Αφηρημένο

Ιστορικό

γονίδιο- κατευθυνόμενη ένζυμο θεραπεία προφαρμάκου (GDEPT) είναι ένα πρωτόκολλο θεραπείας δύο σταδίων για συμπαγείς όγκους που περιλαμβάνει την μεταφορά ενός γονιδίου που κωδικοποιεί ένα ένζυμο ενεργοποίησης προφαρμάκου που ακολουθείται από τη χορήγηση του ανενεργού προφαρμάκου το οποίο στη συνέχεια ενεργοποιείται από το ένζυμο σε όγκο τοξική μορφή του. Ωστόσο, η δημιουργία τέτοιων καθεστώτων νέα θεραπεία για την καταπολέμηση του καρκίνου του παγκρέατος απαιτεί ορίζεται και ισχυρά συστήματα ζωικών μοντέλων.

Μέθοδοι

Εδώ, έχουμε εκτενώς σε σύγκριση έξι ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές (PaCa-44, PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2, Hs-766T, Capan-2, και BxPc-3) σε υποδόρια και orthotopical μοντέλα ποντικών καθώς και στην ευαισθησία τους σε διαφορετικές GDEPTs.

Αποτελέσματα

πρόσληψη όγκου ήταν 83% έως 100% στο υποδόριο μοντέλο και το 60% έως 100% στην orthotopical μοντέλο ποντικού, εκτός από τα κύτταρα HS-766T, η οποία δεν αυξήθηκε ορθοτοπικά. Παθολογοϊστολογικά αναλύσεις των orthotopical μοντέλα αποκάλυψε μια διηθητική ανάπτυξη σχεδόν όλων των όγκων στο πάγκρεας? Ωστόσο, οι διάφορες κυτταρικές σειρές προκάλεσε όγκους με διαφορετικά μορφολογικά χαρακτηριστικά. Όλα τα προκύπτοντα όγκων ήταν θετικοί για το MUC-1 χρώση υποδεικνύοντας την καταγωγή τους από αδενικό ή πορογενές επιθήλιο, αλλά αποκάλυψε διάσπαρτα παν-κυτοκερατίνης χρώση. Μεταφορά του γονιδίου αυτοκτονίας κυτόχρωμα Ρ450 και απαμινάση κυτοσίνης, αντίστοιχα, εντός των παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας ρετροϊικό τεχνολογία διάνυσμα αποκάλυψε υψηλό επίπεδο μολυσματικότητα αυτών των κυτταρικών σειρών και επέτρεψε την ανάλυση της ευαισθησίας αυτών των κυττάρων με τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα ιφωσφαμίδη και 5-φθοροκυτοσίνη , αντίστοιχα.

Συμπέρασμα

τα στοιχεία αυτά πληρούν τις προϋποθέσεις τις κυτταρικές σειρές ως μέρος των πολύτιμων

in vitro

και

in vivo

μοντέλα για χρήση σε προκλινικές ορίζεται μελέτες για τη θεραπεία του παγκρέατος όγκου

Παράθεση:. Hlavatý J, Petznek Η, Holzmüller Η Url Α, Jandl G, Berger A, et al. (2012) Αξιολόγηση ενός Gene-Directed Therapy Enzyme-προϊόν (GDEPT) σε ανθρώπινο παγκρεατικό Κύτταρα Όγκου και η χρήση τους ως εν ζωή μοντέλα για καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (7): e40611. doi: 10.1371 /journal.pone.0040611

Επιμέλεια: Hiroyasu Nakano, Juntendo Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου, την Ιαπωνία

Ελήφθη: 7 του Μάρτη 2012? Αποδεκτές: 11 Ιουν του 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Ιούλη, 2012

Copyright: © 2012 Hlavatý et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το πρόγραμμα αυστριακή Βιομηχανικού Ταμείου Προώθησης Έρευνας, καθώς και από το Εργαστήριο Doppler χριστιανικής για θεραπευτικό γονίδιο Vector Ανάπτυξης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφείς BS και την WHG δηλώνουν υπαγωγή στην εταιρεία Austrianova Σιγκαπούρη PTE LTD. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών. Δεν υπάρχουν άλλες σχετικές δηλώσεις σχετικά με την απασχόληση, παροχή συμβουλών, διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων κλπ υπάρχουν. Συγγραφείς JH, HP, HH, AU, GJ, ΑΒ, MR έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Παρά τις εκτενείς επιστημονικές προσπάθειες και τη συσσώρευση γνώσεων σχετικά με παγκρέατος βιολογία του καρκίνου, τα ποσοστά θνησιμότητας των αυτό ως επί το πλείστον θανατηφόρο ασθένεια δεν έχουν μειωθεί σημαντικά κατά τα τελευταία 30 χρόνια. Επιπλέον, ο παγκόσμιος συχνότητα εμφάνισης αυτής της ασθένειας αυξάνεται [1], [2]. Όταν είναι εφικτό, το ισχύον πρότυπο περίθαλψης περιλαμβάνει τη χειρουργική εκτομή με ή χωρίς μετεγχειρητική χημειοθεραπεία ή χημειοθεραπεία /ακτινοθεραπεία (για επισκόπηση βλέπε [3]). Μέχρι πρόσφατα, η πιο κοινή χημειοθεραπευτικό παράγοντα που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος είναι η 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), χορηγηθεί είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα και /ή ακτινοθεραπεία [4], [5], [6]. Ωστόσο, ένας άλλος νουκλεοτιδικό ανάλογο, γεμσιταβίνη (Gemzar), έφερε στην αγορά το 1997 κυρίως για παρηγορητική αποτελέσματά της παρά για βελτίωση της επιβίωσης, έχει γίνει γρήγορα την χημειοθεραπευτική θεραπεία επιλογής για τον καρκίνο του παγκρέατος, λόγω θεραπευτικό δυναμικό της μόνης ή σε συνδυασμό [7] [8], [9].

