας όγκων σε οξεία μυελοειδή λευχαιμία [22]. Μεταξύ των τεσσάρων προστατευτικών miRNAs, μόνο miR-134 αναφέρθηκε για την αύξηση της επιβίωσης των κυττάρων μέσω επαγωγής G1 σύλληψη στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα [23]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι όλα αυτά τα τέσσερα είχαν miRNAs πάνω ρυθμισμένα σε ασθενείς με μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης. Οι εκφράσεις αυτών των miRNAs σχετίστηκαν θετικά με την επιβίωση των ασθενών. Διείσδυση της διάχυσης με lumophcytes μπορεί να οδηγήσει σε έναν όγκο ανοσολογική απάντηση. Ως εκ τούτου, εμείς εικάζουν ότι τα miRNAs που σχετίζονται με βελτιωμένη επιβίωση μπορεί να υποδεικνύει μια φλεγμονώδη αντίδραση, η οποία πρέπει να αποδειχθεί.

Σε αυτή τη μελέτη, ελεύθερο κυττάρων προφίλ miRNA στην πλευρίτιδες εντοπίστηκαν για πρώτη φορά, η οποία έχει πολλά πλεονεκτήματα. Για τους ασθενείς με NSCLC με MPE, οι στόχοι της θεραπείας είναι να ελέγχετε την ένταση της υπεζωκοτικής συλλογής και παρατείνει την επιβίωση. Ως εκ τούτου, θωρακοσκοπική εκκένωση της συλλογής είναι μια ρουτίνα στην κλινική. Η συλλογή των δειγμάτων συλλογή δεν αυξήσει επιβάρυνση για τους ασθενείς. Εκτός αυτού, οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και κακοήθεις διαχύσεις δεν μπορούν να λάβουν χειρουργική θεραπεία. δείγμα συλλογή είναι πιο εύκολο να αποκτηθούν από δείγμα ιστού. Επιπλέον, miRNAs ως βιοδείκτες που χρησιμοποιείται για την πρόγνωση σε κλινικό περιβάλλον έχουν σημαντικά πλεονεκτήματα σε αντίθεση με mRNAs. Σε αντίθεση με mRNA, miRNAs σε συλλογές παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανέπαφο και σταθερή. Ένας μέτριος αριθμός miRNAs μπορεί να είναι επαρκής για να προβλέψει την επιβίωση του ασθενούς. Έχει αποδειχθεί ότι η κατάταξη των πολλαπλών μορφών καρκίνου με βάση τις υπογραφές έκφραση των miRNAs είναι πιο ακριβή από ό, τι υπογραφές mRNA βάση [24].

Αν και οι περαιτέρω προοπτικές μελέτες με μεγάλο αριθμό ασθενών δικαιολογείται να επιβεβαιώσει το ρόλο του miRNA υπογραφής ως ένας προγνωστικός παράγοντας, τα παρόντα αποτελέσματα μπορεί να έχει σημαντικές κλινικές επιπτώσεις, δεδομένου ότι δεν υπάρχει εγκατεστημένος προγνωστικός δείκτης, εκτός από την κατάσταση απόδοσης προεπεξεργασίας για τους ασθενείς με NSCLC με MPE [25]. Οι πέντε miRNA υπογραφή, που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη, κατατάσσει τους ασθενείς με επιτυχία σε ομάδες χαμηλού κινδύνου και υψηλού κινδύνου και στις δύο σειρές κατάρτισης και επικύρωσης. Αυτό μπορεί να βοηθήσει τους κλινικούς ιατρούς για τον εντοπισμό ασθενών που ανήκουν σε υψηλό κίνδυνο για την πιο αποτελεσματική επικουρική θεραπεία εκτός από το τυπικό πρωτόκολλο θεραπείας. Η ανακάλυψή μας ότι πέντε miRNA υπογραφή δεν μπορεί να προβλέψει την επιβίωση του ασθενούς, επίσης, πιθανό να δημιουργήσει δυναμικό μοριακοί στόχοι για την ανάπτυξη αντικαρκινικών θεραπειών. Από miRNAs μπορούν να στοχεύσουν πολλαπλά γονίδια, οι πιο ενδελεχείς μελέτες που απαιτούνται για την κατανόηση του ρυθμιστικού μηχανισμού αυτών των miRNAs που είναι πιθανό να οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση σχετικά με υπεζωκότα μετάσταση του NSCLC.

Εν κατακλείδι, έχουμε εντοπίσει πέντε miRNA υπογραφή ότι δεν μπορεί να προβλέψει την επιβίωση των ασθενών με προχωρημένο NSCLC. Συλλογές με υψηλή έκφραση του miR-100 και χαμηλή έκφραση των miRNA-93, miRNA-134, miRNA-151 και miRNA-345 συνδέθηκαν με κακή έκβαση της επιβίωσης. Τα ευρήματα αυτά μπορεί να έχουν επιπτώσεις στην κατανόηση των προηγμένων NSCLC, η ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών και την επιλογή των ασθενών με καρκίνο για την επικουρική θεραπεία.

Μέθοδοι

Όλες οι έρευνες που αφορούν τα ανθρώπινα συμμετέχοντες έχουν εγκριθεί από το «Drum επιτροπή Νοσοκομείο πύργου ηθικής »και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα μαθήματα.

συλλογή δειγμάτων και RNA απομόνωση

δείγματα διάχυσης των 184 διαδοχικών ασθενών με ιστολογικά επιβεβαιωμένο καρκίνο του πνεύμονα συλλέχθηκαν κατά την περίοδο Μάρτιο του 2006 έως το Δεκέμβριο του 2010 στο Drum Tower Νοσοκομείο και Nanjing στήθος Νοσοκομείο. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν κοιλότητα παράδοση φαρμάκου, πριν από τη συλλογή του δείγματος. 5 ml έκχυση για εξαγωγή RNA συλλέχθηκε σε RNase-free σωλήνα που περιέχει κιτρικό οξύ από κάθε ασθενή. Το υπερκείμενο ελήφθη με φυγοκέντριση στα 4000 g για 20 λεπτά. 800 μΙ υπερκειμένου αναμίχθηκε με 2,4 ml αντιδραστηρίου ΤΚΙζοΙ LS (Invitrogen, CA, USA). Ένα άλλο 30 fmol ATH-miR159a συμπληρώθηκε σε κάθε σωληνάριο δείγματος. Στη συνέχεια, το συνολικό RNA που περιέχουν μικρές RNA εξήχθη από συλλογές χρησιμοποιώντας miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

μικροσυστοιχιών και της βιοπληροφορικής ερμηνεία των λειτουργικών miRNAs

miRNA μικροσυστοιχιών ήταν αναπτύχθηκε σε 10 δείγματα (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Μετά τη σημαντική ανάλυση και την ανάλυση του FDR, επιλέξαμε τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια, σύμφωνα με την P

-τιμή κατωφλίου και διπλώστε τις αλλαγές [26]. ανάλυση GO εφαρμόστηκε για να αναλυθεί η κύρια λειτουργία των γονιδίων διαφορικής έκφρασης σύμφωνα με την Gene Ontology το οποίο είναι το κλειδί λειτουργική ταξινόμηση του NCBI [27]. Ομοίως, η ανάλυση Διαδρομή χρησιμοποιήθηκε για να μάθετε την σημαντική πορεία των διαφορικών γονιδίων σύμφωνα με KEGG, Biocarta και Reatome [28]. Η σχέση του miRNA και γονίδια που μετρήθηκαν από διαφορικές τιμές τους έκφραση, και miRNA-γονίδιο-Δίκτυο χτίστηκε σύμφωνα με τις αλληλεπιδράσεις των miRNA και γονιδίων στη βάση δεδομένων Sanger miRNA [29]. Το κέντρο του δικτύου ήταν αντιπροσωπεύει κατά βαθμό, που σημαίνει ότι η συμβολή ενός microRNA στα γονίδια γύρω. Τα 5 miRNAs με υψηλότερη βαθμούς επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη.

