Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική νόσος που προσβάλλει τις γυναίκες στις ΗΠΑ. Ο καρκίνος Γονιδιώματος Atlas Δίκτυο εντοπίστηκαν μεταλλάξεις p53 σε 96% των υψηλής ποιότητας ορώδες καρκίνωμα των ωοθηκών, αποδεικνύοντας κρίσιμο ρόλο της. Επιπροσθέτως, η οδός Transforming Growth Factor Beta (ΤΟΡβ) είναι δυσλειτουργικό σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών. Αυτή η μελέτη ερεύνησε πώς η έκφραση του άγριου τύπου, μεταλλάγματος ή απουσία ρ53 μεταβάλλει ωοθηκών κυτταρική απόκριση προς ΤGFβ σηματοδότηση, καθώς και την απόκριση της επιφάνειας επιθηλίου των ωοθηκών και της σάλπιγγας επιθήλιο να ΤΟΡβ. Μόνο τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 ανάπτυξη παρεμποδίζεται από ΤΟΡβ, ενώ ωοθηκών καρκινικά κύτταρα που ήταν μεταλλαγμένο ή null ρ53 δεν ήταν. ΤΟΡβ επαγόμενη μετανάστευση σε ρ53 ηυΙΙ κύτταρα SKOV3, η οποία δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα SKOV3 με σταθερή έκφραση του μεταλλαγμένου ρ53 R273H. Knockdown του άγριου τύπου ρ53 στα OVCA 420 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση σε απόκριση προς ΤΟΡβ. Αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης του DKK1 και TMEPAI, δύο προ-επεμβατική γονιδίων με ενισχυμένη έκφραση σε προχωρημένο στάδιο μεταστατικού καρκίνου των ωοθηκών, παρατηρήθηκε σε ρ53 knockdown και μηδενικά κύτταρα, ενώ τα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά το μεταλλαγμένο ρ53 επέδειξε χαμηλότερη DKK1 και επαγωγή TMEPAI. Η έκφραση της μεταλλαγμένης ρ53 ή απώλεια της άδειας ρ53 συνεχίστηκε πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών παρουσία ΤΟΡβ? Ωστόσο, τα κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο p53 εμφανίζουν μειωμένη μετανάστευση και μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης του DKK1 και TMEPAI

Παράθεση:. Ó hAinmhire Ε, Quartuccio SM, Cheng W, Ahmed RA, ο βασιλιάς SM, Burdette JE (2014) Μετάλλαξη ή απώλειας του p53 διαφορικά Τροποποιεί TGFβ δράση στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (2): e89553. doi: 10.1371 /journal.pone.0089553

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12, Σεπτεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 21 Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 20 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Burdette et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από την Liz Tilberis καρκίνου των ωοθηκών Ταμείο Έρευνας L /T /UIC /0.1.2011, Vahlteich Βραβείο από την UIC College of Pharmacy and American Cancer Society Research Scholar Grant Illinois τμήμα ΕΓΓ-12-230-01-TBG . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πέμπτη συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο και η πιο θανατηφόρα γυναικολογική νόσος μεταξύ των γυναικών στις ΗΠΑ. Το 2013, εκτιμάται ότι περίπου 22.240 περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών θα πρέπει να διαγνωστεί, με αποτέλεσμα 14.030 θανάτους [1]. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι πάνω από το 60% των καρκίνων των ωοθηκών θα διαγνωστεί μετά η ασθένεια έχει εξαπλωθεί σε απομακρυσμένα σημεία. Μόλις μεταστάσεις, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης πέφτει στο κάτω του 30% [1]. Η αναποτελεσματικότητα της διάγνωσης οφείλεται κυρίως στην έλλειψη κατανόησης των εναρκτήριων συμβάντων και τους μηχανισμούς της εξέλιξης που οδηγούν σε καρκίνο των ωοθηκών, με μερικές στρατηγικές έγκαιρης ανίχνευσης [2]. Είναι σημαντικό ότι, αν ο καρκίνος των ωοθηκών διαγιγνώσκεται νωρίτερα, τα ποσοστά επιβίωσης μπορεί να είναι τόσο υψηλό όπως 90% [1]. Αυτά τα στατιστικά στοιχεία απεικονίζουν την βασική ανάγκη για την καλύτερη κατανόηση νωρίς μηχανιστική εκδηλώσεις του καρκίνου των ωοθηκών, που θα βοηθήσει με πρώιμη διάγνωση και βελτίωση πρόγνωση των ασθενών.

Το ογκοκατασταλτικό ρ53 είναι η πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο σε όλους τους καρκίνους του ανθρώπου [2] . p53 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ελέγχει πολλές κυτταρικές λειτουργίες όπως τον κυτταρικό κύκλο, απόπτωση, και απόκριση σε βλάβη του DNA [3]. Οι περισσότεροι

TP53

μεταλλάξεις είναι εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις, όπου ένα ενιαίο αποτέλεσμα υποκατάστασης βάσης νουκλεοτιδίου είτε σε δυσλειτουργία ή απουσία της δραστηριότητας p53 [4]. Αυτές οι μεταλλάξεις οδηγούν σε αυξημένο πολλαπλασιασμό, εισβολή, και μετάσταση σε πολλούς καρκίνους [5]. Ο καρκίνος Γονιδιώματος Atlas Network (CGAN) προσδιόρισε ρ53 ως μεταλλαγμένη σε ποσοστό έως 96% της χημειοθεραπείας ανθεκτικά, υψηλής ποιότητας ορώδες καρκίνους των ωοθηκών, υποδεικνύοντας σημαντικό ρόλο για την ρ53 μεταλλάξεων σε ορώδες καρκίνο των ωοθηκών [6]. Επιπλέον, ο Διεθνής Οργανισμός Ερευνών για τον Καρκίνο (IARC)

TP53

βάση δεδομένων δείχνει ότι η πιο συχνή ρ53 μετάλλαξη στο ορώδες καρκίνο των ωοθηκών είναι μια αργινίνη σε ιστιδίνη μετατροπή στο υπόλειμμα αμινοξέος 273 (R273H) εντός του τομέα δέσμευσης του DNA , η οποία αντιπροσωπεύει το 8% του συνόλου των μεταλλάξεων ρ53 [7]. Μεταλλαγμένα R273H ρ53 έχει αναφερθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην προώθηση του μαστού και τη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα [8], [9] με την αύξηση της μετανάστευσης και της εισβολής.

