Αφηρημένο

ενεργοποίηση ανθεκτικούς RET είναι ένα συχνό συμβάν στο θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (PTC) και μυελοειδές καρκίνωμα του θυρεοειδούς (MTC). Σε αυτούς τους καρκίνους, RET ενεργοποιεί την ERK /MAPK, τα μονοπάτια PI3K /AKT /mTOR και η JAK /STAT3. Εδώ, δοκιμάσαμε την αποτελεσματικότητα ενός αναστολέα JAK1 /2-, AZD1480, στο

in vitro

και

in vivo

ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου του θυρεοειδούς που εκφράζουν ογκογόνο RET. καρκίνο του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν

RET

/PTC1 (TPC-1),

RET

Μ918Τ (MZ-CRC1) και

RET

C634W (ΤΤ) μεταβολές, καθώς και TPC-1 ξενομοσχεύματα, υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολέα της JAK, AZD1480. Αυτός ο αναστολέας οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης ή /και απόπτωση του κυττάρου καρκίνου του θυρεοειδούς γραμμές

in vitro

, καθώς και για την υποχώρηση του όγκου του TPC-1 ξενομοσχευμάτων, όπου εμποδίζεται αποτελεσματικά η ενεργοποίηση STAT3 σε καρκινικά κύτταρα και στρωματικά. Αυτή η αναστολή συσχετίστηκε με μειωμένο πολλαπλασιασμό, μειωμένη πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων, σε συνδυασμό με αυξημένη νέκρωση. Ωστόσο, AZD1480 καταστέλλεται η ανάπτυξη των κυττάρων με ανεπάρκεια STAT3- TPC-1

in vitro

και

in vivo

, αποδεικνύοντας ότι τα αποτελέσματά της σε αυτή την κυτταρική σειρά ήταν ανεξάρτητες από STAT3 στα κύτταρα του όγκου. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές, η JAK αναστολέα μειωμένα επίπεδα φωσφο-Y1062 RET, και mTOR τελεστή φωσφο-S6, ενώ JAK1 /2 προς τα κάτω ρύθμιση με siRNA δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων ούτε RET και ενεργοποίηση S6. Εν κατακλείδι, AZD1480 μπλοκάρει αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη του όγκου των ενεργοποιημένων κυτταρικών γραμμών καρκίνου αναδρομική έναρξη του θυρεοειδούς, πιθανόν μέσω της άμεσης αναστολής RET σε καρκινικά κύτταρα καθώς και με διαμόρφωση του μικροπεριβάλλοντος (π.χ. μέσω αναστολής JAK /φωσφο-STAT3 σε ενδοθηλιακά κύτταρα). Έτσι, AZD1480 θα πρέπει να θεωρηθεί ως θεραπευτικό μέσο για την αντιμετώπιση των αναδρομική έναρξη ενεργοποιηθεί καρκίνων του θυρεοειδούς

Παράθεση:. Couto JP, Almeida A, Daly L, Sobrinho-Simões Μ, Bromberg JF, Soares P (2012) AZD1480 μπλοκ ανάπτυξης και Ογκογένεση των αναδρομική έναρξη Ενεργός καρκίνο του θυρεοειδούς Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 7 (10): e46869. doi: 10.1371 /journal.pone.0046869

Επιμέλεια: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Ιταλία

Ελήφθη: 18 Ιουν, 2012? Αποδεκτές: 6 Σεπ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 2 Οκτωβρίου, 2012

Copyright: © Couto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την πορτογαλική Ίδρυμα για την Επιστήμη και την Τεχνολογία (FCT). Joana Π Couto υποστηρίζεται από ένα FCT SFRH επιχορήγηση /BD /40260/2007. Ana Almeida υποστηρίζεται από ένα FCT SFRH επιχορήγηση /BD /79135/2011. J. Bromberg υποστηρίζεται από R01-CA87637-06, U54: CA148967, Marjorie και Charles Ίδρυμα Holloway, Lerner Ιδρύματος, Sussman Ταμείο Οικογένεια και Astra Zeneca. IPATIMUP είναι Αναπληρωτής Εργαστήριο του πορτογαλικού υπουργείου Επιστημών, Τεχνολογίας και Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης που υποστηρίζεται μερικώς από το FCT. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή χειρόγραφο προετοιμασία

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Jacqueline Bromberg έχει λάβει χρηματοδότηση της έρευνας από την AstraZeneca. Έχει είχε συμβουλευτικό ρόλο στην AstraZeneca και Mediummune και έλαβε honoria για διαλέξεις. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας ή τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Οι μετατεθεί χρονικά κατά τη διάρκεια της επιμόλυνσης (RET) πρωτο-ογκογονίδιο κωδικοποιεί για ένα από τα πρώτα υποδοχέα κινάσες τυροσίνης (RTKs) που βρέθηκαν να συμμετέχουν στον καρκίνο [1]. RET συνδετήρες ανήκουν στην οικογένεια νευροτροφικός νευρογλοιακά σε κύτταρα (GDNF), και, κατά την εμπλοκή με RET, επάγει αυτοφωσφορυλίωση της ενδοκυτταρικής υπολειμμάτων τυροσίνης, στην οποία δεσμεύουν διάφορες προσαρμογείς [2]. Οι προσαρμογείς αυτοί μεσολαβούν την ενεργοποίηση πολλαπλές οδούς, συμπεριλαμβανομένων της ενεργοποιημένης από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) σηματοδότησης, οι φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) μονοπάτι, το c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) μονοπάτι, το μονοπάτι ρ38, SRC, ERK5, PLC-γ και Signal Transducer και Activator of Transcription (STAT) 3 [3].

το πρώτο ογκογόνο ρόλο της RET περιγράφεται στην πιο κοινή ενδοκρινική καρκίνο, θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (PTC) [4] , ως αποτέλεσμα της γενωμικού αναδιατάξεων που οδηγούν σε συστατική ενεργοποίηση του και σε αυξημένη κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα του [5].

RET

/PTC ανακατατάξεις είναι η δεύτερη πιο κοινή γενετική μεταβολή PTC, που βρέθηκαν στο 30% των περιπτώσεων [6].

