Αφηρημένο

Τα φυσικά κυτταροτοξικά υποδοχείς (ΕΚΕΦΕ) είναι ένα μοναδικό σύνολο ενεργοποίηση πρωτεϊνών που εκφράζονται κυρίως στην επιφάνεια των φυσικών φονικών ( ΝΚ) κύτταρα. Οι ΕΚΕΦΕ, η οποία περιλαμβάνει τρία μέλη? NKp46, NKp44 και NKp30, εμπλέκονται κριτικά στην ΝΚ κυτταροτοξικότητα εναντίον διαφόρων στόχων, συμπεριλαμβανομένων ένα ευρύ φάσμα των καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από διάφορες προελεύσεις. Ακόμη και αν οι συνδετήρες του όγκου των ΕΚΕΦΕ δεν έχουν προσδιοριστεί ακόμα, ο επιλεκτικό τρόπο με τον οποίο αυτοί οι υποδοχείς στοχεύουν κύτταρα όγκου μπορεί να παρέχει μια εξαιρετική βάση για την ανάπτυξη νέων θεραπειών κατά του όγκου. Για να ελεγχθεί η πιθανή χρήση των ΕΚΕΦΕ ως παράγοντες κατά των όγκων, δημιουργήσαμε διαλυτές πρωτεΐνες σύντηξης NCR-Ig στην οποία η σταθερή περιοχή της ανθρώπινης IgG 1 συντήχθηκε με το εξωκυτταρικό τμήμα του υποδοχέα. Έχουμε αποδείξει, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, ότι η θεραπεία με NKp30-Ig, αναστέλλει δραματικά την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα δειχθεί ότι μεσολαβεί μια ADCC απόκριση έναντι των κυτταρικών σειρών προστάτη επικαλυμμένα NKp30-Ig. Τέλος, οι πρωτεΐνες σύντηξης Ig αποδείχθηκαν επίσης για τη διάκριση μεταξύ της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και του καρκίνου του προστάτη. Αυτό μπορεί να παρέχει μια νέα διαγνωστική τροπικότητα στο δύσκολο έργο της διαφοροποίησης μεταξύ αυτών των εξαιρετικά κοινή παθολογικές καταστάσεις

Παράθεση:. Arnon TI, Markel G, Bar-Ilan Α, Hanna J, Fima Ε, Benchetrit F, et al . (2008) Αξιοποίηση Διαλυτό ΝΚ κυττάρων δολοφόνων υποδοχείς για τη γενιά των Νέων του καρκίνου του ανοσοποιητικού θεραπεία. PLoS ONE 3 (5): E2150. doi: 10.1371 /journal.pone.0002150

Επιμέλεια: Fu-Sheng Wang, το Πεκίνο Ινστιτούτο Λοιμωδών Νοσημάτων, Κίνα

Ελήφθη: 12 Φεβρουαρίου 2008? Δεκτές: 1 Απρ 2008? Δημοσιεύθηκε: May 14, 2008

Copyright: © 2008 Arnon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Τα Εισαγωγή

Ανοσοποιητικό μηχανισμοί πιστεύεται ότι παρέχουν την απαραίτητη προστασία από το. ανάπτυξη των ασθενειών του καρκίνου. Μελέτες ασθενών ανθρώπων και μοντέλα ποντικών έχουν δείξει ότι οι ελλείψεις σε βασικούς ανοσολογικές συνιστώσες να οδηγήσει σε αυξημένη ευαισθησία στην ανάπτυξη του καρκίνου [1] – [3]. φυσικά κύτταρα φονείς (ΝΚ) είναι ένα σημαντικό υποσύνολο κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων που ανήκουν στο έμφυτο ανοσοποιητικό απόκριση και είναι καλύτερο να χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να σκοτώνουν αυθόρμητα ιικώς μολυσμένα κύτταρα και κύτταρα όγκου [4]. Η αποτελεσματικότητα με την οποία τα κύτταρα ΝΚ να καταστρέψουν ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών γραμμών υποδηλώνει ένα σημαντικό ρόλο στην ανοσοεπιτήρηση. Πράγματι, συσσωρεύοντας κλινικά και πειραματικά δεδομένα καταδεικνύουν τη σημασία της δραστηριότητας ΝΚ στην εξάλειψη του καρκίνου

in vivo

? σε ποντίκια, η εξάντληση των ΝΚ κυττάρων έχει σαν αποτέλεσμα μια σημαντικά αυξημένη ευαισθησία σε χημικά επαγόμενη καρκίνο [1], ενώ σε ασθενείς με λευχαιμία μειωμένη ΝΚ κυτταροτοξικότητα φάνηκε να συσχετίζεται αυστηρά με αυξημένη πρόοδο της ασθένειας [5].

Η ενεργοποίηση των κυττάρων ΝΚ ρυθμίζεται από ένα σύνολο επιφανειακών υποδοχέων που είτε διεγείρουν ή αναστέλλουν την κυτταροτοξική απόκριση [4], [6]. Ο κύριος μηχανισμός που ελέγχει την αναστολή ΝΚ βασίζεται στην αναγνώριση των μορίων MHC τάξης Ι με ΝΚ ανασταλτικοί υποδοχείς, όπως ο δολοφόνος-Ig-σαν υποδοχείς (ΚΙΚ) και το σύμπλοκο /NKG2A CD94. Ο μηχανισμός αυτός εξασφαλίζει ότι τα κύτταρα ΝΚ παρεμποδίζεται συνεχώς από τη θανάτωση υγιών κυττάρων που εκφράζουν φυσιολογικά επίπεδα του MHC τάξης Ι πρωτεΐνες [7]. Ωστόσο, ενώ η έκφραση MHC τάξης Ι είναι απαραίτητη για να αναστέλλουν ΝΚ κυτταροτοξικότητα, ρύθμιση προς τα κάτω δεν είναι αρκετή για να προκαλέσει μια απάντηση, καθώς απαιτούνται επίσης ειδικά σήματα ενεργοποίησης. Τα σήματα αυτά παραδίδονται από ένα σύνολο υποδοχέων λύσεως που αναγνωρίζουν συνδέτες Ι μη MHC κατηγορίας, που εκφράζεται σε κύτταρα-στόχους [8]. Έτσι, τα κύτταρα ΝΚ δεν είναι μόνο σε θέση να ανιχνεύει την απουσία του MHC τάξης Ι πρωτεΐνες, αλλά είναι επίσης εξοπλισμένα με υποδοχείς στην επιφάνεια που επιτρέπουν την ειδική ανίχνευση των στόχων τους.