Ένα άλλο σημαντικό μονοπάτι σηματοδότησης που είναι τροποποιημένο σε καρκίνο των ωοθηκών είναι η Transforming Growth Συντελεστής βήτα οδός (TGFβ) [10]. TGFβ είναι μια υπεροικογένεια πεπτιδικών αυξητικών παραγόντων που ρυθμίζουν την αύξηση, διαφοροποίηση, την απόπτωση, και τη μετανάστευση [10]. ΤΟΡβ σήματα μέσω σύνδεσης με μία οικογένεια υποδοχέων της μεμβράνης κινάσης σερίνης /θρεονίνης, η οποία φωσφορυλιώνει κατάντη μόρια σηματοδότησης, Smads κυρίως 2 και 3 [11]. Μόλις ενεργοποιηθεί, οι εν λόγω Smad σύμπλοκα μετατοπίζονται στον πυρήνα και να αλληλεπιδρούν με διάφορους συν-ενεργοποιητές και καταστολείς να διαμορφώνει Smad-ρυθμιζόμενη μεταγραφή [11], [12]. ΤΟΡβ παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση διακοπής της ανάπτυξης σε φυσιολογικά κύτταρα των ωοθηκών [13]. Σε μερικά καρκινικά κύτταρα, ΤΟΡβ επάγει απόπτωση και κυτταρικό κύκλο σύλληψης, ενώ σε άλλα καρκινικά κύτταρα χάνει την ικανότητα να επάγουν διακοπή αύξησης και μπορεί αντί προάγουν την κυτταρική εισβολή [10]. Μπορεί επίσης να διαδραματίσει έναν ρόλο στην χημειοαντίσταση σε προχωρημένο ορώδες καρκίνους των ωοθηκών [14]. Τα βασικά συστατικά ΤΟΡβ οδού, οι υποδοχείς ΤΟΡβ, και πρωτεΐνες Smad, σπάνια μεταλλαγμένα ή χάνονται στον καρκίνο των ωοθηκών [5], προτείνοντας ότι διακοπή του μονοπατιού TGFβ συμβαίνει με άλλους μηχανισμούς.

Όπως ρ53 και Smads είναι και τα δύο παράγοντες μεταγραφής, ρ53 είναι ικανή να αλληλεπιδρά με Smads να τροποποιήσει τόσο η ρ53 και ΤΟΡβ μονοπατιών σηματοδότησης [4]. Smads μπορεί να σχηματίσει ένα μεταγραφικό σύμπλοκο με ρ53 να επάγει την έκφραση των γονιδίων που προάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου, όπως ρ21 [4]. Smads και ρ53 δεσμεύονται με τα δικά τους στοιχεία απόκρισης στους υποκινητές ΤΘΡβ-γονιδίων που αποκρίνονται σε συνεργικά ενεργοποιήσουν ή να καταστείλουν μεταγραφή [4]. Στην πραγματικότητα, έχει δειχθεί ότι η ρ53 απαιτείται για τον ΤΟΡβ-επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου [4]. Επιπλέον, μεταλλαγμένη ρ53 R273H καταργεί ΤΟΡβ-επαγόμενη αναστολή του κυτταρικού κύκλου και προωθεί μεταστατική συμπεριφορά μπλοκάροντας p63 σε κύτταρα καρκινώματος μαστού [8]. Σε αυτά τα κύτταρα, το μεταλλαγμένο ρ53 /Smad σύμπλεγμα αναστέλλει ρ63-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή οδηγεί στην εισβολή παρουσία ογκογόνου Ras [8].

Λαμβάνοντας υπόψη το υψηλό ποσοστό των μεταλλάξεων ρ53 σε όγκους των ωοθηκών [6] και η πρόσφατη ενδείξεις ότι ρ53 και Smads αλληλεπιδρούν για να ρυθμίζουν τη μετάσταση σε κύτταρα καρκινώματος μαστού [8], ο ρόλος της μεταλλαγμένης ρ53 σε απόκριση σε TGFβ σηματοδότηση σε καρκίνο των ωοθηκών διερευνήθηκε. ρ53 και ΤΟΡβ εμπλέκονται σε πολλούς καρκίνους όπως του μαστού και του πνεύμονα με δική τους [15], [16] και σε συνεννόηση [8]. Σε καρκίνους του μαστού και του πνεύμονα, μεταλλαγμένο ρ53 αλληλεπιδρά με Smads να μεταβάλει τη μεταγραφή των γονιδίων που ρυθμίζουν τη μετάσταση [8], αλλά λίγα είναι γνωστά σχετικά με το πώς ρ53 και ΤΟΡβ αλληλεπιδρούν στον καρκίνο των ωοθηκών. Παράγοντες που απαιτούνται για την ανάπτυξη και την μετάσταση σε μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του μπορεί να μην είναι αναγκαία στον καρκίνο των ωοθηκών, οδηγώντας σε ιστό ειδικές επιδράσεις των μεταλλαγμένων σηματοδότησης ρ53 [17]. Δύο γονίδια (

TMEPAI

και

DKK1

) μελετήθηκαν με βάση το ρόλο τους στη μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών.