RET

σημειακές μεταλλάξεις βρέθηκαν επίσης στο μυελοειδές καρκίνωμα του θυρεοειδούς (MTC) [7], [8], που αντιπροσωπεύουν σχεδόν το σύνολο κληρονομικών υποθέσεων και περίπου το 50% των σποραδικών MTC [9].

Οι ογκογόνοι RET έχει εμπλακεί στη διαμεσολάβηση που σχετίζονται με όγκους φλεγμονή, όπως μεταλλαγμένες μορφές του RET προκάλεσε την έκφραση της IL-8 [10] και άλλων φλεγμονωδών μορίων [11]. Επιπλέον, RET /PTC ρυθμίζεται προς τα πάνω ένα σύνολο φλεγμονοσυσχετιζόμενων σχετικών γονιδίων σε θυρεοκύτταρα [12], [13], πολλές από τις οποίες ανήκουν στην IL-6 /JAK /STAT3 μονοπάτι [14]. IL-6 /σηματοδότηση /STAT3 JAK ενεργοποιείται από IL-6 σύζευξη με τον υποδοχέα-συμπλόκου της, η οποία περιλαμβάνει έναν υποδοχέα για την IL-6 (IL-6R) και το συστατικό μεταγωγής σήματος, gp130 [15]. Μετέπειτα φωσφορυλίωση JAKs υποδοχέα που σχετίζεται με μεσολαβεί φωσφορυλίωση τυροσίνης των STAT, ιδιαίτερα STAT3. Επιπλέον, η IL-6 ενεργοποιεί τις /ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ μονοπάτια /AKT ERK [16]. Η απορρύθμιση JAK /STAT σηματοδότηση (υπερενεργοποίηση) έχει περιγραφεί σε μια ποικιλία ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [17] – [20]. Οι εκλεκτικοί αναστολείς μικρού-μορίου JAK1 /2 που έχουν αναπτυχθεί για τη θεραπεία της JAK- μεταλλαγμένο μυελοπολλαπλασιαστικές διαταραχές [21], [22] είναι σήμερα σε κλινικές δοκιμές για μία ποικιλία καρκίνων. AZD1480 είναι ένας ισχυρός μικρού μορίου /2 αναστολέα JAK1 [23] που βρίσκεται κάτω από κλινικές δοκιμές φάσης Ι για τη θεραπεία των μυελοπολλαπλασιαστικές ασθένειες. Ερευνήσαμε τις επιδράσεις της AZD1480 σε IL-6 /JAK και αναδρομική έναρξη εξαρτώμενη σηματοδότηση (STAT3, ERK /ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ), καθώς και τις βιολογικές δράσεις του σε μοντέλα ανθρώπινο καρκίνο του θυρεοειδούς (κυτταρικές σειρές και ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος). AZD1480 ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη και την ογκογένεση των κυτταρικών σειρών καρκίνου του θυρεοειδούς που φιλοξενούν ογκογόνο

RET

μετατροπές, πιθανόν μέσω της αναστολής της σηματοδότησης ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, υποστηρίζοντας τη χρήση αυτού του αναστολέα για ασθενείς με καρκίνο του θυρεοειδούς, ιδιαίτερα εκείνους με προχωρημένη MTC, για τους οποίους δεν υπάρχουν αποτελεσματικές θεραπευτικές επιλογές.

Αποτελέσματα

μπλοκ AZD1480 η ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου του θυρεοειδούς που φιλοξενούν

RET

ογκογόνο αλλαγές

Σε αυτή τη μελέτη , προσδιορίσαμε την ευαισθησία των κυτταρικών σειρών καρκίνου του θυρεοειδούς που φιλοξενούν ογκογονικές μορφές του

RET

να αναστολέας JAK1 /2, AZD1480. Συγκεκριμένα, αναλύσαμε PTC που προέρχονται TPC-1 (

RET

/PTC1 αναδιάταξη), MTC-προέρχεται MZ-CRC1 (

RET

Μ918Τ μετάλλαξη) και ΤΤ (

RET

C634W μετάλλαξης) κυτταρικές σειρές. Όπως σύγκριση, αντιμετωπίζονται οι ίδιες κυτταρικές σειρές με έναν αναστολέα /2 ΜΕΚ1, AZD6244, η οποία έχει αποδειχθεί ότι έχει μικρή αποτελεσματικότητα σε

RET

-mutated κυττάρων [24], σε αντίθεση με

BRAF

-mutated κύτταρα. Σύμφωνα, χρησιμοποιήσαμε δύο άλλες καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές, K1 (PTC-προέρχεται) και C643 (αναπλαστικό θυρεοειδούς carcinoma- προέρχεται) ότι το λιμάνι

BRAF

V600E και

HRAS

μεταλλάξεις G 13R μεταλλάξεις, αντιστοίχως, ως μάρτυρες της αποτελεσματικότητας AZD6244. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 5 διαδοχικές ημέρες με AZD6244, AZD1480 ή ένα συνδυασμό των δύο φαρμάκων, και η κυτταρική πυκνότητα προσδιορίστηκε.

AZD1480 ανέστειλε την ανάπτυξη όλων

RET

-mutated /αναδιατάσσεται κυτταρικές γραμμές μετά από 1 (MZ-CRC1, TT) και 2 ημέρες (TPC-1) της θεραπείας (p & lt? 0,0001? Εικ. 1Α) και ελάχιστα μείωσε την ανάπτυξη των C643, ενώ έχει καμία επίδραση στην Κ1 (Σχ S1.). Παρατηρήσαμε ότι AZD6244 ελάχιστα μείωσε την ανάπτυξη των C643 και ΜΖ-CRC1 μετά 4/5 ημέρες θεραπείας (ρ & lt? 0,001? Σχ. 1Α και S1), δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη του ΤΤ (Σχ. 1Α) και μειωμένη TPC- 1 αύξηση κατά 50% μετά από 5 ημέρες θεραπείας. Σε αντίθεση, AZD6244 ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των

BRAF

– μεταλλαγμένη K1 κυτταρική γραμμή (Εικ. S1). Δεν παρατηρήθηκε προσθετική ή συνεργιστική επίδραση της συνδυασμένης αναστολής της ΜΕΚ και JAKs. AZD1480 δεν ανέστειλε την ανάπτυξη ενός μη-κακοήθη θυρεοειδούς αρουραίου κυτταρική γραμμή, PCCl3 (Εικ. 1Α). Οι IC50 για AZD1480 προσδιορίστηκαν να είναι στην περιοχή υψηλής ηΜ (~200-450 ηΜ) για αυτές τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 1 Β και S2), και μειώνεται ως συνάρτηση του χρόνου (48 και 72 ώρες), γεγονός που υποδηλώνει μια κυτταροστατική επίδραση (Εικ. 1Β).

