Αφηρημένο

Ιστορικό

στέρησης ανδρογόνων θεραπεία (ADT) είναι η θεραπεία πρώτης γραμμής σε μεταστατικό καρκίνο του προστάτη (PCA). Ωστόσο, η παρατεταμένη έκφραση και λειτουργία του ανδρογόνου (AR) γονίδιο του υποδοχέα συμβάλλουν στην εξέλιξη ανθεκτικών ευνουχισμού καρκίνων του προστάτη (CRPC). Επιπλέον, οι όγκοι μπορεί να προσαρμόσει την PI3K /AKT οδό επιβίωσης για να ξεφύγουν από ADT. Co-στόχευση AR και ΡΙ3Κ σηματοδότησης /ΑΚΤ έχει προταθεί ότι είναι μια πιο αποτελεσματική θεραπευτική μέσο για CRPC ασθενείς. Πολλές κλινικές μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για να ελέγξετε αν οι αναστολείς PI3K /AKT είναι ευεργετική για τους ασθενείς του προστάτη. Ωστόσο, αν αυτοί οι αναστολείς έχουν οποιεσδήποτε επιπτώσεις στις εκφράσεις του πλήρους μήκους AR (AR-FL) και παραλλαγή ματίσματος του (AR-V7) παραμένει ασαφής.

Μέθοδοι

Τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη (LNCaP, LNCaP95, vcap και 22Rv1) με διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς πέντε PI3K /AKT (LY294002, Wortmannin, BKM120, Ακτή και AZD5363) ή ΑΚΤ siRNA. Ar και Ar-V7 επίπεδα πρωτεΐνης και mRNA μετρήθηκαν με προσδιορισμούς PCR ανοσοκηλίδωση και σε πραγματικό χρόνο. AR έναρξη μεταγραφής γονιδίων, εναλλακτικό μάτισμα RNA και τα ποσοστά της υποβάθμισης AR mRNA προσδιορίστηκαν επίσης.

Αποτελέσματα

PI3K /AKT αναστολείς είχε ποικίλες επιπτώσεις στις εκφράσεις πρωτεΐνης AR κυρίως μέσω μεταβολών της έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου AR και μάτισμα του RNA. Ωστόσο, τα αποτελέσματα αυτά παρέμειναν αμετάβλητα με την παρουσία RNA σίγηση των γονιδίων ΑΚΤ.

Συμπέρασμα

PI3K /AKT αναστολείς έχουν off-στόχο επιδράσεις στη γονιδιακή έκφραση AR σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, η οποία είναι λαμβάνονται υπόψη κατά την εφαρμογή αυτών των αναστολέων σε ασθενείς προστάτη, ιδιαίτερα οι ασθενείς υπό θεραπεία ADT

Παράθεση:. Liu L, Dong X (2014) Συγκρότημα Επιπτώσεις των αναστολείς /AKT PI3K να ανδρογόνων υποδοχέων Gene Expression σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (10): e108780. doi: 10.1371 /journal.pone.0108780

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Ιουλίου του 2014? Αποδεκτές: 3η Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 31 Οκτωβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Liu, Dong. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό έλαβε επιδότηση λειτουργίας από την καναδική Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (MOP-137007) και Rising βραβείο αστεριών από καρκίνο του προστάτη Καναδά (RS2013- 58) για να Χσουεσέν Dong. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) είναι η τυπική θεραπεία για μεταστατικό καρκίνο του προστάτη (PCA). Ωστόσο, η εξέλιξη σε καρκίνο του ανθεκτικού ευνουχισμό προστάτη (CRPC) συμβαίνει να πλειονότητα των ασθενών [1]. CRPC όγκοι διατηρηθεί η έκφραση του AR και ρυθμιζόμενων γονιδίων της, υποδεικνύοντας ότι η σηματοδότηση AR συνεχίζει να λειτουργεί [2] – [5]. Αρκετοί μηχανισμοί έχουν προταθεί για παρεκκλίνουσα AR επαναδραστηριοποίηση των υστέρων ADT περιλαμβάνει: i) ενίσχυση γονιδίου AR και να αποκτήσουν-of-λειτουργία μεταλλάξεων [4], [6] – [9]? ii) μεταβολές στην έκφραση και τη λειτουργία των βασικών AR συν-ρυθμιστές [10] – [12]? και iii) κυρίως, γενιά σύνδεσης συνδετήρα τομέα περικόπτεται παραλλαγές ματίσματος AR (AR-Vs) [13] – [16] που συστατικά ενεργοποιούν τη σηματοδότηση AR. Μεταξύ αυτών των παραλλαγών, AR-V7 (ονομάζεται επίσης AR3) είναι η πιο άφθονα εκφραζόμενο AR-V σε PCa [13], [14], [17]. Τα επίπεδα πρωτεΐνης AR-V7 είναι σημαντικά αυξημένα σε CRPC όγκους και που συνδέονται στενά με βραχύτερη επιβίωση των ασθενών [13], [14], [18]. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν ότι η αναστολή της έκφρασης του γονιδίου AR και λειτουργίας παραμένει μια σημαντική θεραπεία.

Επιπλέον, η φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (PI3K) /AKT /στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά σηματοδότησης (mTOR) συχνά ενεργοποιείται σε προστάτη και έχει αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικούς ρόλους για CRPC εξέλιξη και την αντοχή σε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από θεραπεία [19], [20]. Γενετικές αλλοιώσεις των συστατικών του μονοπατιού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR εμφανίστηκε στο 42% των πρωτογενών όγκων του προστάτη και 100% των μεταστατικών όγκων [19]. Το πιο σημαντικό, αμοιβαία ενεργοποίηση ανατροφοδότηση του AR και ΡΙ3Κ μονοπάτια /ΑΚΤ αποδείχθηκε, το οποίο επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να προσαρμοστούν είτε μονοπάτι για την επιβίωση όταν το άλλο είναι φαρμακολογικά αναστέλλεται [21], [22]. Τα ευρήματα αυτά παρέχουν μια λογική που συν-στόχευση και τις δύο οδούς μπορεί να επιτύχει καλύτερα αποτελέσματα για τους ασθενείς CRPC.

