Αφηρημένο

Πλαίσιο

Φλοιοεπινεφριδιακή καρκίνωμα (ACC) είναι μια σπάνια και εξαιρετικά επιθετική ενδοκρινικό νεόπλασμα, με περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές. Τα Ενεργοποίηση β-κατενίνης σωματικές μεταλλάξεις βρέθηκαν σε ACC και έχουν συνδεθεί με κακή κλινική έκβαση. Στην πραγματικότητα, η ενεργοποίηση του μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην ACC επιθετικότητα, και θα μπορούσε, έτσι, αντιπροσωπεύουν μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτικό στόχο.

Στόχος

Παρόμοια με ασθενή όγκου δείγματος κυτταρική σειρά H295 προέρχεται από ένα ACC φιλοξενεί ένα φυσικό ενεργοποίησης μετάλλαξη β-κατενίνης. Εμείς εδώ αξιολογήσει το

in vitro

και

in vivo

αποτέλεσμα της απενεργοποίησης της β-κατενίνης χρησιμοποιώντας μια δοξυκυκλίνη (DOX) επαγόμενων πλασμίδιο shRNA στο H295R γραμμή του φλοιού των επινεφριδίων καρκινικά κύτταρα (κλώνος ονομάζεται shβ).

Αποτελέσματα

Μετά την αγωγή DOX μια βαθιά μείωση

β-κατενίνης

έκφραση ήταν ανιχνεύσιμη σε shβ κλώνων σε σύγκριση με τον έλεγχο κλώνοι (CTR). Κατά συνέπεια, παρατηρήσαμε μία μείωση στην δραστηριότητα Wnt αναφοράς λουσιφεράσης /βcatenin εξαρτώμενη, καθώς και μια μειωμένη έκφραση

AXIN2

αντιπροσωπεύει έναν ενδογενή

β-κατενίνης

γονιδίου στόχου. Ταυτόχρονα,

β-κατενίνης

σίγηση οδήγησε σε μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μεταβολές του κυτταρικού κύκλου με τη συσσώρευση των κυττάρων στην G1 φάση και αυξημένη απόπτωση

in vitro

.

In vivo

, σε καθιερωμένες ξενομοσχευμάτων όγκου σε αθυμικά γυμνά ποντίκια, 9 ημέρες

β-κατενίνης

αποσιώπηση οδήγησε σε σημαντική μείωση του

CTNNB1

και

AXIN2

έκφρασης. Επιπλέον, συνεχής

β-κατενίνης

σίγησης, αρχίζοντας 3 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων, συνδέθηκε με μια πλήρη απουσία ανάπτυξης του όγκου στην ομάδα shβ ενώ όγκοι ήταν παρούσα σε όλα τα ζώα της ομάδας ελέγχου.

Συμπέρασμα

συνοπτικά, τα πειράματα αυτά παρέχουν ενδείξεις ότι η αναστολή Wnt /β-κατενίνης οδού στη θέση ACC είναι ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο

Παράθεση:. Gaujoux S, Hantel C, Launay P, Bonnet S, Perlemoine K, L Lefèvre, et al. (2013) Σίγαση Μεταλλαγμένα

β-κατενίνης

Αναστέλλει κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διεγείρει την απόπτωση στην κυτταρική σειρά καρκίνου του φλοιού H295R. PLoS ONE 8 (2): e55743. doi: 10.1371 /journal.pone.0055743

