Αφηρημένο

Bmi1 υπερεκφράζεται σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του γαστρεντερικού. Το υψηλό επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης Bmi1 σχετίζεται με κακή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του γαστρεντερικού. Από την άλλη πλευρά, τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) συμβάλλουν στην ανάπτυξη του όγκου, εισβολή, και μετάσταση από την παραγωγή διαφόρων μεσολαβητών στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει ΤΑΜ μεσολάβηση ρύθμιση της έκφρασης Bmi1 στον καρκίνο του γαστρεντερικού. Η σχέση μεταξύ ΤΑΜ και έκφραση Bmi1 αναλύθηκε με ανοσοϊστοχημεία και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR), και τα αποτελέσματα έδειξαν μια θετική συσχέτιση με μακροφάγα που διηθούν όγκο (CD68 και CD163) και έκφραση Bmi1 σε καρκινικά κύτταρα. Συγκαλλιέργεια με ΤΑΜ προκάλεσε έκφραση Bmi1 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου και αυξημένη ικανότητα σχηματισμού σφαίρας. miRNA ανάλυση μικροσυστοιχιών του γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή συν-καλλιεργημένα με μακροφάγα διεξήχθη, και χρησιμοποιώντας το

in silico

μεθόδους για την ανάλυση των αποτελεσμάτων, εντοπίσαμε miR-30e * ως πιθανή ρυθμιστής της έκφρασης Bmi1. δοκιμασίες λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας miR-30e * μιμούνται αποκάλυψε ότι Bmi1 ήταν άμεσο στόχο για miR-30e * από τις αλληλεπιδράσεις με το υποτιθέμενο miR-30e * θέσεις δέσμευσης στη μη μεταφραζόμενη περιοχή Bmi1 3 ‘. ανάλυση qRT-PCR εκτομή δειγμάτων καρκίνου έδειξαν ότι miR-30e * έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε περιοχές του όγκου σε σύγκριση με περιοχές μη-όγκου, και η έκφραση Bmi1 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με miR-30e * έκφραση σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς, αλλά όχι στο παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς . Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η ΤΑΜ μπορεί να προκαλέσει αυξημένη έκφραση Bmi1 μέσω miR-30e * καταστολής, οδηγώντας στην εξέλιξη του όγκου. Η καταστολή της έκφρασης Bmi1 διαμεσολαβείται από ΤΑΜ μπορεί επομένως να αντιπροσωπεύουν μια πιθανή στρατηγική ως θεραπεία του καρκίνου του γαστρεντερικού

Παράθεση:. Sugihara Η Ishimoto Τ, Watanabe Μ, γαηια Η, Iwatsuki Μ, Baba Y, et al. (2013) Ταυτοποίηση των miR-30e * Κανονισμός της Bmi1 έκφρασης διαμεσολαβείται από σχετίζονται με τον όγκο μακροφάγα στον Καρκίνο του γαστρεντερικού συστήματος. PLoS ONE 8 (11): e81839. doi: 10.1371 /journal.pone.0081839

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 4 Ιουλίου του 2013? Αποδεκτές: 17 Οκτωβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Σουγκιχάρα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Ταμείο Okukubo Memorial Ιατρικής Έρευνας στο Kumamoto Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου, Ιατρικής Έρευνας Βραβείο Ενθάρρυνση της Ιαπωνίας Ιατρικού Συλλόγου και της Ιαπωνίας Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs) Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (σε TI). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Bmi1 είναι μέλος του συγκροτήματος Polycomb-κατασταλτικό 1 με έναν ουσιαστικό ρόλο στη διατήρηση της χρωματίνης αποσιώπηση [1,2]. Bmi1 παίζει μια λειτουργία στην αυτο-ανανέωση των νευρωνικών και αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων μέσω καταστολής της ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ τόπο [3-6]. Επιπλέον, Bmi1 εκφράζεται στα εντερικά βλαστοκύτταρα και εμπλέκονται στη διατήρηση της μικρό έντερο επιθήλιο [7]. Bmi1 αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως ένα ογκογονίδιο που συνεργάζεται με c-myc διάρκεια lymphomagenesis ποντίκι, και υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του γαστρεντερικού [8-10]. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης Bmi1 σχετίζεται με κακή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του γαστρεντερικού [9,10]. Ωστόσο, ο μηχανισμός που υπογραμμίζει ρύθμιση Bmi1 σε καρκινικά κύτταρα είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

Συμπαγείς όγκοι αποτελούνται από καρκινικά κύτταρα και διάφορους τύπους στρωματικών κυττάρων, ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα και τα αιμοποιητικά κύτταρα, κυρίως μακροφάγα και λεμφοκύτταρα. Τα μακροφάγα έχουν λειτουργικές πλαστικότητα και περιγράφονται από δύο διακριτές καταστάσεις πόλωσης: κλασικό ενεργοποιημένα (Μ1) και εναλλακτικά ενεργοποιημένης (Μ2) φαινοτύπους μακροφάγων. Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι Μ1 και Μ2-πολωμένο μακροφάγα παίζουν διαφορετικούς λειτουργικούς ρόλους στο μικροπεριβάλλον του όγκου [11,12]. Μ1-πολωμένο μακροφάγα έχουν γενικά αντιγονοπαρουσιαστικά λειτουργίες και αντικαρκινική δράση. Σε αντίθεση, Μ2-πολωμένο μακροφάγα παίζουν ένα ρόλο στην απόκριση σε παράσιτα, επούλωση πληγών, την αναδιαμόρφωση των ιστών, και την προώθηση της ανάπτυξης και αγγείωση των όγκων. Σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) συμβάλλουν στην ανάπτυξη του όγκου, εισβολή, και μετάσταση με την έκκριση διάφορους μεσολαβητές, οπότε προτάθηκε η ΤΑΜ ήταν κυρίως πολωμένο προς φαινότυπο μακροφάγου Μ2 [13-17]. Από την άλλη πλευρά, πιο πρόσφατες μελέτες απέδειξαν ότι τα μακροφάγα ήταν πολύ πλαστικό κύτταρα και επιγενετικές μεταβολές τους reprogramed ΤΑΜ από Μ2 σε Μ1-φαινότυπο σε όγκους [17,18].