Ωστόσο, νέες επιλογές θεραπείας απαιτούνται επειγόντως, και κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, αρκετοί ερευνητές έχουν αρχίσει να αξιολογήσει τα νέα και αντισυμβατικό στρατηγικές για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. Αυτό περιλαμβάνει νέα ανοσολογική στρατηγικές που χρησιμοποιούν μονοκλωνικά αντισώματα και θεραπευτικά εμβόλια, καθώς επίσης και προσεγγίσεις γονίδιο, όπως το αντιπληροφοριακά νουκλεϊκά οξέα, η έκφραση των κυρίαρχων αρνητικών ογκογονιδίου μεταλλάκτες, η έκφραση των γονιδίων καταστολής του όγκου ή θεραπεία με ενζυμικό προφάρμακο γονιδιο-κατευθυνόμενη (GDEPT? Για ανασκόπηση δείτε [10], [11]). Σε GDEPT, επίσης γνωστό ως γονίδιο αυτοκτονίας θεραπεία, ένα συγκεκριμένο, ετερόλογο γονίδιο εισάγεται εντός των κυττάρων του όγκου [12]. Όταν εκφράζεται, το αντίστοιχο προϊόν γονιδίου είναι σε θέση να μετατρέψει τοπικά μια συστημικά χορηγούμενη μη-τοξικό προφάρμακο σε δραστικό κύτταρο-τοξική μορφή του, ασκώντας το θεραπευτικό αποτέλεσμα στα κύτταρα όγκου όπως επίσης και σε περιβάλλοντα κύτταρα λόγω λεγόμενο φαινόμενο γειτνιάσεως με τη μεσολάβηση με διάχυση των τοξικών μεταβολιτών.

απλού έρπητα κινάσης θυμιδίνης ιού (HSVtk), αποαμινάση κυτοσίνης (CD) και του κυτοχρώματος Ρ450 (CYP) είναι γονίδια αυτοκτονίας που έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι είναι αποτελεσματικά σε διάφορα συστήματα μοντέλο όγκου ( αναθεωρούνται στο [13]). Ιϊκοί φορείς βασίζονται σε ρετροϊούς, όπως ο ιός λευχαιμίας ποντικών (MLV), έχουν αποκτήσει σημαντική δημοτικότητα για την αποτελεσματική και σταθερή έκφραση του γονιδίου από αυτά τα γονίδια αυτοκτονίας σε καρκινικά κύτταρα, έτσι, αρκετές μελέτες χρησιμοποιούνται ρετροϊικοί φορείς για την παράδοση των θεραπευτικών γονιδίων σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (για επισκόπηση βλέπε [14]).

Ως ένα πρώτο βήμα για την αξιολόγηση νέες ιδέες και έννοιες της θεραπείας, πειράματα που περιλαμβάνουν διαθέσιμων ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών σειρών εκτελούνται συχνά. Παρά τη σημασία του

in vitro

πειράματα, πρέπει να αξιολογηθεί κριτικά η ερμηνεία των αποτελεσμάτων και των συμπερασμάτων, δεδομένου ότι τα μοντέλα που χρησιμοποιούνται συχνά αντιπροσωπεύουν ένα τεχνητό σύστημα το οποίο μπορεί να μην απεικονίζουν με ακρίβεια το

in vivo

κατάσταση. Η απουσία των μοντέλων ποντικού θα συνοψίζονται κρίσιμα στοιχεία της νόσου έχει εμποδίσει μη κλινικές μελέτες [15], συμπεριλαμβανομένων εκείνων του GDEPT προσεγγίσεων. Ως εκ τούτου, η περαιτέρω μη κλινική αξιολόγηση νέων τρόπων θεραπείας απαιτεί την παρουσία ενός κατάλληλου ζωικού μοντέλου του ανθρώπινου καρκίνου του παγκρέατος. Προηγουμένως, η ανάπτυξη του in vivo μοντέλα παγκρεατικού όγκου έχει περιγραφεί από Mohammad και συνεργάτες, οι οποίοι δημιουργούνται ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού (με εμφύτευση του υλικού κύριας ανθρώπινου όγκου) και ζωικά μοντέλα χρησιμοποιώντας πρωτογενή κύτταρα ασθενούς, καθώς επίσης κυτταρικές γραμμές [16], [ ,,,0],17], [18]. Πρόσφατα, αρκετές παγκρέατος μοντέλα καρκίνου που βασίζονται σε γενετικά τροποποιημένα ζώα έχουν τεκμηριωθεί (για επισκόπηση βλέπε [19]).

Στην παρούσα μελέτη, με στόχο να αναλύσει και να συγκρίνει έξι διαφορετικών ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών σειρών σε υποδόρια και ορθοτοπική μοντέλα όγκου ποντικού, καθώς και για την αξιολόγηση της καταλληλότητας αυτών των μοντέλων για μη-κλινικές μελέτες του GDEPT. Οι υποδόριοι όγκοι σχηματίστηκαν σε SCID /μπεζ ποντίκια χρησιμοποιώντας κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές. Στο ορθοτοπικό μοντέλο, πέντε από τις έξι κυτταρικές γραμμές προκάλεσαν όγκους και τα περισσότερα από αυτά διεισδύσει το πάγκρεας με εξαίρεση την κυτταρική σειρά Capan-2. Επιπλέον, έχουμε τη δυνατότητα να δείξουμε ότι ρετροϊό διαμεσολαβούμενη έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν αυτοκτονίας αποαμινάση κυτοσίνης ή κυτόχρωμα Ρ450 2Β1 προσδίδει η ευαισθησία των κυττάρων σε μεταγωγή προς τον αντίστοιχο προφάρμακο (5-φθοροκυτοσίνη, ιφωσφαμίδη) σε κλινικά σχετικές συγκεντρώσεις. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ μπορεί να είναι σημαντική για άλλους ερευνητές σε σχέση με την επιλογή του κατάλληλου ζωικού μοντέλου του ανθρώπινου καρκίνου του παγκρέατος.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε ένα πάνελ ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρικές γραμμές καρκινώματος PANC-1, PaCa-44, Capan-2, BxPC-3, μΙΑ PaCa-2, και HS-766T από πλευράς καταλληλότητας για ένα

in vivo

μοντέλο ποντικού για καρκίνο του παγκρέατος. BxPC-3, Panc-1, Capan-2 κυτταρικές σειρές PaCa-44 και προήλθαν από πορογενές αδενοκαρκινώματα του παγκρέατος, ενώ MIA κύτταρα PaCa-2 προέρχονται από καρκινώματα του σώματος πάγκρεας [20], [21], [22], [23], [24]. Η κυτταρική γραμμή Hs-766T προήλθε από λεμφαδένα μετάσταση καρκινώματος παγκρέατος [25]. Όλες οι κυτταρικές γραμμές ήταν