Επιμέλεια: Hans Α Kestler, Πανεπιστήμιο του Ulm, Γερμανία

Ελήφθη: 14 Σεπτεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 30 Δεκέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 7η Φεβρουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Gaujoux et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Contrat d’Έναρξη à la Recherche Clinique (επιχορήγηση CIRC 05045 – AP-HP), το σχέδιο νοσοκομειακό de Recherche Clinique (AOM06179) στο Δίκτυο COMETE, η Recherche Translationnelle DHOS /INCA 2009 (RTD09024), το ΕΚΤ (07-RNP-067), ο Σύνδεσμος pour la Recherche sur le καρκίνο (SFI20111203542), η Weigand εμπιστοσύνη στη Γερμανία, ο Sander Stiftung (2011.003.1) και το Ligue contre le καρκίνου (RS12 /75-105). Επιπλέον, έρευνα που οδηγεί σε αυτά τα αποτελέσματα έχει λάβει χρηματοδότηση από το Έβδομο Πρόγραμμα Πλαίσιο (FP7 /2007-2013) υπό τον αριθμό συμφωνίας επιχορήγησης 259.735 (ENS @ T-καρκίνου). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Φλοιοεπινεφριδιακή καρκίνωμα (ACC) είναι μια σπάνια και εξαιρετικά επιθετική ενδοκρινικό νεόπλασμα, με 5-ετή συνολική επιβίωση της τάξης του 40% [1] – [4]. Θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς αυτούς είναι σπάνιες, και είναι διαθέσιμη χημειοθεραπείες περιορισμένης αποτελεσματικότητας. Η καλύτερη κατανόηση της βιολογίας του όγκου και μοριακών προγνωστικών παραγόντων θα βοηθήσει να επιλέξετε σχετικών θεραπευτικών στόχων και την ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών.

Η ενεργοποίηση του /της β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt στην ογκογένεση του φλοιού των επινεφριδίων έχει πρόσφατα ερευνηθεί λεπτομερώς [ ,,,0],5] – [10], και φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόγνωση του φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα. Σε ζωικά μοντέλα, ένα συστατική ενεργοποίηση της /β-κατενίνης μονοπάτι Wnt στο φλοιό των επινεφριδίων διαγονιδιακών ποντικών οδηγεί στην ανάπτυξη του φλοιού των επινεφριδίων όγκων με κακοήθη χαρακτηριστικά [11]. Στους ανθρώπους, αυτή η οδός συχνά ενεργοποιείται κυρίως σκάφης γονίδιο β-κατενίνης (

CTNNB1

, δηλαδή Catenin (καντερίνης-πρωτεΐνη που συνδέεται), βήτα 1) μεταλλάξεις [5], [7], και σχετίζεται με συγκεκριμένες κλινικές και παθολογικά χαρακτηριστικά και μια κακή έκβαση [8]. Παρομοίως, ένα ειδικό transcriptomic υπογραφή των όγκων με

CTNNB1

μετάλλαξη έχει πρόσφατα αποδειχθεί [12], και μπορεί να ευθύνονται για την συγκεκριμένη φτωχή πρόγνωση των προσβεβλημένων ασθενών. Συνολικά, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι απενεργοποίηση ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτικός στόχος στην ACC.

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η

in vivo

και

in vitro

επιπτώσεις της Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι ειδική απενεργοποίηση χρησιμοποιώντας μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) σε ένα μοντέλο όγκου για φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα (H295R).

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και γενιά H295R κλώνοι

Φλοιοεπινεφριδική κυτταρική γραμμή καρκινώματος H295R σταθερά επιμολυσμένα με τον καταστολέα Tet (H295R /TR) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Lalli [13]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. διάνυσμα pter-β-κατενίνης, η οποία εκφράζει ένα επαγώγιμο shRNA στοχευμένη

CTNNB1

(

β-κατενίνης

? στοχευμένη αλληλουχία: 5′-GTGGGTGGTATAGAGGCTC-3 ‘) δοξυκυκλίνη mRNA, και ο φορέας ελέγχου ( pter) ελήφθησαν από τον Dr. van de Wetering [15]. H295R /TR επιμολύνθηκαν με το pter-β-κατενίνης ή επιλέχθηκαν pter και οι κλώνοι με ζεοκίνη (50 μg /ml, InvivoGen). Τρεις shRNA-βcatenin κλώνοι επιλέχθηκαν (shβ) στον οποίο

CTNNB1

έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω τουλάχιστον 5 φορές σε ένα δοξυκυκλίνη (ϋΟΧ, 0,2 μg /ml, Sigma) με τρόπο που εξαρτάται σε σύγκριση με τρεις κλώνους ελέγχου ( CTR) επιμολυσμένα με φορέα pter. Όλες οι κυτταρικοί κλώνοι εξετάστηκαν για την ικανότητά τους να εκφράζουν συγκεκριμένες στερεοειδογόνο γονίδια (