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μη-κωδικοποίησης RNAs (21-23 νουκλεοτίδια) που δεσμεύονται ατελώς με το 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) του mRNA που στόχο τους να καταστείλουν τη μετάφρασή τους. έχουν miRNAs έχουν βρεθεί να στοχεύουν διάφορα ογκογονίδια και καταστολείς των όγκων, και τις αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η απορρύθμιση των miRNAs εμπλέκεται στην παθογένεση πολλών μορφών καρκίνου [19,20].

Για να εξερευνήσετε την ρύθμιση της έκφρασης Bmi1 σε καρκινικά κύτταρα , εξετάσαμε μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Bmi1 στη γαστρεντερική καρκινικά κύτταρα και μακροφάγα που έχουν διεισδύσει στο μικροπεριβάλλον του όγκου, και διερευνήθηκε ο μηχανισμός βασίζεται η ρύθμιση της έκφρασης Bmi1. Εδώ έχουμε αποδείξει ότι το miR-30e * μεσολάβηση ΤΑΜ ρυθμίζει άμεσα την έκφραση Bmi1 στον καρκίνο του γαστρεντερικού.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και επεξεργασίας

Οι κυτταρικές σειρές AGS, NUGC4 , COLO201, και ΤΗΡ-1 καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS). κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν κάτω από 5% CO

2 στους 37 ° C σε τροποποιημένο μέσο μίγμα θρεπτικού Eagle του Dulbecco F-12 (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS. Οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources Τράπεζας Κυττάρων και Riken Bioresource Κέντρο Τράπεζας Κυττάρων.

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) και σκοράροντας

διαδικασίες επεξεργασίας των δειγμάτων και IHC έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],21]. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείσθηκε χρησιμοποιώντας 3% υπεροξειδίου του υδρογόνου. Οι τομές επωάστηκαν πρώτα με αραιωμένα αντισώματα, που ακολουθείται από επώαση με βιοτίνη-free horseradish υπεροξειδάση σημασμένο πολυμερούς από το σύστημα ανίχνευσης Envision Plus (Dako, Glostrup, Δανία). Θετικές αντιδράσεις έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας διαμινοβενζιδίνη διάλυμα, και με αιματοξυλίνη Meyer. Ως αρνητικός έλεγχος, πρωτογενή αντισώματα ποντικού χρησιμοποιήθηκαν και καμία θετική λεκέδες παρατηρήθηκαν. Όλα κηλίδωσης βαθμολογήθηκε ανεξάρτητα από δύο παθολόγους. Πυρηνική Bmi1 και κυτταροπλασματική CD68 και CD163 εκφράσεις ερμηνεύονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που δημοσιεύθηκαν στην προηγούμενη μελέτη. Για την πυρηνική Bmi1 και κυτταροπλασματική CD68 και CD163, εμείς σκόραρε τα θετικά χρώση αποτελέσματα σε κατηγορίες από το 0 έως 3+ ως εξής: 0, καμία χρώση? 1+, 1-25% του δείγματος βάφονται? 2+, 26-50%? και 3+, & gt? 50%. . Μία βαθμολογία 3+ θεωρήθηκε θετικό αποτέλεσμα IHC

Αντισώματα για IHC και ανοσοκηλίδωση αναλύσεις

Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση IHC: ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ειδικό για την ανθρώπινη Bmi1 ( 1: 100 αραίωση? Abcam, Cambridge, UK), ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ειδικό για το ανθρώπινο CD68 (αραίωση 1: 100? Dako, Glostrup, Denmark), και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ειδικό για το ανθρώπινο CD163 (αραίωση 1: 100? Novocastra, Newcastle, UK). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση ανοσοκηλίδος: ένα μονοκλωνικό αντισώματα ποντικού να Bmi1 (1: 1000), και ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού για την ανθρώπινη β-ακτίνη (1: 1000? Cell Signaling Technology).

RNA και miRNA απομόνωση

Ολικό RNA, συμπεριλαμβανομένων των miRNA, απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ένα mirVana miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion, Austin, ΤΧ, USA), και εκλούεται σε 100 μΙ διαλύματος θερμαίνεται έκλουσης, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. miRNAs εξήχθησαν από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί του γαστρεντερικού καρκίνου και συμφωνημένα γειτονικό φυσιολογικό γαστρεντερικό επιθήλιο τους χρησιμοποιώντας ένα RecoverAll Σύνολο Nucleic Acid Kit Μόνωση για FFPE (Ambion), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η καθαρότητα και η συγκέντρωση όλων των δειγμάτων RNA αξιολογήθηκαν με αναλογία απορρόφησης στα 260/280 nm, προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies, Rockland, DE, USA).