in vitro

αναπτύχθηκαν ως προσκολλημένες καλλιέργειες μονοστοιβάδας με επιθηλιακά (PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2, Hs-766T, BxPC-3) ή γύρο για να πολυγωνικά (Capan-2, PaCa-44) μορφολογία. Δεδομένου ότι οι γενετικές ακεραιότητες της ρ53 καρκινικών δεικτών, K-ras, ρ16 και Smad4 (επίσης γνωστή ως DPC) σχετίζονται με την έκταση της ογκογονικότητας [26], συγκρίναμε τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε σχέση με γονότυπο τους για αυτούς τους δείκτες (Πίνακας 1). Δεν παρατηρείται σαφής η συνεκτικότητα των γενετικών αλλαγών των εξεταζόμενων γονιδίων των αντίστοιχων κυτταρικών σειρών είναι προφανής και τα ευρήματα είναι συχνά εξαρτάται από το είδος της ανάλυσης που εφαρμόζεται (για ανασκόπηση βλέπε [27], [28]). Σχεδόν όλες οι κυτταρικές σειρές είχαν μεταλλάξεις στον κυτταρικό κύκλο ρύθμισης καταστολείς όγκων ρ53 και ρ16. Μεταλλάξεις εντός του παγκρεατικού σχετίζεται καρκίνωμα ογκοκατασταλτικό Smad4, η οποία εμπλέκεται στο μετασχηματισμό του αυξητικού παράγοντα βήτα (ΤΟΡβ) σηματοδότησης, διαπιστώθηκε εξασθενημένη μόνο στις κυτταρικές γραμμές Hs-766T και BxPC-3 [27]. Από όλες τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, μόνο BxPc-3 περιγράφεται να έχει ένα άθικτο K-ras ογκογονιδίου [27].

Η

Για υποδόρια και ορθοτοπική όγκου Σχηματισμός

Μετά την υποδόρια ένεση των διαφόρων παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, όλα τα ζώα εμφάνισαν σχηματισμό όγκου (με εξαίρεση έναν ποντικό στην ομάδα PANC-1). PaCa-44 που προέρχεται από όγκους έδειξε την πιο γρήγορη αλλά μη ομοιογενή ανάπτυξη. Επτά ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων αυτοί οι όγκοι ήταν μετρήσιμοι με ένα παχύμετρο και το πρώτο ζώο έπρεπε να θυσιαστεί μετά από 18 ημέρες, όπως το μέγεθος του όγκου έγινε μεγαλύτερη από 1900 mm

3, με τον τρόπο αυτό έχει δείξει ένα ρυθμό ανάπτυξης πάνω από 1600 mm

3 εντός τεσσάρων ημερών (Εικ. 1). Η δεύτερη πιο έντονη ρυθμός αύξησης του όγκου παρατηρήθηκε από PANC-1 όγκων, που ακολουθείται από τα κύτταρα Capan-2, BxPC-3 και HS-766T, το οποίο εμφανίζεται μία πιο μέτρια ανάπτυξη του όγκου. Παρόμοια με PaCa-44, ΜΙΑ PaCa-2 όγκοι ήταν μετρήσιμες εντός επτά ημερών μετά την ένεση, αλλά σε αντίθεση, διατήρησαν το μέγεθός τους για 28 ημέρες πριν από τη συνεχή καλλιέργεια (Εικ. 1).

5 × 10

6 κύτταρα από κάθε κυτταρική σειρά παγκρεατικών εγχύθηκαν υποδορίως στην αριστερή πλευρά των CB-17 /IcrHsd- το

Prkcd

scid Lyst

bg

ποντίκια την ημέρα 0. Ορατό όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα με ένα παχύμετρο και το μέγεθος υπολογίστηκε από τον τύπο «μήκος χ πλάτος χ πλάτος /2».

η

Για να προσδιοριστεί η orthotopical συμπεριφορά των παραγόμενων όγκων του παγκρέατος, κομμάτια από τα υποδόρια σχηματίζονται όγκοι μεταμοσχεύτηκαν σε στενή απόσταση από το πάγκρεας του CB-17 /IcrHsd-

Prkcd

SCID Lyst

bg

ποντίκια. PaCa-44, PANC-1, BxPC-3 και Capan-2 κύτταρα αναπτύχθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς (ε.π.) σε όλα τα ζώα. ΜΙΑ PaCa-2 ανάπτυξης όγκου βρέθηκε ε.π. σε τρία από τα πέντε ζώα (Πίνακας 2). Αν και τεμάχια όγκου Hs-766T εμφυτεύθηκαν επανειλημμένα ip, δεν παρατηρήθηκε σχηματισμός όγκου (Πίνακας 2), αν και εκ νέου ανάλυση των εμφυτευμένων τεμαχίων επιβεβαίωσε βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Πάνω από τα δύο τρίτα του PACA-44, PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και BxPC-3 όγκους διεισδύσει το πάγκρεας. Ωστόσο, οι υπολειμματικές όγκοι είχαν σχέση με το κοιλιακό τοίχωμα, αντί να παγκρέατος (Πίνακας 2). Από τα Capan-2 όγκων, μόνο ένας διεισδύσει το πάγκρεας, ενώ οι άλλοι συνδέονται με το σπλήνα ή στο κοιλιακό τοίχωμα χωρίς να δείχνει διείσδυσης (Πίνακας 2). Σε αντίθεση με τον άλλο τύπο κυττάρου, Hs-766T προέρχονται όγκοι δεν προσκολλήθηκαν σε οποιοδήποτε όργανο καθόλου και βρέθηκαν βρίσκεται χαλαρά στην κοιλιακή χώρα.