Υπάρχουν πολλές αναστολείς που στοχεύουν διαφορετικά βασικά συστατικά του μονοπατιού PI3K /AKT συμπεριλαμβανομένων των PI3K, ΑΚΤ και mTOR. Ωστόσο, αναστολείς ΡΙ3Κ LY294002 όπως έχουν επίσης αποδειχθεί να δεσμεύουν και να αναστέλλουν άλλες κινάσες που δεν ανήκουν στην σηματοδότηση ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [23], [24]. Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι όταν δραστηριότητα του mTOR αναστέλλεται από ορισμένες αναστολείς ΑΚΤ, αυτό μπορεί να προκαλέσει ένα μηχανισμό ανάδρασης με αποτέλεσμα την εκ νέου ενεργοποίηση του ΑΚΤ ή ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνες [25], [26]. Μαζί, αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι πέρα ​​από την καταστολή της ΑΚΤ κατάντη δράστες, εκτός στόχου επιδράσεις των αναστολέων της ΑΚΤ θα μπορούσε να παράγει βαθιές επιπτώσεις στα καρκινικά κύτταρα. Το ερώτημα μένει να απαντηθεί είναι αν οι αναστολείς PI3K /AKT μπορεί να αλλάξει τις εκφράσεις του πλήρους μήκους AR (AR-FL) και AR-V7 στα κύτταρα του προστάτη, η οποία θα μπορούσε ενδεχομένως να εξουδετερώσει την αποτελεσματικότητα του ADT.

Σε αυτό το μελέτη, τέσσερις κυτταρικές σειρές PC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς /AKT πέντε PI3K. Μετρήσαμε τόσο mRNA AR και τα επίπεδα της πρωτεΐνης και αποφασιστική έναρξη του γονιδίου AR μεταγραφή, μάτισμα RNA και τα ποσοστά της υποβάθμισης AR mRNA. Έχουμε αναφερθεί υπήρχαν πολύπλοκες επιπτώσεις των αναστολέων PI3K /AKT στο AR γονιδιακής έκφρασης που είναι ανεξάρτητες σε ΑΚΤ νοκ ντάουν. πρέπει να ληφθούν υπόψη αυτές οι off-στόχο επιδράσεις στη γονιδιακή έκφραση AR κατά την εφαρμογή αναστολέων /AKT PI3K για τους ασθενείς του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ο καρκίνος του προστάτη κυτταρικές σειρές, οι αναστολείς PI3K /AKT και siRNA επιμόλυνση

LNCaP, VCAP και 22Rv1 ανθρώπινου προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). κύτταρα LNCaP ήταν μεταξύ 42-50 περάσματα. LNCaP95 κυτταρική γραμμή που παρέχεται από τον Δρ Plymate (University of Washington) και αναφέρθηκε σε προηγούμενες μελέτες [14], [27], [28]. Προέρχεται από LNCaP κυττάρων και έχει λάβει την αντίσταση στην ανδρογόνων συνθήκες εξάντλησης. Τόσο LNCaP και LNCaP95 εκφράζουν μεταλλαγμένο AR (T877A) που μπορούν να ενεργοποιήσουν AR από ένα ευρύ φάσμα στεροειδή ή στεροειδή ανάλογα. Εκφράζουν επίσης μεταλλαγμένο φωσφατάση και tensin ομόλογο γονίδιο (PTEN) που ενεργοποιεί συστατικά ΑΚΤ. κύτταρα vcap εκφράζουν άγριου τύπου AR και PTEN. Αλλά έχουν ενίσχυση γονιδίου AR με αποτέλεσμα υψηλότερα επίπεδα AR-FL και εκφράσεις AR-V7. 22Rv1 κύτταρα εκφράζουν άγριου τύπου ΡΤΕΝ, αλλά έχουν γονίδιο αναδιάταξη του γονιδίου AR προκύπτον υψηλά επίπεδα έκφρασης AR-V7. Μαζί αυτές οι τέσσερις κυτταρικές σειρές προστάτη αντιπροσωπεύουν ένα ευρύ φάσμα των γενετικών αλλοιώσεων των κυττάρων του προστάτη. LY294002 και βορτμαννίνη αγοράστηκαν από την Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). NVP-BKM120 και AZD5363 ήταν από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Houston, TX). ΑΚΤΗ (CAT # 124005) ήταν από την EMD Millipore (Billerica, ΜΑ). Ελέγχου και AKT siRNAs (CAT #: J-003000, Ι-003001 και J-003002 για την ΑΚΤ 1-3 ισομορφές, αντίστοιχα) ήταν από Dharmacon (Οτάβα, Οντάριο). SiRNAs επιμολύνθηκαν σε κύτταρα προστάτη, χρησιμοποιώντας το λιπιδικό αντιδραστήριο siLentFect από την Bio-Rad (Mississauga, ΟΝ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

προσδιορισμούς ανοσοαποτύπωσης

λύματα πρωτεΐνης συλλέχθηκαν με ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ40, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο και 0.1% SDS) συμπληρωμένου με αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης από την Roche (Laval, Κεμπέκ) όπως περιγράψαμε [29]. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε δείγματος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ BCA από την Pierce (Rockford, IL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με πηκτώματα SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε πολυβινύλιο (PVDF) μεμβράνες και γίνεται αποτύπωμα με αντισώματα υποδεικνύονται. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και μία σειρά των αντιπροσωπευτικών κηλίδων δείχθηκε. Αντισώματος πληροφορίες που παρατίθενται στον πίνακα S1.