παρασκευή ΤΗΡ-1 μακροφάγου και συν-καλλιέργειας δοκιμασίας

ΤΗΡ-1 κύτταρα σπάρθηκαν στα ένθετα Transwell (3540, Corning) επί 6 φρεατίων (1 χ 10

6 κύτταρα /φρεάτιο). Για την παρασκευή του Μ1-πολωμένου ΤΗΡ-1 μακροφάγα, 320 ηΜ οξική μυριστική φορβόλη (ΡΜΑ) προστέθηκε σε ΤΗΡ-1 κύτταρα για 6 ώρες, που ακολουθείται από ΡΜΑ συν 20 ng /ml ιντερφερόνης (IFN) -γ και 100 ng /ml λιποπολυσακχαρίτη για τις ακόλουθες 18 ώρες. Για την παρασκευή του Μ2-πολωμένου μακροφάγων ΤΗΡ-1, 320 ηΜ ΡΜΑ προστέθηκαν σε κύτταρα ΤΗΡ-1 για 6 ώρες, που ακολουθείται από ΡΜΑ συν 20 ng /ml ιντερλευκίνης (IL) -4 /IL-13 για την επόμενη 18 ώρες. Μετά από τρεις πλύσεις για την απομάκρυνση κυτοκίνες, Μ1 ή Μ2-πολωμένο ΤΗΡ-1 μακροφάγα συν-καλλιεργήθηκαν σε άνω ένθετα με AGS ή κύτταρα HCT116 σε πλάκες 6-φρεατίων (1 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) χωρίς άμεση επαφή, σε κάθε μέσο χωρίς 10% FBS όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από 24 ώρες συν-καλλιέργειας, τα άνω ένθετα που περιέχουν μακροφάγα απορρίφθηκαν. AGS και τα κύτταρα HCT116 πλύθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για επόμενα πειράματα.

Σφαίρα καλλιέργεια

Όπως περιγράφεται παραπάνω, Μ1 ή Μ2 πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1 παρασκευάστηκε. Μετά από τρεις πλύσεις για την απομάκρυνση κυτοκίνες, Μ1 ή Μ2-πολωμένο ΤΗΡ-1 μακροφάγα συν-καλλιεργήθηκαν σε άνω ένθετα με AGS και τα κύτταρα HCT116 (1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) μη κολλητικά σε πλάκες των 6-φρεατίων ( 3471, Corning) χωρίς άμεση επαφή, επικαλυμμένα με λεπτό αγαρόζη σε πυκνότητα 2 × 10

4 /mm

3 σε DMEM ελεύθερο ορού /μέσου F12 (Invitrogen) που περιέχει 1% Ν2 (Gibco), 2% Β27 (Gibco), 20 ng /ml ανθρώπινο αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (FGF) -2 (Sigma, St. Louis, ΜΟ), και 20 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) (Sigma). Κάθε αγωγή διεξήχθη εις τριπλούν. Το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε κάθε δεύτερη ημέρα μέχρι το σχηματισμό σφαίρας. Μετά από 10 ημέρες, οι σφαίρες συλλέχθηκαν.

μακροφάγων πολιτισμό και συγκαλλιέργειας δοκιμασία

Περιφερειακά μονοπύρηνα κύτταρα αίματος ελήφθησαν από υγιείς εθελοντές δότες. CD14 + μονοκύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσφαιρίδια CD14 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία). Τα μονοκύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (1 χ 10

5 /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν με κοκκιοκυττάρων M-CSF (2 ng /mL) (Wako, Tokyo, Japan) για πέντε ημέρες για την επαγωγή ανώριμα μακροφάγα. Μετά από πλύσεις με PBS, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με ΙΡΝ-γ (1 ng /mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) για να προκληθεί M1 μακροφάγα. Τα μονοκύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες και καλλιεργήθηκαν με M-CSF (100 ng /mL) (Wako) για πέντε ημέρες για την επαγωγή ανώριμα μακροφάγα. Μετά από πλύσεις με PBS, τα κύτταρα διεγείρονται με IL-10 (10 ng /mL) (PeproTech) για να προκληθεί M2 μακροφάγα. Μέσα από Μ1 ή Μ2 πολωμένο καλλιέργειες μακροφάγων συλλέχθηκε και μεταφέρθηκε σε πλάκες 6-φρεατίων που περιέχουν AGS και HCT116 κύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά από 24 ώρες συν-καλλιέργειας, AGS και τα κύτταρα HCT116 πλύθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για μεταγενέστερα πειράματα.

miRNA μικροσυστοιχιών

Κυανίνη-3 (Cy3) σημασμένο cRNA παρασκευάστηκε από 100 ng RNA χρησιμοποιώντας miRNA της Agilent Complete Labeling και Hyb Kit (p /n 5190 έως 0456) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Agilent Ανθρώπινα 8 χ 60Κ miRNA Array διεξήχθη σε δύο ομαδοποιημένα δείγματα. Ο υβριδισμός διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες των miRNA Πλήρης Επισήμανση της Agilent και Hyb Kit. Διαφάνειες σαρώθηκαν αμέσως μετά το πλύσιμο για την Agilent DNA μικροσυστοιχιών Scanner (G2505C) χρησιμοποιώντας μία σάρωση ρύθμιση χρωμάτων για 8x60k διαφάνειες array (Scan Area 61×21.6 mm, σάρωσης 5um ανάλυση, Dye το κανάλι έχει οριστεί σε πράσινο και πράσινο PMT έχει οριστεί σε 100% ). Οι σαρωμένες εικόνες αναλύθηκαν με Feature Extraction Λογισμικό 10.7.3.1 (Agilent) χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες παραμέτρους (πρωτόκολλο miRNA_107_Sep09). εντάσεις Probe ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GeneSpring 12.0 μέσω εκατοστημόριο εξομάλυνση μετατόπιση. Διαφορικά εκφρασμένων miRNAs εντοπίστηκαν μέσω Fold Αλλαγή φιλτραρίσματος. έχουν τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχουν κατατεθεί στο GEO (ένταξη δεν GSE50601?. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50601).

