Αφηρημένο

Ιστορικό

Micro RNAs είναι μικρό, μη-κωδικοποίησης, μονόκλωνο RNA που αρνητικά ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Από miR-143 βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, θέλαμε να αναλύσουμε την έκφρασή του στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη, και να ελεγχθεί η ικανότητα του miR-43 να σταματήσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη in vitro και in vivo.

Αποτελέσματα

η έκφραση του miR-143 αναλύθηκε σε ανθρώπινους καρκίνους του προστάτη με ποσοτική PCR, και με in situ υβριδισμό. miR-143 εισήχθη σε καρκινικά κύτταρα in vivo με ηλεκτροδιάτρηση. ανάλυση βιοπληροφορικής και προσδιορισμούς λουσιφεράσης που βασίζονται χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί miR-143 στόχους. Δείχνουμε σε αυτή τη μελέτη ότι τα επίπεδα miR-143 είναι αντιστρόφως ανάλογα με προχωρημένα στάδια του καρκίνου του προστάτη. Διάσωση της έκφρασης miR-143 στα καρκινικά κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την σύλληψη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την κατάργηση της ανάπτυξης του όγκου σε ποντικούς. Επιπλέον, δείχνουμε ότι τα αποτελέσματα του miR-143 με τη μεσολάβηση, τουλάχιστον εν μέρει από την αναστολή του εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη-5 (ERK5) δραστηριότητα. Δείχνουμε εδώ ότι ERK5 είναι ο στόχος του miR-143 στον καρκίνο του προστάτη

Συμπεράσματα

miR-143 είναι ως ένα νέο στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:.. Clape C, Fritz V, Henriquet C, Apparailly F, Fernandez PL, Iborra F, et al. (2009) miR-143 παρεμβαίνει με την ERK5 Σηματοδοσίας, και καταργεί τον καρκίνο του προστάτη Πρόοδος σε ποντίκια. PLoS ONE 4 (10): e7542. doi: 10.1371 /journal.pone.0007542

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 του Ιούνη 2009? Αποδεκτές: 29 Σεπτέμβρη 2009? Δημοσιεύθηκε: 26 Οκτωβρίου του 2009

Copyright: © 2009 Clape et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από Agence Nationale pour la Recherche (ANR physio2006), Institut National du Cancer (INCA) Association pour la Recherche contre le Καρκίνο (ARC), και Fondation pour la Recherche Medicale (FRM). CC υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση της περιφέρειας Languedoc-Roussillon, και ARC. PLF υποστηρίζεται από Ministerio Επιστημών e Innovación FIS-PI080274

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (ΚΓΠ) είναι η πιο συχνή καρκίνος και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες στις δυτικές χώρες. Υποδοχέα ανδρογόνων (AR), είναι πιθανό ένας κρίσιμος παράγοντας στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Ο καρκίνος του προστάτη είναι εξαρτώμενη αρχικά σε ανδρογόνα για την ανάπτυξη, και η θεραπεία ανδρογόνων προκαλεί υποχώρηση του όγκου [1], πιθανώς μέσω αδρανοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων στόχων AR. Ωστόσο, απάντηση σε αυτή την θεραπεία είναι συχνά παροδικές και πολλοί άνδρες αναπτύσσουν υποτροπιάζουσα ανεξάρτητος από ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη, το οποίο έχει μια πολύ κακή πρόγνωση, επειδή καμία αποτελεσματική θεραπεία είναι σήμερα διαθέσιμες (βλέπε [2] για ανασκόπηση).

Πρόσφατα, μια νέα κατηγορία μικρών RNAs έχει περιγραφεί, ονομαζόμενη microRNAs, τα οποία βρίσκονται να ρυθμίζουν την λειτουργία των mRNA με διαμόρφωση τόσο τη σταθερότητα του mRNA και τη μετάφραση [3], [4]. MiRNAs είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης, μονόκλωνο RNA των ~ 22 νουκλεοτιδίων που ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο, κυρίως μέσω ζευγαρώματος βάσεων με το 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) του mRNAs στόχου. Αυξανόμενες ενδείξεις δείχνουν ότι miRNAs ελέγχουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες, που κυμαίνονται από τον πολλαπλασιασμό στην απόπτωση [5], [6], [7]. Περίπου το 50% των γονιδίων miRNA βρίσκονται σε περιοχές του γονιδιώματος που συνδέεται με καρκίνο ή σε εύθραυστα χώρων [8] και ορισμένα από αυτά έχουν δειχθεί να εμπλέκονται άμεσα στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου [9]. προφίλ έκφρασης microRNA κατατάσσουν επίσης όγκων από αναπτυξιακές καταγωγή και την κατάσταση διαφοροποίησης [10]. Πολλαπλές microRNAs έχουν δειχθεί ότι έχουν ογκογόνο ιδιότητες ή ενεργούν σαν ογκοκατασταλτικά γονίδια [9], [11]. Αυτή είναι η περίπτωση για miR-15A και miR-16-1, η οποία έκφραση χάνεται σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη. Αυτές οι δύο miRNAs δείχνουν αντι-ογκογόνο δράση μέσω της στόχευσης της κυκλίνης D1 και Wnt3A, τα οποία είναι μεσολαβητές του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση [12]. Μειωμένη έκφραση των άλλων miRNAs, όπως miR-23b, -100, -145, -221 και -222 έχει επίσης τεκμηριωθεί. Επιπλέον, έκτοπη έκφραση αυτών των miRNAs ως αποτέλεσμα την αναστολή του προστάτη καρκινικών κυττάρων [13]. Σε αντίθεση με αυτές τις αντι-ογκογόνο miRNA, ογκογόνο miR-106b, ή miR-32 έχουν αναγνωριστεί σε καρκίνο του προστάτη. Αυτά πολλαπλασιασμό των κυττάρων miRNA υποστήριξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων στο χαμηλότερο σημείο στόχευσης της p21 /WAF1 και πρωτεΐνες Bim αντίστοιχα [14]. Πιο ενδιαφέρον είναι η παρατήρηση ότι μερικοί miRNA, όπως miR-141 εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα, και βρίσκονται στον ορό των ασθενών με καρκίνο του προστάτη. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν τη μέτρηση των miRNAs που προέρχεται από όγκο στον ορό ή το πλάσμα ως νέο διαγνωστικό εργαλείο για μια μη επεμβατική μέθοδο ανίχνευσης του καρκίνου στον άνθρωπο [15].

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι ένας συνδυασμός θεραπείας με χρήση ΡΡΑΚγ αγωνιστές και HDAC αναστολέων αποτελέσματα στην αναστολή της ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη κυττάρων σε ποντικούς [16]. Σφαιρική ανάλυση των μικρο-RNA έκφρασης σε αυτά τα επεξεργασμένα κύτταρα συσχετίζεται αυξημένη miR-143 με διακοπή της ανάπτυξης. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η έκφραση του miR-143 στον καρκίνο του προστάτη και διαπίστωσε ότι το επίπεδο έκφρασης του miR-143 μειώθηκε σημαντικά. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με ιστοπαθολογικές βαθμού στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη. Η επιμόλυνση των κυττάρων LNCaP και C4-2 in vitro με πρόδρομο miR-143, ή ηλεκτροδιάτρηση του miR-143 σε ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη σε ποντίκια έδειξαν ότι miR-143 συμβάλλει αρνητικά στην ανάπτυξη του προστάτη των καρκινικών κυττάρων. Τέλος, η βιοπληροφορική αναλύσεις προσδιορίζονται ERK5 ως πιθανό γονίδιο στόχος για Mir-143. ERK5 είναι γνωστό ότι προάγει την κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό σε απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες και η ενεργοποίηση της κινάσης τυροσίνης. Ως εκ τούτου, επίμονη μειωμένα επίπεδα mir-143 στα καρκινικά κύτταρα μπορεί να εμπλέκονται άμεσα στην καρκινογένεση μέσω της ενεργοποίησης του καταρράκτη που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) μέσω ERK5. Στο σύνολό τους τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι mir-143 θα μπορούσε να είναι ένα ογκοκατασταλτικό και μια πιθανή νέα διαγνωστική ή προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του προστάτη.

Αποτελέσματα

miR-143 έκφρασης είναι μειωμένη κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη

Μια πρώτη ένδειξη της συμμετοχής του miR-143 στον καρκίνο του προστάτη ήταν η παρατηρούμενη μειωμένη έκφραση αυτού του miRNA σε LNCaP, και του καρκίνου του προστάτη C4-2, σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κυτταρικές σειρές, όπως αναλύεται με ποσοτική RT-PCR (Εικ. 1Α). Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση, η έκφραση του miR-143 μειώθηκε έντονα σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη, σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (εικ. 1Β). Επιπλέον, τα επίπεδα του μεταγράφηκε miR-143 συσχετίζονταν αντίστροφα με ιστοπαθολογικές βαθμού στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη, η επίτευξη του ορίου ανίχνευσης σε καρκίνους υψηλής ποιότητας (Gleason & gt? 7? Εικ. 1Β). Για να αναλυθεί με μεγαλύτερη ακρίβεια την έκφραση του miR-143,

in situ

υβριδοποίηση εκτελέστηκε σε συστοιχίες ιστών υψηλής πυκνότητας, που περιέχει 40 προστάτη καρκινικούς ιστούς έναντι 10 φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη. miR-143 έκφραση δεν μπορούσε να ανιχνευθεί ειδικά σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη από υψηλή βαθμολογία Gleason, ενώ miR-143 εκφράστηκε σε φυσιολογικό επιθήλιο του προστάτη, και του προστάτη αδένες (Εικ. 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι μειορρύθμιση της έκφρασης miR-143 θα μπορούσε να είναι ένα απαιτούμενο συμβάν για την ανάπτυξη ή την πρόοδο του καρκίνου.

A

, ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (QPCR) του miR-143, κανονικοποιημένη προς η ποσότητα του στόχου RNU48 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης miRNA μετρήθηκαν με τον προσδιορισμό των τιμών ΔCt του υποδεικνύεται κυτταρικής γραμμής έναντι κυττάρων ΡΝΤ2. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM για τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα, εδώ και στα επόμενα σχήματα, * & lt? 0,05? ** & Lt? 0,01? *** & Lt? 0,001.

Β

, QPCR του miR-143, κανονικοποιημένη με το ποσό-στόχο RNU48 σε δείγματα ιστού του προστάτη. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης miRNA μετρήθηκαν με τον προσδιορισμό των τιμών ΔCt του υποδεικνύεται Gleason του καρκίνου του προστάτη σε σχέση με φυσιολογικό προστάτη. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM των ένδεκα δειγμάτων του προστάτη για κάθε ομάδα.

C

, Εκπρόσωπος

in situ

χρώση υβριδοποίηση του miR-143 σε ανθρώπινα μη-όγκου και προστατικού ιστού του όγκου. TMA παρουσιάζει 40 του προστάτη καρκινικούς ιστούς έναντι 10 φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη. (TMA, μεγέθυνση, 400 ×).

Η

Μειωμένη πολλαπλασιασμό και αυξημένη απόπτωση στο miR-143 που εκφράζουν καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Μειωμένη έκφραση στον καρκίνο του προστάτη πρότεινε ότι το miR-143 θα μπορούσε να έχει αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή miR-143 εκτοπικά εκφράζεται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη C4-2 και LNCaP. miR-143 εκφράστηκε 5- και 12 φορές υψηλότερες σε επιμολυσμένα LNCaP, και τα κύτταρα C4-2 αντίστοιχα, σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου που επιμολύνθηκαν με είτε μη-σχετικό miRNA, ή με αντι-miR-143, το οποίο είναι ένας αναστολέας miR-143 (Εικ. 2Α). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές σε κυτταρικούς αριθμούς παρατηρήθηκαν όταν μη-σχετικές miRNA ή αντι-miR-143 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτά τα κύτταρα. Σε έντονη αντίθεση, ο αριθμός των κυττάρων ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με τα επίπεδα έκφρασης του miR-143 σε αμφότερα LNCaP, και κυτταρικές γραμμές C4-2 (Σχ. 2Β-C). Αυτό πρότεινε ότι miR-143 ρυθμίζει αρνητικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Σε συμφωνία με αυτό, πειράματα ενσωμάτωσης BrdU απέδειξαν ότι η έκφραση miRNA έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της σύνθεσης του DNA, και επομένως κατάργηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου (Σχήμα 2D). Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτά τα κυτταροστατικά αποτελέσματα ήταν επίσης συσχετίζεται με αυξημένο κυτταρικό θάνατο σε miRNA εκφράζουν καρκινικά κύτταρα προστάτη, όπως εκτιμήθηκαν από το μπλε τρυπάνης πειράματα (Σχ. 2Ε). Επιπλέον, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε μια αύξηση στο G

0-G

1 πληθυσμού, η ταυτόχρονη σε μείωση S-φάσης σε miR-143 που εκφράζουν κύτταρα (Σχ. 2F). Είναι ενδιαφέρον ότι, η ανάλυση FACS έδειξε μία αύξηση σε κυτταρικό θάνατο (Σχ. 2G). Η απόπτωση ήταν, ωστόσο, δεν άλλαξε το miR-143, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, όπως εκτιμάται από πειράματα ενσωμάτωση annexine (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), ή με το επίπεδο κασπάσης 3 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (Εικ. 2Η). Αυτό υποδηλώνει ότι η παρατηρούμενη κυτταρικό θάνατο δεν εξαρτάται από την απόπτωση, αλλά μάλλον νέκρωση γεγονότα. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι miR-143 ελέγχει αρνητικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και θετικά ελέγχει τον κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

A

, QPCR του miR-143 σε κύτταρα C4-2 (λευκές μπάρες ) και κύτταρα LNCaP (μαύρες ράβδοι), κανονικοποιημένη προς RNU48 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με περιπλεγμένο miR (έλεγχος), miR-143 πρόδρομος ή antimiR-143. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM για πέντε ανεξάρτητα πειράματα.

Β-Γ

, η ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα LNCaP (Β) ή C4-2 (C) κατά τη διάρκεια 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με ομελέτα miR (μαύρο ρόμβο), miR-143 πρόδρομος (μαύρο σταυρό) ή antimiR-143 (λευκό τρίγωνο). Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

D

, Ποσοτικοποίηση του BrdU ενσωμάτωσης 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σε κύτταρα C4-2 και LNCaP απουσία miR-143 (άνω), παρουσία miR-143 (μέσο) ή antimiR-143 (κάτω). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

E

, μπλε τρυπάνης ενσωμάτωση σε C4-2 (λευκές ράβδοι) και LNCaP (μαύρες μπάρες) τα κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σε απουσία ή παρουσία του miR-143 ή στην παρουσία antimiR-143.

F

, το ποσοστό των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου σε κυτταρικές σειρές LNCaP και C4-2 36 ώρες μετά την επιμόλυνση με τον έλεγχο του 5 (μη σχετικό), miR-143 ή antimiR-143. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε δύο ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 2-4).

G

, ανάλυση FACS απόπτωσης σε C4-2 (λευκές ράβδοι) και LNCaP (μαύρες ράβδοι) κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σε απουσία ή παρουσία miR-143 ή σε παρουσία antimiR-143.

H

, Σχετική συγκέντρωση της δραστικής κασπάσης 3 σε C4-2 (λευκές ράβδοι) και LNCaP (μαύρες ράβδοι) κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σε απουσία ή παρουσία miR-143 ή σε παρουσία antimiR-143. Η συγκέντρωση των δραστικών κασπασών 3 ομαλοποιείται με την παγκόσμια συγκέντρωση πρωτεΐνης.

Η

ERK5 είναι ένα miR-143 γονιδίου στόχου

Θέλαμε να προσδιορίσει miR-143 στόχους που θα μπορούσαν να εμπλέκονται σε εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. ανάλυση βιοπληροφορικής έδειξε ότι το 3 ‘UTR του ανθρώπινου ΕΚΚ-5 γονίδιο φιλοξενεί ένα υποθετικό συναινετική θέση για miR-143 σύνδεσης (νουκλεοτίδια 2917-2932) (εικ 3Α). Για την επικύρωση πειραματικά αυτού του στόχου, αναλύσαμε πρώτη έκφραση ERK5 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη. πρωτεΐνη ERK5 ήταν ιδιαίτερα αυξημένη σε LNCaP, και του καρκίνου του προστάτη C4-2 κύτταρα, σε σύγκριση με μη καρκινικές ΡΝΤ2 επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη (Σχ. 3Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση ERK5 ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με την έκφραση miR-143 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 1Α). Περαιτέρω ανάλυση σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη σε συστοιχίες ιστών υψηλής πυκνότητας έδειξαν ότι η έκφραση ERK5, όπως αναλύθηκε με IHC ήταν ιδιαίτερα αυξημένη σε καρκίνο, συγκριτικά με φυσιολογικό ιστό του προστάτη (Σχήμα 3C, κάτω πάνελ). Εντυπωσιακά, η έκφραση ERK5 ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με την έκφραση miR-143, όπως αναλύθηκε με υβριδοποίηση in situ, γεγονός που υποδηλώνει ότι ERK5 μπορούσε να είναι ένα