Real-time PCR

αναλύσεις PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [30], [31]. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας Purelink RNA μίνι κιτ από την Invitrogen (Burlington, ΟΝ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR διεξήχθη εις τριπλούν, χρησιμοποιώντας Applied Biosystems7900HT με 5 ng του cDNA, 1 μΜ από κάθε ζεύγος εκκινητών και SYBR Green PCR κύριο μείγμα από τη Roche (Laval, QC). Όλες οι αναλύσεις PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τρεις τεχνικές επαναλήψεων και τρεις ανεξάρτητες συνθέσεις cDNA. Primer πληροφορίες που παρατίθενται στον πίνακα S1.

Πυρηνική πορεία για την πώληση δοκιμασία

Πυρηνική πορεία στις δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [32] με μικρές τροποποιήσεις. LNCaP και LNCaP95 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 18 ώρες με όχημα, LY294002, AZD5363 ή siRNA κατά AKT1-3 ισομορφών. Εντελώς 6 × 10

6 κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS, συλλέχθηκαν και λύθηκαν επί πάγου εντός 0,5% Nonidet Ρ-40 ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [10 mM Tris · HCl (ρΗ 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2] και φυγοκεντρείται σε 500 χ g για 10 λεπτά. Τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν και οι πυρήνες επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης [10 mM Tris · HCl (ρΗ 8.0), 5 mM MgCl2, 0.3 mM KCl] που περιέχει 2.5 mM ΝΤΡ συν μείγμα Βιοτίνη-16-UTP από την Roche (Laval, QC) για 45 λεπτά στους 30 ° C. Βιοτινυλιωμένο εν τω γεννάσθαι μεταγραφές RNA κατακρημνίστηκαν με στρεπταβιδίνη σφαιρίδια από Gold Biotechnology (St. Louis, ΜΟ) και πλύθηκαν με αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού νατρίου συν 15% φορμαλδεΰδη. Καταβυθισθέν RNA εκλούεται από σφαιρίδια στρεπταβιδίνης και χρησιμοποιούνται ως πρότυπα για πραγματικού χρόνου αναλύσεις PCR με εκκινητές ενίσχυση mRNAs του συνολικού AR ή 18S rRNA (18rS) όπως περιγράφεται στον Πίνακα S1. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως μέση ± SEM από τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις του κάθε πειραματική συνθήκη.

δοκιμασίας ματίσματος RNA του γονιδίου AR

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας Purelink RNA μίνι κιτ από την Invitrogen (Burlington, ΟΝ ). Real-time PCR διεξήχθη για να μετρηθεί το γονίδιο AR μάτισμα RNA. Η σχετική AR-FL και AR-V7 αποδοτικότητα ματίσματος προσδιορίστηκε με κανονικοποίηση με ένα εσωτερικό PCR προϊόντος εντός AR εξώνια 2 και 3. Primer πληροφορίες που παρατίθενται στον Πίνακα S1. Όλες οι αναλύσεις PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τρεις τεχνικές επαναλήψεων και τρεις ανεξάρτητες συνθέσεις cDNA.

Οι στατιστικές

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. Για τον προσδιορισμό των διαφορών μεταξύ των πειραματικών ομάδων, μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από φοιτητής

t

-test διεξήχθη χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (έκδοση 4) με το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε σε Ρ & lt? 0,05 ως *, Ρ & lt? 0,01 ως ** και η P & lt?. 0.001 ως ***

Αποτελέσματα

Επιπτώσεις των αναστολέων /AKT PI3K για AR επίπεδα πρωτεΐνης στα κύτταρα του προστάτη

LY294002 είναι ένα ισχυρό ανταγωνιστικό αναστολέα να PI3K και αποτρέπει PI3K από φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση κατάντη δράστες της ΑΚΤ [33]. Η βορτμαννίνη είναι ένας ομοιοπολικός αναστολέας της ΡΙ3Κ που καταστέλλει μη αναστρέψιμα φωσφορυλίωση της ΑΚΤ [34]. LY294002 κατασταλεί επίπεδα πρωτεΐνης AR-FL σε κύτταρα LNCaP (Εικ. 1Α), ανέστειλε τόσο την AR-FL και τα επίπεδα πρωτεΐνης AR-V7 σε κύτταρα LNCaP95 (Εικ. 1Β). Τόσο LNCaP και LNCaP95 κύτταρα είναι ελλειμματικά κύτταρα ΡΤΕΝ, στην οποία AKT είναι συστατικά ενεργός στη φωσφορυλίωση του μορφή (π-ΑΚΤ). Τόσο LY294002 και βορτμαννίνη παρεμποδίζει ισχυρά ρ-ΑΚΤ επίπεδα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Πυκνότητας αναλύσεις σε πρωτεΐνη εκφράσεις του AR-FL, AR-V7 και π-ΑΚΤ μετρήθηκαν (Εικ. 1Γ). Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο LY294002 και βορτμαννίνη κατέστειλε AR-FL και AR-V7 εκφράσεις πρωτεΐνης σε κύτταρα VCAP (Εικ. 2Α). Ωστόσο, LY294002 αυξημένη AR-FL, αλλά μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης AR-V7 στην 22Rv1 κύτταρα (Εικ. 2Β). Ουορτμανίνη ανέστειλε τόσο AR-FL και εκφράσεις πρωτεΐνης AR-V7 στα κύτταρα vcap και 22Rv1. Πυκνότητας αναλύσεις σε πρωτεΐνη εκφράσεις του AR-FL και AR-V7 αναλύθηκαν (Σχ. 2C). Από VCAP και 22Rv1 κύτταρα είναι επαρκής κύτταρα ΡΤΕΝ, όπου το ρ-ΑΚΤ είναι σε πολύ χαμηλά /μη ανιχνεύσιμα επίπεδα εκτός ενεργοποιούνται ανάντη υποδοχείς κινάσης τυροσίνης της, τα αποτελέσματα της LY294002 στον AR έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα VCAP και 22Rv1 δεν είχαν πιθανόν σχετίζονται με την ενεργοποίηση ΑΚΤ . BKM120 είναι ένας αναστολέας παν-ΡΙ3Κ, αλλά όχι να mTOR [35]. BKM120 κατέστειλε αποτελεσματικά π-ΑΚΤ επίπεδα και στις δύο κύτταρα LNCaP και LNCaP95. Ωστόσο, BKM120 δεν είχε επιπτώσεις στο AR-FL και τα επίπεδα της πρωτεΐνης AR-V7 σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές του προστάτη (Εικ. 1-2). Akti είναι ένα ανταγωνιστικό αναλογική αιθέρα φωσφατιδυλινοσιτόλης που αποβάθρες στο ομολογία πλεκστρίνης (PH) τομέα της ΑΚΤ, αποτρέπει την ΑΚΤ μετατόπιση προς PI3K στην πλασματική μεμβράνη έτσι αναστέλλει τη φωσφορυλίωση ΑΚΤ και την ενεργοποίηση [36]. ΑΚΤΗ δεν έδειξαν καμία κατασταλτικές επιδράσεις στο AR-FL ή τα επίπεδα της πρωτεΐνης AR-V7 (Εικ. 1-2). AZD5363 είναι μια ATP-ανταγωνιστικός αναστολέας της ΑΚΤ [37], [38]. Αυξήθηκε τόσο AR-FL και τα επίπεδα πρωτεΐνης AR-V7 και επαγόμενη από ρ-ΑΚΤ επίπεδα σε κύτταρα LNCaP και LNCaP95 (Εικ. 1). Ωστόσο, μειώθηκε AR-FL και AR-V7 επίπεδα πρωτεΐνης σε ΡΤΕΝ επαρκή VCAP και 22Rv1 κύτταρα (Εικ. 2).