Ποσοτική πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση μεταγραφής-πολυμεράσης (qRT-PCR)

Τα επίπεδα έκφρασης του miR-30e * προσδιορίστηκαν από TaqMan qRT-PCR χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας TaqMan miRNA (Ambion) αντιστραφεί, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως . miR-30e * έκφραση ρυθμίζεται σύμφωνα με την έκφραση του RNU6B μικρά πυρηνικά RNA. Τα επίπεδα έκφρασης του Bmi1 ποσοστώθηκαν με Probes κύριο qRT-PCR χρησιμοποιώντας ένα LightCycler 480 Probes κύριο (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) και ομαλοποιήθηκε ως προς αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης. Όλα qRT-PCR αντιδράσεις έτρεξαν χρησιμοποιώντας το LightCycler 480 System II (Roche Diagnostics). Οι σχετικές ποσότητες του miR-30e * και Bmi1 μετρήθηκαν με τη μέθοδο -ΔΔCT 2

. Όλα qRT-PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η επιμόλυνση των miRNA

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 5 ηΜ μιμούνται ή αναστολέα miR-30e * (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMax διαμόλυνσης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ειδικότητα της διαμολύνσεως επαληθεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα αρνητικό μιμητικό ελέγχου (Applied Biosystems). Τα επίπεδα έκφρασης του miR-30e * προσδιορίστηκαν ποσοτικά 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για μεταγενέστερα πειράματα.

Δημιουργία Bmi1 3’UTR μεταλλακτών

φορείς που περιέχουν μεταλλαγμένα miR-30e * αλληλουχίες στόχους στο ανθρώπινο Bmi1 3’UTR εισήχθησαν με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές PCR: 5′-ccUAUGGACGU UAAUUGAAAa -3 ‘για Luc-Bmi1-άγριου τύπου, και 5′-ccUAUGGACGU UAUGACUUUa -3’ για Luc-Bmi1-μεταλλαγμένο.

λουσιφεράσης δοκιμασία

AGS κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με MultiFectam (Promega) χρησιμοποιώντας το pMIR-REPORT ™ Luciferase miRNA φορέα έκφρασης που περιέχει Reporter πυγολαμπίδας λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο ενός συστήματος προαγωγέα /τερματιστή θηλαστικού. Ένας στόχος περιοχή κλωνοποίησης miRNA συμπεριλήφθηκε καθοδικά της αλληλουχίας μετάφρασης της λουσιφεράσης ή κενό φορέα (Invitrogen), και μιμούνται τον έλεγχο ή μιμητικό miR-30e * (Invitrogen). δοκιμασίες Reporter διεξήχθησαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με τις Luc-SCREEN® System (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα καλλιεργημένα κύτταρα συλλέγονται από τις πλάκες 6 φρεατίων πλύθηκαν μία φορά σε PBS και λύθηκαν σε ρυθμιστικό ραδιοανοσοκατακρήμνισης συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης /φωσφατάσης κοκτέιλ (Thermo Scientific , Tokyo, Japan). Τα δείγματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου με δωδεκυλοθειϊκό νάτριο και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, και η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτεύοντα αντισώματα. Σήματα ανιχνεύθηκαν με επώαση με δευτερογενή αντισώματα, χρησιμοποιώντας το σύστημα ECL Detection (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).

Ασθενείς και δείγματα ιστών

Πρωτοβάθμια ιστούς του γαστρεντερικού καρκινώματος και συμφωνημένα γειτονικό φυσιολογικό γαστρεντερικό επιθήλιο τους ελήφθησαν από 83 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο και 49 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου οι οποίοι υποβλήθηκαν σε εκτομή του γαστρεντερικού καρκίνου, χωρίς προεγχειρητική θεραπεία στο Χειρουργικής Τμήμα Gastroenterological, Kumamoto Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο από το 2005 έως το 2008. Υπεγράφη συγκατάθεση να συμμετάσχουν λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή ιατρικής δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Kumamoto.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά παρατηρείται σταθερά αποτελέσματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Chi-τετράγωνο τεστ χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των διαφορών στην αναλογία μεταξύ της έκφρασης Bmi1 και έκφραση CD68 /CD163. Ανεξάρτητη Φοιτητών

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν τις συνεχείς μεταβλητές μεταξύ των δύο ομάδων, και η διαδικασία Tukey-HSD χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση συνεχείς μεταβλητές μεταξύ των τριών ομάδων. Για τις στατιστικές αναλύσεις, χρησιμοποιήσαμε το JMP (έκδοση 9, SAS Institute) και τα προγράμματα λογισμικού SAS (έκδοση 9.1, SAS Institute). Μια τιμή P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της Bmi1 συσχετίζεται με τα επίπεδα του ΤΑΜ στο γαστρεντερικό ιστούς καρκίνου