bona fide

miR-143 στόχου (Σχ. 3C, συγκρίνετε άνω προς κάτω πλαίσια). Για να αποδειχθεί αυτή η υπόθεση πειράματα υπερέκφρασης έγιναν. Η έκτοπη έκφραση του miR-143 σε LNCaP, και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη C4-2 οδήγησε σε σημαντική μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης ERK5, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με μη σχετικές miRNA, ή με το αντιπληροφοριακό miR-143. (Σχ. 3D). Μειωμένη έκφραση ERK5 συσχετίζεται με μειωμένο πολλαπλασιασμό σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές κατά την έκφραση του miR-143 (Εικ. 2). Επιπλέον, η μειωμένη ERK 5 έκφραση σε κύτταρα κατεργασμένα Mir-143 επίσης συσχετίζεται με μειωμένη έκφραση του Jun, το οποίο είναι ένας γνωστός στόχος ERK5 (Εικ. 3Ε).

A

, Σχηματική αναπαράσταση του προβλεπόμενη θέση στόχος του miR-143 στην 3 ‘UTR του ERK5 mRNA. Σπόρος-ταιριάζουν ακολουθία ενδείκνυται. Η.δ. ERK5 3’ΙΙΤΡ είναι ο Homo Sapiens 3’UTRsequence.

B

, ανάλυση Western blot της έκφρασης ενδογενούς ERK5 σε προστάτη φυσιολογικές και καρκινικές κυτταρικές σειρές. Οι σχετικές εκφράσεις, κανονικοποιημένη σε GAPDH, μετρήθηκαν με εικόνας J λογισμικού ως μια πτυχή της ενδεικνυόμενης κατάστασης σε σχέση με ομελέτα miR. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM για τρία ανεξάρτητα πειράματα. C, Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημική χρώση ERK5, και in situ υβριδοποίηση miR-143 σε διαδοχικές τομές του ιστού συστοιχίας υψηλής πυκνότητας.

D

, ανάλυση κηλίδος Western έκφρασης ενδογενούς ERK5 σε κύτταρα C4-2 και LNCaP 48 ώρες μετά την παροδική διαμόλυνση του υποδεδειγμένου miR-143. Σχετική έκφραση, ποσοτικά με Image J λογισμικού είναι κανονικοποιημένη σε GAPDH, και μετράται από πλάσια της ενδεικνυόμενης κατάστασης έναντι κωδικοποιημένα miR. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

E

, Μέτρο της δράσης της λουσιφεράσης σε κύτταρα COS επιμολυσμένα με ένα γονίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης pGL3 συντήκεται με το ΕΚΚ-5 3 ‘UTR μεταλλαγμένα ή όχι με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ή miR-143 (0? 25? 50? 100 ηΜ). Οι τιμές κανονικοποιούνται προς δραστηριότητα β-γαλακτοσιδάσης και εκφράζεται σε πλάσια έναντι απουσία miR-143. Μαύρες μπάρες, ERK5 3’ΙΙΤΡ, λευκό μπαρ, μεταλλαγμένη 3 ‘UTR? δεδομένα είναι μέσοι όροι ± SEM για τέσσερα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

F

, ανάλυση Western blot της έκφρασης ενδογενούς c-Jun σε κύτταρα LNCaP 48 ώρες μετά την παροδική διαμόλυνση του υποδεδειγμένου miR-143. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

G

, QPCR του ERK5 σε κύτταρα C4-2 (λευκές ράβδοι) και κύτταρα LNCaP (μαύρες ράβδοι), κανονικοποιημένη σε 18 s γονίδιο 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με pSuper-shNeo (έλεγχος) ή pSuper-shERK5. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

H

, Ποσοτικοποίηση της ενσωμάτωσης BrdU σε κύτταρα C4-2 (λευκές ράβδοι) και κύτταρα LNCaP (μαύρες ράβδοι) 48 μετά από επιμόλυνση με pSuper-shNeo (έλεγχος) ή pSuper-shERK5. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Στη συνέχεια, για να αποδείξουν περαιτέρω την υπόθεση ότι οι παρατηρούμενες επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό είναι το αποτέλεσμα της αναστολής ERK5, πραγματοποιήθηκαν φίμωση πειράματα. shRNA έκφραση κατευθύνεται προς ERK5 οδήγησε σε σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε LNCaP και C4-2, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με μη-σχετικό shRNA (Σχ. 3F). επίπεδο έκφρασης ERK5 μειώθηκε περίπου 90% και στις δύο κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με το ειδικό shERK5 (Σχ. 3G).

Τέλος, για να αποδειχθεί περαιτέρω ότι είναι ένα ERK5 miR-143 γονιδίου στόχου πειράματα παροδικής επιμόλυνσης με χρησιμοποίηση της 3’UTR περιοχή του ERK5 περιέχει το υποτιθέμενο miR-143 ταιριάζουν τοποθεσία, μεταλλαγμένα ή όχι, κατάντη της λουσιφεράσης ανοικτού πλαισίου ανάγνωσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης του κατασκευάσματος 3 ‘UTR ERK-Luc μειώθηκε σε παρουσία miR-143, ενώ δεν επηρεάστηκε δραστικότητα λουσιφεράσης του μεταλλαγμένου -Luc κατασκευάσματος, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-143 διαμορφώνουν την έκφραση ERK5 μέσω σύνδεσης προς ERK5-3’UTR ( Σχήμα 3F).

Διάσωση της έκφρασης miR-143 μειώνει την εξέλιξη του όγκου σε ποντικούς

για να διερευνηθεί η επίδραση της miR-143 στην ανάπτυξη του όγκου, αθυμικά γυμνά ποντίκια μπολιασμένα υποδορίως με καρκίνο του προστάτη LNCaP και C4-2 κύτταρα. Δύο εβδομάδες μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων, όταν οι όγκοι έφθασαν ένα μέσο όγκο 392 mm

3, miR-143 πειράματα διάσωσης διεξήχθησαν. Η ενδονεοπλασματική ένεση miR-143, που ακολουθείται από ηλεκτροδιάτρηση όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους τμήμα είχε ως αποτέλεσμα την κατάργηση ή μείωση της ανάπτυξης του όγκου σε ποντικούς μπολιασμένα με LNCaP και C4-2 κύτταρα αντίστοιχα (Εικ. 4Α και 4Β), ενώ ηλεκτροδιάτρηση μη ελέγχου -relevant miR δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου (Σχ. 4Α και 4Β). Παρά την αναμενόμενη miR-143 ταχεία αποικοδόμηση σε βιολογικό περιβάλλον, η έκφραση του miR-143 παρέμεινε σημαντικά αυξημένη στην miR-143 ηλεκτροδιάτρηση όγκων (Σχ. 4C). Συνεπής με την παρατηρούμενη μείωση στην ανάπτυξη του όγκου, η αναλογία πολλαπλασιασμού των LNCaP και C4-2 όγκων μειώθηκε επίσης, όπως ποσοτικά με χρώση PCNA σε όγκους ηλεκτροδιατρήθηκαν με miR-143 (Εικ. 4D). Τέλος, η ανάλυση του επιπέδου της πρωτεΐνης ERK5 με ανοσοϊστοχημεία έδειξε ότι η έκφραση ERK5 μειώθηκε σε παρουσία του miR-143 σε LNCaP και C4-2 όγκους (Σχ. 4Ε). Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα αποτελέσματα απέδειξαν ότι miR-143 λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Α-Β

, ανάπτυξη όγκου του LNCaP (Α) ή C4-2 κύτταρα (Β) με υποδόρια ένεση και ηλεκτροδιατρήθηκε τρεις φορές με μη σχετικές miR (έλεγχος, λευκό τετράγωνο) ή miR-143 πρόδρομος (μαύρο ρόμβο). Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM για επτά ποντίκια που αναλύθηκαν ανά κάθε ομάδα.

C

, QPCR ανάλυση του miR-143 έκφρασης σε C4-2 (λευκές ράβδοι) και ξενομοσχευμάτων LNCaP (μαύρες μπάρες), κανονικοποιημένη σε RNU48. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM για επτά ποντίκια που αναλύθηκαν ανά κάθε ομάδα.

D

, Ανάλυση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με χρώση PCNA επί ξενομοσχευμάτων τμήματα αθυμικών γυμνών ποντικών εγχύθηκαν υποδορίως με κύτταρα C4-2 (λευκές ράβδοι) ή LNCaP (μαύρες ράβδοι) μετά από τρεις ηλεκτροδιατρήσεις με περιπλεγμένο miR ή miR-143 πρόδρομος . Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM για επτά ποντίκια που αναλύθηκαν ανά κάθε ομάδα.

E

, Εκπρόσωπος ανοσοϊστολογική χρώση ERK5 σε C4-2 και LNCaP όγκων. Γυμνά ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως με κύτταρα C4-2 (λευκές ράβδοι) ή LNCaP (μαύρες ράβδοι) μετά από τρεις ηλεκτροδιατρήσεις με περιπλεγμένο miR ή πρόδρομος miR-143. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά για επτά ποντίκια που αναλύθηκαν για κάθε ομάδα. (Μεγέθυνση, 400 ×).

Η

Συζήτηση

Έχουμε αναλύσει την έκφραση και τα αποτελέσματα των miR-143 στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Μερικές μελέτες έχουν δείξει προηγουμένως ότι miR-143 θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στην ογκογένεση αφού η έκφρασή του μειώνεται σε αρκετούς καρκίνους [19]. Αναφέρουμε δύο σημαντικά ευρήματα σε αυτή τη μελέτη. Πρώτον, δείχνουμε ότι η έκφραση miR-143 είναι σαφώς ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. Διαλογή στρατηγικές έχουν ως αποτέλεσμα την ανίχνευση του καρκίνου του προστάτη σε προοδευτικά προηγούμενα στάδια και χαμηλότερα επίπεδα των προγνωστικών κινδύνου [20]. Σε πολλούς άνδρες, ο καρκίνος του προστάτη έχουν μακρά φυσική ιστορία, ενώ άλλοι θα εξελιχθεί σε μεταστατικό στάδιο και να πεθάνουν από τη νόσο τους (που επισκοπείται στο [21]). Παρά την αποδεκτή τιμή μέτρησης των επιπέδων (PSA) προστατικού αντιγόνου specifc για τη διαλογή για τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη, την αξία του ως προγνωστικός δείκτης εξακολουθεί να αποτελεί θέμα συζήτησης. Άλλες παράμετροι των όγκων που σχετίζονται με συμπεριλαμβανομένης της κλινικής σταδιοποίησης χρησιμοποιώντας το σύστημα ΤΝΜ, Gleason βαθμολογία βιοψία και το αντιγόνο (PSA) επίπεδο ειδικού προστατικού προεπεξεργασίας ορό χρησιμοποιούνται σήμερα για την ταξινόμηση των ασθενών, όπως είναι σε χαμηλής, ενδιάμεσης ή υψηλού κινδύνου για την ανάπτυξη του επιθετικού καρκίνου [22] – [24]. Καμία ανάλυση δεν είναι σε θέση, ωστόσο, να προσδιορίσει επαρκώς όλους τους ασθενείς με εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη που έχουν υψηλή πιθανότητα εξέλιξης μετά τη θεραπεία. Η ανακάλυψή μας ότι το miR-143 είναι στο όριο ανίχνευσης σε επιθετικό καρκίνο του προστάτη θα μπορούσε να βοηθήσει στον εντοπισμό αυτών των ασθενών. Σύμφωνα με τα ευρήματα μας έκφραση του miR-143 έχει βρεθεί να μειωθεί επίσης σε άλλους καρκίνους, όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου [25], κακοηθειών Β-κυττάρων [26], του καρκίνου του προστάτη [27], οι όγκοι της υπόφυσης [28], ή του τραχήλου της μήτρας του καρκίνου [29]. Αυτό κάτω ρύθμιση miR-143 σε δείγματα καρκίνου του προστάτη έχει προταθεί να αντικατοπτρίζει την χαμηλότερη στάδιο διαφοροποίησης του ιστού του όγκου σε σύγκριση τον φυσιολογικό ιστό [30]. Περαιτέρω προοπτικές μελέτες για την επικύρωση miR-143 ως προγνωστική στόχος της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη είναι δικαιολογημένη.