TMEPAI

είναι ένα ΤΟΡβ-επαγόμενη αρνητικός ρυθμιστής [18] και εμπλέκεται σε ΤΘΡβ-επαγόμενη μετάσταση σε κυτταρικές σειρές καρκινώματος του μαστού [18], αλλά δεν έχει ποτέ αναφερθεί ότι είναι συν-ρυθμίζονται από ρ53 και Smads.

DKK1

είναι ένας αναστολέας της σηματοδότησης Wnt, η οποία συχνά ρυθμίζεται αυξητικά σε μεταστατικό καρκίνο των ωοθηκών, και σχετίζεται με κακή πρόγνωση [19]. Maspin, ένα αντι-μεταστατικό πρωτεΐνη, επιλέχθηκε ως έχει καθιερώσει ρύθμιση από ρ53 και Smads [20]. Η τρέχουσα μελέτη αξιολόγησε εάν η έκφραση μιας από τις πιο κοινές μεταλλάξεις ρ53 σε καρκίνο των ωοθηκών (R273H) μεταβάλλει το κύτταρο απόκριση προς σηματοδότηση Smad να ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυττάρων καλλιέργεια

Όλα τα αντιδραστήρια ελήφθησαν από την Life Technologies (Carlsbad, CA) εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. OVCA 420, OVCA 429, και OVCA 432 είναι κυτταρικές σειρές που έχουν προηγουμένως δημοσιευθεί [21], [22], ενώ τα κύτταρα OVCAR5 είναι διαθέσιμα μέσω του ινστιτούτου εθνικής καρκίνου (NCI) ως μέρος της NCI60 καρκινικών κυττάρων γραμμή της οθόνης αντικαρκινικών φαρμάκων [ ,,,0],23]. Οι OVCA 420, OVCA 429, OVCA 432, και OVCAR5 κύτταρα (δώρα από το Δρ Gustavo Rodriguez και ο Δρ Τερέζα Woodruff στο Πανεπιστήμιο Northwestern) διατηρήθηκαν σε Minimum Essential Media (ΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1 % L-γλουταμίνη, 1% μη απαραίτητα αμινοξέα, 1% πυροσταφυλικό νάτριο, και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. κύτταρα OVCAR3 ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA) και διατηρήθηκαν στα ίδια μέσα όπως παραπάνω, με την εξαίρεση των συμπληρωμάτων με 20% FBS. κύτταρα SKOV3 αποκτήθηκαν από την ATCC και διατηρήθηκαν σε McCoy 5Α συμπληρωμένο με 2.3 g ανθρακικού /L νάτριο, 10% FBS, και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη.

Σταθερές κυτταρικές γραμμές επελέγησαν χρησιμοποιώντας ανθεκτικών στα αντιβιοτικά πλασμίδια που περιέχουν το γονίδιο του ενδιαφέρον. κύτταρα SKOV3 που εκφράζουν σταθερά μεταλλαγμένο p53 R273H [24] (Addgene, πλασμίδιο: 16439, δωρεά του Δρ Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine, Βαλτιμόρη, MD) επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 500 μg /mL G418 (Δίδυμοι βιο-προϊόντα, Δυτικό Σακραμέντο , CA) και διατηρήθηκαν σε μέσα SKOV3 που περιέχει 200 ​​μg /mL G418. OVCA 420 κύτταρα που εκφράζουν ρ53 shRNA ή ομελέτα shRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) επελέγησαν χρησιμοποιώντας 4 μg /mL πουρομυκίνη (Sigma-Aldrich) και διατηρήθηκε με 1 μg /mL πουρομυκίνη. ρ53 άγριου τύπου πλασμίδιο [24] αγοράστηκε από Addgene (Addgene πλασμίδιο: 16434, δωρεά του Δρ Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine, Βαλτιμόρη, MD)

Κανονική απαθανάτισε ανθρώπινη επιφάνεια επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών (. IOSE 80) ήταν ένα δώρο από τον Dr. Nelly Auersperg στο Πανεπιστήμιο του Βανκούβερ και διατηρήθηκαν σε 50% ν /ν Medium 199 και 50% ν /ν MCDB (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), 15% FBS, 1% L-γλουταμίνη, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και 0,055% αύξηση των επιθηλιακών παράγοντα (EGF, PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ) [25]. Κανονικό ανθρώπινο σάλπιγγα εκκριτικά επιθηλιακά κύτταρα (FTSEC) ήταν ένα δώρο από τον Dr. Ronny Drapkin στο Πανεπιστήμιο του Χάρβαρντ και διατηρήθηκαν σε 50% ν /ν DMEM και 50% ν /ν F-12 (Mediatech, Manassas, VA), 1% L-γλουταμίνη, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και 2% Ultroser G (Pall Corporation, Port Washington, ΝΥ) [26]. Mouse επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών επιφάνεια (MOSE) απομονώθηκαν από ποντίκια C57BL /6 και των σαλπίγγων επιθηλιακά κύτταρα ποντικού (MTEC) απομονώθηκαν από ποντικούς CD1 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Τα καλλιεργημένα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα.

Λουσιφεράσης δοκιμασία

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 25.000 ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων και επωάζονται διανυκτέρευση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 0.05 μg /πηγάδι ενός κατασκευάσματος έκφρασης που περιέχει τον προαγωγό δεσμευτικός στοιχείο Smad ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας Mirus TransIT LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το πλασμίδιο στοιχείο απόκρισης Smad περιέχει μια αλληλουχία CAGA επαναλαμβάνεται δώδεκα φορές ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης (δώρο από τον Dr. Αρη Μουστάκας στο Ludwig Institute for Cancer Research, Uppsala, Σουηδία). Τα πλασμίδια για την έκφραση του άγριου-τύπου ρ53 ή μεταλλαγμένο πλασμίδια R273H ρ53 διαμολύνθηκαν σε κύτταρα σε 0.05 μg /mL. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν για 24 ώρες σε μέσο συμπληρωμένο με ορό. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και επεξεργάστηκε με TGFβ1 στα 10 ng /mL (Sigma Aldrich) για 24 ώρες. SB-431542 (Σέλεκ Chemicals, Houston, ΤΧ) χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 5 μΜ για όλες τις δοκιμασίες λουσιφεράσης. Το πρωτόκολλο και η SBE-λουσιφεράσης αποδόσεις επιμόλυνσης ομαλοποιούνται και τρέχει όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Κανονική δραστικότητα λουσιφεράσης των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Synergy Mx (BioTek, Winooski, VT).