(Α) LNCaP και (Β) LNCaP95 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις ΡΙ3Κ /αναστολείς ΑΚΤ LY294002 (0, 25, 50 μΜ), βορτμαννίνη (0, 0.5 και 1 μΜ), BKM120 (0, 0.5 και 1 μΜ), Ακτή (0, 5 και 10 μΜ) ή AZD5363 (0, 2,5 και 5 υΜ ) για 18 ώρες. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανοσοστυπώθηκαν με AR (Ν-20), AR-V7, Pan-ΑΚΤ, φωσφόρου-ΑΚΤ (Ser473) και β-ακτίνης αντισώματα. (Γ) Τα αποτελέσματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. ανάλυση πυκνομετρία ζώνες πρωτεΐνης μετρήθηκαν από το λογισμικό Image J και απεικονίζονται ως μέση + SEM. Μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από Student t-test έγινε με * η P & lt? 0,05, ** η P & lt? 0,01 και *** η P & lt?. 0.001

Η

(Α) vcap και (Β ) 22Rv1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις /αναστολέων ΑΚΤ ΡΙ3Κ LY294002 (0, 25, 50 μΜ), βορτμαννίνη (0, 0.5 και 1 μΜ), BKM120 (0, 0.5 και 1 μΜ), Ακτή (0, 5 και 10 υΜ) ή AZD5363 (0, 2,5 και 5 υΜ) για 18 ώρες. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανοσοστυπώθηκαν με AR (Ν-20), AR-V7, Pan-ΑΚΤ, φωσφόρου-ΑΚΤ (Ser473) και β-ακτίνης αντισώματα. (Γ) Τα αποτελέσματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. ανάλυση πυκνομετρία ζώνες πρωτεΐνης μετρήθηκαν από το λογισμικό Image J και απεικονίζονται ως μέση + SEM. Μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από Student t-test έγινε με * η P & lt? 0,05, ** η P & lt? 0,01 και *** η P & lt?. 0.001

Η

Επιπτώσεις των αναστολέων /AKT PI3K για να επίπεδα AR mRNA στα κύτταρα του προστάτη

επίπεδα AR mRNA μετρήθηκαν επίσης σε κυτταρικές σειρές προστάτη υπό θεραπείες αναστολέων /AKT PI3K. Οι αλλαγές του AR-FL και τα επίπεδα AR-V7 mRNA (εικ. 3) ήταν σύμφωνα με αυτά που παρατηρήθηκαν σε επίπεδα πρωτεΐνης AR όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 και 2. LY294002 και βορτμαννίνη μειώθηκαν και τα δύο επίπεδα AR-FL και AV-7 mRNA σε όλες οι κυτταρικές σειρές προστάτη, εκτός του ότι LY294002 αυξημένα επίπεδα AR-FL mRNA σε 22Rv1 κύτταρα. BKM120 και Ακτή δεν είχε σημαντικές επιπτώσεις στα επίπεδα AR mRNA. AZD5363 αυξημένη AR-FL και AR-V7 mRNA επίπεδα στα κύτταρα LNCaP και LNCaP95, αλλά μειώθηκαν τα επίπεδα mRNA σε κύτταρα vcap και 22Rv1 με στατιστική σημαντικότητα. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι οι αναστολείς ΡΙ3Κ /ΑΚΤ επηρεάζονται έκφραση γονιδίου AR κυρίως στο επίπεδο του mRNA.

LNCaP, LNCaP95, VCAP και 22Rv1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις των αναστολέων /ΑΚΤ ΡΙ3Κ LY294002 (0, 25, 50 μΜ) , Wortmanin (0, 0.5 και 1 μΜ), BKM120 (0, 0.5 και 1 μΜ), Ακτή (0, 5 και 10 μΜ) ή AZD5363 (0, 2,5 και 5 υΜ) για 18 ώρες. τα επίπεδα έκφρασης του mRNA AR-FL (Α) και AR-V7 (Β) σε σχέση με 18rS προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. Τα αποτελέσματα ήταν από τρεις ανεξάρτητες RNA εκχυλίσεις με τριπλούν προσδιορισμούς PCR σε πραγματικό χρόνο για κάθε δείγμα RNA. Τα δεδομένα χαράσσονται ως μέση τιμή + SEM. Μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από Student t-test έγινε με * η P & lt? 0,05, ** η P & lt? 0,01 και *** η P & lt?. 0.001