(Α) TPC-1, κυτταρικές σειρές ΜΖ-CRC1 και ΤΤ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AZD6244 (1 μΜ), AZD1480 (1 μΜ), και ένα συνδυασμό και των δύο φαρμάκων (1 μΜ το καθένα) για την υποδεικνυόμενη φορά. Ένα από αρουραίο προερχόμενα μη κακοήθων κυττάρων θυρεοειδούς γραμμή, PCCl3, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με AZD1480 (1 μΜ) ή DMSO ελέγχου. Η ανάπτυξη προσδιορίστηκε με την δοκιμασία σουλφοροδαμίνης Β. (Β) Οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ή 72 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις του AZD1480 (0.1, 0.5 και 1 μΜ) και η κυτταρική πυκνότητα προσδιορίστηκε. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *** P & lt?. 0.0001

Η

Λόγω της ευαισθησίας των

RET

-mutated /αναδιατάσσεται κυτταρικές σειρές σε AZD1480, θα αναλύεται το προφίλ του κυτταρικού κύκλου του TPC-1, Mz- CRC1 και ΤΤ αγωγή για 72 ώρες με AZD1480 (Εικ. 2Α). Ο αναστολέας JAK οδήγησε σε σύλληψη G1 σε TPC-1 (94% σε σύγκριση με 79% στην ομάδα ελέγχου, ρ = 0,01). Στις τρεις κυτταρικές γραμμές, το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S μειώθηκε μετά από αγωγή AZD1480 (TPC-1: 2% έναντι 8% στην ομάδα ελέγχου, ρ = 0,01? MZ-CRC1: 4% έναντι 11%, p = 0.004? ΤΤ: 6% έναντι 11%, ρ = 0,09). Ομοίως, η αναλογία των κυττάρων στην G2 /M μειώθηκε επίσης σε TPC-1 κύτταρα κατεργασμένα με τον αναστολέα JAK (1% έναντι 13% στην ομάδα ελέγχου, ρ = 0,01). Σε ΜΖ-CRC1 και ΤΤ, μια σημαντική αύξηση του πληθυσμού subG1 (ενδεικτική του κυτταρικού θανάτου με απόπτωση) ανιχνεύθηκε (18% έναντι 2%, σε DMSO-αγωγή, ρ = 0,04 και 11% έναντι 0.6%, ρ & lt? 0,0001 , αντίστοιχα) μετά από 72 ώρες αγωγής AZD1480. Για να επιβεβαιωθεί η επίδραση του AZD1480 σε απόπτωση, οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με AZD1480 για 48 ώρες και χρωματίστηκαν με αντιδραστήριο TUNEL, αποκαλύπτοντας μια αύξηση του αριθμού των αποπτωτικών MZ-CRC1 (p = 0.02) και ΤΤ (ρ = 0.1) κυττάρων σε σύγκριση να DMSO-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, AZD1480 δεν προκάλεσε καμία απόπτωση σε TPC-1 (Σχ. 2Β). Παράλληλα, παρατηρήσαμε αυξημένα επίπεδα του αναστολέα κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη, ρ27, και μειωμένα επίπεδα κυκλίνης D1 και του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη, BCL-2, σε AZD1480- κατεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2C).

(Α) TPC-1, ΜΖ-CRC1 και ΤΤ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AZD1480 (1 μΜ? +) για 72 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση προφίλ κύκλου με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (μέσος όρος ± SE). (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AZD1480 (1 μΜ) για 48 ώρες και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο προσδιορίστηκε με TUNEL. (Γ) AZD1480 επάγει ρ27 προς τα πάνω ρύθμιση και η κυκλίνη D1 και BCL-2 προς τα κάτω ρύθμιση σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του θυρεοειδούς. TPC-1, κυτταρικές σειρές ΜΖ-CRC1 και ΤΤ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AZD1480 (1 μΜ) για 24 ώρες. Τα κυτταρολύματα ανιχνεύθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα, με κηλίδωση Western. * P & lt? 0,05? *** P & lt?. 0.0001

Η

AZD1480 προκαλεί παλινδρόμηση του TPC-1 ξενομοσχευμάτων

Τα αποτελέσματα του αναστολέα JAK για το

in vivo

ανάπτυξη της TPC- 1 κύτταρα αξιολογήθηκαν με υποδόρια ένεση στα πλευρά γυμνών ποντικών. Όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 0.5 cm

3, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, AZD1480 ή AZD6244 για 16 διαδοχικές ημέρες (Σχ. 3Α). Οι όγκοι από ποντικούς ελέγχου και AZD6244- ποντίκια με αγωγή συνέχισαν να αυξάνονται μέχρι την ημέρα 9 και λόγω του μεγάλου μεγέθους τους, τα ποντίκια θυσιάστηκαν. Σε αντίθεση, AZD1480- αγωγή ποντικοί έδειξαν μαρτυρία ύφεσης νεοπλάσματος μετά από 4 ημέρες και μετά από 16 ημέρες, μέτρησαν ~ 23% του αρχικού τους μεγέθους (Σχ. 3Α). Η ανοσοϊστοχημική χρώση του αντιπροσωπευτικές τομές όγκων έδειξαν σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση φωσφο-STAT3 με AZD1480 σε καρκινικά κύτταρα και στρωματικά κύτταρα (ενδοθηλιακά κύτταρα). Ο αναστολέας ΜΕΚ, AZD6244 μειωμένη φωσφο-ERK1 /2 επίπεδα σε όγκους (Σχ. 3Β). Ιστολογικά, το μεγαλύτερο μέρος της μάζας του όγκου (90%) από AZD1480- αγωγή όγκων που αποτελείται από νεκρωτικό ιστό, ενώ η πλειονότητα των όγκων κυττάρων των ομάδων ελέγχου και AZD6244 ήταν βιώσιμα και ενεργά πολλαπλασιαζόμενα, όπως φαίνεται με χρώση Κί67 (Εικ. 3C) . Περαιτέρω χαρακτηρισμός αυτών των όγκων απεκάλυψε μία μείωση σε ενδοθηλιακά κύτταρα (Meca-32) μετά από θεραπεία AZD1480, σε σύγκριση με τον έλεγχο και τις ομάδες AZD6244 (ρ = 0,06 και ρ & lt? 0,0001, αντίστοιχα? Εικ. 3C). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές ανιχνεύθηκαν στον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων (TUNEL), των οποίων το ποσοστό ήταν χαμηλή σε όλα τα καρκινώματα.