Η κύρια ΝΚ ενεργοποιώντας τους υποδοχείς που εμπλέκονται στην αναγνώριση και τη θανάτωση των όγκοι περιλαμβάνουν το ομοδιμερές NKG2D και τα τρία φυσικά κυτταροτοξικά υποδοχείς (ΕΚΕΦΕ) NKp46, NKp44 και NKp30 [8]. Η σχετική συμβολή του καθενός από αυτούς τους υποδοχείς για ΝΚ κυτταροτοξικότητα έναντι όγκων διαφέρει, υποδεικνύοντας την ύπαρξη διαφόρων ειδικών συνδετήρων λύσης [9]. Πράγματι, αρκετές στρες διεγέρσιμο κυτταρικές πρωτεΐνες έχουν ταυτοποιηθεί ως συνδέτες για τον υποδοχέα NKG2D:. Το MHC τάξης Ι αλυσίδα που σχετίζονται αντιγόνων (MICA και MICB) και τις πρωτεΐνες πρόσδεσης UL16 (ULBP1-4) [10]

Αντίθετα με την NKG2D, οι κυτταρικοί συμπλοκοποιητές των ΕΚΕΦΕ είναι προς το παρόν άγνωστη και οι μόνες ΕΚΕΦΕ προσδέματα ταυτοποιηθεί μέχρι τώρα ιικώς πρωτεΐνες που προέρχονται από [11] – [14]. Ωστόσο, ουσιαστικές αποδείξεις δείχνουν ότι υπάρχουν κυτταρική συνδετήρες για τις ΕΚΕΦΕ και ότι η έκφραση τους είναι κρίσιμη για την ικανότητα των κυττάρων ΝΚ να καταστρέφουν τους όγκους [9], [15] – [17]. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζονται από κλινικές μελέτες που δείχνουν για αρκετές περιπτώσεις AML ένας συσχετισμός μεταξύ χαμηλών επιπέδων συνδετήρων ΕΚΕΦΕ σε ασθενείς AML και μια φτωχή πρόγνωση της νόσου [18]. Επιπλέον, έχουμε δείξει πρόσφατα ότι η διαγραφή ενός μόνο γονιδίου NCR, το ομόλογο NKp46 ποντίκι (NCR1), μειώνει σημαντικά την ικανότητα των κυττάρων ΝΚ για να καθαρίσετε τα καρκινικά κύτταρα

in vivo

[19].

Κατά την τελευταία δεκαετία, οι μελέτες του καρκίνου ανοσοθεραπεία έχουν εκτενώς επικεντρωθεί στην προσπάθεια να εκμεταλλευτεί την άκρως ιδιαίτερη φύση της προσαρμοστικής ανοσολογικής απόκρισης για την ανάπτυξη νέων θεραπειών. Αυτή η προσέγγιση οδήγησε στην παραγωγή αρκετών ανθρωποποιημένων αντισωμάτων που κατευθύνονται εναντίον ειδικών αντιγόνων όγκου. Η εντυπωσιακή κλινική επιτυχία της θεραπείας που βασίζονται σε αντισώματα ανοίξει την πύλη για μια εντατική έρευνα για επιπλέον εξαιρετικά ειδικών δεικτών όγκου και δεδομένου ότι το 1995 αρκετά αντισώματα έχουν εγκριθεί για κλινική χρήση, ενώ περισσότερο επί του παρόντος αξιολογούνται σε δοκιμές ογκολογία [20], [21] .

για να επεκτείνει τη μέθοδο αυτή, έχουν διάφορα εργαλεία έχουν εφαρμοστεί σε μια προσπάθεια να εντοπίσουν νέες καρκινικά αντιγόνα που θα ήταν κατάλληλο για ένα ευρύτερο φάσμα των καρκίνων και εξακολουθούν να διατηρούν την επιλεκτική αναγνώριση. Οι ΕΚΕΦΕ αντιπροσωπεύουν ένα μοναδικό παράδειγμα για πρωτεΐνες που έχουν αποκτήσει μια τέτοια ευρεία εξειδίκευση και είναι ιδιαίτερα προσαρμοσμένο να αναγνωρίσουν τα καρκινικά κύτταρα. Για να μεταφράσει αυτές τις δυνατότητες σε ένα θεραπευτικό εργαλείο, έχουμε δημιουργήσει πρωτεΐνες σύντηξης ανοσοσφαιρίνης (Ig) που περιέχουν το εξωκυτταρικό τμήμα του υποδοχέα συντήκεται με την σταθερή περιοχή της ανθρώπινης IgG1. Έτσι, παρόμοια με την προσέγγιση θεραπεία όγκου με βάση αντισώματα, υποθέσαμε οι πρωτεΐνες σύντηξης NCR-Ig μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως «στοχευμένη βλήματα»? το εξωκυτταρικό μέρος παρέχει ειδικότητα όγκου, ενώ η σταθερή περιοχή της ανθρώπινης IgG1 (Fc) επιτρέπει την πρόσληψη του ανοσοποιητικού συστατικών, τα οποία ενισχύουν ειδική εξάλειψη του όγκου. Εδώ δείχνουμε την πιθανή χρήση των εν λόγω θεραπείας χρησιμοποιώντας προστάτη μοντέλα ανθρώπων.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells

Χρησιμοποιήσαμε το ανθρώπινο προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή DU145 και τον ανθρώπινο προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή PC3 /

Luc

, το οποίο παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Εν συντομία, PC3.38, ένας κλώνος του αδενοκαρκινώματος ανθρώπινη κυτταρική σειρά προστάτη, που προέρχεται από PC3 (ATCC, CRL-1435), μολύνθηκε με ανασυνδυασμένο rLNC /

Luc

ρετροϊό (που εκφράζει γονίδιο λουσιφεράσης κατάντη προς CMV προαγωγό) και επιλέγονται από G418 (400 μg /ml) δημιουργώντας PC3 /

Luc

κλώνο. Σταθερή έκφραση της λουσιφεράσης σε καλλιέργειες κυττάρων ήταν συνήθως επιβεβαίωσε τη χρήση της κάμερας CCCD.