StAR

και

CYP11B1

) και τις απαντήσεις τους στο μονοπάτι cAMP /PKA η οποία βρέθηκε να είναι συγκρίσιμη με εκείνη της γονικής κυτταρική γραμμή, H295R [16] (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). S45P

CTNNB1

(

β-κατενίνης

) γονιδιακή μετάλλαξη ενεργοποίησης, που είχαν διαπιστωθεί στο γονική H295R κυτταρική σειρά [5], [8], επιβεβαιώθηκε με άμεση αλληλούχιση σε όλα τα Ctr και shβ κλώνους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ενώ τα δεδομένα που παρουσιάζονται για μια ενιαία Ctr και shβ κλωνοποιήσουν όλες τις

in vitro

πειράματα επιβεβαίωσαν με ισοδύναμα αποτελέσματα σε 2-3 επιμέρους κλώνους (Ctr και shβ).

Ανάλυση των επιπέδων του RNA και των πρωτεϊνών

Ολικό RNA ή πρωτεΐνης εκχυλίσεις και ανάλυση από κυτταρικές σειρές διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14] με τους εκκινητές και τα αντισώματα που περιγράφονται στον πίνακα S1.

δοκιμασίες

διαμόλυνσης κυττάρων, και ρεπόρτερ

Ως /β-κατενίνης κατασκεύασμα ανταποκριτή μονοπάτι Wnt κατευθύνει έκφραση του γονιδίου λουσιφεράσης, χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο TopFlash (Top) ήταν το οποίο περιέχει δύο αντίγραφα των θέσεων TCF δέσμευσης παράγοντα /Τ-κυττάρων β-κατενίνης, ενώ το πλασμίδιο FopFlash (Fop) περιέχει δύο μεταλλαγμένα αντίγραφα των β-κατενίνης /sites TCF δέσμευσης [5]. ιός σαρκώματος Rous (RSV) -Renilla (Promega) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος της αποτελεσματικότητας μορφομετατροπής. Τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν και δραστηριοτήτων λουσιφεράσης Firefly και Renilla μετρήθηκαν διαδοχικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης ανάλυση

Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία (Promega). Το κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, όπως έχει ήδη αναφερθεί [17].

ξενομοσχεύματος, παθολογική εξέταση και ανοσοϊστοχημική χρώση

Θηλυκά αθυμικά NMRI ηυ /ηυ ποντίκια (6-8 εβδομάδες) ήσαν αγοράστηκαν από την Harlan Winkelmann (Borchen, Γερμανία) και στεγάστηκαν κάτω από συνθήκες χωρίς παθογόνα. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν ακολουθώντας τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την Regierung von Oberbayern και σύμφωνα με τις γερμανικές οδηγίες για μελέτες σε ζώα. 15 × 10

6 κύτταρα των μεμονωμένοι κλώνοι εμβολιάστηκαν σε όγκο 200 μΐ PBS υποδορίως στο λαιμό του κάθε ποντικού. Για βραχυπρόθεσμη θεραπευτική πειράματα ξεκίνησε θεραπεία DOX, όταν οι μεγαλύτερες διάμετροι των όγκων κυμαίνονταν μεταξύ 0,2-0,9 cm σε μέγεθος (μετά από 21-31 ημέρες). Δοξυκυκλίνης προστέθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 2 mg /ml στο πόσιμο νερό σε μπουκάλια νερού κεχριμπάρι. Μετά από 9 ημέρες όγκων θεραπεία DOX αποκόπηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη, και 4 μm τομές κόβονται και χρωματίζονται με αιματοξυλίνη-ηωσίνη-Saffron. Ανοσοϊστοχημεία για β-κατενίνης πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Τα κύτταρα για τις μακροπρόθεσμες θεραπευτικές πειράματα εμβολιάσθηκαν και 3 ημέρες μετά τα ποντίκια επαγωγή όγκου αρχίζοντας από τότε συνεχώς σε επεξεργασία με DOX νερό. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε δεύτερη ημέρα χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Την ημέρα 31 ημέρες μετά την επαγωγή όγκου, όταν πρώτα όγκοι έφτασαν μία μακρύτερη διάμετρος όγκου 1,5 cm, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αποκόπηκαν.

Στατιστική ανάλυση

Όλα

in vitro

δεδομένων με στατιστικές αναλύσεις αντιπροσωπεύουν την ποσοτικοποίηση των τουλάχιστον τριών πειραμάτων. συνθήκες ελέγχου ορίστηκαν ως 100% και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ του Fisher. Η στατιστική ανάλυση για τη σύγκριση του βάρους του όγκου μετά από μακροχρόνια θεραπευτική πείραμα

in vivo

διεξήχθη με Mann-Whitney test. Σημαντικότητας ορίστηκε στο P & lt? 0,05 (εκπρόσωπος * σε αριθμούς)? P & lt? 0.01 (**) και Ρ & lt? 0.001 (***)

Αποτελέσματα

Η αποτελεσματική αδρανοποίηση του

CTNNB1 από

shRNA στο φλοιού των καρκινικών κυττάρων

κύτταρα H295R, που φιλοξενούν ένα ετερόζυγο

CTNNB1

γονιδιακή μετάλλαξη στη θέση φωσφορυλίωσης της ΟδΚ3β (S45P), παρουσιάζουν μια συστατική μεταγραφική δραστηριότητα της β-κατενίνης-LEF /TCF [5]. κλώνοι κυττάρων που εκφράζουν ένα δοξυκυκλίνης επαγώγιμο shRNA στόχευση β-κατενίνης παρήχθησαν. Δύο ημέρες μετά την επαγωγή shRNA-β-κατενίνης με δοξυκυκλίνη (DOX) θεραπεία,

CTNNB1

mRNA (-85%? Ρ & lt? 0,01) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης μειώθηκαν σημαντικά (σχήμα 1-Α). Αυτή η μείωση στο

CTNNB1

επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης συνεχίστηκε με τη θεραπεία με DOX μέχρι 10 ημέρες. Σε αντίθεση, η θεραπεία DOX δεν είχε καμία επίδραση στο

CTNNB1

έκφρασης στον κλώνο ελέγχου (CTR) (σχήμα 1-Α).

Ένα, πάνελ κηλίδα Ιστόγραμμα και Δυτική αντιπροσωπεύουν

CTNNB1

(

β-κατενίνης

) συσσώρευση mRNA και της πρωτεΐνης, στο CTR και shβ κλώνοι μετά από 2, 5 ή 10 ημέρες μετά την προσθήκη της δοξυκυκλίνης (DOX) σε μέσο καλλιέργειας (0,2 μg /ml). Β-αριστερά, τα κύτταρα παροδικά συν-επιμολυσμένα με ένα τεχνητό Wnt /-β-κατενίνης Κατασκευές οδού δημοσιογράφος (Top) ή τον έλεγχο του μεταλλαγμένου (Fop). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή DOX (0,2 μg /ml) για 24 ώρες και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε. -Σωστά, ιστόγραμμα αντιπροσωπεύουν

AXIN2

συσσώρευση του mRNA μετά από 2 ημέρες θεραπείας DOX. C-αριστερά, καμπύλη κυτταρική επιβίωση των κυττάρων, όπως αξιολογήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ χωρίς ή με DOX (0,2 μg /ml) για 1, 4, 8 ή 12 ημέρες. -Center, η κατανομή των κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του χρώση ιωδιούχου προπιδίου μετά από θεραπεία όχημα ή DOX για 2, 5 και 10 ημερών. Western blots δείχνουν β-κατενίνης, κυκλίνη και CDK2 επίπεδα πρωτεΐνης στο 10 την ημέρα. -Σωστά, ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκε με ενσωμάτωση κυτταρομετρίας ροής αννεξίνη V, μετά από θεραπεία όχημα ή DOX για 2, 5 και 10 ημέρες, χωρίς ή με σταυροσπορίνη συν-θεραπεία για 6 τελευταία h (0,5 μg /ml). Western κηλίδες δείχνουν την διασπασμένη κασπάση 3 (ΥΧ3) στην ίδια κατάσταση.

Η

CTNNB1

αποσιώπηση μειώνει Wnt /β-κατενίνης-LEF /TCF εξαρτώμενης μεταγραφής

Η Wnt /β-κατενίνης-LEF /TCF εξαρτώμενη μεταγραφή μελετήθηκε με τη χρήση των πλασμιδίων Top-Flash /Fop-Flash (Top και Fop). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα επιμολυσμένα κύτταρα H295R έδειξαν υψηλότερη μεταγραφική δραστικότητα του β-κατενίνης-LEF /TCF εξαρτώμενη αναφοράς λουσιφεράσης κατασκεύασμα Κορυφή σε σύγκριση με το μεταλλαγμένο Fop κατασκεύασμα (Σχήμα 1-Β, Ctr-Fop: 5% σε σύγκριση με Ctr-Top: 100 %, p & lt? 0,01? και shβ-Fop: 9% σε σύγκριση με shβ-Top: 100%, p & lt? 0,01). κύτταρα H295R που εκφράζονται shRNA-β-κατενίνης (shβ με DOX) έδειξε χαμηλότερη μεταγραφική δραστηριότητα του δημοσιογράφου κατασκευάσει Top (shβ-Top: -53%, p & lt? 0,01). θεραπεία Dox δεν επηρέασε δραστηριότητα του Top κατασκευή του κλώνου ελέγχου (Ctr-Top) ή στο Fop κατασκευάσει με μεταλλαγμένες θέσεις LEF /TCF σε δύο κλώνους (Ctr-Fop και shβ-Fop).

Επιπλέον ,

CTNNB

1 αποσιώπηση για δύο ημέρες μείωσε σημαντικά τα επίπεδα του mRNA ενός ενδογενούς γονιδίου κανονική κατάντη στόχου της Wnt /β-κατενίνης οδού, δηλαδή

AXIN2

, στον κλώνο shβ (σχήμα 1-Β , shβ: -82%, p & lt? 0,01) σε σύγκριση με τον έλεγχο των κλώνων (Ctr,

ns

)

CTNNB1

φίμωση αλλάζει τον πολλαπλασιασμό, του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

μια μελέτη χρονικής πορείας της

CTNNB1

αποσιώπηση στην κυτταρική σειρά H295R έδειξε μια σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό (-45,8% σε 12 ημέρες, p & lt? 0,05) σε σύγκριση με shβ κλώνο χωρίς να

CTNNB1

φίμωση (-ΟΟΧ) ή ο κλώνος ελέγχου (εικόνα 1-C), που προσδιορίζεται με μετατροπή ΜΤΤ.

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου με χρώση ιωδιούχου προπιδίου δεν έδειξε καμία επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου μέχρι 5 ημέρες. Ωστόσο, μετά από 10 ημέρες θεραπείας DOX,

CTNNB1

αποσιώπηση ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση κυττάρων στις φάσεις G1 και μείωση της κυτταρικής αναλογίας στη φάση S (Σχήμα 1-C, shβ-10d-G1: 55,3 ± 0,4%

vs

65,8 ± 2,2%? -S: 27,5 ± 0,2%

vs

16,5 ± 1,6%, p & lt? 0,05). Δεν υπάρχει τέτοια διαφορά δεν παρατηρήθηκε στον κλώνο ελέγχου (CTR). Σε αυτό το χρονικό σημείο, παρατηρήσαμε μια μείωση δύο σημαντικών πρωτεϊνών για G1 /S μετάβαση, κυκλίνη Α και CDK2 μόνο σε κύτταρα σιγήσει για

CTNNB1

(Σχήμα 1-C).

Ομοίως, καμία επίδραση στην απόπτωση προσδιορίστηκε από την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της ενσωμάτωσης annexine V σε κύτταρα, παρατηρήθηκε μέχρι 5 ημέρες, ενώ 10 ημέρες DOX επάγεται

CTNNB1

σίγηση αύξησε το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (Σχήμα 1-C, shβ- 10δ: 167%, p & lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα χωρίς θεραπεία DOX. Καμία τέτοια διαφορά δεν παρατηρήθηκε στον κλώνο ελέγχου. Αυτή η αύξηση της απόπτωσης από

CTNNB1

αποσιώπηση επιβεβαιώθηκε επίσης από το κέρδος του ενός προαποπτωτικής επίπεδο πρωτεΐνης, διασπάται caspase3 (ΥΧ3), η οποία ήταν ανιχνεύσιμη ήδη σε προγενέστερο χρονικό σημείο (5 ημέρες, εικόνα 1-C). Παρομοίως,

CTNNB1

σίγηση αύξησε το αποπτωτικό αποτέλεσμα σταυροσπορίνης (Σχήμα 1-C? Shβ-5d + STAU: 224%

vs

377%, ρ & lt? 0,05), ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική διαφορά σε κλώνους ελέγχου.