(Α) TPC-1 κύτταρα (10

6) ενέθηκαν υποδορίως στα πλευρά του γυμνούς ποντικούς. Μετά την εμφύτευση του όγκου (~ 0,5 cm

3), οι ποντικοί κατανεμήθηκαν σε τέσσερις ομάδες (η = 5 /ομάδα) με παρόμοια μέση τιμή όγκων του όγκου. Ομάδες υπέστησαν αγωγή με φορέα φαρμάκου (χωρίς θεραπεία), AZD6244, στα 25 mg /Kg, μία φορά την ημέρα, ή AZD1480, στα 30 mg /Kg, bi-καθημερινά. Οι όγκοι των όγκων προσδιορίστηκαν δύο φορές την εβδομάδα (μέση τιμή ± SE). (Β) AZD1480- και AZD6244- αντιμετωπίζονται TPC-1 τομές όγκων ανοσοχρωματίστηκαν για φωσφο-STAT3 και έκφραση φωσφο-ERK1 /2, αντίστοιχα. Τα στρωματικά κύτταρα φωσφο-STAT3 θετικά περιγράφονται με μια διακεκομμένη γραμμή (μεγέθυνση: 400x). (C) JAK αναστολέα μειώνει τον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση του TPC-1 ξενομοσχευμάτων. Η &? Ε χρώση του TPC-1 όγκων σε αγωγή με φορέα φαρμάκου (έλεγχος), AZD6244 ή AZD1480. Αντιπροσωπευτικές τομές όγκου χρωματίστηκαν για πολλαπλασιασμό (Ki67), την αγγειογένεση (Meca-32) και την απόπτωση (TUNEL) δείκτες. Αρχική μεγέθυνση: 200x. Ποσοτικός προσδιορισμός γραφικής παράστασης. ** P & lt? 0.001? *** P & lt?. 0.0001

Η

AZD1480- μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης είναι ανεξάρτητη από STAT3

JAKs είναι οι κύριοι μεσολαβητές της IL-6 /gp130 /σηματοδότηση STAT3 και, σε αρκετές καρκίνο μοντέλα, τα αντι-ογκογόνο επιδράσεις αναστολείς της JAK »διαμεσολαβείται από STAT3. Προκειμένου να καθοριστεί αν STAT3 ήταν απαραίτητη για JAK αναστολέα μεσολάβηση διακοπή αύξησης, έχουμε σταθερά μειωμένη STAT3 σε κύτταρα TPC-1 χρησιμοποιώντας ένα σύντομο φουρκέτας, όπως προσδιορίζεται με στύπωμα Western και ανοσοϊστοχημεία (Εικ. 4Α, C2). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AZD1480 για τέσσερις συνεχόμενες ημέρες και

in vitro

κυτταρική ανάπτυξη παρακολουθήθηκε, αποκαλύπτοντας σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων shSTAT3 TPC-1 (ρ & lt? 0,0001? Εικ. 4Β).

In vivo

ανάπτυξη εκτιμήθηκε με έγχυση των κυττάρων shSTAT3 υποδορίως και, φτάνοντας -0,5 cm

3, τα ποντίκια που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με όχημα ή AZD1480, για 21 ημέρες. Η ομάδα ελέγχου θυσιάστηκε μετά από 8 ημέρες, λόγω του μεγάλου μεγέθους των όγκων. επεξεργασία AZD1480 που προκαλείται από παλινδρόμηση (καρκινικός όγκος ήταν -24% του αρχικού μεγέθους της? p & lt? 0,0001) των όγκων TPC-1 shSTAT3 (Σχήμα 4C1.). Φωσφο-STAT3 επιβεβαιώθηκε να μειωθεί σε καρκινικά κύτταρα των ποντικών που έλαβαν με φορέα, αλλά όχι σε στρωματικά κύτταρα, ενώ από όγκο και stromal- φωσφο-STAT3 ήταν σημαντικά μειωμένες σε AZD1480- ποντίκια (Σχ. 4C2) αντιμετωπίζεται.

(Α) STAT3 ήταν νοκ ντάουν στον TPC-1 κύτταρα από μια σύντομη φουρκέτα. Φωσφο-STAT3 και STAT3 αρνητική ρύθμιση επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western. (Β) TPC-1 κύτταρα shSTAT3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή AZD1480 (1 μΜ) και η αναστολή της ανάπτυξης προσδιορίστηκε με δοκιμασία SRB. Τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SE από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (C) κύτταρα TPC-1 shSTAT3 ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές των γυμνών ποντικών. Όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 0.5 cm

3, τα ποντίκια κατανεμήθηκαν εξίσου σε δύο ομάδες: η μία ήταν η ομάδα ελέγχου (όχημα) και το άλλο υποβλήθηκε σε επεξεργασία με AZD1480 στα 30 mg /Kg, bi-καθημερινά. (C1) Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SE. (C2) Αντιπροσωπευτική Η &? Ε και φωσφο-STAT3 ανοσοχρώση όγκων τμήματα από μη επεξεργασμένα (όχημα) ή AZD1480- κατεργασία TPC-1 όγκων shSTAT3. Τα βέλη δείχνουν φωσφο-STAT3- θετικά στρωματικά κύτταρα ποντικού. Μεγέθυνση: 200x. *** P & lt?. 0.0001