πρωτεϊνών σύντηξης και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Η παραγωγή NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-Ig και CD99- Ig περιγράφηκε πριν από [13]. Ελέγχουν ανθρώπινη πρωτεΐνη IgG 1 (hIgG1 κάπα, PHP010) αγοράστηκε από την Serotec (Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο).

Η ανοσοϊστοχημεία

προστάτη ιστών, τόσο υπερπλασικά και κακοήθεις, μονιμοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης. Η θέρμανση με μικροκύματα των σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη τμήματα ιστού σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού διεξήχθη για να ανακτήσετε αντιγόνα. Οι τομές στη συνέχεια βάφονται με το διαφορετικό NCR-Igs ή ελέγχου-Ig (8 μg /ml, τελική συγκέντρωση) που ακολουθείται από βιοτινυλιωμένο-κατσίκας-αντι-ανθρώπινο-Ρο (Jackson ImmunoResearch, West Grove, ΡΑ). Για την ανίχνευση, το σύμπλοκο υπεροξειδάσης μέθοδος αβιδίνης-βιοτίνης χρησιμοποιήθηκε με κιτ Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Η χρώση βαθμολογήθηκε ως το ποσοστό των θετικών κυττάρων του προστάτη (υπερπλαστικού ή κακοήθεις) από ένα σύνολο 100 κυττάρων. Αξιολογήσαμε επίσης την ένταση της χρώσης ως 0 = μη, 1 = ασθενής, 2 = μέτρια και 3 = ισχυρή. Βιτρώ τμήματα αναλύθηκαν από δύο παθολόγους. Ανοσοϊστοχημική αποτελέσματα θεωρήθηκαν ως θετικά, όποτε το ποσοστό θετικά χρωματισμένων κυττάρων του προστάτη ξεπέρασε το 50% και η ένταση ήταν υψηλότερη από 1.

εμφύτευση του όγκου και τη θεραπεία

Για το μοντέλο DU145 εμείς s.c. ένεση αρσενικά γυμνά ποντίκια με τη σειρά ανθρώπινου όγκου του προστάτη DU145 (4 × 10

6). Δύο εβδομάδες μετά την ένεση, όταν οι όγκοι έγιναν ορατές, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, ελέγχουν την ανθρώπινη IgG 1 ή PBS. Οι αγωγές χορηγήθηκαν 5 φορές (ημέρες 2, 7, 15, 25 και 34) και περιλαμβάνεται μια αρχική μεγαλύτερη δόση των πρωτεϊνών (20 mg /kg) ακολουθούμενη από μικρότερες δόσεις (10 mg /kg). Η πρόοδος του όγκου αξιολογήθηκε κάθε τρεις ημέρες με τη μέτρηση της διαμέτρου των όγκων.

Για το PC3 /

Luc

μοντέλο, αρσενικοί γυμνοί ποντικοί (ηλικίας 4-8 εβδομάδων) εγχύθηκαν με 15 × 10

6 PC3 /

Luc

κύτταρα στο sc χώρο αριστερό πλευρό του κάθε ποντικιού της της. Τρεις εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου, τα ποντίκια ενέθηκαν ί.ρ. με 4 μg /kg NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, ελέγχουν την ανθρώπινη IgG 1 ή PBS κάθε δεύτερη ημέρα για μια περίοδο 3-4 εβδομάδων.

Απεικόνιση PC3 όγκου /

Luc

ξενομοσχεύματα

Όλοι οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν ως προς την έκφραση του όγκου πριν και στο τέλος των διαδικασιών θεραπείας. Μόνο εκείνα τα ποντίκια που μέσα σε 21 ημέρες από την ένεση εξέφρασαν ένα ανιχνεύσιμο μέγεθος του όγκου, όπως αξιολογήθηκε από την κάμερα CCCD, επιλέχθηκαν για περαιτέρω χειρισμούς. Πριν την απεικόνιση, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ένυδρη χλωράλη 4% (Fluka-Sigma, Ισραήλ). Πέντε λεπτά πριν από την απεικόνιση, τα ποντίκια ενέθηκαν ί.ρ. με 126mg /kg σωματικού βάρους του υδατικού διαλύματος Beetle lucifering (Promega Corp., Madison, WI). Τα ποντίκια στη συνέχεια τοποθετούνται σε ένα ελαφρύ-σφιχτό θάλαμο ενός συστήματος κάμερας CCCD (Roper Επιστημονική, Princeton μέσο, ​​Trenton NJ) και φωτογραφήθηκαν πρώτα με ένα συμπληρωμένο ελεγχόμενο φως προκειμένου να ληφθεί ένα γκρι κλίμακας εικόνα αναφοράς του σώματος. Φωτόνια που εκπέμπονται από το ποντίκι στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν σε πλήρες σκοτάδι, συλλέγεται και ολοκληρωμένη για μια περίοδο 2 λεπτών. Ένα χρώμα ψευδο εικόνα αντιπροσωπεύει την ένταση του φωτός (μπλε ως λιγότερο έντονο και το κόκκινο ως το πιο έντονο). Μετρήσεις είναι η ενσωμάτωση του συνολικού ποσού των σημάτων που ανιχνεύονται, αφαιρείται από το φόντο ολοκληρωμένο φως που εκπέμπεται από μια ίση έκταση από το ίδιο ποντίκι.