ΤΑΜ να συμβάλει στην ανάπτυξη του όγκου, εισβολή και μετάσταση στο πολλοί καρκίνοι από την παραγωγή διαφόρων μεσολαβητών [13-17]. Για να καθοριστεί εάν η έκφραση της Bmi1 σε καρκινικά κύτταρα συσχετίζεται με τα επίπεδα των ΤΑΜ, εξετάσαμε την έκφραση Bmi1, CD68, CD163 και σε γαστρεντερικές καρκινικούς ιστούς χρησιμοποιώντας IHC. χρώση CD68 χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει παν-μακροφάγων, και ο πληθυσμός Μ2 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας CD163, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια θετική σχέση με την έκφραση Bmi1 και CD68 /CD163 σε γαστρικό καρκίνο (Σχήμα 1Α, C) και σε καρκίνο του παχέος εντέρου (Σχήμα 1Β, D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα μακροφάγα στο στρώμα του όγκου μπορεί να εμπλέκεται στην έκφραση Bmi1 στο γαστρεντερικό καρκινικά κύτταρα.

(Α) Ανοσοϊστοχημεία έκφρασης Bmi1, CD68, CD163 και σε 83 γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Κλίμακα μπαρ, 100 μm. (Β) Το ποσοστό των CD68 /163 θετικά δείγματα σε υψηλές Bmi1 εκφράζοντας γαστρικού καρκίνου. Υπήρξε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Bmi1 και /163 έκφρασης CD68 (*

P

& lt? 0,05, ***

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα). (Γ) Η ανοσοϊστοχημεία των Bmi1, CD68, και την έκφραση CD163 σε 49 ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου. Κλίμακα μπαρ, 100 μm. (Δ) Το ποσοστό των CD68 /163 θετικά δείγματα σε υψηλές Bmi1 εκφράζουν τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Υπήρξε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ αυτών των δύο ομάδων (**

P

& lt? 0,01, **

P

& lt? 0,01, αντίστοιχα).

Η

έκφραση Bmi1 είναι αυξημένη σε γαστρεντερικό καρκίνο κυτταρικές σειρές συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1 ή Μ2-πολωμένο ΤΗΡ-1 μακροφάγα, που οδηγεί στην αποκτήσει ικανότητα σχηματισμού σφαίρας σε 3D καλλιέργεια

επόμενο εκτελείται μια

in vitro

δοκιμασία συν-καλλιέργειας με Μ1 ή Μ2 πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1 για να εξετάσει εάν τα μακροφάγα επηρεάζουν την έκφραση Bmi1 σε καρκινικά κύτταρα και τις λειτουργίες των καρκινικών κυττάρων. Όπως φαίνεται προηγουμένως, ΤΗΡ-1 κύτταρα διαφοροποιούνται σε Μ1 ή Μ2 πολωμένου μακροφάγα με διακριτή αντιμετώπιση κυτοκίνες (Εικόνα 2Α) [23]. ανάλυση qRT-PCR αποκάλυψε ότι η έκφραση Bmi1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε AGS και κύτταρα HCT116 συν-καλλιεργήθηκαν με τόσο Μ1 και Μ2-πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1 (Σχήμα 2Β, C). Bmi1 εμπλέκεται στην ικανότητα αυτο-ανανέωσης μέσω της καταστολής της ΙΝΚ4 &-ARF τόπο, έτσι υποθέσαμε ότι γαστρεντερικού κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με ΤΑΜ μπορεί να έχει την ικανότητα για αυτο-ανανέωση μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης Bmi1. Για να διερευνηθεί το φαινότυπο των γαστρεντερικών κυττάρων συν-καλλιεργήθηκαν με ΤΑΜ, πραγματοποιήσαμε μια 3D καλλιέργεια σφαίρα αναπτύχθηκαν σε μη-προσκολλημένα καλλιέργειας χωρίς ορό σε γαστρεντερικά κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1 ή Μ2-πολωμένο ΤΗΡ-1 μακροφάγα (Σχήμα 2D, Ε ). Η ικανότητα σχηματισμού σφαίρα των γαστρεντερικών κυττάρων συν-καλλιεργήθηκαν με ΤΑΜ ενισχύθηκε (Σχήμα 2F, G). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΤΑΜ υπερέκφραση Bmi1 και ενισχυμένο σχηματισμό σφαίρας.

(Α) προφίλ παραγωγή κυτοκίνης των Μ1 και Μ2-πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1. (Β) ανάλυση qRT-PCR της έκφρασης Bmi1 σε AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1 και Μ2-πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1, σε σύγκριση με την έκφραση σε Bmi1 AGS κύτταρα μόνο ως ομάδα ελέγχου. Σημαντικά υψηλότερη έκφραση Bmi1 ανιχνεύθηκε σε συν-καλλιεργημένα ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (***

P

& lt? 0.001, ***

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα). ανάλυση (C) qRT-PCR της έκφρασης Bmi1 σε κύτταρα HCT116 συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1 και Μ2-πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1, σε σύγκριση με την έκφραση σε κύτταρα Bmi1 HCT116 μόνο ως ομάδα ελέγχου. Σημαντικά υψηλότερη έκφραση Bmi1 ανιχνεύθηκε σε συν-καλλιεργημένα ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (***