Η

Επιπτώσεις της ΑΚΤ νοκ ντάουν να AR γονιδίου έκφραση

για να διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον οι επιπτώσεις της LY294002 και AZD5363 σε πρωτεΐνη AR και τα επίπεδα mRNA ήταν μεσολάβηση ΑΚΤ, πραγματοποιήσαμε ΑΚΤ νοκ ντάουν δοκιμασίες που χρησιμοποιούν κοινές πηγές siRNA έναντι και των τριών AKT1-3 ισομορφές. Η αποτελεσματικότητα της ΑΚΤ siRNA δείχθηκε με κηλίδωση Western (Εικ. 4Α-Β). Παρατηρήσαμε ότι ανεξάρτητα η παρουσία της ΑΚΤ νοκ ντάουν, LY294002 μπορεί ακόμα να μειώσουν δραματικά τα επίπεδα AR-FL και AR-V7 πρωτεΐνης (Εικ. 4Α) και του mRNA (Εικ. 4C) στα κύτταρα LNCaP, LNCaP95 και vcap. LY294002 υπερέκφραση AR-FL, αλλά μειωμένη έκφραση AR-V7 στην 22Rv1 κύτταρα. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι AZD5363 αυξήθηκε σημαντικά εκφράσεις AR-FL σε κύτταρα LNCaP και LNCaP95 και μειωμένη AR-FL και AR-V7 σε VCAP και 22Rv1 κύτταρα, τα οποία αποτελέσματα παρέμειναν αμετάβλητα ακόμη και παρουσία αποτελεσματικών knockdown ΑΚΤ (Σχ. 4Β και 4D). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι επιπτώσεις της LY294002 και AZD5363 σε AR εκφράσεις ήταν ανεξάρτητες σε ΑΚΤ και κατάντη δράστες του.

LNCaP, LNCaP95, vcap και 22Rv1 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο ή κοινές siRNA για την ΑΚΤ 1-3 ισομορφές για 36 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια περαιτέρω κατεργάζεται με 50 υΜ LY294002 (Α) ή 5 μΜ AZD5363 (Β) για άλλες 18 ώρες. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανοσοστυπώθηκαν με AR (Ν-20), AR-V7, Pan-ΑΚΤ, ρ-ΑΚΤ (Ser473) και β-ακτίνης αντισώματα. Τα αποτελέσματα επαναλήφθηκαν σε περισσότερα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. ανάλυση πυκνομετρία ζώνες πρωτεΐνης μετρήθηκαν από το λογισμικό Image J και απεικονίζονται ως μέση + SEM. επίπεδα (C) AR-FL και (D) AR-V7 mRNA έκφραση σε σχέση με 18rS προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. Τα αποτελέσματα ήταν από τρεις ανεξάρτητες RNA εκχυλίσεις με τριπλούν προσδιορισμούς PCR σε πραγματικό χρόνο για κάθε δείγμα RNA και απεικονίζονται ως μέση + SEM. t-τεστ του Student πραγματοποιήθηκαν σύγκριση μεταξύ οχήματος και θεραπείες LY294002 /AZD5363 με * η P & lt? 0,05? ** Η P & lt? 0,01 και *** η P & lt?. 0.001

Η

LY294002 και AZD5363 επηρεάζουν την έναρξη της μεταγραφής του γονιδίου AR, RNA splicing και AR mRNA σταθερότητα

Οι επιπτώσεις της LY294002 και AZD5363 σε επίπεδα AR mRNA θα μπορούσε να είναι σε πολλαπλά δυνατά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένων έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου AR, προ-mRNA ματίσματος και την υποβάθμιση του AR mRNA. Χρησιμοποιώντας την πυρηνική πορεία για τη δοκιμασία μετρήσαμε τα δύο ποσοστά έναρξης μεταγραφής AR και γονίδιο 18rS παρουσία οχήματος ή αναστολέων ΡΙ3Κ /ΑΚΤ (Εικ. 5Α). Το γονίδιο 18rS χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος καθώς τα επίπεδα του mRNA δεν επηρεάστηκαν από αναστολείς /ΑΚΤ ΡΙ3Κ. Δείξαμε ότι LY294002 αναστέλλεται, ενώ AZD5363 αυξημένα ποσοστά έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου AR σε σχέση με 18rS τόσο LNCaP και LNCaP95 κύτταρα. Επιπλέον, να χτυπήσει κάτω ΑΚΤ δεν μετέβαλε τα ποσοστά μεταγραφής γονιδίου AR.

(Α) LNCaP και LNCaP95 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα, 50 υΜ LY294002 ή 5 υΜ AZD5363 για 18 ώρες (αριστερά). LNCaP και LNCaP95 κύτταρα επιμολύνθηκαν επίσης με τον έλεγχο ή AKT1-3 siRNAs για 48 ώρες (δεξιά). δοκιμασίες Πυρηνική πορεία επί διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικό και Μέθοδος. (Β) LNCaP και LNCaP95 κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή συγκεντρωμένων siRNA για ΑΚΤ 1-3 ισομορφές για 36 ώρες. Κυττάρων μετά περαιτέρω κατεργασία με 50 μΜ LY294002 ή 5 υΜ AZD5363 για άλλες 18 ώρες. δοκιμασίες ματίσματος RNA για AR-FL και AR-V7 μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικό και Μέθοδος. (Γ) LNCaP και LNCaP95 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 2 μΜ ακτινομυκίνη D για 2 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, 50 υΜ LY294002 ή 5 υΜ AZD5363 για 0, 2, 4, 6, 8, και 16 ώρες. επίπεδα AR-FL και την έκφραση του mRNA AR-V7 σε σχέση με 18rS προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. (D) LNCaP και LNCaP95 κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή συγκεντρωμένων siRNA για ΑΚΤ 1-3 ισομορφές για 36 ώρες. Κυττάρων προ-επεξεργασία με 2 μΜ ακτινομυκίνη D για 2 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 50 υΜ LY294002 ή 5 υΜ AZD5363 για 6 ώρες. επίπεδα AR-FL και την έκφραση του mRNA AR-V7 σε σχέση με 18rS προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. Τα αποτελέσματα ήταν από τρεις ανεξάρτητες RNA εκχυλίσεις με τριπλούν προσδιορισμούς PCR σε πραγματικό χρόνο για κάθε δείγμα RNA. Μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από Student t-test έγινε με * η P & lt? 0,05, ** η P & lt? 0,01 και *** η P & lt?. 0.001