Tumor Pathology

Οι όγκοι όλων των ορθοτοπικά αυξανόμενη κυτταρικές σειρές καθώς και η υποδόρια αυξανόμενη κυτταρική γραμμή Hs-766T αναλύθηκαν ιστολογικά. Ανάλυση της σχεδόν όλα τα μοντέλα ορθοτοπικό όγκο αποκάλυψαν εστιακό εισβολή των autochtonic παγκρέατος από ένα στερεό αναπλαστικό καρκίνωμα, εκτός από το μοντέλο BxPC-3 όγκου τα οποία έδειξαν διαδίδονται σωληνοειδές διαφοροποίηση και Capan-2 κύτταρα τα οποία αναπτύχθηκαν ως αδενοκαρκίνωμα πορογενές. PANC-1, BxPC-3 και Capan-2 όγκους παρουσίασαν μικρή κυτταρική και πυρηνική πλειομορφισμό και έγιναν από μεγάλα κύτταρα με άφθονο ωχρό κυτταρόπλασμα και μεγάλο πυρήνες (PANC-1, Capan-2) ή μικρά, στρογγυλά κύτταρα με πυκνή πυρήνες ( BxPC-3). PaCa-44 και ΜΙΑ PaCa-2 όγκων, αντίθετα, είχε εξέχουσα κυτταρική και πυρηνική pleomorphisms. ΜΙΑ PaCa-2 όγκους αποτελούνταν κυρίως από μικρά, στρογγυλά προς ατρακτοειδή κύτταρα με πυκνή πυρήνες εκτός μεγάλα κύτταρα αποκαλύπτοντας υπερ-ηωσινοφιλικό κυτταροπλασματική ζώνες τυπικά για κυψελιδικά κύτταρα, ενώ PaCa-44 όγκους αποκάλυψαν μεγάλο, κυτόπλασμα πλούσια σε κύτταρα με μεγάλους πυρήνες. Εκτός Capan-2 και BxPC-3 καρκινικά κύτταρα τα οποία είχαν μόνο ένα μέτριο ρυθμό της μίτωσης, κύτταρα όλων των άλλων όγκων έδειξαν μία εξαιρετικά αυξημένη μιτωτική δραστηριότητα δείχνει την υψηλή κακοήθεια αυτών των όγκων. Επιπλέον, σε PANC-1, μπορεί να παρατηρηθεί ΜΙΑ PaCa-2 και οι όγκοι BxPC3 μεγάλες περιοχές υφίστανται νέκρωση – μια περαιτέρω χαρακτηριστικό γνώρισμα της υψηλής κακοηθών όγκων. Στο σύνολό τους, σχεδόν όλοι οι όγκοι αποκάλυψαν ένα υψηλό βαθμό αποδιαφοροποίηση, με μόνο Capan-2 όγκων, καθώς και σε ορισμένες περιοχές της BxPC-3 όγκους υπολειμματική τυπικά χαρακτηριστικά του αδενικού προέλευση των όγκων είναι ανιχνεύσιμα.

Μόνο λίγο λεμφοκυτταρική και ουδετεροφιλική διήθηση του όγκου-γειτονικό ιστό, όπως λιπώδη και ινώδη ιστό και το autochtonic παγκρέατος, ανιχνεύθηκε στο PANC-1, PaCa-44, BxPC-3, ΜΙΑ PaCa-2, και Capan-2 μοντέλα με επιπλέον λεμφοκυτταρική διήθηση στο ίδιο το PaCa-44 ιστό του όγκου (Σχ. 2Α). Επιπλέον, παρατηρήθηκε διάχυτη μέτρια ουδετερόφιλων εισβολή του συνόλου ΜΙΑ PaCa-2 που προέρχεται όγκους με εστιακές περιοχές της colliquation (Εικ. 2Α). Ως orthotopical εμφύτευση των τεμαχίων όγκου Hs-766T δεν είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη του όγκου, το ανάλογο υποδόριο μοντέλο ήταν ιστολογικά αναλύθηκε αποκαλύπτοντας ένα στερεό αναπλαστικό καρκίνωμα με εξέχοντα κυτταρική και πυρηνική pleomorphisms, που αποτελούνται κυρίως από μικρά, στρογγυλά προς ατρακτοειδή κύτταρα με πυκνή πυρήνες, υψηλή μιτωτική δραστηριότητα, και μεγάλες περιοχές του νεκρωτικού ιστού όγκου (Σχ. 2Α). Ευρεία υποκαταστήματα ινώδους ιστού ήταν ανιχνεύσιμα στην περιφέρεια των όγκων, αλλά και διαδίδονται δίπλα σε ομάδες των καρκινικών κυττάρων in BxPC-3, Capan-2 και PaCa-44 όγκους? σε PaCa-44 όγκους ίνωση συνοδευόταν από ανώριμα λευκοκύτταρα διηθήσεις.

(2Α) Τμήματα των παγκρεατικών όγκων που προέρχονται από τα υποδεικνυόμενα παγκρεατικών κυτταρικές γραμμές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Το δείγμα HS-766T αποκόπηκε από έναν υποδόριο όγκο? Όλα τα άλλα δείγματα πάρθηκαν από ορθοτοπικά καλλιεργούνται όγκους. (2Β) διαφόρων τμημάτων του BxPC-3 που προέρχεται από όγκο υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστολογική ανάλυση με αντισώματα έναντι Μουκίνη-1 (MUC-1), παν-κυτοκερατίνης (Pan-CK), και α-λείου μυός ακτίνη (SMA). Η μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει ένα μήκος 53 μm, εκτός από την αντι-MUC-1 χρώση (27 μm).

Η

χρώση PAS διεξήχθη για να προσδιορίσει τις δομές των όγκων που προέρχονται από αγωγούς και /ή acini. Σε Capan-2 και BxPC-3 όγκους 40% και 25% των καρκινικών κυττάρων ήταν θετικά για PAS, αντίστοιχα. Όλες οι άλλες όγκους, με την εξαίρεση της ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1, το οποίο παρέμεινε εντελώς αρνητικό, αποκάλυψε μόνο ένα οριακό αριθμό των PAS-χρωματισμένων κυττάρων – πιθανότατα λόγω της πιο αποδιαφοροποιημένα κατάστασή τους (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)

.

η ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση των πρωτεϊνών MUC-1, που εκφράζεται από τα περισσότερα αδενικό και επιθηλιακά κύτταρα του πόρου, οδήγησε σε διακριτή επισήμανση σχεδόν ολόκληρης της μάζας του όγκου στο PaCa-44, PANC-1, BxPC-3 (Σχ . 2Β) και Capan-2 μοντέλα ορθοτοπική όγκου και περίπου 75% της ΜΙΑ PaCa-2 όγκων. Σε σύγκριση με τις ανοσολογικές σήματα που παρατηρούνται εντός των κανονικών ανθρώπινων παγκρέατος, όπου καφετί επισήμανση βρέθηκε εντός του κυτταροπλάσματος του acini και επιθηλιακά κύτταρα του πόρου, τα προφίλ έκφρασης αυτών των όγκων είναι ενδεικτικές για acinar τους και πόρου προέλευσης. Αν και σπανίως histomorphology μοιάζει autochtonic παγκρέατος ιστού, σύμφωνα με τα προφίλ χρώσης που αναφέρθηκαν παραπάνω, οι εν λόγω όγκοι είναι αναγνωρίσιμα ως αδενοκαρκίνωμα του πόρου προέλευσης, η οποία αντιπροσωπεύει το 85% έως 90% όλων των όγκων του παγκρέατος [29], [30]. Ωστόσο, σύμφωνα με την ΠΟΥ ταξινόμηση, η οποία αναγνωρίζει διάφορες παραλλαγές εκτός από την κλασική tubuloglandular πόρου αδενοκαρκίνωμα [30], το σύνολο σχεδόν των ορθοτοπική όγκων αντιστοιχούν στην παραλλαγή αναπλαστικό καρκίνωμα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ανίχνευση IHC του κυτοκερατίνες (CK) 1-8, 10, 14-16 und 19 χρησιμοποιώντας αντίσωμα Pan-CK είχε σαν αποτέλεσμα ανοσολογική επισήμανση ολόκληρης όγκου συσταθεί με κύτταρα Capan-2 PaCa-44, BxPC-3 και αλλά σε μόνο 60% και 40% προετοιμασμένα κύτταρα σε ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 όγκων, αντίστοιχα. Όπως Pan-CK κυρίως χρωματισμένο σωληνοειδές /πορογενές δομές των φυσιολογικό ανθρώπινο πάγκρεας, η μειωμένη ανοσοσήμανση σε ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 σε σύγκριση με τους άλλους όγκους μπορεί να υποδηλώνουν μια πιο κυψελοειδή προέλευση των όγκων αυτών, ή, κυρίως στην περίπτωση μΙΑ PaCa-2, η οποία εξέφρασε επίσης MUC-1 σε μόνο το 75% των κυττάρων του όγκου, το πρότυπο έκφρασης μπορεί να είναι ενδεικτική ενός μεγαλύτερου βαθμού κακοήθειας, η οποία υποστηρίζεται από την ιστολογική εμφάνιση αυτού του όγκου με μεγάλες περιοχές νέκρωσης, ουδετερόφιλα colliquation και ένα υψηλό μιτωτικό ρυθμό. Τα σήματα που λαμβάνονται από την ανάλυση της ικανότητας των παν-CK και MUC-1 αντισώματα να συνδεθούν με τις κυτταρικές γραμμές ήταν ανομοιογενή και ασυνεπής, γεγονός που περιπλέκει την ερμηνεία των δεδομένων.

Εν περιλήψει, σύμφωνα με την ιστολογική εμφάνιση τους, το πρότυπο PAS-χρώση, και τα προφίλ έκφρασης για PANC-1 κυτταρικές σειρές MUC-1 και Pan-CK, ΜΙΑ PaCa-2 και έδωσε αφορμή για τις πιο αποδιαφοροποιημένα όγκοι αυτής της μελέτης? Ωστόσο, κατηγορηματική ομοιότητα με υγιή ανθρώπινο πάγκρεας δόθηκε σε κανένα από τους όγκους, όπως, με την εξαίρεση της μικρής σωληνοειδούς περιοχή στην Capan-2, ακόμη και οι μη-αναπλαστικό όγκους έδειξε ένα στερεό, μη-αδενικά πρότυπο ανάπτυξης.

Χρήση αντι-SMA, πολυάριθμα βαθιά καφετί χρωματισμένο κυτταρόπλασμα πλούσια στρωματικά κύτταρα γειτονικά καρκινικά κύτταρα βρέθηκαν σε όλη τους όγκους όλων των κυτταρικών γραμμών? φυσιολογικό πάγκρεας παρέμεινε αρνητική (Σχ. 2). Διακριτή ίνωση συνοδεύονται τα ΚΕΕ, οι περισσότεροι προφανώς BxPC-3, Capan-2 και PaCa-44 όγκους. χρώση GFAP αποκάλυψε θετική ανοσοχρώση μόνο ΜΙΑ PaCa-2 όγκων, που εκπροσωπεί την ένδειξη διαδικασίες αστεροειδής κυττάρων γύρω από την παγκρεατική acini. Έτσι, καθώς ενεργοποιούνται ΚΕΕ γνωστό ότι είναι η αρχή δραστικά κύτταρα σε ίνωση, η οποία είναι μια συνεπής παθολογικό χαρακτηριστικό στην ανθρώπινη παγκρεατικού καρκίνου [31], [32], [33], και την διατάραξη της δεσμοπλαστικό στρώμα όγκου ενισχύει τη χορήγηση και την αποτελεσματικότητα των αντι -tumor φάρμακα [33]. BxPC-3, Capan-2, και PaCa-4 κύτταρα αντιπροσωπεύουν τα πλέον ελπιδοφόρα μοντέλα όγκου για τις μελέτες σχετικά με την αναστολή της ινογένεσης στο ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος.

Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι, με τη χρησιμοποίηση διαφορετικών παγκρεατικών κυτταρικών γραμμών σε ένα ορθοτοπική ρύθμιση, θα μπορούσε να δημιουργηθεί ένα ευρύ φάσμα ετερόλογη τύπους παγκρεατικών όγκων που χρησιμεύει ως μοντέλο για διάφορες θεραπευτικές εφαρμογές στη θεραπεία πάγκρεας όγκου. Προηγούμενες μελέτες σε ποντίκια SCID αποκάλυψε ότι s.c. εμφυτευθεί όγκοι εμφανίζονται μόνο σπάνια μετάσταση [16]. Στη μελέτη μας, τα ποντίκια κρατήθηκαν για μέχρι 18 εβδομάδες μετά την έναρξη έναρξη Capan-2 και BxPC-3 όγκου, 13 και 10 εβδομάδες μετά ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 έναρξης του καρκίνου, αντίστοιχα, και 4 εβδομάδες μετά PaCa-44 όγκου και το ακαθάριστο αναλύσεις των οργάνων του ποντικιού δείχνουν ότι κανένα από τα καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε τοπικό ή άπω μεταστάσεις, είτε μετά από sc ή ορθοτοπική μεταμόσχευση. Σε αντίθεση, Tseng και συνεργάτες διαπίστωσαν πρόσφατα μεταστάσεις ήπατος σε Β6 /129 ποντικούς κατά 6 έως 8 εβδομάδες μετά την εμφύτευση κυτταρικών γραμμών από ηπατικές μεταστάσεις που λαμβάνονται από K-ras (G12D /+), LSL-Trp53 (R172H /+) και PDX-1 -Cre ποντικούς [34]. Όπως σε ανθρώπους, οι περισσότεροι αν όχι όλοι οι καρκινώματα παγκρέατος δείχνουν τοπικό και απομακρυσμένο μετάσταση την πάροδο του χρόνου, η έλλειψη των μεταστατικών τάση πρέπει να ληφθεί υπόψη κατά τον καθορισμό μιας δοκιμαστικής αποτελεσματικότητα του φαρμάκου με τις εν λόγω κυτταρικές σειρές όγκων.