P

& lt? 0.001, ***

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα). (D) Μικροσκοπική εικόνες 3D σφαίρας καλλιεργημένων AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα, σε σύγκριση με 3D σφαίρα καλλιεργημένα κύτταρα AGS μόνο ως ομάδα ελέγχου. Κλίμακα μπαρ, 100 μm. (Ε) Μικροσκοπική εικόνες 3D σφαίρας καλλιεργημένα κύτταρα HCT116 συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα, σε σύγκριση με 3D σφαίρα κύτταρα καλλιεργημένα HCT116 μόνο ως ομάδα ελέγχου. Κλίμακα μπαρ, 100 μm. (F) Σημαντικά υψηλότερη αριθμούς σφαίρα ανιχνεύθηκαν σε συν-καλλιεργημένα ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου σε AGS κύτταρα (*

P

& lt? 0,05, *

P

& lt? 0,05, αντίστοιχα). (G) Σημαντικά υψηλότερη αριθμούς σφαίρα ανιχνεύθηκαν σε συν-καλλιεργημένα ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου σε κύτταρα HCT116 (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, αντίστοιχα) .

Η

Αναγνώριση των miRNAs ρυθμίζουν την έκφραση Bmi1 χρησιμοποιώντας σχετίζονται με τον καρκίνο έλεγχο miRNA στον καρκίνο του στομάχου κύτταρα

Πολλά miRNAs εμπλέκονται στη ρύθμιση των δραστηριοτήτων των καρκινικών βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της αυτο-ανανέωσης και ογκογενετικότητας [19,20]. Συνεπώς εξετάσαμε την υπόθεση ότι η ρύθμιση της έκφρασης Bmi1 στη γαστρεντερική καρκινικά κύτταρα μπορεί να προκαλείται από miRNAs χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA. Έχουμε επιλέξει τις δέκα πιο μειωτικά miRNAs στο γαστρεντερικό κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1 ή Μ2-πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1 σε σύγκριση με το γαστρεντερικό κύτταρα μόνο (Πίνακας 1Α, Β). Χρησιμοποιώντας διάφορες ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων (Μιράντα, Diana, Targetscan, TargetMiner, miRbase), miR-30e-3ρ (miR-30e *) ήταν ο μοναδικός υποψήφιος miRNA μεταξύ όλων προσδιορίζονται miRNAs βρέθηκε να στοχεύουν άμεσα την Bmi1 3 ‘UTR. Ως εκ τούτου, επικεντρώθηκε στην miR-30e * για περαιτέρω ανάλυση.

Α

Η Β

Η miRNAfold αλλαγή (M1 vs ελέγχου) miRNAfold αλλαγή (M2 vs control)hsa-miR-36820.006816627hsa-miR-36820.005809477hsa-miR-30e-3p0.011009754hsa-miR-373-3p0.015210649hsa-miR-3350.013768308hsa-miR-192-3p0.015870558hsa-miR-335-3p0.016194038hsv1-miR-H6-3p0.016751566hsa-miR-373-3p0.017847616hsa-miR-1225-3p0.017139628hsa-miR-192-3p0.01862193hsa-miR-36760.017353492hsa-miR-296-5p0.019188985hsa-miR-7660.032502682hsa-miR-1225-3p0.020111009hsa-miR-335-3p0.324230407hsa-miR-7660.038137453hsa-miR-769-5p0.445738351hsa-miR-769-5p0.434152471hsa-miR-30e-3p0.54343376Table 1. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών του 1360 miRNAs σε AGS κυτταρικές σειρές συν-καλλιεργήθηκαν με ΤΗΡ-1 μακροφάγα.

(Α) Οι δέκα κορυφαίοι miRNAs μειωτικά σε κυτταρικές γραμμές AGS συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1-πολωμένο μακροφάγα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. (Β) οι δέκα miRNAs προς τα κάτω σε κυτταρικές σειρές AGS συν-καλλιεργήθηκαν με M2-πολωμένο μακροφάγων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. CSV Λήψη CSV

miR-30e * καταστέλλει την έκφραση Bmi1 στο γαστρεντερικό κύτταρα και στοχεύει άμεσα η Bmi1 3 ‘UTR

Για να αποκαλυφθεί η λειτουργική συνάφεια του miR-30e * έκφραση, εξετάσαμε την έκφραση Bmi1 στις 6 γαστρεντερικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές με κηλίδωση Western (Σχήμα 3Α), και ανέλυσε τη σχέση μεταξύ miR-30e * και έκφραση Bmi1 σε υψηλή έκφραση του καρκίνου Bmi1 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν καρκινικές κυτταρικές σειρές (AGS και HCT116) επιμολυσμένα με miR-30e * μιμείται, και χαμηλή Bmi1 (NUGC4 και COLO201) επιμολυσμένα με miR-30e * αναστολείς. ανάλυση Western blot αποκάλυψε σημαντικά μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης Bmi1 στο AGS και τα κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με miR-30e * μιμείται σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήμα 3Β, C), και τα αυξημένα επίπεδα σε κύτταρα NUGC4 και COLO201 επιμολυσμένα με miR-30e * αναστολείς σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήμα 3Δ, E). Επιπλέον, για να διερευνήσει τον φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων που επιμολύνθηκαν με miR-30e * μιμείται, πραγματοποιήσαμε μια 3D καλλιέργεια σφαίρα αναπτύχθηκαν σε μη-προσκολλημένα καλλιέργειας άνευ ορού AGS κύτταρα επιμολυσμένα με miR-30e * μιμείται (Σχήμα 4Α). Η ικανότητα σχηματισμού σφαίρα των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με AGS miR-30e * μιμείται ανεστάλη (Σχήμα 4Β), έτσι ώστε να επιβεβαιώνεται ότι η προς τα κάτω ρύθμιση του miR-30e * προκάλεσε ένα βελτιωμένο σχηματισμό σφαίρα.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης Bmi1 σε 6 γαστρεντερικό καρκινικές κυτταρικές σειρές. (Β) Ανάλυση Western blot της έκφρασης Bmi1 σε υψηλή AGS κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν Bmi1 επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο (NC) και miR-30e * μιμείται. (C) Ανάλυση Western blot της έκφρασης Bmi1 σε υψηλής έκφρασης Bmi1 κυτταρικές σειρές HCT116 επιμολυσμένα με NC και miR-30e * μιμείται. (Δ) Ανάλυση Western blot της έκφρασης Bmi1 σε χαμηλές Bmi1-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν NUGC4 επιμολυσμένα με * αναστολείς NC και miR-30e. (Ε) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης Bmi1 σε χαμηλές Bmi1-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν COLO201 επιμολυσμένα με NC και miR-30e * αναστολέων.