Η

AZD1480 αναστέλλει RET Y1062 φωσφορυλίωση και κατάντη PI3K /AKT /mTOR σηματοδότησης

Ογκογόνες RET μονοπάτια τελεστές περιλαμβάνουν ERK /MEK, PI3K /AKT και STAT3 [ ,,,0],3]. Λαμβάνοντας υπόψη τις σημαντικές δράσεις καταστολής της ανάπτυξης του αναστολέα JAK για το ογκογόνο

RET

– μεταμορφωθεί TPC-1 ξενομόσχευμα ανεξάρτητα από STAT3, υποθέσαμε ότι AZD1480 μπορεί να έχει άμεση επίδραση στην RET μεσολάβηση σηματοδότησης. Εμείς αγωγή TPC-1, ΜΖ-CRC1, ΤΤ (Σχ. 5Α), καθώς και ένα μοντέλο του επαγώγιμη έκφραση RET /PTC3 σε PCCL3 (Εικ. 5Β), με AZD1480 ή /και AZD6244, για 24 ώρες. Τα επίπεδα έκφρασης και φωσφορυλίωσης του RET, καθώς και από τους κύριους δράστες της JAK /STAT3, ΕΚΚ /ΜΑΡΚ και μονοπατιού PI3K /AKT, δηλαδή φωσφο-STAT3 Tyr705, φωσφο-ERK1 /2 Thr202 /Tyr204 και φωσφο-ΑΚΤ Ser473 /φωσφο -S6 Ser235 /236, αντίστοιχα, εξετάστηκαν με ανάλυση δυτικής κηλίδας. AZD1480 και AZD6244 μείωσε αποτελεσματικά τα επίπεδα των κατάντη τους στόχους φωσφο-STAT3 και φωσφο-ERK1 /2, αντίστοιχα, σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 5Α, Β). MZ-CRC1 δεν εκφράζουν φωσφο-ERK1 /2 στα βασικά επίπεδα (εικ. 5Α). Επιπλέον, AZD1480 μείωσε τα επίπεδα της φωσφο-ERK1 /2 σε PCCl3-RET /PTC3 και ΤΤ, καθώς και της φωσφο-ΑΚΤ, φωσφο-S6 και φωσφο-RET σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 5Α, Β). Αντίθετα, η θεραπεία AZD6244 αυξημένη φωσφο-STAT3 σε κύτταρα TPC-1, αυξήθηκε φωσφο-ΑΚΤ και φωσφο-S6 σε κύτταρα ΜΖ-CRC1 και αυξημένη φωσφο-RET σε PCCl3-RET /PTC3 κύτταρα (Σχ. 5Α, Β). Δεν υπάρχουν στοιχεία που να αποδεικνύουν την ημερομηνία μια λειτουργική σχέση μεταξύ RET και JAKs. Για να προσδιορίσετε αν η μειωμένη φωσφο-RET οφειλόταν σε off-στόχο επιπτώσεις της AZD1480, εμείς knockdown έκφραση JAK1 /2 στο TPC-1, MZ-CRC1 και τα κύτταρα ΤΤ από σύντομης παρεμβολής (SI) RNA. Στις 48 ώρες, τα επίπεδα JAK1, JAK2 και φωσφο-STAT3 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε όλες τις κυτταρικές σειρές, χωρίς επιδράσεις στο φωσφο-RET, φωσφο-ERK1 /2 και φωσφο-S6 (Σχ. 6Α). Σε αντίθεση με AZD1480, JAK1 /2 knockdown δεν μείωσε τον πολλαπλασιασμό οποιασδήποτε από τις κυτταρικές γραμμές, όπως φαίνεται από BrdU ενσωμάτωση (Εικ. 6Β). Πραγματοποιήσαμε μία in vitro δοκιμασία κινάσης και επαλήθευσε ότι AZD1480 απευθείας ανέστειλε δραστικότητα κινάσης RET:. 40% αναστολή στα 0,001 μΜ, 90% αναστολή σε 0,1 μΜ και 99% σε 1 μΜ (Εικ. S3)

(Α ) TPC-1, ΜΖ-CRC1, ΤΤ και ένα (Β) PCCl3-RET /PTC3 δοξυκυκλίνη επαγόμενο κυτταρική σειρά έλαβαν θεραπεία για 24 ώρες με AZD1480 (1 μΜ), AZD6244 (1 μΜ), ή ένας συνδυασμός και των δύο φαρμάκων. Συνολικά εκχυλίσματα κυτταρικής πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με αντισώματα για τις υποδεικνυόμενες τελεστές της JAK /STAT3, ERK /ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ μονοπατιών σηματοδότησης, καθώς και για φωσφο-RET Y1062. Στο κατώτερο πάνελ του TPC-1, το DMSO (D) λωρίδα είναι μη συνεχόμενες στην AZD6444 (6.244) λωρίδα, στην ίδια πηκτή. (C) TPC-1 αντιπροσωπευτικές τομές ξενομοσχευμάτων »ανιχνεύθηκαν για την ενεργοποίηση STAT3 (φωσφο-STAT3), ΕΚΚ /ΜΑΡΚ (φωσφο-ERK1 /2) και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ (φωσφο-S6) μονοπατιών σηματοδότησης. Ποσοτικός προσδιορισμός γραφικής παράστασης (μέση τιμή ± SE). * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.001

Η

(Α) Η έκφραση της JAK1 ή /και JAK2 ήταν μειωτικά από siRNA στο TPC-1, κυτταρικές σειρές ΤΤ MZ-CRC1 και. Τα επίπεδα των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών και κατάσταση φωσφορυλίωσης τους προσδιορίστηκαν μετά από 48 ώρες, με ανάλυση δυτικής κηλίδας. πολλαπλασιασμό (Β) των κυττάρων μετρήθηκε με ενσωμάτωση BrdU, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με ένα συνδυασμό των siRNAs που στοχεύουν τόσο JAK1 και JAK2. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέση ± SE από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0.05