Εκτός in vivo μοντέλα που φέρουν ξενομοσχεύματα ανθρώπινου κυττάρου, πρόσφατα, γενετικά μοντέλα ποντικών του καρκίνου του παγκρέατος έχει τεκμηριωθεί (για ανασκόπηση βλέπε [19], [35]). Δεδομένου ότι αυτά τα συστήματα μοντέλο που βασίζεται σε ενιαίο γενετικές τροποποιήσεις, αυτές είναι πολύτιμα εργαλεία για τη μελέτη της επίδρασης αυτών των γενετικών αλλοιώσεων ή των οδών σηματοδότησης και μόνο για την ανάπτυξη του όγκου [19]. Ωστόσο, αυτά είναι λιγότερο κατάλληλα για την αξιολόγηση νέων θεραπευτικών εννοιών για παγκρεατικό θεραπεία του καρκίνου. Αντ ‘αυτού, το μοντέλο συστήματα όπως ορθοτοπικά αυξανόμενη ανθρώπινους όγκους ξενομοσχευμάτων είναι πολύ καλύτερα προσαρμοσμένες ως μοιάζουν, λόγω της προέλευσης της ανθρώπινης παγκρεατικών όγκων, την τρέχουσα κατάσταση και την ετερογένεια της ανθρώπινης ασθένειας.

Αποαμινάσης Κυτοσίνης μεσολάβηση Ευαισθησία ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρικές γραμμές Για 5-φθοροκυτοσίνη

Για να μελετηθεί συγκριτικά το δυναμικό θανάτωσης του συστήματος /5-FC απαμινάση κυτοσίνης σε παγκρεατικά καρκινικά μοντέλα μας, κάθε μία από τις έξι κυτταρικές γραμμές όγκου σταθερώς μολυσμένα

in vitro

με τον φορέα ρετροϊού PCCDWmCMVpuro, που φέρει το γονίδιο κυτοσιν-δεαμινάσης ζύμης (CD) υπό τον μεταγραφικό έλεγχο του πανταχού κυτταρομεγαλοϊού ποντικού (CMV) [36]. Το CD μαγιά επιτρέπει τη μετατροπή του μη τοξικού προφαρμάκου 5-φθοροκυτοσίνη (5-FC) στο εξαιρετικά τοξικό χημειοθεραπευτικό παράγοντα 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και ως εκ τούτου, μετά την ενσωμάτωση εντός των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, η έκφραση του θα πρέπει να επιτρέπει προτιμησιακή όγκου εξάντληση των κυττάρων κατά τη χορήγηση 5-FC.

Για την επιβεβαίωση της μεταγραφής CD μετά την μεταγωγή ρετροϊού, RT-PCR πραγματοποιήθηκε από κυτταρολύματα μεταχθέντα κύτταρα καθώς και από μη-μετατραπέντα κύτταρα. Το θραύσμα γονιδίου CD ~480 bp ήταν σαφώς ανιχνεύθηκε σε κύτταρα που μετατρέπονται με τον φορέα PCCDWmCMVpuro (Εικ. 3), αλλά απουσίαζε σε μη-μολυσμένα κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν σωστής ενσωμάτωσης φορέα και συγκρίσιμη έκφραση του διαγονιδίου CD σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 3).

Το συνολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε από υποδεικνύεται κυτταρικές σειρές και mRNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας oligo (dT) εναρκτήρες. CD- καθώς και την Autism Speaks-ειδικά γονιδιακά θραύσματα ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές και διαχωρίστηκαν σε μια γέλη αγαρόζης που δείχνει τα αναμενόμενα μεγέθη ~480 bp για CD και ~350 bp για GAPDH. Η ποσότητα cDNA που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση PCR ρυθμίστηκε για να αποδώσει συγκρίσιμες ποσότητες του θραύσματος γονιδίου GAPDH.

Η

Για να αξιολογηθεί αυτή η στρατηγική GDEPT για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων

in vitro

, προσδιορίσαμε το LD

50 μετά την χορήγηση του προφαρμάκου 5-FC της ανθρώπινης παγκρεατικής κυτταρικές γραμμές όγκου προηγουμένως μεταγωγή με PCCDWmCMVpuro. Σε σύγκριση με μη μεταδιηγερμένα κύτταρα που δεν ήταν αποκριτικά σε 5-FC (& gt? 1.000 μg /ml), η LD