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

Σουλφοροδαμίνη Β (SRB) δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η πυκνότητα των κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με ΤΟΡβ (20 ng /mL) που ακολουθείται από χρωματομετρική ανάλυση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Η επιβίωση των κυττάρων υπολογίστηκε με σύγκριση των τιμών απορρόφησης μεταξύ θεραπεία και τον έλεγχο φρεάτια. Ιστορικό αφαιρέθηκε με μέτρηση της απορρόφησης του 0.1 mM από μόνη της Τρις-βάση.

Η κυτταρομετρία ροής

OVCA 420, OVCA 432, και SKOV3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε Τ25 φιάλες 24 ώρες πριν από τη θεραπεία. Μέσο που περιέχει ΤΟΡβ (20 ng /mL) ή έλεγχος διαλύτη προστέθηκε και επωάστηκε για 48 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS, επαναιωρήθηκαν σε 500 μL PBS, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 4 mL 70% αιθανόλης και αποθηκεύθηκε στους -20 ° C όλη τη νύκτα. Τα στερεωμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και βάφτηκαν με 500 μL ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διάλυμα [50 μg /mL ΡΙ, 90 μονάδες RNase Α, 0,1% Triton Χ-100, 4 mmol ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού /L, 10 mM πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG ) 4000]. Τα κύτταρα επωάστηκαν στο διάλυμα ΡΙ για 20 λεπτά στους 37 ° C πριν από επεξεργασία με διάλυμα άλατος 500 μL ΡΙ (1 mg /mL ΡΙ, 0.1 mL 10% Triton Χ-100, διάλυμα 4 Μ NaCl, 10 mM PEG 4000) . Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε σε ένα Beckman Coulter Elite ESP (Miami, FL) με τουλάχιστον 30.000 μεμονωμένα γεγονότα ανά αντίδραση. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με Mod-fit λογισμικού (Verity Software House, Inc., Topsham, ΜΕ).

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν στα 50,000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων, επιμολυσμένα με κατάλληλα πλασμίδια στα 0,05 μg /mL, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με TGFβ1 (10 ng /mL) για 24 ώρες. Για την επαγωγή ρ53 Express, σισπλατίνη (Fisher Scientific, NC9343338) κατεργασία πραγματοποιήθηκε σε 125 μΜ για δύο ώρες. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με δοκιμασία BCA (Pierce, Rockford, IL). Κυτταρόλυμα (30 μg) αναλύθηκε με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη. Τα στυπώματα στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 5% γάλα σε ΤΒδ-Τ και ανιχνεύθηκαν όλη τη νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ανθρώπινο ρ53 (# 9282), ρ21 (# 9247), maspin (# 9117), CDC2 (# 9112) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, ΜΑ) σε συγκέντρωση 1:1000? DKK1 (H-120) και ρ21 ποντικού (F-5) (Santa Cruz Technology, Inc, Santa Cruz, CA) χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 1:200? TMEPAI 2A12 (Abnova, Ταϊπέι, Tiawan) χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 1:500? και ακτίνη (Sigma-Aldrich) σε συγκέντρωση 1:1000. Αντι-ποντικού και κουνελιού HRP-συνδεδεμένη δευτερογενή (Cell Signaling Technology, Inc.) χρησιμοποιείται για όλες τις κηλίδες σε συγκέντρωση 1:1000.

πληγών επούλωσης δοκιμασία

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 50.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μία πλάκα 24 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Μια ενιαία πληγή που δημιουργείται μέσω της κυτταρικής μονοστοιβάδας χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας. Τα κύτταρα πλύθηκαν και κατεργάστηκαν με TGFβ1 (20 ng /mL) αμέσως μετά το ξύσιμο. Εικόνες ελήφθησαν στις 0, 24, και 48 ώρες μετά την ξύσιμο, και η περιοχή του μηδέν αναλύθηκε με λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Τοις εκατό κλείσιμο μετρήθηκε σε σύγκριση με 0 ώρες και διπλώστε την αλλαγή προσδιορίστηκε από εκατό κλείσιμο σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο.

Ζώα, καλλιέργεια οργάνων και ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Τα ζώα αποκτήθηκαν, η επεξεργασία, και στεγάζεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Ωοθήκες και ωαγωγούς αποκόπηκαν και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30], [31]. Το μέσο αύξησης συνίστατο από άλφα-ΜΕΜ (Invitrogen), και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen) με 0,1% DMSO, 20 ng /μL ΤΟΡβ, 5 μΜ SB431542 (αναστολέας ΤΟΡβ), ή 20 ng /μL ΤΟΡβ συν 5 μΜ SB431542 προστίθεται ως προϋποθέσεις θεραπείας. ΤΟΡβ διαλύθηκε σε νερό, αλλά το 0,1% του DMSO προστέθηκε στο μόνη προϋπόθεση TGFβ να ελέγχουν για SB431542 διαλύτη. Βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU, Sigma? 10 μΜ) προστέθηκε στο μέσο ανάπτυξης 24 ώρες πριν από τη μονιμοποίηση του ιστού. Οι ιστοί ήταν προετοιμασμένοι για τομές παραφίνης και ανοσοϊστοχημεία ολοκληρώθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27].