Η

Εξετάσαμε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της STAT3, ERK και S6 στο TPC-1 ξενομοσχευμάτων αγωγή με όχημα, AZD1480 και AZD6244. Παρομοίως με ό, τι παρατηρήθηκε στις άλλες κυτταρικές γραμμές RET ενεργοποιούμενη TPC-1 και

in vitro

, αναστολέα JAK οδήγησε σε σημαντική μείωση του φωσφο-S6 και τα επίπεδα φωσφο-STAT3 (ρ & lt? 0.001) στον όγκο, ενώ δεν μείωση παρατηρήθηκε στις όχημα ή AZD6244- αγωγή όγκων (Σχ. 5C). επίπεδα φωσφο-ΕΚΚ ήταν αμετάβλητη μεταξύ του ελέγχου και των ομάδων AZD1480 και ήταν σημαντικά μειωμένη (p = 0,01) στην ομάδα θεραπείας AZD6244- (Εικ. 5C).

Συζήτηση

RET

γονίδιο αλλοιώσεις είναι ογκογόνο «οδηγούς» στην παθογένεση του καρκίνου του θυρεοειδούς, ιδιαίτερα σε MTC και PTC. Οι ογκογόνοι RET είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής της ERK /ΜΑΡΚ και μονοπάτια ΡΙ3Κ και μπορεί να επάγει την έκφραση φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως CCL2, CXCL-1, GM-CSF, IL-1β και IL-6 [5], [25] – [ ,,,0],27]. Επιπλέον, RET /PTC και μεταλλαγμένων RET μπορεί να επάγει φωσφορυλίωση του STAT3 είτε άμεσα [14], [28] ή σε ένα JAK-εξαρτώμενο τρόπο [29]. JAKs είναι κινάσες τυροσίνης που διαμεσολαβούν IL-6- ενεργοποίηση εξαρτώμενη STAT3, η οποία έχει δειχθεί ότι προάγει την εξέλιξη του καρκίνου σε πολυάριθμα παραδείγματα των συμπαγών όγκων. Σημαντικά, JAK2 ενεργοποίηση μεταλλάξεων είναι κρίσιμα στην παθογένεση μυελοπολλαπλασιαστικές διαταραχές και ότι έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη των μικρών μορίων αναστολέων JAKs [22], [23]. Εδώ, ερευνήσαμε τις βιολογικές επιδράσεις ενός αναστολέα της JAK1 /2, AZD1480, σχετικά με την ανάπτυξη των PTC- και MTC- προέρχονται κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς που φιλοξενούν την ενεργοποίηση

RET

/αναδιατάξεις PTC και

RET

μεταλλάξεις, αντιστοίχως. Παρατηρήσαμε ότι AZD1480 ανέστειλε την ανάπτυξη του TPC-1, ΜΖ-CRC1 και ΤΤ με IC

50s & lt? 500 nm, η οποία είναι 2 έως 10 φορές μικρότερη από εκείνη που αναφέρθηκε για άλλες καρκινικές κυτταρικές γραμμές [23], [30]. Το μπλοκ της αύξησης οφειλόταν σε διακοπή κύκλου G1 κυττάρων σε κύτταρα TPC-1, ενώ στην ΜΖ-CRC1 και ΤΤ, η αναστολή JAK αυξήθηκε σημαντικά απόπτωση. Από την άλλη πλευρά, ένας αναστολέας ΜΕΚ1 /2, AZD6244, απέτυχε να μεταβάλλει

in vitro

ανάπτυξη του ΜΖ-CRC1 και ΤΤ. Δεν προσθετική ή συνεργιστική επίδραση της

in vitro

ανάπτυξης παρατηρήθηκαν με το συνδυασμό των δύο αναστολείς. Αντιθέτως, AZD6244 (αλλά όχι AZD1480) ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη ενός

BRAF

V600E- μεταλλαγμένη κυτταρική γραμμή, Κ1. Τόσο AZD1480 και AZD6244 είχε ελάχιστη επίδραση στην ανάπτυξη ενός

RAS

– μεταλλαγμένη κυτταρική γραμμή, C643. Η αναισθησία του RET-ενεργοποιημένων κυττάρων καρκίνου του θυρεοειδούς στην αναστολή ΜΕΚ έχει προηγουμένως αποδειχθεί, σε αντίθεση με την υψηλή ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς που εκφράζουν

BRAFV600E

[31]. Αυτή η αντίσταση μπορεί να αντανακλά την ικανότητα των ογκογόνων RET για την ενεργοποίηση εναλλακτικών οδών σηματοδότησης, ιδιαίτερα το μονοπάτι PI3K /AKT /mTOR [32]. Επιπλέον, AZD6244 προκάλεσε αυξητική ρύθμιση του φωσφο-RET Y1062 στο μοντέλο PCCl3-RET /PTC3 καθώς και τελεστές mTOR, φωσφο-S6 και φωσφο-ΑΚΤ, σε ΜΖ-CRC1. Η υπερενεργοποίηση του μονοπατιού mTOR σε απόκριση προς την αναστολή της ΜΕΚ μπορεί ενδεχομένως να εξηγηθεί από ανακούφιση των feed-back αναστολή και έχει προηγουμένως αναφερθεί σε άλλα μοντέλα [33], όπου μεσολαβεί κύτταρο ανθεκτικότητα σε AZD6244 [34], [35].