50 μειώθηκε κατά 16 φορές κατά μέσο όρο σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Πίνακας 3). Αυτή επιφανείς αύξηση της ευαισθησίας 5-FC δείχνει ότι η έκφραση του CD με επιτυχία η μετατροπή του προφαρμάκου 5-FC προς την τοξική 5-FU σε όλες υποστεί μεταγωγή κυτταρικές γραμμές όγκου του παγκρέατος. Είναι ενδιαφέρον ότι η CD κυτταρική γραμμή που εκφράζει BxPc-3 ήταν μέχρι 30 φορές πιο ευαίσθητα σε 5-FC συγκριτικά με μεταδιηγερμένα κύτταρα HS-766T. Για να αναλυθεί αν αυτή η διαφορά στην ευαισθησία είναι ανεξάρτητη της έκφρασης CD, τόσο μη επεξεργασμένα και μεταγωγή του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές άμεσα επωάστηκαν με τοξικά 5-FU. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ευαισθησία όλων των κυτταρικών σειρών σε 5-FU ήταν ανεξάρτητη από μεταγωγή με φορέα PCCDWmCMVpuro. Ωστόσο, σύμφωνα προς 5-FC αποτελέσματα της θεραπείας, BxPC-3 κύτταρα ήταν περίπου 30 φορές πιο ευαίσθητα σε 5-FU από κύτταρα HS-766T (Πίνακας 3), υποδεικνύοντας ότι οι δοκιμαζόμενες παγκρεατικών κυτταρικών γραμμών έχουν διαφορετική ευαισθησία στο τοξικό φάρμακο

per se

. Σύμφωνα με κλινικές μελέτες που χρησιμοποιούν 5-FC, οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα σε ασθενείς φθάνοντας επίπεδα 50-125 μg /ml 5-FC μετά από του στόματος χορήγηση 150 mg 5-FC ανά kg σωματικού βάρους [37], [38], [39] . Ωστόσο, οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα πάνω από 100 μg /ml θεωρούνται συχνά ως τοξική για τον ασθενή [39]. Από την άποψη αυτή, η θεραπεία με τον φορέα PCCDWmCMVpuro αφέθηκε τέσσερις από έξι κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν για να ανταποκριθεί σε 5-FC συγκεντρώσεις κάτω των 100 μg /ml, υποδεικνύοντας ότι GDEPT μπορεί να επιτρέψει μια αποτελεσματική θεραπεία όγκων σε δόσεις προφαρμάκου κάτω από τα επίπεδα των μη-ειδικής τοξικότητας.

Η

κυτοχρώματος P450 Θανάτωση ανθρώπινης παγκρεατικής γραμμών όγκου κυττάρων

Η χρήση του ιφοσφαμιδίου χημειοθεραπευτικού παράγοντα για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος έχει περιγραφεί σε διάφορες μελέτες [40], [ ,,,0],41], [42], [43], [44]. Η ιφωσφαμίδη προφάρμακο μετατρέπεται σε φωσφοραμιδίου μουστάρδα από το κυτόχρωμα Ρ450. Φωσφοραμιδίου μουστάρδα καθιστά DNA διαιρούμενων κυττάρων δυσλειτουργικών μέσω αλκυλίωσης, η οποία είναι η βάση για την εκλεκτικότητα του για διαιρούμενα κύτταρα όπως περιλαμβάνεται σε ταχέως αναπτυσσόμενους όγκους. Δυστυχώς, όπως το κυτόχρωμα Ρ450 είναι κατά κύριο λόγο παράγεται στο ήπαρ, την τοξικότητα του μεταβολίτη ιφωσφαμίδη είναι μάλλον συστημική και όχι όγκου-ειδικά. Για την ενίσχυση της τοξικότητας όγκου-ειδικά σε συγκριτική μοντέλο πάγκρεας όγκου μας, χρησιμοποιήσαμε το φορέα ρετροϊού που στεγάζει το PCCWmCMV Ρ450 2Β1 (CYP2B1) γονίδιο cytochrome αρουραίου για σταθερή μεταγωγή των παγκρεατικών κυτταρικών σειρών.

Για την παρακολούθηση της έκφρασης του CYP2B1 μετά μεταγωγή, έχουν αναλύσεις κηλίδος Western έχουν διεξαχθεί με προϊόντα λύσης πρωτεΐνης μεταγωγή και μη μετατραπέντα κύτταρα. έκφραση CYP2B1 ανιχνεύθηκε μόνο σε κύτταρα προηγουμένως μεταγωγή με το ρετροϊικό φορέα (Εικ. 4). Η κυτταρική γραμμή BxPC-3 αποκάλυψε μόνο ελάσσονα επίπεδα έκφρασης του CYP2B1. Για την αξιολόγηση της ευαισθησίας των CYP2B1 εκφράζουν παγκρεατικού καρκινικές κυτταρικές σειρές BxPC-3, ΜΙΑ PaCa-2, Hs-766T, PaCa-44 και PANC-1 προς ιφοσφαμίδη, η LD

50 προσδιορίστηκε σε σύγκριση με μη μεταδιηγερμένα κύτταρα. Η μη ειδική τοξικότητα του προφαρμάκου ιφωσφαμίδη σε μη μετασχηματισμένων γραμμών κυττάρων ποικίλουν σημαντικά και κυμαίνονται από 0,18 (κύτταρα HS-766T) mm έως 2 mm (κύτταρα PANC-1) LD

50 τιμές (Πίνακας 4). Η έκφραση του διαγονιδίου CYP2B1 οδήγησε σε μια έως και 13-φορές αυξημένη ευαισθησία σε ιφοσφαμίδη σε τέσσερις από τις πέντε κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Πίνακας. 4). Μόνο κύτταρα HS-766T, το οποίο ήταν πιο ευαίσθητα σε ιφοσφαμίδης

per se

, δεν έδειξε αυξημένη ευαισθησία σε ιφοσφαμίδη παρά την έκφραση του γονιδίου CYP2B1.

Σύνολο κυτταρολύματα από 8 × 10

5 κύτταρα διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% υπό μετουσιωτικές συνθήκες. Μετά την κηλίδωση, πρωτεΐνη CYP2B1 ανιχνεύθηκε με CYP-ειδικό αντίσωμα.

Η

Οι μελέτες σχετικά με τη σκοπιμότητα της in vivo GDEPT για τον καρκίνο του παγκρέατος έχουν ήδη πραγματοποιηθεί στο παρελθόν [44], [45], [46], [47], [48]. Δείξαμε ότι ενθυλακωμένα κύτταρα γενετικώς τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν το γονίδιο του κυτοχρώματος Ρ450 αυτοκτονίας εμφυτεύονται σε ποντικούς στην περιοχή των όγκων που προέρχονται από PaCa 44 κύτταρα είναι ικανά να προκαλέσουν μείωση του όγκου, όταν το κατάλληλο προφάρμακο που ενεργοποιείται από το κυτόχρωμα Ρ450 δίνεται [45] , [46]. Επιπλέον, έχουμε χρησιμοποιήσει αυτά τα έγκλειστα κύτταρα σε μια κλινική δοκιμή σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος και ήταν σε θέση να αποδείξει ότι η μέση επιβίωση αυτής της ομάδας ασθενών διπλασιάστηκε [44], [47].