Η φαρμακοκινητική ανάλυση

in vivo

Η

Θηλυκά ποντίκια CB17.SCID εγχύθηκαν ίρ με μια απλή δόση (5 mg /kg σωματικού βάρους) NKp46D2-Ig ή NKp30-Ig. Επίπεδα πρωτεϊνών σύντηξης στον ορό προσδιορίστηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία, συμπεριλαμβανομένων 0 (προ-δόση) 0,25, 0,5, 1, 2, 6, 24, 48, 96, 168, 216, 264 και 336 ώρες μετά τη δόση χορήγησης. Σε κάθε χρονικό σημείο, 3 ποντικοί θυσιάστηκαν δείγματα αίματος συλλέχθηκαν σε σωλήνες διαχωρισμού, τα οποία επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά πριν από την φυγοκέντρηση (για να επιτρέψει την πήξη). Μετά από 30 λεπτά, οι σωλήνες φυγοκεντρήθηκαν αμέσως (10 λεπτά σε 10.000 rpm σε θερμοκρασία δωματίου) και ο ορός συλλέχθηκε. Επίπεδα πρωτεϊνών σύντηξης NKp30-Ig ή NKp46D2-Ig στον ορό αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια πρότυπη δοκιμασία ELISA.

Προσδιορισμός απόπτωσης

PC3 /

Luc

ή DU145 κυττάρων (50.000 /ml) επωάστηκαν με 5, 10 ή 50 μg /ml του NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-Ig ή PBS για 2 ώρες σε πάγο. Cross θέση της συνδέουσας αντίσωμα (έναντι ανθρώπινου IgG 1) ήταν από προστέθηκαν σε τελικές συγκεντρώσεις που ισούται με το 1/10 της ποσότητας πρωτεΐνης σύντηξης προστέθηκε προηγουμένως (0,5, 1 ή 5 μg /ml). Τα κύτταρα από επωάστηκαν στους 37 ° C για 48 ώρες και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο ανάλυσης αννεξίνης V /ΡΙ.

μακροφάγων διαμεσολαβείται δοκιμασίες θανάτωσης

ως κύτταρα τελεστές χρησιμοποιήσαμε περιτοναϊκά μακροφάγα που προέρχονται από CD1 γυμνά ποντίκια 5 ημέρες μετά την ένεση θειογλυκολικό. Ανακτήθηκε μακροφάγα ήταν από ενεργοποιείται για 2 ώρες με LPS (1 mg /ml). Ραδιενεργά επισημασμένα PC3 /

Luc

ή DU145 κυττάρων (1 * 10

4 /φρεάτιο σε επίπεδη πλάκα 96 φρεατίων) επωάστηκαν με τα ενεργοποιημένα με LPS μακροφάγα στις υποδεικνυόμενες αναλογίες E:T. Ειδικής λύσης καθορίστηκε μετά από 48 ώρες.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των κακοήθων πρωτοπαθούς καρκίνου του προστάτη στον άνθρωπο από NKp30 και NKp46

NKp46 και NKp30 είναι constrictively εκφράζονται στην επιφάνεια της ανάπαυσης, όπως καθώς και τα ενεργοποιημένα κύτταρα ΝΚ και δεσπόζει εμπλέκονται στη δολοφονία των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών

in vitro

. Ωστόσο, δεδομένου ότι τα κυτταρικά συνδέτες αυτών των υποδοχέων είναι ακόμη άγνωστες, λίγα είναι γνωστά για τους πρότυπο έκφρασης και διανομή σε διαφορετικές παθολογικές ρυθμίσεις.

καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται στερεού όγκου μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις δυτικές χώρες [22]. Δυστυχώς, δεν υπάρχουν αποτελεσματικές θεραπείες που είναι διαθέσιμες σήμερα για τη μοιραία ορμονοάντοχου στάδιο της νόσου. Για να ελέγξετε αν οι ανθρώπινους όγκους του προστάτη αναγνωρίζεται από το ΕΚΕΦΕ που βάφονται τα PC3 /

Luc

και κυτταρικές σειρές DU145 με πρωτεΐνες NKp30 και NKp46 συγχωνευμένο με ανθρώπινη IgG 1. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η θέση δέσμευσης του NKp46 σε διάφορους όγκους βρίσκεται στο εγγύτερο μεμβράνη τομέα και της περιοχής του ατμού του υποδοχέα (D2) και ότι η έκφραση του D2 συντηγμένη με ανθρώπινη IgG (NKp46D2-Ig) επιτρέπει την καλύτερη αναγνώριση των στόχων κύτταρα [13]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1α και β, και τα δύο PC3 /

Luc

και DU145 κύτταρα ειδικώς βάφτηκαν με NKp30-Ig και NKp46D2-Ig, αλλά όχι από τους ελέγχου CD99-Ig (γκρι ιστογράμματα), υποδεικνύοντας έτσι την έκφραση συνδετήρων για τις δύο αυτές ενεργοποιώντας τους υποδοχείς ΝΚ σε κυτταρικές γραμμές όγκου του προστάτη.

(a, b) NKp30-Ig και NKp46D2-Ig δεσμεύονται ειδικά σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη. PC3 /

Luc

(α) και DU145 (β) κυτταρικές γραμμές χρωματίστηκαν με NKp30-Ig, NKp46D2-Ig ή ελέγχουν CD99-Ig, που ακολουθήθηκε από αντι-ανθρώπινο αντίσωμα IgG 1 ΡΕ-συζευγμένα ποντικού. Grey ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν την χρώση υποβάθρου από την πρωτεΐνη σύντηξης CD99-Ig ελέγχου και τα μαύρα κενά ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τη χρώση είτε NKp30-Ig ή NKp46D2-Ig, όπως αναφέρεται στην κορυφή κάθε ιστόγραμμα. Ο αριθμός αυτός αντιπροσωπεύει το ένα πείραμα από τρία που εκτελούνται. (Γ) Η ανοσοϊστοχημική χρώση του πρωτογενούς ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος του προστάτη και την καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ) με NKp30-Ig και NKp46D2-Ig. Τεμάχια από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη εμπεδωθεί με παραφίνη (άνω πάνελ) και ΒΡΗ (κάτω πίνακας) ήταν αντιγόνου-ανακτώνται από μικροκύματα-κιτρικό θεραπεία. Τα πλακίδια στη συνέχεια χρωματίζονται με NKp30-Ig, αρνητικός έλεγχος CD99-Ig ή NKp46D2-Ig, που ακολουθήθηκε από σύμπλοκο βιοτινυλιωμένης-κατσίκα-αντι-ανθρώπινο-Ρο και αβιδίνη-βιοτίνη HRP. Υπόστρωμα για HRP ήταν AEC (κόκκινο χρώμα) και πλακίδια βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη. Το σχήμα δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό χρώση σε Χ400 μεγέθυνση. Arrow σε NKp30-Ig βαφή αδενοκαρκινώματος (πάνω αριστερά πάνελ) σημεία σε χρώση εκπρόσωπο της μεμβράνης. Ένταση χρώσης για πάνω αριστερά και πάνω πάνελ δικαίωμα αυτό θεωρείται ως 2 (βλέπε Μέθοδοι). (Δ) Η έκφραση της NKp30 και NKp46 συνδέτες είναι πλούσια σε κακοήθεις όγκους του προστάτη. Τεμάχια από διαφορετικούς ασθενείς που πάσχουν από καλοήθεις (