Η

Για να μετρηθεί η

bona fide

επιπτώσεις της LY294002 και AZD5363 σε AR-FL και AR-V7 RNA splicing, αλλά αποκλείει τις επιπτώσεις τους για την έναρξη της μεταγραφής του γονιδίου AR, σχεδιάσαμε τρία σετ εκκινητών για τη μέτρηση των σχετικών ποσοστών ματίσματος για AR-FL και AR-V7 . Από AR-V7 RNA μάτισμα είναι μια αμοιβαία αποκλειστική διαδικασία ματίσματος RNA του εξωνίου 3β και εξόνιο 4 της AR προ-mRNA, ένα σύνολο εκκινητών καλύπτουν το εξώνιο 3 και 4 διασταύρωση του γονιδίου AR για τη μέτρηση των επιπέδων AR-FL mRNA, μία σύνολο εκκινητών καλύπτουν εξονίου 3 και 3β για τα επίπεδα AR-V7 mRNA και το άλλο σύνολο των εκκινητών είναι εντός εξώνια 2 και 3 για τα συνολικά επίπεδα AR mRNA. Δείξαμε ότι AR-FL RNA μάτισμα δεν επηρεάζεται από LY294002, AZD5363 ή ΑΚΤ νοκ ντάουν. Ωστόσο, LY294002 ανέστειλε δραματικά, ενώ AZD5363 αυξημένη AR-V7 μάτισμα σε κύτταρα LNCaP95 (Εικ. 5Β). Οι αλλαγές του AR-V7 μάτισμα που προκαλείται από LY294002 ή AZD5363 δεν μεταβλήθηκαν με την παρουσία της ΑΚΤ νοκ ντάουν.

AR-FL και σταθερότητα του mRNA AR-V7 μελετήθηκαν επίσης σε κύτταρα LNCaP και LNCaP95 προ-επεξεργασμένα με ακτινομυκίνη D (Σχ. 5C). LY294002 ενισχυμένη AR-FL και η υποβάθμιση του AR-V7 mRNA σε κύτταρα LNCaP95 μέσα σε 16 ώρες. AZD5363 ενισχυμένη AR-FL ή υποβάθμιση AR-V7 mRNA σε δύο κύτταρα LNCaP και LNCaP95. Ωστόσο, οι επιπτώσεις της LY294002 και AZD5363 για σταθερότητα του mRNA AR δεν επηρεάστηκαν από την ΑΚΤ νοκ ντάουν (Εικ. 5D). Από τα συνολικά επίπεδα mRNA του AR-FL και AR-V7 στα κύτταρα LNCaP και LNCaP95 αυξήθηκαν κατά AZD5363 (Εικ. 3), αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι επιπτώσεις της AZD5363 για την έναρξη της μεταγραφής του γονιδίου AR και μάτισμα RNA αντισταθμισθούν επιπτώσεις της AR mRNA υποβάθμισης.

LY294002 και AZD5363 επηρεάζουν AR-FL και μεταγραφική δραστικότητα AR-V7

Για να διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσο οι μεταβολές των AR-FL και τα επίπεδα της πρωτεΐνης AR-V7 με LY294002 και AZD5363 θα επηρεάσει AR μεταγραφική δραστηριότητες, μετρήσαμε τις εκφράσεις των δύο γονιδίων που ρυθμίζονται AR-FL (PSA και OPRK1) και ένα AR-V7 ρυθμιζόμενο γονίδιο (UGT2b17). Σε αμφότερα LNCaP και vCap κύτταρα, AR-FL αγωνιστή R1881 διεγείρεται έκφραση PSA, η οποία δράσεις κατεστάλησαν με LY294002 (Σχ. 6Α-Β). Αντίθετα, AZD5363 ενίσχυσε την επίδραση R1881 στην προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης PSA σε κύτταρα LNCaP, αλλά μείωσε τη δράση R1881 στα κύτταρα vcap. Οι αλλαγές αυτές ήταν συνεπείς στις επιπτώσεις της LY294002 και AZD5363 στα επίπεδα της πρωτεΐνης AR-FL σε αυτά τα κύτταρα. Η έκφραση του γονιδίου OPRK1 κατεστάλη μέσω της ενεργοποιημένης συνδέτη AR-FL [39]. Θεραπεία της LY294002 μειώθηκε AR-FL παρεμπόδιση που προκαλείται να OPRK1 έκφρασης και στις δύο LNCaP κύτταρα (69% καταστολή μειώνεται στο 35%) και τα κύτταρα VCAP (94% καταστολή μειώνεται στο 42%). AZD5363 ενισχυθεί AR-FL στην καταστολή έκφρασης OPRK1 σε κύτταρα LNCaP (69% καταστολή αυξήθηκε στο 79%), αλλά μείωσε AR-FL μεσολαβεί αναστολή της έκφρασης σε κύτταρα OPRK1 VCAP (94% καταστολή μειώνεται στο 86%). Ωστόσο, και οι δύο επιπτώσεις της LY294002 και AZD5363 για PSA και OPRK1 εκφράσεις δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά από την ΑΚΤ νοκ ντάουν. Για να μελετηθεί η μεταγραφική δραστικότητα AR-V7, μετρήσαμε την έκφραση της σε κύτταρα UGT2b17 VCAP και LNCaP95 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με MDV3100 να εμποδίσει δραστικότητα AR-FL. Και τα δύο κύτταρα vcap και LNCaP95 εκφράζουν τόσο AR-FL και AR-V7. Αποδείξαμε προηγουμένως ότι με την παρουσία του AR-FL λειτουργικό αποκλεισμό, η προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης του UGT2b17 προσδιορίστηκε με AR-V7 [27]. LY294002 ανέστειλε έκφραση UGT2b17 τόσο LNCaP95 και κυττάρων VCAP (Σχ. 6C-D). AZD5363 διεγείρεται έκφραση UGT2b17 στα κύτταρα LNCaP, αλλά μειωμένη έκφραση του σε κύτταρα vcap. Αυτές οι αλλαγές στην έκφραση γονιδίων UGT2b17 ήταν συνεπή με τα επίπεδα πρωτεΐνης AR-V7 υπό LY294002 και AZD5363 θεραπείες. Ωστόσο, αυτές οι επιπτώσεις δεν μεταβλήθηκαν από ΑΚΤ knockdown.