CTNNB1

αποσιώπηση καταργήσει ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων της κυτταρικής σειράς ACC

για να αξιολογηθεί η λειτουργική σημασία της β-κατενίνης knock-down για την ανάπτυξη των όγκων προχωρήσαμε με έρευνα σε ένα υποδόριο μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς.

σε ένα πρώτο βήμα, βραχυπρόθεσμα πειράματα με

CTNNB1

αδρανοποίηση επί εγκατεστημένων όγκων (21 έως 31 ημέρες μετά την ξενομεταμόσχευση) για μια διάρκεια 9 ημέρα διεξήχθησαν για να αντικατοπτρίζει τη χρονική πορεία από μας

in vitro

πειράματα (Σχήμα 1-C). Παρόμοια με το

in vitro

καθορισμό αναλύσεις έκφρασης mRNA αποκάλυψε ένα εξαρτώμενο DOX σημαντική μείωση στην ογκική

CTNNB1

και

AXIN2

έκφραση σε shβ κλώνος (Σχήμα 2-Α?

CTNNB1

: -89%, p = 0,007?

AXIN2

: -87%, p & lt? 0.001), ενώ οι κλώνοι του ελέγχου παρέμειναν ανεπηρέαστα από τη θεραπεία DOX. Εξάλλου, και σύμφωνα με τα πειράματα καλλιέργειας κυττάρων, ανοσοϊστοχημική ανάλυση (Σχήμα 2-Β) αποκάλυψε μια θεραπεία DOX εξαρτώμενη μείωση της πρωτεΐνης β-κατενίνης. Όμως, δεν έχουμε παρατηρήθηκε καμία διαφορά για την Κί67 και το διασπασμένο έκφραση caspase3 με αναλύσεις ανοσοϊστοχημεία (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι 9 ημέρες DOX δεν επαρκεί

in vivo

να επάγουν επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού και επί της απόπτωσης . Επειδή αυτή τη φορά βέβαια είναι πολύ σύντομη για να ερευνήσει μια πιθανή επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου σε ένα

in vivo

μοντέλο, έγινε μακροχρόνια θεραπεία DOX. Ctr και shβ κλώνοι υποδορίως και 3 ημέρες μετά τα ποντίκια επαγωγή όγκου υπέστησαν αγωγή με DOX με ένα συνεχή τρόπο. Δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μετά από 31 ημέρες στο μέγεθος του όγκου μεταξύ shβ και οι κλώνοι Ctr σε απουσία αγωγής DOX, αλλά είναι φαίνεται ότι ο κλώνος shβ αναπτύσσονται πιο αργά από τον κλώνο Ctr, πιθανώς λόγω ενός κλωνικού αποτελέσματος. Για το λόγο αυτό η δοξυκυκλίνη-επαγώγιμο σύστημα είναι κατάλληλο, επειδή οι κλώνοι είναι δικό τους έλεγχο. Ενώ η θεραπεία DOX δεν επηρέασε την ανάπτυξη του όγκου και το βάρος του κλώνου ελέγχου (Σχήμα 2-C-αριστερά, το βάρος διάμεσοι: 112 mg

vs

162,7 mg,

ns

), υπήρχε μια σημαντική αντίκτυπο των

CTNNB1

φίμωση κατά την επεξεργασία DOX στο shβ κλώνο (σχήμα 2-Ο-rigth). Πράγματι, για shβ κλώνος, κατά τη διάρκεια των πρώτων 10 ημερών, η ανάπτυξη του όγκου ήταν παρατηρήσιμη και στις δύο ομάδες (χωρίς ή με DOX), αλλά, μετά από 13 ημέρες, δεν όγκου ήταν ανιχνεύσιμη σε κανένα από τα ποντίκια της ομάδας shβ αγωγή με ϋΟΧ, συμπεριλαμβανομένης μετά την ανατομή και παθολογική ανάλυση (σχήμα 2-Ο-rigth, διάμεσο βάρος 67,4 mg

vs

0 mg, σ & lt? 0.001).