Ποσοτική RT-PCR

miRNAs είχαν μεταγραφεί αντίστροφα σε cDNA με αντίστροφη μεταγραφάση AMV (Takara, Ιαπωνία). Το συνολικό RNA (1,5 μL για κάθε miRNA) χρησιμοποιήθηκε ως τα πρότυπα, και η αντίδραση επωάστηκε σε 16 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 42 ° C για 40 λεπτά και 70 ° C για 15 λεπτά για να μετουσιωθεί το αντίστροφης μεταγραφάσης. Ποσοτική PCR αντιδράσεις για miRNAs διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας UPL ανιχνευτή (Roche, Basel, Switerland) από την ABI StepOne Plus Σύστημα Ανίχνευσης (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Οι συνθήκες PCR ήταν 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 50 κύκλους στους 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Σχετικά επίπεδα έκφρασης miRNA υπολογίστηκαν σύμφωνα με τη συγκριτική μέθοδο Ct χρησιμοποιώντας ΤΕΑ-miR159a ως αναφορά και ένα μίγμα από RNA που εξάγεται από ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα Α549 και γαστρικά καρκινικά κύτταρα BGC-823 (1:01) ως το βαθμονομητή.

Στατιστική ανάλυση

οι διαφορές μεταξύ δύο ομάδων εκτιμήθηκαν με t-test. Οι συσχετίσεις μεταξύ της συνολικής επιβίωσης και των επιπέδων έκφρασης των miRNAs συλλογή αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier, δοκιμασία log-rank, και Cox μοντέλων παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων. βαθμολογίες Κίνδυνος αποδόθηκαν σε όλους τους ασθενείς σύμφωνα με ένα γραμμικό συνδυασμό του επιπέδου έκφρασης του miRNA, με το συντελεστή παλινδρόμησης από τα δείγματα κατάρτισης. Η βαθμολόγηση κινδύνου υπολογίστηκε ως εξής: κινδύνων βαθμολογία = (1,21 × επίπεδο έκφρασης του miR-100) + (- επίπεδο έκφρασης 0,28 × του miR-134) + (- επίπεδο 0,33 × έκφραση του miR-151) + (- 0,35 × επίπεδο έκφρασης του miR-345) + (- επίπεδο 0,19 × έκφραση του miR-93). μοντέλο και διαστρωμάτωση Cox σταδιακή υποχώρηση αναλύσεις και διεξήχθησαν. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού (SPSS 18? SPSS? Chicago, IL). Η στατιστική σημαντικότητα έγινε δεκτή για

P

τιμές & lt?. 0.05

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

113 miRNAs ανιχνεύθηκαν σε αυτούς τους 10 ασθενείς μεταξύ της ομάδας πιο επιβίωση και την ομάδα μικρότερης επιβίωσης από miRNA μικροσυστοιχιών (S1 αρχείου). Διπλώστε αλλαγές, αξίας FDR και τιμή p υπολογίστηκαν για όλα τα miRNAs

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043268.s001

(XLS)

Εικόνα S1.

Το οικόπεδο ηφαίστειο δείχνει τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs σε συλλογές μεταξύ της ομάδας πλέον, την επιβίωση και την ομάδα μικρότερης επιβίωσης. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει την πολλαπλή μεταβολή μεταξύ δύο ομάδων. Ο κάθετος άξονας αντιπροσωπεύει την P-τιμή του t-test για τις διαφορές μεταξύ των δειγμάτων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043268.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

GO και η ανάλυση μονοπατιού με βάση miRNA στοχεύει γονίδια. Ο κάθετος άξονας είναι το GO (Α) και οδός (Β) κατηγορία, και ο οριζόντιος άξονας είναι ο εμπλουτισμός των GO και οδών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043268.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3. δίκτυο

miRNA-mRNA. Κόκκινο κόμβοι κουτί αντιπροσωπεύουν miRNA και μπλε κόμβους κύκλο αντιπροσωπεύουν mRNA. Τα άκρα δείχνουν την ανασταλτική επίδραση των miRNA επί mRNA. Το κέντρο του δικτύου ήταν αντιπροσωπεύει κατά βαθμό, που σημαίνει ότι η συμβολή ενός microRNA στα γονίδια γύρω. miRNA-93 έχουν τις μεγαλύτερες βαθμούς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043268.s004

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε διαχύσεις μεταξύ ομάδα μεγαλύτερης επιβίωσης και ομάδα μικρότερης επιβίωση.

doi: 10.1371 /journal.pone.0043268.s005

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Qian Qian και σαν Yu στο Nanjing στήθος Νοσοκομείο για την παροχή μέρος της συλλογής μας δείγματα.