Η

(Α) 3D σφαίρα καλλιέργεια καλλιεργείται σε μη-προσκολλημένα ελεύθερο ορού καλλιέργεια με AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα και επιμολυσμένα με μιμητικό miR-30e *, σε σύγκριση με 3D σφαίρα καλλιέργεια με AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα και επιμολυσμένα με μιμητικό NC ως ομάδα ελέγχου. Κλίμακα μπαρ, 100 μm. (Β) Σημαντικά χαμηλούς αριθμούς σφαίρα ανιχνεύθηκαν σε μιμούνται miR-30e * επιμολυσμένα ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (* Ρ & lt? 0,05, * Ρ & lt? 0,05, αντίστοιχα). (Γ) Η υποθετική miR-30e θέση * στόχο ή μία μεταλλαγμένη αλληλουχία του 3 ‘UTR του Bmi1 κλωνοποιήθηκε αμέσως καθοδικά του γονιδίου λουσιφεράσης. (D) δραστηριότητα λουσιφεράσης των κυττάρων AGS συν-επιμολύνθηκαν με πλασμίδια που περιέχουν την αλληλουχία-στόχο * miR-30e άγριου τύπου στην 3 ‘UTR του Bmi1 ή πλασμίδια ελέγχου, μαζί με το mRNA μιμητικό NC και μιμούνται miR-30e *. (Ε) Η δραστικότητα λουσιφεράσης των κυττάρων AGS συν-επιμολύνθηκαν με πλασμίδια που περιέχουν το άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη αλληλουχία * στόχου miR-30e στην 3 ‘UTR του Bmi1 μαζί με το mRNA μιμητικό NC και μιμούνται miR-30e *.

Η

Ανάλυση του Bmi1 3 ‘UTR χρησιμοποιώντας την ηλεκτρονική βάση δεδομένων Miranda αποκάλυψε μια προβλεπόμενη αλληλουχία στόχο για miR-30e *. Στη συνέχεια ερευνήσαμε αν miR-30e * στοχεύει άμεσα την 3 ‘UTR του Bmi1 χρησιμοποιώντας κατασκευάσματα που περιέχουν το υποτιθέμενο miR-30e θέση * στόχο ή μία μεταλλαγμένη αλληλουχία του 3’ UTR του Bmi1 κλωνοποιημένων αμέσως κατάντη του γονιδίου λουσιφεράσης. Η LUC-Bmi1 κατασκεύασμα που περιέχει την προβλεπομένη σειρά * στόχου miR-30e στο Bmi1 3 ‘UTR δείχνεται στην Εικόνα 4C, με αλληλουχίες σπόρος υποδεικνύεται με γραμμές. Η επιμόλυνση των κυττάρων με AGS ΜΙΚ-30e * μιμούνται κατέστειλε σημαντικά δραστηριότητα λουσιφεράσης από τον φορέα ανταποκριτή που περιέχει το άγριου τύπου Bmi1 3 ‘UTR (LUC-Bmi1-WT) σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου (Εικόνα 4D). Κατασκευάσαμε επίσης διανύσματα ρεπόρτερ που περιέχουν το μεταλλαγμένο Bmi1 3 ‘UTR (LUC-Bmi1-ΜΤ). Η επιμόλυνση με το miR-30e * μιμούνται δεν καταστέλλει δραστικότητα λουσιφεράσης από τον φορέα ανταποκριτή που περιέχει την μεταλλαγμένη 3 ‘UTR του Bmi1 σε σύγκριση με τον άγριου-τύπου 3’ UTR φορέα (Σχήμα 4Ε). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-30e * ρυθμίζει την έκφραση Bmi1 με απευθείας στόχευση 3 ‘UTR του.