n

= 8) ή κακοήθη (

n

= 9) όγκους του προστάτη παρασκευάστηκαν και χρωματίστηκαν ως ανωτέρω. Η χρώση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Ανάλυση της έντασης χρώσης (0-3) και το ποσοστό των χρωματισμένο καρκινικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με δύο παθολόγους. Θετική χρώση ορίστηκε όταν χρώση ένταση ήταν πάνω από 1 και περικλείονται τουλάχιστον το 50% των κυττάρων, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι».

Η

Για να ελαττώσει τις παρατηρήσεις μας, αναλύσαμε την έκφραση προσδεμάτων για NKp30 και NKp46 στο πρωτογενές αδενοκαρκίνωμα του προστάτη και της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΒΡΗ) που προέρχεται από ανθρώπους ασθενείς. Φορμαλίνη σταθερού εμπεδωθεί με παραφίνη προστατική καρκίνους χρωματίστηκαν με NKp30-Ig, NKp46D2-Ig ή πρωτεϊνών σύντηξης ελέγχου (όπως CD99-Ig). Το σχήμα 1 c δείχνει αντιπροσωπευτικά παραδείγματα βάφονται ιστών και το Σχήμα 1δ συνοψίζει τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από 9 αδενοκαρκίνωμα και 8 καλοήθεις ιστούς καρκίνου του προστάτη. Όπως φαίνεται, 7/9 και 5/9 αδενοκαρκινώματα του προστάτη θετικώς βάφτηκαν με NKp30-Ig και NKp46D2-Ig, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας την ύπαρξη συνδετών για NKp30 και NKp46 επί των κακοήθων κυττάρων. Η έκφραση αυτών των αντιγόνων περιλάμβανε 50-95% των κυττάρων του όγκου με διαφορετικούς βαθμούς εντάσεις και έδειξε τόσο ενδοκυτταρικά και μεμβρανικές διανομής (Σχήμα 1γ, βέλος στο επάνω αριστερό σημείο του πίνακα με χρώση μεμβράνης). Αντίθετα, όλα τα τμήματα ΒΡΗ ελέγχθηκαν αρνητικά χρωματίστηκαν με NKp30-Ig ή NKp46D2-Ig, καθώς στις περισσότερες περιπτώσεις βάφτηκαν λιγότερο από το 10% των κυττάρων και η ένταση ήταν παρακάτω 1. Είναι σημαντικό, ούτε βάφτηκαν τα αδενοκαρκινώματα ούτε τα τμήματα ΒΡΗ μέσω του ελέγχου Ig πρωτεΐνη σύντηξης CD99-Ig (και άλλες πρωτεΐνες ελέγχου, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι παρόμοια με κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια, οι όγκοι που προέρχονται πρωτογενούς εκφράζουν επιλεκτικά προσδέματα για τους υποδοχείς ΝΚ λύση NKp30 και NKp46D2. Επιπλέον, η έκφραση αυτών των συνδετήρων άγνωστος επάγεται μόνο σε μετέπειτα στάδια της ασθένειας στην οποία αδενοκαρκίνωμα έχει ήδη εξελιχθεί.

NKp30-Ig αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή DU145

in vivo

Ig πρωτεΐνες σύντηξης έχουν προηγουμένως χρησιμοποιηθεί ως αποτελεσματικοί θεραπευτικοί παράγοντες στην κλινική πρακτική [23]. Εδώ δείχνουμε ότι οι δύο NKp30-Ig και NKp46D2-Ig δεσμεύονται ειδικά ανθρώπινων ιστών που προέρχονται από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, υποδεικνύοντας την παρουσία των ειδικών (αν και άγνωστη) συνδετήρες (Εικόνα 1Β και γ).

Για να καθοριστεί εάν NKp30 και NKp46D2 συγχωνευμένο με ανθρώπινη IgG 1 θα μπορούσε να μεσολαβήσει αποτελεσματική καταπολέμηση της ανταπόκρισης του όγκου

in vivo

, έχουμε ένεση γυμνά ποντίκια με τη σειρά ανθρώπινου όγκου του προστάτη DU145. Δύο εβδομάδες μετά την ένεση, όταν οι όγκοι έγιναν ορατές, (που ορίζεται ως ημέρα 1 στο Σχήμα 2) ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, ελέγχουν την ανθρώπινη IgG 1 ή PBS (σημείωση επεξήγηση του σχήματος 2 για την πορεία της θεραπείας και την αξιολόγηση της ανάπτυξης) . Σε αμφότερες τις ομάδες ελέγχου που έλαβαν ανθρώπινη IgG 1 (

n

= 10) ή PBS (

n

= 10), τα ζώα επέδειξαν ταχεία ανάπτυξη των όγκων (Σχήμα 2). Ομοίως, η NKp46D2-Ig ποντίκια που έλαβαν αγωγή (

n

= 9) έδειξε σταδιακή αύξηση του μεγέθους των όγκων, που δείχνει καμία θεραπευτική δράση. Σε αντίθεση, η αγωγή με NKp30-Ig (

n

= 10) είχε ως αποτέλεσμα μια αξιοσημείωτη καταστολή της ανάπτυξης του όγκου? από τη δεύτερη χορήγηση του NKp30-Ig (την ημέρα 7), οι όγκοι μεγέθους παρέμεινε σταθερή για τρεις εβδομάδες και μόνο μια μέτρια εξέλιξη ανιχνεύθηκε τις επόμενες ημέρες (σχήμα 2). Επιπλέον, 5 από 10 ποντικούς που εγχύθηκαν με NKp30-Ig, οι όγκοι εξαφανίστηκαν μετά τη δεύτερη ένεση (ημέρα 7) και δεν επανεμφανίζονται καν μέχρι και δύο μήνες μετά την τελευταία ένεση.

Αρσενικά γυμνά ποντίκια ένεση με τη σειρά ανθρώπινου όγκου του προστάτη DU145 (4 × 10

6), υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NKp30-Ig (

n

= 10), NKp46D2-Ig (

n

= 9) , τον έλεγχο της ανθρώπινης IgG 1 (

n

= 10), ή PBS (

n

= 10). Ημέρα 1 ορίζεται σε δύο εβδομάδες μετά την ένεση όταν οι όγκοι έγιναν ορατά. Οι αγωγές χορηγήθηκαν 5 φορές (ημέρες 1, 7, 15, 25 και 34, σημειωμένες με βέλη) και περιελάμβανε μια αρχική μεγαλύτερη δόση των πρωτεϊνών (20 mg /kg), ακολουθούμενη από μικρότερες δόσεις (10 mg /kg). Η πρόοδος του όγκου αξιολογήθηκε κάθε τρεις ημέρες με τη μέτρηση της διαμέτρου των όγκων. Τα γραφήματα δείχνουν την μέση διάμετρος (mm) των όγκων σε κάθε ομάδα που μετράται σε ημέρες 1-45.

Η

Η θεραπεία με NKp30-Ig μειώνει PC3 /

Luc

ανάπτυξη του όγκου em

in-vivo

η

Σπουδές μια πολύπλοκη βιολογική διεργασία, όπως η ανάπτυξη του όγκου και των επιπτώσεων της θεραπείας

in-vivo

απαιτεί ένα μοντέλο που είναι τόσο ευαίσθητο και αρκετά ακριβείς για να ανιχνεύσει ακόμη και λεπτές εξελίξεις. Πρόσφατα, μια νέα τεχνολογία απεικόνισης βιοφωταύγεια που επιτρέπει στους μη επεμβατική ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων

in-vivo

αναφέρθηκε [14], [24]. Αυτή η στρατηγική βασίζεται στην μεταμόσχευση ανθρώπινων καρκίνων που εκφράζουν σταθερά ένα γονίδιο αναφοράς, όπως

λουσιφεράσης (

Luc

), σε ποντικούς. Η έκφραση της λουσιφεράσης επιτρέπει

in-vivo

παρακολούθηση του σχετικού μεγέθους και της κατανομής των όγκων και μπορεί ως εκ τούτου να ανιχνεύσει επίσης μεταστατικών ανάπτυξη. Επιπλέον, το σύστημα αυτό είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και αξιόπιστη ανίχνευση σε ήσσονος όγκων που είναι δύσκολο ή ακόμα και αδύνατο να ανιχνεύει σε άλλες μεθόδους όπως τις άμεσες μετρήσεις του μεγέθους του όγκου ή ανάλυση FACS εκχυλίσματα όγκων [24]. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε την ανθρώπινου προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή PC3 επισημαίνονται με σταθερή έκφραση του γονιδίου λουσιφεράσης (PC3 /

luc

) που είχε προηγουμένως εφαρμοστεί και σε άλλες παρόμοιες

in-vivo

μοντέλα [14 ].

για την παρακολούθηση της επίδρασης των πρωτεϊνών σύντηξης NKp30-Ig και NKp46D2-Ig στην εξέλιξη της PC3 /

Luc

καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή

in-vivo

, εμείς ένεση ανδρικό γυμνό ποντίκια με PC3 /

Luc

κύτταρα. Τρεις εβδομάδες μετά την ένεση (που ορίζεται ως «σημείο εκκίνησης»), η ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε από την κάμερα CCCD και εκείνοι οι ποντικοί που εκφράζουν όγκοι που ήταν αρκετά μεγάλο για την μετάδοση ενός ολοκληρωμένου ένταση σήματος 100 μετρήσεις φωτονίων και παραπάνω, επιλέχθηκαν για περαιτέρω κατεργασία με NKp30 -Ig (

n

= 16), NKp46D2-Ig (

n

= 9) ή με PBS ως μάρτυρα (

n

= 8). Η θεραπεία περιλάμβανε μια ε.π. ένεση του PBS ή 4 mg /kg βάρους σώματος της σχετικής πρωτεΐνης σύντηξης, κάθε δεύτερη ημέρα για ένα μήνα. Στο τέλος της περιόδου θεραπείας (που ορίζεται ως «τελικό σημείο»), το μέγεθος του όγκου αξιολογήθηκε και πάλι στη μηχανή CCCD.

Όπως φαίνεται στο σχήμα 3α και συνοψίζεται στο σχήμα 4β, η αγωγή των ποντικών με NKp30-Ig είχε μια δραματική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου. Ενώ παρατηρήθηκε στην ομάδα ελέγχου (Σχήμα 3c και 4), η ταχεία αύξηση του μεγέθους του όγκου σε σχεδόν όλα τα ζώα (87,5%), NKp30-Ig-treatement οδήγησαν σε σημαντική μείωση στην πρόοδο του όγκου? σε 50% των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με NKp30-Ig ο όγκος μειώθηκε δραστικά στο 20% ή παρακάτω του αρχικού του μεγέθους (θεωρούνται ως «αποτελεσματική θεραπεία»), 25% έδειξε μερική επίδραση ενώ το 25% δεν απάντησε και ανέπτυξε προοδευτική όγκους. Επιπλέον, εκείνα τα ποντίκια στο οποίο αποκτήθηκε αποτελεσματική θεραπεία, δεν υποτροπή παρατηρήθηκε ακόμη 3 μήνα μετά την τελευταία χορήγηση NKp30-Ig. Σημαντικά, NKp30-Ig θεραπευτικό αποτέλεσμα δεν εξαρτιόταν από το αρχικό μέγεθος του όγκου, ως ανταπόκριση ή μη ανταπόκριση δεν συσχετίζεται με την αρχική σήμα που ανιχνεύεται από τον όγκο, όπως μετριέται στο «σημείο εκκίνησης» (αναφέρεται στον αριθμό πάνω από κάθε στήλη) .

Αρσενικά γυμνά ποντίκια ενέθηκαν με PC3 /

Luc

καρκινικά κύτταρα (15 × 10

6) στα SC αριστερά πλευρά. Τρεις εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου, τα ποντίκια ενέθηκαν (ε.π.) κάθε δεύτερη ημέρα για μια περίοδο ενός μηνός με 4 mg /kg NKp30-Ig (

n

= 16) (α), NKp46D2-Ig (

n

= 9) (β) ή PBS (

n

= 8) (γ). Η πρόοδος του όγκου παρακολουθήθηκε με μέτρηση εκπομπής φωτός από κάθε ποντικό στην έναρξη ( «σημείο εκκίνησης») και στο τέλος ( «τελικό σημείο») της περιόδου αγωγής. Υ-άξονες παριστάνουν τα σχετικά (σε ποσοστό) αλλαγές στο μέγεθος του όγκου μετά από αγωγή, όπως υπολογίζεται από την ολοκληρωμένη εκπομπή φωτός μετρήθηκε σε κάθε χρονικό σημείο (που αναφέρεται παραπάνω αριθμοί στήλες). Συρρίκνωση του όγκου κατά 20% ή κάτω από το αρχικό του μέγεθος αναφερόταν ως «αποτελεσματική θεραπεία». Ο αριθμός αυτός είναι μια περίληψη των δύο πειραμάτων και περιλαμβάνει όλα τα ποντίκια που ελέγχθηκαν. Θεραπεία

Η

NKp30-Ig κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη τόσο της DU145 και PC3 /

Luc

, αλλά με μια πιο εμφανή επίδραση στην PC3 /

Luc

(σχήματα 2-4). Αυτό δεν θα μπορούσε να αποδοθεί σε διαφορές στην έκφραση συνδέτη (σχήμα 1α) και θα μπορούσαν να αντανακλούν την ενισχυμένη προοδευτική αύξηση των DU145 σε σύγκριση με PC3 /

Luc

. Σε αντίθεση με NKp30-Ig και σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν παραπάνω (εικόνα 2), η θεραπεία NKp46D2-Ig είχε μόνο ένα οριακό αποτέλεσμα (Σχήμα 3Β και 4)? 66,6% των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με NKp46D2-Ig έδειξε προοδευτική ανάπτυξη όγκου, ενώ 22,2% και 11,1% ήταν μερικώς αποτελεσματικά θεραπευθούν ή να θεραπευθεί, αντίστοιχα.

(α) Οπτικοποίηση της εξέλιξης και της διανομής

in vivo όγκων

. Το σχήμα δείχνει μια απεικόνιση εικόνα από έναν εκπρόσωπο των ζώων της κάθε θεραπείας. Η κλίμακα για το δικαίωμα κάθε σχήμα περιγράφει το χάρτη χρώμα του αριθμού των φωτονίων. Η ολοκληρωμένη εκπομπή φωτός ( «εγώ») αναγράφεται στο αριστερό της κάθε φωτογραφίας. (Β) Σύνοψη της επίδρασης της θεραπείας. Ο Πίνακας περιγράφει το συνολικό αποτέλεσμα των θεραπειών, όπως φαίνεται με λεπτομέρειες στο σχήμα 3.

Η

Σχήμα 4α δείχνει μια απεικόνιση από έναν εκπρόσωπο ποντίκι από κάθε ομάδα θεραπείας. Στις περισσότερες περιπτώσεις, δεν παρατηρήθηκαν μεταστάσεις. Οι μετρήσεις του όγκου που περιγράφονται παραπάνω (σχήμα 3) αντιπροσωπεύουν το σύνολο της μάζας του όγκου ανιχνεύθηκε σε κάθε ζώο.

Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν σαφώς το θεραπευτικό δυναμικό της πρωτεΐνης σύντηξης NKp30-Ig για θεραπεία ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη

in vivo

.

η φαρμακοκινητική της NKp30-Ig και NKp46D2-Ig

στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι NKp30-Ig, αλλά όχι NKp46D2-Ig, μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Αυτή η επιλεκτική αποτέλεσμα ήταν εκπληκτικό δεδομένου ότι τόσο NKp30-Ig και NKp46D2-Ig παρόμοια συνδέονται με PC3 /

Luc

, DU145 (σχήμα 1α και β) και τα ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του προστάτη

in vitro

(σχήμα 1γ ). Έτσι, οι διαφορές μεταξύ του θεραπευτικού δυναμικού των NKp46D2-Ig και NKp30-Ig πρέπει να προκύπτει από τα άλλα χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της θεραπείας.

Ένας από τους πιο σημαντικούς παράγοντες στη θεραπεία του καρκίνου είναι το t

1/2 του θεραπευτικού παράγοντα. Προκειμένου να μεσολαβήσει ένα σημαντικό αποτέλεσμα κατά του όγκου οι πρωτεΐνες σύντηξης θα πρέπει να είναι σε θέση να φθάσουν τον ορό και παραμένουν σταθερά για αρκετές ώρες.

Για να εκτιμηθεί η σχετική σταθερότητα της σύντηξης πρωτεϊνών

in vivo

, τα ποντίκια έλαβαν μία μόνο δόση (5 mg /kg σωματικού βάρους) είτε NKp30-Ig ή NKp46D2-Ig και στη συνέχεια παρακολουθούνται για συγκεκριμένα επίπεδα πρωτεΐνης στον ορό κάθε λίγες ώρες για 14 ημέρες. Το μέγιστο επίπεδο των πρωτεϊνών μετριέται στον ορό ήταν παρόμοιο και για τις δύο NKp46D2-Ig και NKp30-Ig (Σχήμα 5Α και Β). Ωστόσο, παρατηρήθηκαν σαφείς διαφορές στην κινητική και τη σταθερότητα των δύο πρωτεϊνών σύντηξης? υψηλά επίπεδα NKp46D2-Ig προσδιορίστηκαν στον ορό μετά από 1 ώρα από την ένεση, αν και μειώθηκε γρήγορα στο αίμα και μέσα σε 2 ώρες αποδομήθηκε σχεδόν το 50% της πρωτεΐνης. Επιπλέον, μετά από 24 ώρες, μόνο μικρά ίχνη NKp46D2-Ig βρέθηκαν (Σχήμα 5Β). Αντίθετα, υψηλότερα επίπεδα NKp30-Ig ανιχνεύθηκαν στον ορό ήδη 30 λεπτά μετά την ένεση και διατηρήθηκαν για σχεδόν 2 ημέρες, μειώνοντας μόνο μετά από 120 ώρες (Σχήμα 1Α). Αυτές οι παρατηρήσεις αποδεικνύουν τη σχετική σταθερότητα του NKp30-Ig