απεικόνιση της διάδοσης

απεικόνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα Nikon E600 Μικροσκόπιο με ένα DS-Ri1 ψηφιακή φωτογραφική μηχανή και ΝΑΚ Στοιχεία Λογισμικού (Nikon Instruments, Melville, ΝΥ). ImageJ χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ποσοστό πολλαπλασιασμός υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των επιθηλιακών κυττάρων χρωματίζονται θετικά για BrdU διά του συνολικού αριθμού των επιθηλιακών κυττάρων.

δήλωση Ηθική

Όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή σύμφωνα με τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των κατευθυντήριων γραμμών για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου και την καθιερωμένη Θεσμικών Ζωικά Χρήσης και το πρωτόκολλο Φροντίδας στο Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή Animal Care στο Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο (αριθμός πρωτοκόλλου: A08-250). Τα ζώα στεγάστηκαν σε μία θερμοκρασία και φως ελεγχόμενο περιβάλλον (12 ώρες φως, 12 ώρες σκοτάδι) και παρέχεται τροφή και νερό κατά βούληση. Όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 εισπνοή ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση.

Στατιστικές αναλύσεις

Όλες οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. ANOVA που ακολουθήθηκε από πολλαπλές δοκιμές σύγκρισης του Tukey χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθούν οι διαφορές μεταξύ των πειραματικών και ελέγχου ομάδων. Για τον προσδιορισμό επούλωσης πληγών, ένα αντιστοιχισμένο t-test χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του ελέγχου και αντιμετωπίζεται σε κάθε κυτταρική σειρά, ενώ ένα μη ζευγαρωμένο t-test χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση αγωγή ομάδες μεταξύ δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές. p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

TGFβ προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53

Για να κατανοήσουμε καλύτερα το ρόλο της p53 στον καρκίνο των ωοθηκών. , έξι γνωστές κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών αναλύθηκαν ως προς την έκφραση της ρ53 (Εικ. 1a). OVCA 420 και 429 κύτταρα εκφράζουν χαμηλά επίπεδα πρωτεΐνης ρ53, σε συνέπεια με αναφορές ότι έχουν άγριου-τύπου ρ53 [32]. Λόγω αυτών των χαμηλά επίπεδα, θεραπεία σισπλατίνη χρησιμοποιήθηκε για να επάγει και να επιβεβαιώσει την έκφραση ρ53 σε OVCA 429 (Εικ. S1). SKOV3 και OVCAR5 δεν έδειξαν καμία έκφραση της πρωτεΐνης ρ53, όπως είναι συνεπές με την προηγούμενη διαπίστωση ότι τα ταξινομημένα ως ρ53 null [7]. Σε αντίθεση, OVCA 432, και OVCAR3 παρουσίασαν έκφραση άφθονη πρωτεΐνη p53 λόγω των R277H και R248Q μεταλλάξεων, αντίστοιχα (Πίνακας S1) [7].

(α) ανάλυση στυπώματος Western των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών καταδεικνύοντας p53 τους κατάσταση. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Έξι κυτταρικές σειρές καρκίνου ωοθήκης (OVCA 420, 429, SKOV3, OVCAR 5, OVCA 432, και OVCAR 3), μαζί με τέσσερις, κυρίως, μη-καρκινικές κυτταρικές γραμμές (MOSE, MTEC, IOSE80, και FTSEC) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς ΤΟΡβ (10 ng /mL) με τη χρήση του SBE-luc πλασμίδιο. ANOVA πραγματοποιήθηκε ξεχωριστά για πλάσια επαγωγή (TGFβ) και διπλώστε την καταστολή (αναστολέα και αναστολέα + TGFβ) να αναλύσει τη σημασία σε σύγκριση με τη μη επεξεργασμένη. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM, * p ≤ 0,05.

Η

Για να αξιολογηθεί ο τρόπος της έκφρασης p53 ρυθμίζει την ικανότητα των κυττάρων να ανταποκρίνονται σε Smad σηματοδότηση, ένας προσδιορισμός λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί ποια κύτταρα ανταποκρίνονται σε TGFβ επαγόμενη Smad μεταγραφής (σχ. 1β). Όλες οι κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, εκτός OVCAR5, κατέδειξε ΤΟΡβ-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή που θα μπορούσε να μπλοκαριστεί από SB431542, έναν αναστολέα ΤΟΡβ (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Στη συνέχεια, η επίδραση του ΤΟΡβ σε μη καρκινικές προγονικών κυττάρων διερευνήθηκε. Από επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών (ΟΣΕ) και επιθήλιο σάλπιγγα (TEC) μπορεί να οδηγήσει σε καρκίνο των ωοθηκών [33], η απόκριση αυτών των φυσιολογικών κυττάρων σε ΤΟΡβ διερευνήθηκε. Για την παρακολούθηση σηματοδότησης κατάντη του TGFβ, αναλύσεις SBE-λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκαν σε κανονική 2D ΟΣΕ ποντικού (MOSE) και τα κύτταρα ποντικού ΣΕΚ (MTEC), καθώς και τα ανθρώπινα απαθανάτισε ΟΣΕ (IOSE80) και της ανθρώπινης σάλπιγγα επιθήλιο του σωλήνα (FTSEC). ΟΣΕ και ΣΕΚ κύτταρα ανταποκρίθηκαν σημαντικά στην Smad με τη μεσολάβηση της μεταγραφής που προκαλείται από TGFβ τόσο του ποντικιού και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (Σχ. 1β). κύτταρα MOSE απάντησε με μια υψηλότερη ενεργοποίηση φορές (21 φορές) από τον δημοσιογράφο από κύτταρα MTEC (7 φορές). έκφρασης p53 σε MOSE ήταν προηγούμενο επιβεβαιώνεται ως άγριου τύπου [27], [34]. κύτταρα MTEC συμπεριφέρθηκε ως άγριου τύπου σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη (Εικ. S2), ενώ η IOSE80 και FTSEC ήταν λειτουργικά null για ρ53 λόγω αθανατοποίηση με SV40.

Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, τρεις κυτταρικές γραμμές (OVCA 420 , OVCA 432, και SKOV3) επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση των επιπτώσεων του TGFβ στον πολλαπλασιασμό. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΟΡβ (20 ng /mL) για 48 ώρες και εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου εξετάστηκε μέσω κυτταρομετρίας ροής. επεξεργασία TGFβ που προκαλείται G

0 /G

1 κύτταρο σύλληψη του κύκλου στο OVCA 420 (Σχ. 2α). OVCA 432 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν μεταλλαγμένο ρ53, δεν ήσαν αναστολή ανάπτυξης με αγωγή ΤΟΡβ (Σχ. 2β). Τέλος, ΤΟΡβ δεν προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα SKOV3, αλλά μάλλον μείωσε τον αριθμό των κυττάρων σε G

0 /G

1 (Σχ. 2c).

(α-γ) OVCA 420, OVCA 432, και κυτταρικές γραμμές SKOV3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 ng /mL TGFβ για 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Οι κατανομές των κυττάρων στις τρεις φάσεις του κυτταρικού κύκλου που αντιπροσωπεύεται από μέση ποσοστά +/- SEM. Η στατιστική σημαντικότητα αντιπροσωπεύει μια διαφορά μεταξύ του αριθμού των κυττάρων σε κάθε κύκλο μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων και αντιπροσωπεύονται με * για αύξηση των επεξεργασμένων κυττάρων σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα?

#represents μείωση των επεξεργασμένων κυττάρων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα? p ≤ 0,05 (δ) ανάλυση κηλίδας Western των τριών κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών διερευνήθηκαν για πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου ρ21 και CDC2. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε-στ) ανάλυση της διάδοσης πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ενσωμάτωσης BrdU σε καλλιέργεια οργάνων 3D των ωοθηκών και σωλήνες ποντίκι. Η μονόδρομη ΑΝΟνΑ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM * p ≤ 0,05.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ο μηχανισμός για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου p53-Smad, η έκφραση της p21 και CDC2 αξιολογήθηκαν σε OVCA 420, OVCA 432, και SKOV3 κύτταρα κατεργασμένα με ΤΟΡβ (Εικ. 2d). ρ21 είναι ένας εξαρτώμενος από κυκλίνη αναστολέας κινάσης που ρυθμίζεται τόσο από ρ53 και Smads, και συσχετίζεται με ΤGFβ-διαμεσολαβούμενη αναστολή του κυτταρικού κύκλου [4]. CDC2 (ή CDK1) είναι μια εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση και η έκφρασή του είναι συμβατή με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [35]. θεραπεία ΤΟΡβ σε OVCA 420 αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης ρ21 (Εικ. 2α και δ), το οποίο δεν παρατηρήθηκε στα OVCA 432 και SKOV3 κυττάρων (Εικ. 2d). Οι OVCA 432 και SKOV3 κύτταρα εξέφρασαν υψηλά επίπεδα CDC2, σε σύγκριση με OVCA 420 (Σχ. 2δ). Στη συνέχεια, ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε για την παρακολούθηση πολλαπλασιασμό κανονικών επιφάνεια των ωοθηκών ποντικού επιθήλιο και σαλπίγγων επιθήλιο χρησιμοποιώντας ένα σύστημα καλλιέργειας οργάνου 3D [30] υποβάλλεται σε επεξεργασία με ΤΟΡβ. Μετά από 48 ώρες, ο πολλαπλασιασμός του ΟΣΕ ήταν σημαντικά μειωμένη με τη θεραπεία TGFβ σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO (Εικ. 2ε). Παρά το γεγονός ότι μεταγραφικά ανταποκρίνεται, ο πολλαπλασιασμός δεν ανεστάλη με αγωγή ΤΟΡβ σε σαλπίγγων κύτταρα σε 3D καλλιέργεια (Σχ. 2f). Η αθανατοποίηση των IOSE80 και FTSEC με αντιγόνο SV40T αδρανοποιεί p53 [25], [26], επομένως δοκιμασίες ανάπτυξης με ΤΟΡβ δεν πραγματοποιήθηκαν σε αυτά τα κύτταρα.

ΤΟΡβ-επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου ακυρωθεί ρ53 μεταλλαγμένη και μηδενικά κύτταρα

Παραλλαγές του OVCA 420 δημιουργήθηκαν για να διερευνήσει το ρόλο της p53 στον ΤΟΡβ-επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου (Πίνακας S1 και S2). Χρησιμοποιώντας shRNA, ενδογενές ρ53 άγριου τύπου είχε ουσιαστικά γκρέμισε OVCA 420 (OVCA 420 p53 shRNA) κυττάρων σε σύγκριση με το ανακατωμένο έλεγχο shRNA (OVCA 420 SCR) (Εικ. 3α). Επιπροσθέτως, τα κύτταρα SKOV3 διαμολύνθηκαν σταθερά για να εκφράσουν το μεταλλαγμένο ρ53 R273H (Σχ. 3α). Άγριου-τύπου ρ53 δεν θα μπορούσε να επιμολυνθεί σταθερά σε κύτταρα SKOV3 επειδή τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε γήρανση και δεν μπορούσε να διαδοθεί, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [36]. Παροδική διαμόλυνση των άγριου τύπου ρ53 σε κύτταρα SKOV3 δεν προκάλεσε αμέσως γήρανση, η οποία επέτρεψε τη συλλογή δεδομένων σε μικρότερα χρονικά σημεία.