(Α) LNCaP και (Β) κύτταρα vCap επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή AKT1-3 siRNAs για 48 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή 1 ηΜ R1881. Τα κύτταρα επίσης συν-θεραπεία με έκδοχο, 50 υΜ LY294002 ή 5 υΜ AZD5363 για 18 ώρες. αναλύσεις PCR πραγματικού χρόνου μετρήθηκαν PSA και τα επίπεδα OPRK1 mRNA. (C) LNCaP95 και (D) κύτταρα vCap επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή AKT1-3 siRNAs για 48 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 50 υΜ LY294002 ή 5 υΜ AZD5363 σε παρουσία 5 μΜ MDV3100 για 18 ώρες. αναλύσεις PCR πραγματικού χρόνου μετρήθηκαν τα επίπεδα UGT2b17 mRNA. Τα αποτελέσματα ήταν από τρεις ανεξάρτητες RNA εκχυλίσεις με τριπλούν προσδιορισμούς PCR σε πραγματικό χρόνο για κάθε δείγμα RNA. t-τεστ του Student πραγματοποιήθηκαν σύγκριση μεταξύ οχήματος και θεραπείες LY294002 /AZD5363 με * η P & lt? 0,05? ** Η P & lt? 0,01 και *** η P & lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

Η ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K /AKT είτε μέσω γενετικών ή επιγενετικών μηχανισμών συμβαίνει συχνά σε όγκους, καθιστώντας αυτή την οδό ελκυστικό θεραπευτικό στόχο για ένα ευρύ φάσμα καρκίνων. Πολλοί αναστολείς είναι διαθέσιμα για να εμποδίσει ΡΙ3Κ σηματοδότηση /ΑΚΤ και μερικά είναι κάτω από πρώιμες κλινικές δοκιμές. Ωστόσο, η ετερογένεια των καρκίνων του προστάτη είναι ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό, το οποίο καθιστά δύσκολο να προβλεφθεί κατά πόσον η αναστολή της σηματοδότησης PI3K /AKT θα ωφελήσει τους ασθενείς του προστάτη. Επιπλέον, πολλές πιθανές βιολογικές συνέπειες της PI3K αναστολή /AKT μπορεί να υπονομεύσει περαιτέρω το δυναμικό θεραπευτικό όφελος. Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να διερευνήσει κατά πόσον οι αναστολείς PI3K /AKT έχει κανένα εκτός στόχου επιδράσεις στην έκφραση του γονιδίου AR σε ένα πάνελ κυτταρικών σειρών προστάτη που αντιπροσωπεύουν τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη με ένα ευρύ φάσμα των γενετικών παραλλαγών. Είναι σημαντικό να τεκμηριώσει το προφίλ έκφρασης του AR-FL και AR παραλλαγές ματίσματος σύμφωνα με θεραπείες αναστολέων PI3K /AKT, αφού σταθερή έκφραση AR και η λειτουργία είναι ένα από τα κρίσιμα μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων οι όγκοι του προστάτη προχωρήσει σε CRPC. Έχουμε αναφερθεί ότι οι αναστολείς PI3K /AKT είχε περίπλοκες συνέπειες στην έκφραση του γονιδίου AR που ήταν ανεξάρτητες σε AKT, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτοί οι αναστολείς PI3K /AKT θα μπορούσε να επηρεάσει τη σηματοδότηση πέρα ​​από το μονοπάτι PI3K /AKT στα κύτταρα του προστάτη που εκκρεμούν κατά την γενετικό υπόβαθρο τους. Αυτές οι επιπτώσεις εκτός-προειδοποιούνται πιθανή εφαρμογή των αναστολέων ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σε ορισμένες, αν όχι όλες, η PCA πληθυσμούς ασθενών.