in vivo

και μπορεί να εξηγήσει, τουλάχιστον εν μέρει, η αποτυχία των NKp46D2-Ig για να παραχθεί ένα θεραπευτικό αποτέλεσμα.

Τα ποντίκια ενέθηκαν ί.ρ. με μία δόση (5 mg /kg) του NKp30-Ig (α) ή NKp46D2-Ig (β). Ορός δείγμα συλλέχθηκαν (σε 0, 0,5, 1, 2, 6, 25, 48, 120, 168, 264 και 312 ώρες μετά την ένεση) και τα επίπεδα του NKp30-Ig ή NKp46D2-Ig προσδιορίστηκαν σε ένα πρότυπο ποσοτικό προσδιορισμό ELISA. Το σχήμα δείχνει το μέσο ποσό των πρωτεϊνών σύντηξης ανιχνεύθηκε στον ορό τριών ποντικών, μέτρο σε κάθε χρονικό σημείο. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD της τριπλούν.

Η

NKp30-Ig ενισχύει μακροφάγων κυτταροτοξικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων

in vitro

Η

Αρκετοί μηχανισμοί έχουν προταθεί για την ικανότητα των αντισωμάτων του όγκου να μεσολαβήσει η επίδρασή τους

in vivo

. Ένας πιθανός τρόπος με τον οποίο αυτά τα αντισώματα μπορεί να αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου είναι με σύνδεση στην επιφάνεια υποδοχείς που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [25]. Ως εκ τούτου, πρώτα ελεγχθεί αν η σύνδεση του NKp30-Ig σε άγνωστες συνδέτες όγκου του μπορεί να επάγει άμεση απόπτωση ή διακοπή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων σε καλλιέργεια. PC3 /

luc

και τα κύτταρα DU145 επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις NKp30-Ig, NKp46D2-Ig ή ελέγχουν πρωτεΐνη σύντηξης Ig για 48 ώρες υπό την παρουσία ενός σταυρού αντίσωμα σύνδεσης. Μετά την αγωγή, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε με Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο χρώση (ΡΙ). Η επώαση του είτε PC3 /

luc

ή DU145 κυττάρων με τις διάφορες πρωτεΐνες σύντηξης δεν είχε καμία επίδραση στα ποσοστά της απόπτωσης (Εικόνα 6Α και β) ως η μέση αυθόρμητη απόπτωση των PC3 /

luc

και DU145 κύτταρα (περίπου 25% και 8%, αντίστοιχα) παρέμεινε παρόμοια και δεν επηρεάστηκε από καμμία από τις αγωγές. Επιπλέον, δεν διακοπή του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκε, όπως εκτιμήθηκαν από θυμιδίνης δοκιμασίες ενσωμάτωσης (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν μετά από επώαση για 24 ώρες ή 72 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(a, b) NKp30-Ig δεν επάγει απόπτωση σε κύτταρα όγκου. PC3 /

luc

(α) ή DU145 (β) τα κύτταρα επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, ελέγχουν Ig ή PBS με την παρουσία ενός αντισώματος διασταυρούμενης σύνδεσης. Μετά από 48 ώρες, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε με Annexin V και χρώση ΡΙ. Το σχήμα δείχνει ένα από τα τρία πειράματα που πραγματοποιήθηκαν. (C, d) NKp30-Ig μπορούν να μεσολαβήσουν οψωνινοποίηση όγκου από μακροφάγα. Ραδιενεργά επισημασμένα PC3 /

Luc

(γ) ή κύτταρα DU145 (d) επωάστηκαν με LPS-ενεργοποιημένα μακροφάγα στις υποδεικνυόμενες αναλογίες E:T. Η ειδική λύση προσδιορίστηκε μετά από 48 ώρες. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± Τ.Α του τριπλούν. Το σχήμα παριστάνει ένα από τα τρία πειράματα που πραγματοποιήθηκαν. (Ε) Η διείσδυση των μακροφάγων στον ιστό του όγκου. Οι ανθρώπινοι όγκοι του προστάτη (DU145) αναπτύχθηκαν σε γυμνούς ποντικούς σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη. ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές χρωματίστηκαν σε αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Τα βέλη δείχνουν όγκου associated- μακροφάγα (X380). Ο αριθμός αυτός αντιπροσωπεύει το ένα από τα 5 τμήματα που εξετάστηκαν.

Η

Δεδομένου ότι τα καρκινικά κύτταρα δεν επιδεικνύουν καμία εγγενή ευαισθησία σε NKp30-Ig

in vitro

, είμαστε δίπλα δοκιμαστεί η ικανότητα των NKp30- Ig να επάγουν τελεστή μεσολάβηση θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. έχουν μακροφάγα προηγουμένως εμπλακεί ως σημαντικοί παράγοντες για τον έλεγχο αντισωμάτων εξαρτώμενη όγκου

in vivo

[26], [27]. Για να αξιολογηθεί η ικανότητα του NKp30-Ig για την ενίσχυση των μακροφάγων-μεσολαβούμενη λύση κυττάρων όγκου, οι ποντικοί εγχύθηκαν πρώτα (i.p.) με θειογλυκολικό, προκειμένου να προκαλέσει μια τοπική μη παθογόνου φλεγμονή και να προσλάβει μεγάλο αριθμό μακροφάγων στο περιτόναιο κοιλότητα. Πέντε ημέρες αργότερα, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα μακροφάγα απομονώθηκαν.