(α) ανάλυση κηλίδας Western των σταθερών κυτταρικών γραμμών για knockdown του ρ53 με shRNA πλασμίδιο ή έκφραση του μεταλλαγμένου p53 R273H. C = ελέγχου, Τ = TGFβ θεραπεία. (Β) SB-431542 (5 μΜ) χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει ΤΟΡβ σηματοδότηση. Για κάθε πίνακα, τα δεδομένα αντιπροσωπεύει μέση αύξηση ± SEM p ≤ 0,05 πάνω από θεραπευτική αγωγή για τις ομάδες επισημαίνονται με ένα, ή μεταξύ των ομάδων που υπέστησαν αγωγή επισημαίνονται με b. (Γ) Η επιβίωση των κυττάρων. Ποσοστό ΤΟΡβ επεξεργασμένου κυττάρου επιβίωση σε σύγκριση με τη μη επεξεργασμένη. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM, * p ≤ 0,05.

Η

Πρώτον, η ικανότητα της παραλλαγής κυτταρικών γραμμών για την αντιμετώπιση ΤΟΡβ διερευνήθηκε. Όλες οι σταθερές κυτταρικές σειρές διατήρησε την ικανότητα να διεγείρει Smad-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή ενός πλασμιδίου SBE-λουσιφεράσης ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53 (Εικ. 3b). Η επαγωγή της λουσιφεράσης παρέμεινε η ίδια στην OVCA 420 p53 shRNA και OVCA 420 Scr όταν συγκρίνεται με τις OVCA 420 μητρικών κυττάρων (Σχ. 3b). Ομοίως, οι σταθερές μεταλλαγμένα κύτταρα ρ53 R273H SKOV3 δεν μετέβαλλε ΤΟΡβ-επαγόμενη Smad-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή του γονιδίου λουσιφεράσης (Σχ. 3β). Παροδική έκφραση του άγριου-τύπου ρ53 στα κύτταρα SKOV3 μειωμένη Smad-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή σε σύγκριση με τα κύτταρα R273H μεταλλαγμένο ρ53 SKOV3, αλλά εμφανίζεται καμία σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την SKOV3 μητρική κυτταρική γραμμή (Σχ. 3β).

για να εκτιμηθεί ο πολλαπλασιασμός σε απόκριση σε ΤΟΡβ (20 ng /mL), δοκιμασίες ανάπτυξης κυττάρου διεξήχθησαν μετά από επώαση 48 ωρών. Όπως ήταν αναμενόμενο, OVCA 420 κυτταρική ανάπτυξη Scr καταστάλθηκε σε απόκριση ΤΟΡβ, η οποία ήταν παρόμοια με την γονική γραμμή (Σχ. 3c). TGFβ αναστολή που προκαλείται από την ανάπτυξη χάθηκε στο OVCA 420 p53 shRNA. Ομοίως, TGFβ λένε το αντίθετο αργό πολλαπλασιασμό είτε τη μητρική SKOV3 ή την p53 μεταλλαγμένο R273H κυτταρική σειρά SKOV3 (Σχ. 3γ).

Mutant έκφραση p53 R273H αποτρέπει TGFβ που προκαλείται από τη μετανάστευση των κυττάρων SKOV3

Εκτός επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό, ΤΟΡβ και ρ53 έχουν επίσης αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τη μετανάστευση των κυττάρων του όγκου από το στήθος και τους πνεύμονες [8], [9], [37]. Προηγούμενη βιβλιογραφία δείχνει ότι το μεταλλαγμένο ρ53 μπορεί να λειτουργήσει ως ένα μοριακό σκανδάλη επιτρέπει ΤΟΡβ να επάγει προμεταναστευτικές ερεθίσματα [38]. Ως εκ τούτου, η ρύθμιση ΤΟΡβ της κυτταρικής μετανάστευσης παρουσία άγριου τύπου, μεταλλάγματος και μηδενική ρ53 διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας μια πληγή δοκιμασία επούλωσης. ΤΟΡβ επαγόμενη μετανάστευση στις δύο OVCA 420 Scr και OVCA 420 p53 κύτταρα shRNA μεταξύ 0 και 24 ώρες και 24 και 48 ώρες (Σχ. 4α). OVCA 420 SCR (ρ53 άγριου τύπου) κύτταρα επεξεργασμένα με ΤΟΡβ μετανάστευσαν σημαντικά περισσότερο από μη-επεξεργασμένα ελέγχου μεταξύ 0 και 24 ώρες, αλλά όχι μεταξύ 24 και 48 ώρες, ενώ OVCA 420 p53 κύτταρα shRNA σε επεξεργασία με ΤΟΡβ μετανάστευσαν σημαντικά περισσότερο από τον έλεγχο μεταξύ 0 και 24 ώρες και μεταξύ 24 και 48 ώρες (Σχ. 4α). Μεταναστευτικά ποσοστά συγκρίθηκαν μεταξύ αντιμετωπίζονται OVCA 420 SCR και OVCA p53 shRNA. Εξόντωση ρ53 επιτρέπονται για αυξημένη μετανάστευση σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου (σχ. 4β).

(α) δοκιμασίες επουλωτικές των πληγών διεξήχθησαν σε σταθερές κυτταρικές σειρές SKOV3 και OVCA 420. μονοστοιβάδες κυττάρων γδαρμένο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς TGFβ στα 20 ng /mL για 48 ώρες. Το κλείσιμο της πληγής μετρήθηκε ως αύξηση πλάσια ή μείωση σε σύγκριση με τον έλεγχο χωρίς θεραπεία. Paired t-test χρησιμοποιήθηκε με ένα p ≤ 0,05. (Β) Σύγκριση της πλάσια αύξηση των δειγμάτων ΤΟΡβ από 5 (α). Ζευγαρωμένο t-test χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν σημασία. Σημασία αντιπροσωπεύεται από * και σηματοδοτεί μια στατιστική διαφορά μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM, * p ≤ 0,05.

Η

Η ικανότητα των SKOV3 άκυρη και SKOV3 κύτταρα ρ53 μετάλλαξη R273H να μεταναστεύσουν σε απάντηση TGFβ αναλύθηκε επίσης. ΤΟΡβ επαγόμενη μετανάστευση σε ρ53 ηυΙΙ κύτταρα SKOV3 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα μεταξύ των δύο μηδέν και 24 ώρες και μεταξύ 24 και 48 ώρες (Σχ. 4α). Ωστόσο, η έκφραση της μεταλλαγμένης ρ53 R273H σε κύτταρα SKOV3 ανέστειλε ΤΟΡβ-επαγόμενη μετανάστευση, χωρίς μεταβολή μεταξύ 0 και 24 ώρες, ή 24 και 48 ώρες, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 4α). κύτταρα SKOV3 εκφράζουν μεταλλαγμένες ρ53 R273H αποδειχθεί λιγότερο ΤΟΡβ-επαγόμενη μετανάστευση από SKOV3 null κύτταρα (Σχήμα 4β).

Η έκφραση της μεταλλαγμένης ρ53 R273H μεταβάλλει ΤΟΡβ επαγόμενη έκφραση του TMEPAI και DKK1

Για να διαλεύκανση πιθανοί μηχανισμοί με τους οποίους το ρ53 και ΤΟΡβ θα μπορούσαν να ρυθμίζουν τη μετανάστευση, διερευνήθηκαν προ-επεμβατική στόχους που είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται είτε με ρ53 ή TGFβ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Maspin είναι ένας αναστολέας πρωτεάσης σερίνης που αποκλείει τη μετάσταση [20] και είναι γνωστό ότι είναι συν-ρυθμίζονται από ρ53 και Smads σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού [20]. Επιπλέον, η έκφραση maspin φέρεται χάνεται σε καρκίνους των ωοθηκών, και αυτό έχει συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση ποσοστά επιβίωσης και [39]. Maspin ήταν ελάχιστα επάγεται με αγωγή ΤΟΡβ σε OVCA420 και OVCA432 κύτταρα (Εικ. 5α), και δεν προκλήθηκε σε SKOV3. Παραδόξως, maspin δεν έδειξε εξάρτηση από θεραπεία ΤΟΡβ ή έκφραση ρ53 σε κυτταρικές γραμμές ρ53 μεταλλαγμένη SKOV3 R273H (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) σε σύγκριση με γονικά κύτταρα υποδηλώνοντας ότι επιπλέον πορείες τροποποιούν ρ53 και ρύθμιση Smad του maspin σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών OVCA420 ρ53 shRNA ή.

(α) OVCA 420 (άγριου τύπου ρ53), OVCA 432 (ρ53 μετάλλαξης) και SKOV3 (null p53) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ng /mL TGFβ για 24 ώρες και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με Maspin, TMEPAI και DKK1 πρωτογενή αντισώματα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. (Β) κυτταρικές γραμμές OVCA 420 αναλύθηκαν με Western Blot και ανιχνεύτηκαν για προ-μεταστατικό παράγοντες TMEPAI, και DKK1. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. (Γ) κυτταρικές γραμμές SKOV3 αναλύθηκαν με Western Blot και ανιχνεύτηκαν για προ-μεταστατικό παράγοντες TMEPAI και DKK1. SKOV3 p53 WT διαμολύνθηκε παροδικά με 100 ng /mL του p53 πλασμίδιο άγριου τύπου. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης.

Η

TMEPAI είναι ένα ΤΟΡβ-επαγόμενη πρωτεΐνη η οποία είναι γνωστή για τη μετατροπή ΤΟΡβ από ένα ογκοκατασταλτικό σε έναν προαγωγό όγκου στον καρκίνο του μαστού, και σχετίζεται με αυξημένη μετανάστευση σε προστάτη και νεφρικά καρκινώματα [18], [40], [41]. Η υπερέκφραση του TMEPAI έχει συσχετισθεί με πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών [42]. ΤΟΡβ αυξημένη έκφραση TMEPAI σε άγριου τύπου ρ53 OVCA 420 κύτταρα και null SKOV3 κύτταρα (Σχ. 5α). Μεταλλαγμένο p53 R277H OVCA 432 κύτταρα έδειξαν μειωμένο επαγωγή της έκφρασης TMEPAI. ΤΟΡβ-επαγόμενη έκφραση TMEPAI σε OVCA 420 μεταλλαγμένης ρ53 R273H παροδική κύτταρα μειώθηκε σε σύγκριση με τον άγριου-τύπου και null κύτταρα ρ53 (Σχ. 5β). Ομοίως, TMEPAI επαγωγή με ΤΟΡβ σε SKOV3 κύτταρα R273H μεταλλαγμένο ρ53 ήταν μικρότερη από εκείνη του SKOV3 άγριου τύπου και null κύτταρα ρ53 (Εικ. 5c).

Τέλος DKK1, ένας αναστολέας Wnt-σηματοδότηση, επελέγη ως το διαφορικά ρυθμίζεται από άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων ρ53, και είναι επίσης υπερεκφράζεται σε στάδιο μεταστατικούς καρκίνους ωοθηκών αργά [19]. ΤΟΡβ επαγόμενη έκφραση του DKK1 σε SKOV3 κύτταρα null ρ53 (Εικ. 5α). Η αύξηση αυτή δεν παρατηρήθηκε σε άγριου τύπου OVCA 420 ή μεταλλαγμένο p53 R277H OVCA 432 κύτταρα. Σε OVCA 420 κύτταρα, τα συνολικά επίπεδα DKK1 ήταν υψηλότερα στην OVCA 420 p53 shRNA, με μια μικρή επαγωγή κατά την επεξεργασία TGFβ (Εικ. 5β). OVCA 420 μεταλλαγμένη ρ53 R273H είχε το μικρότερο ποσό του DKK1, χωρίς επαγωγή κατά την κατεργασία ΤΟΡβ (Σχ. 5β).