Ένα, ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν

CTNNB1

(

β-κατενίνης

) και

AXIN2

συσσώρευση mRNA σε ξενομοσχεύματος τόσο για Ctr (-ΟΟΧ n = 6? + DOX, η = 5) και shβ (-ΟΟΧ, η = 5? + DOX, n = 5) κλώνων σε καθιερωμένους όγκους και μετά από 9 ημέρες θεραπείας DOX. Β, αιματοξυλίνη-ηωσίνη-σαφράν και β-κατενίνη, χρώσης (χ 20) σε αντιπροσωπευτικά όγκους shβ κλώνου χωρίς και με αγωγή DOX (ίδιο πείραμα όπως Β). C, Boxplots αντιπροσωπεύουν τα μεγέθη του όγκου για Ctr και shβ ξενομοσχευμάτων σε ποντικούς συνεχώς σε επεξεργασία με όχημα ή ϋΟΧ μετά από 3 ημέρες της επαγωγής του όγκου. Boxplots στην αριστερή γωνία αντιπροσωπεύουν τα βάρη των όγκων που αποκόπτονται. CTR (-ΟΟΧ n = 7, + DOX n = 8), shβ (-ΟΟΧ, n = 7? + DOX, n = 8)

Η

Συζήτηση

Σε πολλές. καρκίνους, η οδός σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt παίζει σημαντικό ρόλο ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, της κινητικότητας, της διαφοροποίησης και [19]. Εμείς και άλλοι αποδείξαμε προηγουμένως και τη σημασία της ενεργοποίησης οδού σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt σε φλοιό επινεφριδίων ογκογένεση [5] – [10]. Αυτή η ενεργοποίηση σχετίζεται με μια συγκεκριμένη μοριακή υπογραφή και χειρότερη έκβαση με χαμηλότερη συνολική επιβίωση [12]. Doghman και οι συνεργάτες προηγουμένως έδειξαν ότι ένας ανταγωνιστής TCF αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του φλοιού των επινεφριδίων H295R, προτείνοντας ένα κεντρικό ρόλο του Wnt μονοπάτι /β-κατενίνης σε φλοιού των επινεφριδίων ογκογένεση [20]. Ωστόσο, αυτή η φαρμακολογική προσέγγιση μπορεί να μην είναι ειδικά για σηματοδότηση Wnt. Εμείς εδώ, χρησιμοποιώντας τόσο

in vitro

και

in vivo πειράματα

, αποδεικνύουν ότι άμεση και συγκεκριμένη β-κατενίνης αδρανοποίηση οδηγούν σε αλλοιώσεις του πολλαπλασιασμού, του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης που οδηγούν σε δραματική μείωση στην ανάπτυξη όγκου σε ένα μοντέλο όγκου για ACC. Περαιτέρω πειράματα χρειάζονται για να ξέρω αν β-κατενίνης αδρανοποίηση καταστέλλει την ανάπτυξη ή εμποδίζει την εμφύτευση των κυττάρων. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν 1 /η βιολογική συνέπεια της ενεργοποίησης της οδού /β-κατενίνης Wnt στην ογκογένεση του φλοιού των επινεφριδίων, και 2 /το μείζον θεραπευτικό ενδιαφέρον για τη στόχευση αυτού του μονοπατιού.

Η αναστολή της Wnt μονοπατιού /β-κατενίνης σε ένα υποομάδα της επιθετικής ACC φαίνεται να είναι μια ενδιαφέρουσα θεραπευτικό στόχο και θα πρέπει να αξιολογηθεί με περισσότερες λεπτομέρειες στο μέλλον.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1. συνθήκες

PCR και αντισώματα που χρησιμοποιούνται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0055743.s001

(XLS)

Ευχαριστίες

Ο Δρ. Ε Lalli για τη γενναιόδωρη δωρεά των κυττάρων H295R /TR και ο Δρ H Clevers για τη γενναιόδωρη δωρεά του pter-sh

βcatenin

φορέα.