έκφραση Bmi1 είναι αντιστρόφως ανάλογη με το miR-30e * έκφραση σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου

επόμενο αναλύονται τα επίπεδα του miR-30e * έκφραση σε καρκινικούς ιστούς και συμφωνημένα γειτονικό φυσιολογικό επιθήλιο τους χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Η έκφραση του miR-30e * ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με συμφωνημένα γειτονικό κανονικό επιθήλιο τους τόσο γαστρικό καρκίνο (Σχήμα 5Α) και τον καρκίνο του παχέος εντέρου (Σχήμα 5C). Επιπλέον, σε σύγκριση miR-30e * επίπεδα έκφρασης μεταξύ υψηλών και χαμηλών Bmi1 εκφράζοντας καρκινικούς ιστούς. Υψηλά επίπεδα έκφρασης Bmi1 ανιχνεύθηκαν σε 45% (24/53) των γαστρικών δειγμάτων καρκίνου και 54% (20/37) των δειγμάτων καρκίνου του παχέος εντέρου. έκφραση Bmi1 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με miR-30e * έκφραση σε γαστρικό καρκίνο (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, η έκφραση Bmi1 δεν συσχετίστηκε με miR-30e * έκφρασης σε καρκίνο του παχέος εντέρου (Εικόνα 5D). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση Bmi1 έντονα συσχετίζεται με miR-30e * έκφραση σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο αλλά όχι σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.

(Α) Τα επίπεδα του miR-30e * έκφραση σε 16 γαστρικό καρκινικούς ιστούς και τους ταιριάζουν γειτονικό φυσιολογικό γαστρικό επιθήλιο, όπως εκτιμάται από qRT-PCR. (Β) Τα επίπεδα του miR-30e * έκφραση σε 29 υψηλής και χαμηλής 24 του Bmi1 εκφράζουν γαστρικού καρκινικούς ιστούς όπως αξιολογείται με qRT-PCR. (Γ) Τα επίπεδα του miR-30e * έκφρασης σε 37 καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου και συμφωνημένα γειτονικό φυσιολογικό επιθήλιο κόλου τους όπως αξιολογείται με qRT-PCR. (Δ) Τα επίπεδα του miR-30e * έκφρασης σε 20 υψηλής και 17 του χαμηλού Bmi1 εκφράζουν ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου, όπως εκτιμάται από qRT-PCR.

Η

Μ1 και Μ2-πολωμένο μακροφάγα καθαρίστηκαν από ανθρώπινα μονοκύτταρα επαγόμενη μειορύθμιση του miR-30e * και προς τα πάνω ρύθμιση Bmi1

προηγούμενα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η έκφραση Bmi1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε AGS και κύτταρα HCT116 συν-καλλιεργήθηκαν με τόσο Μ1 και Μ2-πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1. Εμείς επόμενο συν-καλλιεργήθηκαν AGS και κύτταρα HCT116 με Μ1 και Μ2-πολωμένα μακροφάγα καθαρίστηκαν από ανθρώπινα μονοκύτταρα. έκφραση Bmi1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με τόσο Μ1 και Μ2-πολωμένα μακροφάγα καθαρίστηκαν από ανθρώπινα μονοκύτταρα, και miR-30e * έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη σε AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με δύο μακροφάγα (Σχήμα 6Α, C). Αντίθετα, η έκφραση Bmi1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα HCT116 συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1-πολωμένο μακροφάγα, αλλά όχι σε κύτταρα HCT116 συν-καλλιεργήθηκαν με M2-πολωμένο μακροφάγα. Η έκφραση του miR-30e * μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα HCT116 συν-καλλιεργήθηκαν με δύο μακροφάγα (Σχήμα 6Β, D). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι Μ1 και Μ2-πολωμένα μακροφάγα καθαρίστηκαν από ανθρώπινα μονοκύτταρα επαγόμενη μειορύθμιση του miR-30e * στην γαστρεντερική κυτταρικές γραμμές, και προς τα πάνω ρύθμιση Bmi1 σε γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή, αλλά όχι στο παχύ έντερο κυτταρική σειρά καρκίνου.

(Α) qRT-PCR ανάλυση του miR-30e * έκφραση σε AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1 και Μ2 πολωμένο μακροφάγα. Σημαντικά χαμηλότερο miR-30e * έκφραση ανιχνεύθηκε σε συν-καλλιεργημένα ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (***

P

& lt? 0.001, *

P

& lt? 0,05, αντίστοιχα). (Β) ανάλυση qRT-PCR του miR-30e * έκφραση σε κύτταρα HCT116 συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1 και Μ2 πολωμένο μακροφάγα. Σημαντικά χαμηλότερο miR-30e * έκφραση ανιχνεύθηκε σε συν-καλλιεργημένα ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (***

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01, αντίστοιχα). (C) qRT-PCR ανάλυση της έκφρασης Bmi1 σε AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1 και Μ2 πολωμένο μακροφάγα. Σημαντικά υψηλότερη έκφραση Bmi1 ανιχνεύθηκε σε συν-καλλιεργημένα ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (***

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01, αντίστοιχα). (Δ) Ανάλυση qRT-PCR του miR-30e * έκφραση σε κύτταρα HCT116 συν-καλλιεργήθηκαν με Μ1 και Μ2 πολωμένο μακροφάγα. Σημαντικά υψηλότερη έκφραση Bmi1 ανιχνεύθηκε σε Μ1 μακροφάγων συν-καλλιεργήθηκαν ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (**

P

& lt? 0,01). (Ε) Σχηματική αναπαράσταση του miR-30e * -Bmi1 σηματοδότηση διαμεσολαβείται από ΤΑΜ.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι ΤΑΜ υπερέκφραση Bmi1, με αποτέλεσμα την αύξηση σφαίρα ικανότητα σχηματισμού. έκφραση Bmi1 κατεστάλη από miR-30e * μέσω miR-30e * άμεσης σύνδεσης με Bmi1 3 ‘UTR, και η έκφραση Bmi1 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με miR-30e * έκφρασης σε καρκινικούς ιστούς.