Στο σύνολό τους, Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι μια τέτοια GDEPT προσεγγίσεων για την θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος είναι ελπιδοφόρες. Ωστόσο, τέτοιες νέες θεραπείες θα πρέπει να δοκιμαστεί σε περισσότερα από ένα σχετικό σύστημα ζωικού μοντέλου που μοιάζει με το χαρακτηριστικό των αντίστοιχων όγκων όσο το δυνατόν περισσότερο. Αυτό δείχνει σαφώς ότι υπάρχει επείγουσα ανάγκη για περαιτέρω χαρακτηρισμό των ζωικών μοντέλων επιλογής, όπως έχουμε δείξει σε αυτή τη μελέτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ζώα αντιμετωπίζονται σε αυστηρή συμφωνία με την ορθή πρακτική των ζώων. εργασία ζώο εγκρίθηκε από τη συμβουλευτική επιτροπή για τα πειράματα σε ζώα του Ομοσπονδιακού Υπουργείου Παιδείας, Επιστημών και Πολιτισμού, σύμφωνα με το αυστριακό ομοσπονδιακό νόμο των πειραμάτων σε ζώα (BGBl Νο 501/1988, BGBl I αριθ 169/1999, και BGBl I αριθ . 136/2001) και μια άδεια για δοκιμές σε ζώα εκδόθηκε ειδικά για αυτή τη μελέτη (GZ 68.205 /177-BrGT /2003). Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων. Χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκαν υπό γενική αναισθησία. Τα ζώα θανατώθηκαν πριν ο όγκος φτάσει σε ένα ψηλαφητό μέγεθος 1500 mm

3.

πλασμίδια

Η ακολουθία κωδικοποίησης του γονιδίου κυτοσιν-δεαμινάσης (CD, GenBank αριθμός πρόσβασης Νο. U55193, pos. 183-659) από

Saccharomyces cerevisiae

ενισχύθηκε με PCR από το γενομικό ΟΝΑ ζυμομύκητα (Sigma) και στη συνέχεια εισάγεται στη κλωνοποίησης pCR-XL-ΤΟΡΟ φορέα (Invitrogen) με αποτέλεσμα το πλασμίδιο pYCD. Στη συνέχεια, το cDNA απαμινάση κυτοσίνης απελευθερώθηκε από το πλασμίδιο μέσω ενός pYCD

EcoR

Ι πέψη περιορισμού και συνδέθηκε με το 7.7 kb

EcoR

Ι-θραύσμα του πλασμιδίου pPCEWmCMVpuro κωδικοποιεί ένα MLV που βασίζεται ρετροϊικό φορέα [ ,,,0],36]. Το πλασμίδιο που προέκυψε ονομάστηκε pPCCDWmCMVpuro. Η κωδικοποιητική αλληλουχία του γονιδίου του κυτοχρώματος Ρ450 αρουραίου 2Β1 (CYP2B1) ενισχύθηκε με PCR από το πλασμίδιο pc3 /2Β1 [47] χρησιμοποιώντας εκκινητές Age-CYP (5′-GCGTACCGGTCCACCATGGAGCCCAGTATCTTGC-3 ‘) και CYP-Μη (5′-AAGCGGCCGCTATCACCGAGCTGAGAAGCAG-3’ ) που φιλοξενούν

Age

Ι και

Δεν

Ι ειδικές θέσεις περιορισμού, αντίστοιχα, και κλωνοποιήθηκε εντός του μεγάλου

Ηλικία

I-

Δεν

Ι θραύσμα του ρετροϊικός φορέας πλασμίδιο pPCEmCMV [36]. Το πλασμίδιο που προέκυψε ονομάστηκε pPCCmCMV. Για τη δημιουργία του πλασμιδίου pPCCWmCMV, ο ιός της ηπατίτιδας μαρμότας μετα-μεταγραφικό ρυθμιστικό στοιχείο (WPRE) απελευθερώθηκε από το πλασμίδιο pPCEWmCMV με αφομοίωση περιορισμού με

Δεν

Ι και εισάγεται εντός του

Δεν

Ι-γραμμικό φορέα pPCCmCMV [36 ].

κυτταρικές γραμμές

Αμφοτροπικά κύτταρα συσκευασίας ρετροϊικό με βάση την ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή ΗΕΚ293 [49], ανθρώπινη παγκρεατική καρκινικές κυτταρικές σειρές PANC-1 (ATCC CRL-1469), PaCa- 44 [22], ΜΙΑ PaCa-2 (ATCC CRL-1420), και Hs-766T (ATCC ΗΤΒ-134) αναπτύχθηκαν σε Dulbeccos τροποποιημένο μέσο Eagles (DMEM /Glutamax? Life Technologies) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS , Life Technologies). Ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρικές γραμμές όγκου BxPC-3 (ATCC CRL-1687) και Capan-2 (ATCC ΗΤΒ-80) καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI (Life Technologies) συμπληρωμένο με 10% FCS και γλουταμίνη και μεσαίου McCoys (Life Technologies) συμπληρωμένο με 10 % FCS, αντίστοιχα. κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 (ATCC CRL-1658) διατηρήθηκαν σε DMEM /Glutamax συμπληρωμένο με 5% FCS.

παραγωγή του ιού και την παραγωγή σταθερά μολυσμένα κύτταρα

Η μέθοδος συν-καταβύθισης φωσφορικού ασβεστίου χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργία κυττάρων που σταθερά παράγουν ιό [50]. Εν συντομία, 7 χ 10

5 ρετροϊικών κυττάρων συσκευασίας ΗΕΚ293 βάση [49] επιμολύνθηκαν σε ένα πλακίδιο 6 φρεάτων με 3,0 μg του πλασμιδίου pPCCDWmCMVpuro και pPCCWmCMV, αντίστοιχα. 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και επιλέγονται σε DMEM που περιέχει είτε 0,6 μg /ml πουρομυκίνη (Sigma) για pPCCDWmCMVpuro επιμολυσμένα κύτταρα ή 400 μg /ml Geneticin (Gibco) για pPCCWmCMV επιμολυσμένα κύτταρα μέχρι σχηματίστηκαν αποικίες μόνο κύτταρο. Επιλεγμένα κύτταρα επεκτάθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα.