Αφηρημένο

Ο ανασταλτικός παράγοντας μετανάστευσης μακροφάγων (MIF), έχει ολοένα και εμπλέκεται στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου με την προώθηση της φλεγμονής, αγγειογένεση, κυττάρου όγκου επιβίωση και ανοσοκαταστολή. MIF υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία στερεών τύπων όγκων εν μέρει λόγω της ανταπόκρισης του σε υποξία διεγέρσιμο παράγοντα (HIF) οδηγείται μεταγραφικής ενεργοποίησης. έκκριση MIF, όμως, είναι μια ελάχιστα κατανοητή διαδικασία λόγω του γεγονότος ότι MIF είναι ένας ακέφαλη πολυπεπτίδιο το οποίο ακολουθεί ένα μη-κλασσικής εκκριτικής οδού. Καλύτερη κατανόηση της επεξεργασίας και την απελευθέρωση MIF θα μπορούσε να έχει θεραπευτικές συνέπειες. Εδώ, έχουμε ανακαλύψει ότι η ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR) και άλλα επιβλαβή καταπονήσεις DNA μπορούν να επάγουν ισχυρή έκκριση MIF σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές. ΠΔΠ έκκριση από IR εμφανίζεται ανεξάρτητα από ABCA1, τη χοληστερίνη αντλία εκροής που έχει εμπλακεί στο παρελθόν σε έκκριση ΠΔΠ. Ωστόσο, η έκκριση ΠΔΠ δυναμικά που προκαλούνται από το οξειδωτικό στρες. Είναι σημαντικό ότι, η έκκριση MIF μπορεί να παρατηρηθεί τόσο σε μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας καθώς και σε όγκους σε ποντικούς εν ζωή. Ταχεία εξάντληση του MIF από τα κύτταρα του όγκου που παρατηρείται ανοσοϊστοχημικά συμπίπτει με αυξημένα κυκλοφορούντα MIF ανιχνεύεται στους ορούς αίματος ακτινοβολημένων ποντικών. Με δεδομένη την ισχυρή όγκου προώθηση δραστηριοτήτων του MIF, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μια έμφυτη αντίδραση του ξενιστή στο γονοτοξικό στρες μπορεί να μετριάσει τα ευεργετικά αποτελέσματα της θεραπείας του καρκίνου, και ότι η αναστολή του MIF μπορεί να βελτιώσει την θεραπευτική απαντήσεις

Παράθεση:. Gupta Υ, Pasupuleti V, W Du, Welford SM (2016) μετανάστευση μακροφάγων ανασταλτικό παράγοντα έκκριση επάγεται από ιοντίζουσα ακτινοβολία και το οξειδωτικό στρες στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 11 (1): e0146482. doi: 10.1371 /journal.pone.0146482

Επιμέλεια: Ester Hammond, Πανεπιστήμιο της Οξφόρδης, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: May 14, 2015? Αποδεκτές: 17 Δεκεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 7 του Γενάρη, 2016

Copyright: © 2016 Gupta et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα στοιχεία που είναι απαραίτητα να αναπαράγουν τα ευρήματα αυτής της μελέτης περιλαμβάνονται στο έγγραφο

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το NCI (CA178157), η αμερικανική Εταιρεία Καρκίνου (RSG-12-097-01-CCG), και η AACR (14-60-36WELF). Βασικές εγκαταστάσεις στην υπόθεση Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου υποστηρίχθηκαν από P30CA043703. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παράγοντας αναστολής μετανάστευσης μακροφάγων (MIF) είναι μια πλειοτροπική κυτοκίνη με προφλεγμονώδεις και prosurvival επιδράσεις εμπλέκονται μια ποικιλία ανθρώπινων νοσηρών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [1]. MIF υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος, στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, μελάνωμα, γλοιοβλάστωμα, και καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων σαφής κύτταρο (ccRCC) [2-4]. Ανατίμηση των αυξημένων επιπέδων MIF έχει οδηγήσει σε στόχευση των στρατηγικών και μελέτες βιοδεικτών που κατέχουν υπόσχονται να βελτιώσουν τις θεραπείες του καρκίνου.

ΠΔΠ είναι ένα προ-ογκογόνο πρωτεΐνη που επηρεάζουν τα κύτταρα του όγκου και στρώματος του όγκου μέσω διαφόρων μηχανισμών. Λειτουργώντας ως τριμερές, MIF έχει δειχθεί ότι προκαλούν σηματοδότηση μέσω του υποδοχέα CD74-CD44 σύμπλοκο [5,6] και τους υποδοχείς χημειοκίνης CXCR2 και CXCR4 [7] για να σηματοδοτήσει αντιαποπτωτικών και prosurvival οδούς μέσω ΜΑΡΚ, ΑΚΤ, και Src σε ένα τεράστιο συστοιχία κυτταρικών τύπων [8]. MIF έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν σταθερότητα της πρωτεΐνης p53 [9-11], η μετανάστευση επίδραση σε κύτταρα όγκου [12], την προώθηση της διήθηση φλεγμονωδών /ανοσοκατασταλτικά κυττάρων σε όγκους [13,14], και για την προώθηση αγγειογένεση μέσω στρατολόγηση και την επέκταση του ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (EPC) [15,16]. Μαζί, η πολυπλοκότητα των ΠΔΠ που σχετίζεται με τις λειτουργίες του καρκίνου υπογραμμίζουν τη σημασία της κατανόησης νέων πτυχών του MIF βιολογίας.

Οι μελέτες μας έχουν εντοπίσει έναν κρίσιμο ρόλο για ΠΔΠ σε καρκίνο του νεφρού [12,17]. ccRCC είναι ένα κοινό φαινότυπο όγκου της νόσου von Hippel-Lindau με τον οποίο τα άτομα κληρονομούν ετερόζυγο αδρανοποίηση του von Hippel-Lindau ογκοκατασταλτικό γονίδιο (VHL), και να αναπτύξουν την απώλεια της ετεροζυγωτίας σε όλη τη διάρκεια της ζωής τους. Σποραδικές περιπτώσεις ccRCC επίσης συνήθως φιλοξενούν ελαττώματα VHL, υπογραμμίζοντας τη σημασία της στον καρκίνο του νεφρού [18]. Η πιο καλά κατανοητό λειτουργία του VHL είναι να χρησιμεύσει ως μια Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης τον έλεγχο της σταθερότητας του υποξίας επαγώγιμου παράγοντα HIF υπομονάδων 1α και 2α σε ένα τρόπο που εξαρτάται οξυγόνου. Απώλεια VHL οδηγεί σε συστατική ενεργοποίηση των συμπλοκών μεταγραφής HIF, και η υπερέκφραση των κανονικών γονιδίων στόχων HIF, όπως GLUT1, VEGF, και CAIX, στη νεφρική καρκίνους. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι MIF είναι ένας άμεσος γονίδιο στόχος HIF [19,20], ότι τα κυκλοφορούντα επίπεδα MIF αυξημένη σε ασθενείς ccRCC, και ότι MIF knockdown όγκοι αναπτύσσονται πολύ πιο αργά από τους ελέγχους τους σε ζωικά μοντέλα [17]. Ο υποδοχέας MIF, CD74, έχει επίσης δειχθεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ccRCC [21].

Ενώ οι μηχανισμοί που ελέγχουν την έκφραση του MIF έχουν τεκμηριωθεί, έκκριση MIF συμβαίνει μέσω μια κακώς περιγράφεται οδό. Η διέγερση με LPS, υποξία, την έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία και φωτοδυναμική θεραπεία έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε έκκριση του MIF σε κύτταρα τόσο διαφορετικά όπως τα μακροφάγα, τα Τ-κύτταρα, δενδρίτες, ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα [15,22-26]. ΠΔΠ είναι μια ακέφαλη πολυπεπτίδιο εκκρίνεται μέσω μη-κλασική μηχανισμοί πιθανώς παρόμοια με την IL-1β και FGF1 και FGF2 [27]. IL-1β έχει προταθεί για να εκκρίνεται μέσω inflammasomes, εξωκυττάρωση της εκκριτικής λυσοσώματα, μικροκυστίδια, εξωσώματα και αυτοφαγοσώματα [28]. Αναστολή της ΑΤΡ-σύνδεσης μεταφορέα κασέτας (ABCA1) μπορεί να επηρεάσει την έκκριση της IL-1β [29]. Ομοίως, τα πειράματα αναστολής ΑΒΟΑ1 έχουν δείξει ανασταλτικά για ΠΔΠ έκκριση [27]. Μείωση του MIF έκκριση εξαιτίας 17β-οιστραδιόλη φάνηκε να συσχετίζεται με μία μείωση των ABCA1 mRNA και η πρωτεΐνη [30]. Πώς έκκριση MIF ρυθμίζεται σε καρκίνο είναι άγνωστος, και η στόχευση του MIF στο επίπεδο της έκκρισης μπορεί να έχει θεραπευτική σημασία.

Στην παρούσα μελέτη, ανακαλύψαμε ότι η έκκριση MIF μπορεί να επαχθεί από τις ιονίζουσες ακτινοβολίες (IR) και άλλες παράγοντες βλάβης του DNA σε νεφρική, του μαστού και του καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα. Ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ του μονοπατιού βλάβη του DNA και την έκκριση MIF, καθώς ο καταστολέας όγκου ρ53 ρυθμίζεται αυξητικά με την παρουσία της βλάβης του DNA και αποδεικνύεται ότι αναστέλλεται από MIF [11]? αλλά διαπίστωσε ότι η έκκριση ΠΔΠ είναι p53 ανεξάρτητη επειδή η έκκριση συμβαίνει σε ρ53 μεταλλαγμένα ή μηδενική κύτταρα. Σε αντίθεση, η έκκριση MIF προκλήθηκε από το οξειδωτικό στρες, μια κοινή μεσολαβητής μιας ποικιλίας διεγέρτες της έκκρισης MIF. Τέλος, βρήκαμε αυξημένη έκκριση MIF σε ποντικούς που φέρουν όγκο μετά από έκθεση σε ακτινοβολία. Έτσι, προτείνουμε ότι οι ΠΔΠ έκκριση σε συμπαγείς όγκους μπορεί να είναι ένα ελαφρυντικό για τον έλεγχο του όγκου σε κοινές θεραπείες του καρκίνου.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι εργασίες των ζώων έγινε σύμφωνα με με το πρότυπο τις κατευθυντήριες γραμμές, και εγκρίθηκε από το Case Western Reserve University IACUC, έγκρισης 2012 – 0183. Κεταμίνη /ξυλαζίνη αναισθησία χρησιμοποιήθηκε για την ελαχιστοποίηση της δυσφορίας των ζώων κατά θεραπείες ακτινοβολίας. Τα ποντίκια στεγάζονται σε κλουβιά μικροαπομονωτικά και ήταν φροντίδα από CWRU κτηνιατρική και την κτηνοτροφία προσωπικό σε καθορισμένες εγκαταστάσεις των ζώων. Τα ποντίκια τράφηκαν με κανονική δίαιτα, αποστειρωμένο νερό, και τους δόθηκε τυπική κρεβάτι. Η συμμόρφωση με τις κατευθυντήριες γραμμές ΦΘΑΣΕΙ περιγράφονται στον Πίνακα S1.

Αντιδραστήρια

Η καμπτοθεκίνη (C9911), και Αδριαμυκίνη (D1515) αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich. Ανθρώπινα MIF ELISA διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Duoset ELISA Development Kit από το R &? D Systems (DY289? Minneapolis, MN, USA) ακολουθώντας το δεδομένο πρωτόκολλο

Cells, καλλιέργειας κυττάρων και κατασκευάζει

RCC4. , 786-0, και τα κύτταρα MCF7 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Thermo Scientific, Logan, UT) με 10% FBS (Invitrogen), και διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C. shABCA1 και shGFP ελήφθησαν από Open Biosystems (Thermo Scientific, Logan, UT): TRCN0000276420 και RHS4459, αντίστοιχα. Για θεραπείες ακτινοβολίας, 500.000 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 cm και αφέθηκαν να προσκολληθούν για μία νύχτα. 2 ώρες πριν από την ακτινοβόληση, τα μέσα άλλαξαν για να ελαχιστοποιηθεί η συνεισφορά της βασικής έκκρισης MIF. Ακτινοβολίες πραγματοποιήθηκαν σε Shepherd Mark I

137Cs σταθερό ακτινοβολίας πηγή στο Μηχανισμό υπόθεση Comprehensive Cancer Center Ακτινοβολία Πόρων Core.

διαχωρισμό πρωτεΐνη, ανάλυση κηλίδος Western, ανοσοϊστοχημεία

λύματα πρωτεΐνη συλλέχθηκαν το 9Μ του Ουρία, ρυθμιστικό 0.075 Μ Tris (pH 7,6) και να ποσοτικοποιηθούν χρησιμοποιώντας BCA δοκιμασία. Τα δείγματα έτρεξαν σε πηκτές SDS-PAGE χρησιμοποιώντας πρότυπο πρωτόκολλο. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αντι-ΜΙΡ (1: 2500) (Santa Cruz, sc-20121), αντι-ρ53 (1: 500) (Santa Cruz? Sc-1315), αντι-PS15 p53 (1: 1000) (κυτταρική σηματοδότηση ? 9284S), ΑΒΟΑ1 (1: 1000) (Genscript, A00121) και αντι-β-ακτίνη (1: 50.000) (Santa Cruz? sc-47778). Όγκου χρώση ενότητα για ΠΔΠ έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12,17].

Μελέτες σε ζώα

3Χ10

6 786-0 κύτταρα εμφυτεύεται υποδόρια σε 40 ηλικίας 8-10 εβδομάδων θηλυκά NCR ηυ /ηυ αγοράστηκαν από το Μηχανισμό αθυμικά πυρήνα στην υπόθεση Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου. Ελέγχου και πειραματικές ομάδες τυχαιοποιήθηκαν και ακτινοβολούνται φορά όγκοι έφτασαν ένα εκατοστό

3. Τελική μεγέθη δειγμάτων ήταν μάρτυρες (χωρίς IR) n = 7, 0,5 ώρες μετά από 4 Gy IR n = 7, 2 ώρες μετά IR n = 10, 6 ώρες μετά IR n = 8, και 24 ώρες μετά την IR n = 8 . Ορός συλλέχθηκε με καρδιακή παρακέντηση μόλις πριν την θυσία στο τέλος κάθε χρονικό σημείο.

Στατιστικές αναλύσεις

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε GraphPad Prism με t τεστ Student για όλες τις παρουσιαζόμενες τιμές ρ, εκτός από το ζώο δεδομένα ELISA στην οποία μια μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε, όπως υποδεικνύεται. ρ τιμές κάτω από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Όλες οι γραμμές σφάλματος υποδεικνύουν τυπικές αποκλίσεις. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές, αλλά γενικά τρεις ή περισσότερες φορές.

Αποτελέσματα

ιοντίζουσα ακτινοβολία επάγει την έκκριση ΠΔΠ

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της ακτινοβολίας στην έκφραση ΠΔΠ σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα, στύπωμα Western αναλύσεις ccRCC κυτταρικών γραμμών RCC4 και 786-O διεξήχθησαν. Μετά από 4 Gy ακτινοβολίας, βρήκαμε μια σημαντική μείωση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα MIF μέσα σε 15-30 λεπτά (Σχήμα 1Α και 1Β). Η μείωση των επιπέδων του MIF ανακτάται μετά από 1 hr σε 786-Ο κύτταρα, αλλά πήρε 24 ώρες σε κύτταρα RCC4. Ως μάρτυρας για τη σηματοδότηση βλάβης του DNA, αξιολογήσαμε ρ53 φωσφοσερίνης 15 επίπεδα (pS15-p53) σε κύτταρα RCC4. Είναι ενδιαφέρον, MIF και pS15-p53 επίπεδα φάνηκε να anticorrelated, τόσο της ταχείας απαντήσεις μέσα σε λίγα λεπτά της έκθεσης. Για να προσδιοριστεί η μοίρα του MIF μετά από ακτινοβόληση, μετρήσαμε MIF στα προσαρμοσμένα μέσα με ELISA. Πράγματι, 1 ώρα μετά την ακτινοβόληση, βρήκαμε ισχυρή και στατιστικά σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα MIF εκκρινόμενη σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ 1D και 1Ε).

Α) κηλίδα Western κυττάρων RCC4 επεξεργασία με 4 Gy IR και λύθηκαν σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την έκθεση χρωματίστηκαν με φωσφοσερίνη 15 ρ53, MIF, και β-ακτίνη αντισώματα. επίπεδα MIF βρέθηκαν να μειώνονται κατά 0,25 ώρες και να ανακτήσει από 24 ώρες. Β) στύπωμα Western των κυττάρων 786-Ο υποβάλλεται σε επεξεργασία με 4 Gy IR και λύθηκαν σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την έκθεση. Γ) Western στύπωμα κυττάρων MCF7 σε επεξεργασία με 4 Gy IR και λύθηκαν σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την έκθεση. DF) ανάλυση ΠΔΠ ELISA για τα κύτταρα ακτινοβολούνται σε πάνελ (AC) στο χρονικό σημείο μιας ώρας.

Η

Για να επεκτείνει τις παρατηρήσεις μας πέρα ​​από νεφρική γραμμές καρκίνου, ελέγξαμε επίσης τις επιπτώσεις της έκθεσης σε ακτινοβολία σε επίπεδα MIF στο η κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MCF-7 και η γραμμή καρκίνου του πνεύμονα Η1299. Σε συμφωνία με τις κυτταρικές σειρές νεφρού, βρήκαμε ακτινοβολία προκάλεσε πτώση των κυτταρικών επιπέδων ΠΔΠ μέσα σε 30-60 λεπτά, και μια σχετική αύξηση του εξωκυττάριου MIF στα μέσα μαζικής ενημέρωσης (Σχήμα 1Γ, 1Δ, 1Ε και 1). Έτσι, τα δεδομένα υποστηρίζουν μια γενικευμένη επίδραση στην έκκριση ΠΔΠ μετά από IR.

έκκριση MIF προκαλείται από το DNA καταστροφικές τάσεις

Για να μελετηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ της έκκρισης του MIF και βλάπτουν το DNA τονίζει, υποβάλλαμε RCC4 κυττάρων σε διάφορες κυτταρικές στρεσογόνους παράγοντες που είναι γνωστό ότι προκαλούν βλάβη του DNA. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ αδριαμυκίνη ή 4μΜ καμπτοθεκίνη, τοποϊσομεράσης II και Ι αναστολείς, αντίστοιχα, για τέσσερις ώρες, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για western blot. Όπως ακτινοβολία, τόσο αδριαμυκίνη και καμπτοθεκίνη οδήγησε σε σταθεροποίηση και φωσφορυλίωση της ρ53 σε σερίνη 15, όπως επίσης και σημαντικές μειώσεις στα κυτταρικά επίπεδα του MIF σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου επεξεργασμένα DMSO (σχήμα 2Α). Επειδή οι 786-O κύτταρα είναι γνωστό ότι είναι p53 μεταλλαγμένο [31], έχουμε την υποψία ότι ΠΔΠ έκκριση μετά από βλάβη του DNA είναι ανεξάρτητη p53. Για να δοκιμαστεί τυπικά τον ρόλο της ρ53, εκθέσαμε το p53-ανεπαρκή καρκίνου του πνεύμονα κυτταρική γραμμή Η1299 [32] για να IR και αξιολογούνται ξανά έκκριση MIF. Όπως και οι δύο από τις νεφρικές σειρές καρκίνου και τη γραμμή MCF7, έκκριση MIF ήταν αποτελεσματικά επάγεται (Σχήμα 2Β). Έτσι υποθέσαμε ότι μάλλον μια κοινή μεσολαβητής του στρες ζημιά θα μπορούσε να είναι ο ένοχος της έκκρισης MIF. Μια ποικιλία από καταπονήσεις έχουν αναφερθεί ότι οδηγούν σε έκκριση MIF, συμπεριλαμβανομένων υποξία [15], LPS [23], η φωτοδυναμική θεραπεία (PDT) [24], UV [25], και τώρα IR. Ένα κοινό θέμα σε όλες αυτές τις καταπονήσεις είναι η επαγωγή αντιδραστικών μορφών οξυγόνου (ROS), που η ίδια έχει δειχθεί άμεσα να διεγείρει την έκκριση MIF σε καρδιομυοκύτταρα [33]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αδριαμυκίνη και καμπτοθεκίνη είναι επίσης γνωστό ότι επάγει ROS [34-36]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε εάν MIF έκκριση σε κύτταρα όγκου θα μπορούσε να προκληθεί με H

2O

2 μεσολάβηση οξειδωτικού στρες. RCC4, 786-0, και τα κύτταρα Η1299 διεγέρθηκαν με 10 mM H

2O

2 επί 2 ώρες, μια δόση σχετικώς ισοδύναμο με 4 Gy ιονίζουσα ακτινοβολία με διπλό μέτρα παραγωγή σπάσιμο κλώνου και την επιβίωση [37], μετά την οποία τα μέσα ενημέρωσης συλλέχθηκε και αναλύθηκε για MIF έκκριση με ELISA. Παρατηρήσαμε μια 6.9 φορές αύξηση στην έκκριση MIF από τα κύτταρα RCC4, μια 5,2 φορές αύξηση από 786-0, και μία 11,2 φορές αύξηση από Η1299 (Σχ 2C). Έτσι κυττάρου όγκου στρες από χημειοθεραπεία και ακτινοβολία μπορεί να διεγείρουν την έκκριση MIF μέσω ενός οξειδωτικού μονοπατιού στρες.

Α) Western στύπωμα της RCC4 κυττάρων μετά 4 ώρες επεξεργασίας με 10 μΜ αδριαμυκίνη, 4 μΜ καμπτοθεκίνη, ή 4 Gy IR που ανιχνεύτηκε με φωσφοσερίνη 15 ρ53, ρ53 σύνολο, MIF, και β-ακτίνη αντισώματα. Β) Ανάλυση MIF ELISA για Η1299 κύτταρα ακτινοβολημένα και δοκιμάστηκαν στο χρονικό σημείο μιας ώρας. Γ) MIF ELISA επί RCC4, 786-O, και Η1299 κυττάρων ρυθμισμένα μέσα μετά από διέγερση με 10 mM H

2O

2 επί 2 ώρες. Δ) στυπώματος Western προϊόντων λύσης κυττάρου με RCC4 ABCA1 knockdown με shRNA σε σύγκριση με συγκριτικούς shGFP ανιχνεύθηκαν με ABCA1 και β-ακτίνη αντισώματα. Ε) Η έκκριση του MIF μετρήθηκαν με ELISA από κύτταρα shABCA1 και shGFP RCC4 στα 30 λεπτά και 60 λεπτά μετά 4 Gy IR. ΣΤ) Η έκκριση του MIF μετρήθηκαν με ELISA από κύτταρα shABCA1 και shGFP RCC4 στα 60 λεπτά μετά από έκθεση σε 10 mM H

2O

2. G) Η έκκριση του MIF μετρήθηκαν με ELISA από RCC4 και 786-Ο κύτταρα με ή χωρίς VHL resonstitution στα 60 λεπτά μετά την έκθεση σε 4 Gy IR.

Η

Ακτινοβολία και ROS προκαλούμενη έκκριση MIF γίνεται ανεξάρτητα από ABCA1

MIF έχει αναφερθεί να διαμένουν σε προσχηματισμένα ενδοκυτταρική πισίνες, αλλά ο μηχανισμός με τον οποίο εκκρίνεται ΠΔΠ έχει εδώ και καιρό φευγαλέα [38]. Δεδομένου του ρόλου του MIF σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων ccRCC, και η χρήση του ως ένας διαγνωστικός δείκτης για καρκίνο του προστάτη [39], ο προσδιορισμός του μηχανισμού θα μπορούσε να αποφέρει πιθανούς θεραπευτικούς στόχους. Δεδομένου ότι ο μεταφορέας ABCA1 έχει ενοχοποιηθεί την οδό εξαγωγής του MIF, αποφασίσαμε να δοκιμάσει άμεσα το ρόλο των ABCA1 στην έκκριση που προκαλείται από ακτινοβολία. ΑΒΟΑ1 χτυπήθηκε κάτω, μέσω της χρήσης των shRNA στα κύτταρα RCC4, όπως επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western (Σχήμα 2D). Έλεγχος shGFP και shABCA1 κύτταρα knockdown RCC4 στη συνέχεια εξετέθησαν σε 4 Gy ακτινοβολίας, και το μέσο ελέγχθηκε σε 30 λεπτά και 60 λεπτά για την έκκριση MIF με ELISA (Σχήμα 2Ε). Τα αποτελέσματα έδειξαν έκκριση MIF δεν επηρεάστηκε από την knockdown του μεταφορέα ABCA1. Δοκιμάσαμε περαιτέρω εάν H

2O

2 μεσολαβεί ROS άγχος θα επηρεάσει την έκκριση σε ABCA1-εξαρτώμενο τρόπο. Παρόμοια με IR, ROS το άγχος φαίνεται να επάγουν την έκκριση σε ΑΒΟΑ1 ανεξάρτητο τρόπο (Σχήμα 2F). Τέλος, επειδή η έκφραση του MIF Σημειώνεται ότι είναι αυξημένα στο ccRCC, συμπεριλαμβανομένων RCC4 και 786-Ο κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν εδώ, λόγω της απενεργοποίησης του καταστολέα VHL όγκου και μετέπειτα υπερενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής HIF [17], μπορούμε επόμενο ερώτημα εάν συστατική ενεργοποίηση του HIF είχε αντίκτυπο στην έκκριση MIF. RCC4 και 786-O γονικής και VHL ανασυσταθεί κύτταρα έτσι υποβάλλονται σε H

2O

2 θεραπεία, και προσαρμοσμένα μέσα ελέγχθηκαν για έκκριση ΠΔΠ. Άλλα από τα αναμενόμενα μειωμένα επίπεδα του MIF λόγω κάτω ρύθμιση των HIF, η έκκριση του MIF ήταν προφανώς ανεπηρέαστη από VHL (Σχήμα 2G). Παραμένει πιθανή καθώς η παραγωγή MIF επηρεάζεται μετά την αρχική εκκριτική περίπτωση μετά από το οξειδωτικό στρες. Έτσι συμπερασματικά, έκκριση MIF εξής IR φαίνεται να είναι εξαρτώμενη από ROS αλλά ABCA1 και VHL ανεξάρτητοι.

έκθεση IR σε ξενομοσχεύματα όγκου ccRCC οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα κυκλοφορούντων MIF

ορού επίπεδα MIF στον καρκίνο έχουν γίνει ιδιαίτερο ενδιαφέρον στο κλινικό περιβάλλον [40]. Οι παρατηρήσεις μας προτείνουν θεραπείες όγκων μπορεί να επηρεάσει λειτουργικά επίπεδα MIF πέρα ​​από την απλή ανύψωση από την ανάπτυξη του καρκίνου, και το σημαντικότερο θα μπορούσε δυνητικά να οδηγήσει σε άμβλυνση των ογκοκτόνο αποτελέσματα. Για να επικυρώσετε μας

in vitro

ευρήματα της ιονίζουσας ακτινοβολίας που προκαλείται από την έκκριση του ΠΔΠ, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο υποδόριου ξενομοσχεύματος ποντικού. Ογκογονικά 786-Ο κύτταρα εμφυτεύθηκαν σε γυμνούς ποντικούς λόγω της ταχείας ανάπτυξης του όγκου τους και άφθονη έκφραση του MIF και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε μέγεθος ~ 1 cm

3. Τα ζώα στη συνέχεια τυχαιοποιήθηκαν και ακτινοβολήθηκε με 4.0 Gy IR. Σε 0,5, 2, 6, και 24 ώρες μετά την ακτινοβολία, τα ζώα θυσιάστηκαν και οι οροί και καρκινικών ιστών συλλέχθηκαν. τομές ιστών όγκου χρωματίστηκαν για MIF παρουσίασαν δραματική μείωση στην κηλίδωση ΠΔΠ σε 30 λεπτά και 2 ώρες σε σύγκριση με μη ακτινοβολημένα όγκους, με επιστροφή σε επίπεδα βασικής γραμμής στις 24 ώρες (Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια εξετάστηκαν οι οροί αίματος για την ανίχνευση των κυκλοφορούντων MIF. Βρήκαμε, κατά χρονικά συντονισμένο τρόπο, ότι υπήρξε μια ακίδα στην κυκλοφορία του MIF στις 2 ώρες, μειώθηκε κατά 6 ώρες και επιστρέφουν στα βασικά επίπεδα στις 24 ώρες, αντικατοπτρίζοντας αποτελεσματικά την επίδραση στο επίπεδο των ιστών του όγκου (Σχήμα 3Β). Έτσι, η ανάλυση των όγκων δείχνει ότι η επίδραση της ακτινοβολίας επί της έκκρισης MIF δεν περιορίζεται σε κύτταρα σε καλλιέργεια, αλλά ανακεφαλαιώνονται σε όγκους in vivo.

Α) Ανοσοϊστοχημική χρώση MIF σε τομές όγκων 786-Ο σε 0.5, 2, 6, ή 24 ώρες μετά από 4 Gy IR. Διαφορετικές όγκοι χρησιμοποιήθηκαν για κάθε χρονικό σημείο. Κλίμακα ράβδου = 50 μm Β) ELISA των κυκλοφορούντων επιπέδων του ανθρώπινου MIF σε ορούς ποντικού από 786-O ποντικών που φέρουν όγκο σε 0,5, 2, 6, ή 24 ώρες μετά από 4 Gy IR. Οι αριθμοί των ζώων για κάθε υποδεικνυόμενο σημείο. Η στατιστική σημαντικότητα μετρήθηκε με μονόδρομη ANOVA.

Η

Συζήτηση

Επανεμφάνιση των όγκων μετά την ακτινοβολία είναι ένα σημαντικό θεραπευτικό εμπόδιο που μπορεί να αποδοθεί σε διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων επιβίωση των ραδιοανθεκτικά κύτταρα όγκου, φλεγμονώδεις αποκρίσεις και ανοσοκαταστολή, και επαναγγείωση του ακτινοβολημένου πεδίο [41]. Η πλειοτροπική φύση του ΠΔΠ σηματοδότησης συνεπάγεται ένα ευρύ ρόλο για ΠΔΠ στην προώθηση του καρκίνου, και στην υποτροπή του καρκίνου. Στην τρέχουσα χαρτί, έχουμε ανακαλύψει νέα ερεθίσματα του MIF έκκριση σε καρκίνο που θα μπορούσε να έχει κλινικές επιπτώσεις. Θεωρούμε ότι ιονίζουσα ακτινοβολία και άλλους παράγοντες βλάβης του DNA μπορεί να οδηγήσει σε δραματικές μειώσεις στα κυτταρικά επίπεδα MIF με διέγερση έκκριση στο εξωκυττάριο περιβάλλον. Η έκκριση μπορεί να διεγείρεται σε κύτταρα τουλάχιστον σαφής καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, καρκίνο του μαστού, καρκίνο του πνεύμονα και προέλευση, και εμφανίζεται τόσο in vitro και in vivo. Έκκριση φαίνεται να είναι τόσο p53 και ΑΒΟΑ1 ανεξάρτητη, αλλά τα στοιχεία μας δείχνουν μια κοινά αναγνωρισμένων ερεθίσματα της έκκρισης ΠΔΠ να είναι ένα οξειδωτικό στρες μηχανισμό μεσολάβηση. Στο πλαίσιο της θεραπείας του καρκίνου, αυξημένη έκκριση MIF θα μπορούσε να προωθήσει ισχυρός επιβίωση καρκινικών κυττάρων, φλεγμονή, και αγγειογόνων επιπλοκές. Ως εκ τούτου, τα στοιχεία αναδεικνύουν το πιθανό όφελος του επικουρικού αναστολής MIF να αξιοποιηθεί πλήρως το δυναμικό της αντικαρκινικής θεραπείας.

Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ παρατηρείται έκκριση ΠΔΠ σε αρκετές κυτταρικές σειρές μετά την IR, ενώ άλλοι δεν έχουν δει τέτοια μείωση στην κυτταρική ΠΔΠ. Youn et al. έχουν διερευνηθεί πρόσφατα την επίδραση της ακτινοβολίας στην αλληλεπίδραση του MIF με rp53 σε Α549, και ΝΟΙ-Η358 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, και δεν παρατήρησαν μείωση στην κυτταρική MIF μετά από έκθεση [42]. Αυτή η αντίφαση δείχνει γενετικών παραμέτρων μπορεί να οδηγήσει σε διαφορές στα επίπεδα MIF ή έκκριση που θα μπορούσε περαιτέρω να φωτίσει το μηχανισμό της έκκρισης MIF. Ομοίως, η παρατήρηση εδώ ότι ΑΒΟΑ1 δεν ρυθμίζει ΠΔΠ έκκριση με IR ή ROS στρες στα πειράματά μας δείχνουν υπάρχει ένα ακόμα πιο σύνθετο μηχανισμό της έκκρισης MIF, και μπορεί να εξαρτάται από το πλαίσιο και το άγχος, αν και παραμένει τυπικά πιθανό ότι τα υπόλοιπα επίπεδα ΑΒΟΑ1 μετά από νοκ ντάουν είναι εμπλεγμένος. Αποκρυπτογράφηση των μεσολαβητών της έκκρισης ΠΔΠ θα μπορούσε να έχει σημαντικές επιπτώσεις σε μια σειρά από ρυθμίσεις και αξίζει σαφώς μεγαλύτερη έρευνα.

ΠΔΠ είναι μια καλά περιγράφεται σήμα επιβίωσης για μια ποικιλία κυτταρικών τύπων, και τα αποδεικτικά στοιχεία έχει στην πραγματικότητα πρότεινε το ρόλο του στην άμβλυνση γονοτοξικό στρες [43]. MIF είναι επίσης ένας ισχυρός προ-φλεγμονώδης και αγγειογόνων μόριο. ΠΔΠ μπορούν να εξουδετερώσουν αποτελεσματικά τις αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις των γλυκοκορτικοειδών. Με την παρουσία βακτηριακής λοίμωξης, για παράδειγμα, η φλεγμονή συνήθως ενεργοποιείται, και η επακόλουθη απελευθέρωση του MIF επιτρέπει παρατεταμένη φλεγμονή μέσω της απελευθέρωσης των άλλων προ-φλεγμονωδών κυτοκινών όπως ΤΝΡ-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-2, και ΙΡΝ-γ [22,44]. Στο πλαίσιο της βιολογίας των όγκων, MIF έχει δειχθεί ότι επάγει την διείσδυση διαφόρων τύπων κυττάρων σε όγκους, συμπεριλαμβανομένων των συναγόμενων μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSC) [13], τα ουδετερόφιλα [45], και τα μαστοκύτταρα [46], καθώς και για την επηρεάζουν την πόλωση των μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους [47]. Το μικροπεριβάλλον του όγκου γίνεται ανοσοκαταστολή, μειώνοντας κατά του όγκου αποκρίσεις υποδοχής.

Μια μπροστινή γραμμή θεραπείας για ccRCC είναι η αναστολή του VEGF, αλλά οι απαντήσεις των ασθενών παραμένει σχετικά χαμηλή με μέση επιβίωση σε 7-11 μήνες και μόνο το 10% διαβίωσης τελευταία 5 χρόνια [ ,,,0],48]. Απαντήσεις σε αναστολείς VEGF θα μπορούσε επίσης να αποδοθεί εν μέρει στις προαγγειογόνος αποτελέσματα της ΠΔΠ, όπως στοιχεία έχουν δείξει ότι η έκκριση του MIF μπορεί να προκαλέσει πρόσληψη των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων, τα οποία μπορούν να οδηγήσουν την ανάπτυξη νέων αγγείων. Η διέγερση με MIF έχει δειχθεί ότι επηρεάζουν άμεσα τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων, την επαγωγή σχηματισμού σωλήνα σε

in vitro

και

δοκιμασίες in vivo

Matrigel [49]. Τα μυελοειδή προέρχονται κατασταλτικά κύτταρα έχουν επίσης όλο και περισσότερο εμπλέκονται στην στην ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων, καθώς εκκρίνουν αγγειογονικούς παράγοντες. Kozin

et al

. έδειξε ότι η ταχεία διείσδυση των MDSCs διευκόλυνε υποτροπής του όγκου [50], και μάλιστα Finke

et al

. έχουν εμπλακεί άμεσα MDSC διήθηση με αντοχή στο sunitinib [14].

Άλλοι τρόποι δράσης MIF έχουν πρόσφατα αναφερθεί. Έχει δειχθεί ότι MIF μπορούν να δεσμεύονται ριβοσωμική πρωτεΐνη S3 και διασπάται κατά την έκθεση IR [51]. MIF διαστάσεως ενεργοποιείται ΝΡ-κΒ, η αυξημένη έκκριση των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, και ρυθμιζόμενη έκφραση δεικτών μετάβαση επιθηλίου-μεσεγχύματος. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με

in vivo

ξενομόσχευμα στοιχεία που δείχνουν αύξηση της μετάστασης, την περαιτέρω σύνδεση ΠΔΠ στο πλαίσιο του ρόλου της ως ογκογόνο πρωτεΐνη. Δεδομένων των πολλών τρόπων δράσης ΠΔΠ, είναι σαφές ότι η αναστολή του MIF θα μπορούσε να έχει τεράστιες συνέπειες για τη θεραπεία του καρκίνου και την επανεμφάνιση του όγκου.

Εν περιλήψει, τα στοιχεία αποκαλύπτουν ότι ΠΔΠ έκκριση ως ανταπόκριση στη θεραπεία του καρκίνου θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές αρνητικές επιπτώσεις στην έκβαση των ασθενών. Υποθέτουμε ότι αποτελεσματικοί παράγοντες στόχευσης MIF θα μπορούσε να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της ακτινοβολίας και ενδεχομένως άλλα χημειοθεραπευτικά με τη μείωση των επιπτώσεων της protumorigenic MIF σηματοδότησης. Παρακολούθηση έκκριση ΠΔΠ μετά την ακτινοβολία μπορεί επίσης να έχουν χρησιμότητα στην πρόβλεψη της έκβασης του ασθενούς, και ως εκ τούτου έχουν προγνωστική σημασία στο παρελθόν παραγνωρισμένη τρόπους.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 πίνακα. . ΑΦΙΞΗ κατευθυντήριες γραμμές

τήρηση να φτάσουν τις κατευθυντήριες γραμμές περιγράφεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0146482.s001

(PDF)

Ευχαριστίες

Η ακτινοβολία Πόρων Πυρήνας διευκόλυνση της υποθέσεως Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη αυτή.