Επιπλέον, AZD1480 ανέστειλε ισχυρά την

in vivo

ανάπτυξη του TPC-1 ξενομοσχευμάτων, με αποτέλεσμα την υποχώρηση του όγκου, ενώ οι όγκοι από AZD6244- ποντίκια με αγωγή αυξήθηκε ελαφρώς περισσότερο από τους όγκους ελέγχου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπεία

RET

-mutated καρκίνων του θυρεοειδούς με αυτού του αναστολέα μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου. Στο TPC-1 όγκων, και παρόμοια με τα αποτελέσματα

in vitro

, AZD1480 μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό ενώ δεν επηρεάζουν σημαντικά την απόπτωση. Ωστόσο,

in vivo

, παρατηρήσαμε σημαντική υποχώρηση του όγκου, με όγκους που παρουσιάζουν εκτεταμένες περιοχές νεκρωτικό ιστό και μια σημαντική μείωση του αριθμού των αιμοφόρων αγγείων. Το τελευταίο θα μπορούσε να προκαλέσει μια πτώση στις θρεπτικών συστατικών και του οξυγόνου εφοδιασμού των όγκων, πιθανόν εξηγώντας την εντονότερη νέκρωση και, κατά συνέπεια, μείωση του όγκου. Τέτοια αποτελέσματα επί της ανάπτυξης του όγκου έχουν τεκμηριωθεί προηγουμένως σε άλλα μοντέλα καρκίνου (πνεύμονα, του μαστού, του προστάτη, του εγκεφάλου) [23], [36], [37]. Σε αυτά τα μοντέλα, η αναστολή JAK ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματική στην φωσφο-STAT3-θετικούς όγκους /κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, AZD1480 έχει επίσης δειχθεί να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυτταρικών γραμμών ανεξάρτητα από την ενεργοποίηση STAT3, ιδιαίτερα σε υψηλότερες δόσεις [23], πιθανώς λόγω εκτός στόχου επιδράσεις του φαρμάκου. Σε μια πρόσφατη έκθεση, AZD1480 μπλοκάρει τόσο JAK /STAT3 και FGFR3 σηματοδότησης στα κύτταρα του μυελώματος [30]. Για να ελέγξετε αν τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του AZD1480 εξαρτώνται από STAT3 στα μοντέλα μας, νοκ-κάτω STAT3 στα κύτταρα TPC-1. ανεπάρκεια STAT3 σε αυτά τα κύτταρα δεν επηρέασε την ευαισθησία τους στην αναστολή JAK, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, AZD1480 ήταν παρόμοια αποτελεσματικό στην παρεμπόδιση της ανάπτυξης των STAT3- ανεπάρκεια TPC-1 ξενομοσχευμάτων, η οποία εμφανίζεται εκτεταμένη νέκρωση, παρόμοια με AZD1480 επεξεργασμένο γονική όγκους TPC-1. Επιπλέον, έχουμε νοκ-κάτω JAK1 και JAK2 έκφραση σε TT-κυτταρικές γραμμές TPC-1, ΜΖ-CRC1 και με siRNA, η οποία δεν είχε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό τους. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι AZD1480 αναστέλλει την ανάπτυξη του RET-ενεργοποιημένων καρκίνο του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές

in vitro

και

in vivo

, ανεξάρτητα από JAK /STAT3 σηματοδότηση σε καρκινικά κύτταρα.

επιδιώξαμε να εντοπίσει τους μηχανισμούς που εξηγούν τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του AZD1480

in vitro

και

in vivo

. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές, AZD1480 μειωμένη αποτελεσματικά επίπεδα φωσφο-STAT3, συμπεριλαμβανομένης της C634W μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά TT, αν και αυτό ογκογόνο μορφή RET περιγράφηκε ως ενεργοποίηση STAT3 ανεξάρτητα από JAKs, μέσω δύο θέσεις σύνδεσης επί RET (Tyr752 και Tyr928) [28] . Προτείνουμε ότι τα αποτελέσματά μας διαφέρουν λόγω της χρήσης ενός διαφορετικού αναστολέα της JAK, με διαφορετικές ικανότητες, από αυτό που χρησιμοποιείται από Schuringa

et

al

.

Μέχρι στιγμής, δεν υπάρχει δεδομένα έχουν καταδείξει ένα ρόλο για JAKs στην ενεργοποίηση RET (Y1062 φωσφορυλίωση), ούτε για την ενεργοποίηση των κατάντη ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ της. Διαπιστώσαμε ότι AZD1480 μπλοκάρει φωσφορυλίωση RET Y1062 στο TPC-1, MZ-CRC1, ΤΤ, καθώς και σε μια υπό όρους μοντέλο του

RET /PTC3

έκφρασης. Επιπλέον, αν και AZD1480 δεν αναστέλλει την οδό ERK /ΜΑΡΚ στις περισσότερες κυτταρικές σειρές μας, μπλοκάρει την ενεργοποίηση του τελεστών ΡΙ3Κ ΑΚΤ και S6. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν στην AZD1480- αγωγή TPC-1 ξενομοσχευμάτων, όπου δεν ανιχνεύθηκαν διαφορές στα επίπεδα ERK /ΜΑΡΚ, και φωσφο-S6 ήταν σημαντικά ρυθμίζεται προς τα κάτω. Έχουμε δείξει ότι αυτά τα αποτελέσματα ήταν ανεξάρτητα της JAKs, όπως φωσφο-RET, φωσφο-ΕΚΚ και τα επίπεδα φωσφο-S6 δεν άλλαξε κατά την JAK1 /2 νοκ ντάουν με siRNA. Έχουμε αποδείξει ότι AZD1480 αναστέλλει άμεσα τη δράση της κινάσης της ανασυνδυασμένης RET με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, το οποίο πιθανόν υπογραμμίζει τις ανασταλτικές και μεταλλαγμένων-RET ειδικές επιδράσεις του AZD1480 για την ανάπτυξη και την επιβίωση του καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων. Πράγματι,

in vitro δοκιμασίες κινάσης

από μια προηγούμενη έκθεση έχουν αποδείξει ότι μπορούν να αναστείλουν AZD1480 -50% και 90% της δραστηριότητας RET σε 0.1 και 1 μΜ συγκεντρώσεις, αντίστοιχα [23].