Off-στόχος επιδράσεις των αναστολέων /ΑΚΤ ΡΙ3Κ είχε καλά τεκμηριωμένη και κατ ‘επανάληψη παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη. LY294002 και βορτμαννίνη καταδείχθηκαν να δεσμεύσει πολλές άλλες κινάσες που δεν σχετίζονται με την PI3K /AKT σηματοδότησης [23], [24]. Ως εκ τούτου, δεν αποτελεί έκπληξη ότι LY294002 και Wortmannin είχε δείξει κυρίαρχη αρνητικές επιπτώσεις για την έκφραση του γονιδίου AR ακόμη και κάτω από ΑΚΤ νοκ ντάουν κατάσταση. Παρά το γεγονός ότι τόσο BKM120 και Ακτή καταστέλλεται δραματικά φωσφορυλίωση ΑΚΤ και την ενεργοποίηση, δεν δείχνουν κανένα αντίκτυπο στην γονιδιακή έκφραση AR σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές του προστάτη. Αυτά τα αποτελέσματα απέκλεισε το ενδεχόμενο ότι η ενεργοποίηση της ΑΚΤ ήταν άμεσα υπεύθυνος για τις αλλαγές του γονιδίου AR εκφράσεις. Εξυπηρέτησαν ως αρνητικοί μάρτυρες για να υποστηρίξει περαιτέρω τις επιπτώσεις εκτός στόχου της LY294002, Wortmannin και AZD5363 στο γονίδιο AR εκφράσεις. Είναι ενδιαφέρον, AZD5363 μπορεί να αλλάξει AR-FL και AR-V7 εκφράσεις που εκκρεμούν κατά το γενετικό υπόβαθρο των κυτταρικών σειρών προστάτη. Ωστόσο, αρκετές αποδείξεις που αναφέρονται παντού τα αποτελέσματα εκτός στόχου του AZD5363 στην έκφραση του γονιδίου AR. Κατ ‘αρχάς, αν και LNCaP και LNCaP95 κύτταρα εκφράζουν μεταλλαγμένη PTEN και ουσιαστικά δραστική ΑΚΤ, AZD5363 αυξηθεί τόσο AR-FL και AR-V7 εκφράσεις, ακόμα και όταν τα ενδογενή ΑΚΤ είχαν μειωθεί σημαντικά από την RNA σίγηση (Εικ. 4). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενεργοποίηση ανατροφοδότηση της ΑΚΤ από AZD5363 δεν συμβάλλουν στις αλλαγές των εκφράσεων AR. Δεύτερον, VCAP και 22Rv1 κύτταρα εκφράζουν άγριου τύπου ΡΤΕΝ με χαμηλά /μη ανιχνεύσιμα επίπεδα του p-ΑΚΤ απουσία ενεργοποίησης των ανάντη υποδοχέων κινάσης τυροσίνης (Εικ. 1-2). Οι επιπτώσεις του AZD5363 σε μείωση AR-FL και AR-V7 στην vcap και 22Rv1 γραμμές, επομένως, δεν σχετίζονται με την ενεργοποίηση ΑΚΤ. Τέλος, AZD5363 μπορεί να ενισχύσει AR έναρξης μεταγραφής του γονιδίου (Σχ. 5Α), RNA μάτισμα του AR-V7 (Εικ. 5Β), AR-FL και αποικοδόμηση AR-V7 mRNA ανεξάρτητα να ΑΚΤ knockdown (Σχ. 5C-D).

Τόσο AR και ΡΙ3Κ σηματοδότησης /ΑΚΤ είχε αποδειχθεί ότι είναι σημαντική για τα κύτταρα του προστάτη να αναπτύξουν αντίσταση θεραπεία. Ανάπτυξη αναστολέων σε αυτά σηματοδότησης παρέχει νέες ευκαιρίες για τους ασθενείς του προστάτη. Η αντιστάθμιση αυτών των δυνατοτήτων είναι η πρόκληση της εντός του ασθενούς ετερογένειας των κυττάρων του προστάτη [40]. Πολλαπλές κλώνους καρκινικών κυττάρων με διαφορετικές γενετικό υπόβαθρο θα μπορούσαν να συνυπάρξουν στο ίδιο ασθενή [41]. Ως εκ τούτου, αναστολέα /ΑΚΤ ένας ΡΙ3Κ θα μπορούσε να είναι αποτελεσματική για ένα πληθυσμό των καρκινικών κυττάρων, αλλά ενδεχομένως παρέχουν προνόμιο ανάπτυξης για τους άλλους μέσω κλωνικής διαδικασίας επιλογής. Συνεργασία με στόχο AR και PI3K /AKT μονοπάτια μπορεί να είναι ακόμη πιο δύσκολο. Αμοιβαία ενεργοποίηση των AR και PI3K σηματοδότησης /AKT σε καρκίνους του προστάτη θα μπορούσε να περιπλέξει την έκβαση των ασθενών προστάτη που λαμβάνουν συνδυαστική θεραπείες του AR και PI3K αναστολή /AKT. Αντι-ανδρογόνα μπορεί ενδεχομένως να υπονομεύσει την αποτελεσματικότητα των αναστολέων /AKT PI3K. Αντιστρόφως, οι αναστολείς /AKT PI3K μπορεί να εξουδετερώσει την αποτελεσματικότητα των αντι-ανδρογόνα. Πρόσφατες μελέτες χρησιμοποιώντας περαιτέρω ΡΤΕΝ μοντέλα knockout ποντίκια έδειξε ότι αν και τα ευαίσθητα ευνουχισμός όγκων απάντησαν στις AR και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σηματοδότηση, τα ανθεκτικά καρκινώματα που προέρχονται ευνουχισμός υποστούν φαινοτυπική πλαστικότητα που οδηγεί σε αυξημένη ενδοογκική ετερογένεια και την απώλεια της ανεξαρτησίας του όγκου σε ΡΙ3Κ σηματοδότηση [42]. Οι προηγούμενες μελέτες μας είχαν δείξει ότι οι συνθήκες ευνουχισμός επαγωγή της μεταγραφής του γονιδίου AR και μάτισμα RNA του AR-V7 [27]. Εμείς περαιτέρω έδειξε εδώ ότι οι αναστολείς όπως AZD5363 μπορεί να αυξήσει την έναρξη γονίδιο AR μεταγραφής και AR-V7 μάτισμα RNA. Συν-θεραπεία αντι-ανδρογόνων και AZD5363 θα μπορούσε ενδεχομένως να οδηγήσει σε αυξημένη έκφραση AR-V7 και την προώθηση της AR-V7 οδηγείται όγκων σε μια υποομάδα ασθενών προστάτη.

Εν περιλήψει, οι μελέτες μας απέδειξαν /αναστολείς ΑΚΤ PI3K έχουν διάφορες εκτός στόχου επιπτώσεις στο γονίδιο AR εκφράσεις σε κύτταρα προστάτη με διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο. Οι πληροφορίες αυτές πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά τη θεραπεία ασθενών προστάτη με αυτούς τους αναστολείς.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Πληροφορίες αντισωμάτων και εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0108780.s001

(DOCX)