Συμπερασματικά, δείξαμε ότι ο αναστολέας JAK1 /2, AZD1480, μπορεί να εμποδίσει την ανάπτυξη και να επάγει τον κυτταρικό θάνατο των κυτταρικών σειρών καρκίνου του θυρεοειδούς που φιλοξενούν διακριτές μορφές ογκογόνων

RET in vitro

και

in vivo

. Σε αυτά τα κύτταρα, AZD1480 πιθανόν αναστέλλει RET άμεσα, οδηγώντας στην επακόλουθη αποκλεισμό του ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /μονοπάτι mTOR, η οποία φαίνεται να είναι η προτιμησιακή ογκογόνο κινητήρια δύναμη κύτταρα RET-ενεργοποιηθεί. Αν και αυτά τα αποτελέσματα ήταν ανεξάρτητα της STAT3 στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα, AZD1480 ανέστειλε αποτελεσματικά φωσφο-STAT3 στο στρώμα, ιδιαίτερα σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Στην πραγματικότητα, οι αναστολείς JAK γνωστών ρυθμιστών του μικροπεριβάλλοντος μέσω της αναστολής της αγγειογένεσης και της κινητοποίησης μυελοειδούς κυττάρου με τρόπο που εξαρτάται από STAT3- [36], [38]. Δεδομένης της σημαντικής μείωσης της αγγείωσης του AZD1480- αγωγή όγκων και επακόλουθη νέκρωση όγκου, προτείνουμε ότι φωσφο-STAT3 αναστολή στο μικροπεριβάλλον (ενδοθηλιακά κύτταρα) συνεργάζεται με αναστολή RET σε καρκινικά κύτταρα για να προκαλέσει υποχώρηση του όγκου. Επιπλέον, δεν μπορούμε να απορρίψει ότι και άλλες κινάσες τυροσίνης RET-ανεξάρτητο (όπως FLT1, FGFR [23]) μπορεί να επηρεαστεί από AZD1480, συμβάλλοντας στην αύξηση σύλληψη αναδρομική έναρξη ενεργοποιημένων κυττάρων και όγκων.

Είναι σημαντικό ότι, ΜΖ -CRC1, η οποία φιλοξενεί το RET M918

μετάλλαξη που σχετίζεται με το σύνδρομο Men2B, ήταν ιδιαίτερα ευαίσθητα στις ανασταλτικές επιδράσεις στην ανάπτυξη του AZD1480. Οι ασθενείς που διαγιγνώσκονται με Men2B αναπτυχθεί ταχέως εξελισσόμενη, πολυεστιακή MTC με μεταστάσεις στους λεμφαδένες, συνήθως απαιτεί ολική θυρεοειδεκτομή πριν 1 έτους [39]. Η μεγαλύτερη ευαισθησία του MZ-CRC1 να AZD1480 σε σύγκριση με το ΤΤ (που φιλοξενεί το λιγότερο επιθετική μετάλλαξη C634W), μπορεί να εξηγηθεί από τις διαφορετικές ικανότητες των MEN2A- και MEN2B- RET μεταλλάξεις για να ενεργοποιήσετε κατάντη οδούς, δηλαδή το μονοπάτι PI3K /AKT [40]. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν τη χρήση του AZD1480 για την αντιμετώπιση επιθετικών μορφών καρκίνου του θυρεοειδούς, ιδιαίτερα MEN2B- MTC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλες οι διαδικασίες των ζώων έρευνα συμπεριλήφθηκαν στο πρωτόκολλο (αριθμός 0011091) που εγκρίθηκε από την επιτροπή MSKCC Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IUAC), μετά την Welfare Act πειραματόζωα, τον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου και τις κατευθυντήριες γραμμές και πολιτικές για το πείραμα τρωκτικών.

καλλιέργειας κυττάρων και τα ναρκωτικά

TPC-1, K1, C643 (που παρέχονται από τον καθηγητή Marc Mareel, Βέλγιο) και ΤΤ (αγοράστηκε από την American Type Culture Collection – ATCC) [29], [ ,,,0],41] κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI, 10% FBS, 1% Penstrep. PCCl3-RET /PTC3 παρεσχέθη από τον Dr James Fagin και καλλιεργήθηκε όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [13]. MZ-CRC1 (που παρέχεται από τον Dr Robert Hofstra, Κάτω Χώρες) [29] και 293Τ (ATCC) διατηρήθηκαν σε DMEM, 10% FBS, 1% Penstrep. Όλα τα αντιδραστήρια κυτταρικής καλλιέργειας ήταν από την GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, USA. AZD1480 [23] και AZD6244 [24] ήταν δώρα από τον Dennis Huszar και ο Michael Zinda (AstraZeneca, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο).

λεντοϊών μολύνσεις και τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών

Η STAT3 shRNA λεντοϊού κατασκεύασμα περιγράφηκε προηγουμένως [42]. Τα ιικά σωματίδια που φέρουν τα κατασκευάσματα δημιουργήθηκαν σε 293Τ κύτταρα. Τα ιικά σωματίδια στο υπερκείμενο κατακρημνίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα καταβύθισης ιό πολυαιθυλενογλυκόλης (Σύστημα Biosciences LLC, Mountain View, CA, USA). Λεντοϊών κατασκευάσματα περιλαμβάνεται ένας κωδικοποιεί κασέτα μεταγραφής ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη [42], που επέτρεψε την επιλογή των κυττάρων με τη διαλογή.

ολόκληρου πρωτεΐνη κυτταρικά εκχυλίσματα και κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν σε δοκιμασία ραδιο-ανοσοκατακρημνίσεως ρυθμιστικό, συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA). Οι πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μία τροποποιημένη δοκιμασία Bradford (Biorad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), επιλύονται με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε Hybond ECL μεμβράνες (GE Healthcare, Little Chalfont, Αγγλία). Τα πρωτογενή αντισώματα για φωσφο-STAT3 (Tyr705), STAT3, φωσφο-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ERK1 /2, φωσφο-ΑΚΤ (Ser473), ΑΚΤ, φωσφο-S6 (Ser235 /236), και S6 ήταν από Cell Signaling Technologies, Inc, Danvers, ΜΑ, USA. Η κυκλίνη D1 αντίσωμα ήταν από NeoMarkers, Fremont, CA, USA. αντίσωμα ακτίνης, φωσφο-RET (Y1062), συνολικής RET (C-19) και p27 ήταν από την Santa Cruz της BT, Santa Cruz, USA, BCL-2 αντισώματος ήταν από ϋΑΚΟ, Glostrup, Δανία, και α-τουμπουλίνης ήταν από Sigma Aldrich , St. Louis, ΜΟ, USA. Υπεροξειδάση συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα ήταν από την Santa Cruz της BT.