Το δεύτερο σημαντικό εύρημα της μελέτης μας είναι η παρατήρηση ότι η διάσωση του miR-143 έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη έχει ως αποτέλεσμα την κατάργηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, τόσο in vitro όσο και σε ποντικούς. Αποδείξαμε, για πρώτη φορά ότι miR-143 είναι ένας καταστολέας όγκων σε ποντίκια. Άλλες μελέτες έχουν επισημάνει σε ένα ογκοκατασταλτικό ρόλο του miR-143 στο παχύ έντερο, και άλλα καρκινικά κύτταρα [26], κυρίως μέσω της αναστολής της KRAS, και ERK5 πρωτεΐνες [26], [31]. Έχει δειχθεί ότι ERK5 μπορεί να είναι μια άμεση ή έμμεση στόχος του miR-143 [32]. Θα δείξουμε τώρα και παρέχουμε αρκετά στοιχεία για να αποδείξει ότι ERK5 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-143 στον καρκίνο του προστάτη. Αυτό υποστηρίζεται από την παρουσία θέσης πρόσδεσης miR-143 στην 3’UTR της ERK5 mRNA. Επιπλέον, miR-143 αναστέλλει την έκφραση μιας πρωτεΐνης ρεπόρτερ όταν αυτή θέση σύνδεσης αντικαθιστά την 3’UTR του mRNA λουσιφεράσης. Τέλος, η έκφραση της πρωτεΐνης ERK5 συσχετίζεται αντίστροφα με την έκφραση miR-143 σε ανθρώπινους καρκίνους του προστάτη. ERK5 έχει ενοχοποιηθεί στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, και είναι η πιο πρόσφατα προσδιορίστηκε ΜΑΡΚΚ [33]. Οι δραστηριότητες αρκετών παραγόντων μεταγραφής, ως επί το πλείστον εμπλέκονται στον καρκίνο έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζεται από ERK5, συμπεριλαμβανομένων MEF2, c-Fos και Fra1, Sap-1, c-Myc και NF-κΒ [34] – [37]. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα ERK5 υπερέκφραση μας σχετίζεται με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη και προκαλεί τον πολλαπλασιασμό, την κινητικότητα και εισβολή σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [38].

Συνοπτικά έχουμε δείξει ότι miR-143 είναι ένας καταστολέας όγκων miRNA στον καρκίνο του προστάτη , που ελέγχει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση μέσω της διαμόρφωσης του, τουλάχιστον στην έκφραση μέρος ERK5. Διάσωση της έκφρασης των miRNAs σε όγκους του προστάτη θα πρέπει επομένως να θεωρηθεί ως νέο στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλα τα ανθρώπινα δείγματα αγοράστηκαν. πάροχοι μας Biochain (Hayward, CA), Cytomix (Lexington, ΜΑ) έχουν τα απαιτούμενα δικαιώματα.

Κλινικά δείγματα

Τριάντα επτά μη ζευγαρωμένα (13 κανονικά και 24 RNAs όγκου από διαφορετικούς ασθενείς ) και ένα αντιστοιχισμένο όγκο του προστάτη και των γύρω ανεπηρέαστο RNAs ιστού του ελήφθησαν από Biochain (Hayward, CA), Cytomix (Lexington, ΜΑ).

Ζώα., και in vivo ηλεκτροπόρωση

Αρσενικά αθυμικούς γυμνά ποντίκια (Foxn1 ηυ /ηυ) (Harlan, Grannat, Γαλλία) χρησιμοποιήθηκαν στην ηλικία των 7 εβδομάδων. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σε συμμόρφωση με την Ευρωπαϊκή Σύμβαση για την Προστασία των σπονδυλωτών ζώων που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς και εγκρίθηκε από την Comite d’Ethique du IRCM de Montpellier, η οποία είναι η τοπική επιτροπή δεοντολογίας. Τα ξενομοσχεύματα συστάθηκε με υποδόρια ένεση 2 χ 10

6 LNCaP ή C4-2 κύτταρα σε 100 μΙ ενός διαλύματος Matrigel. μετρήσεις όγκου των όγκων ελήφθησαν ανά διήμερο λίγο πριν την ηλεκτροδιάτρηση. Σε ευθανασία, οι όγκοι αποκόπηκαν και είτε κατεψυγμένα για εξαγωγή RNA ή μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη για ανοσοϊστολογική ανάλυση. Για ενδο-ξενομοσχεύματος ηλεκτρομεταφορά, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση ενός κεταμίνης (30 mg /Kg) και ξυλαζίνης (/Kg 10 mg) διάλυμα. 500pmole του προδρόμου miR-143 ή ομελέτα miR ενέθηκαν σε 100 μL PBS στο ξενομοσχεύματος. Πριν ενέσεις, εφαρμόστηκε ηχογραφικές γέλη, διαδερμική ηλεκτρικών παλμών εφαρμόσθηκαν χρησιμοποιώντας δύο ηλεκτρόδια από ανοξείδωτο χάλυβα πιάτο παραγγελία τοποθετούνται στις δύο πλευρές του ξενομοσχεύματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Takei et al., 2008). Εν συντομία, 8 τετραγωνικό κύμα ηλεκτρικών παλμών 50 msec μήκους, και μία τάση εξόδου 100 V /cm παρήχθησαν από electropulsator ECM-830 (ΒΤΧ, San Diego, CA, USA).

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμολύνσεις

ΡΝΤ2 προστάτη επιθηλιακά κυτταρική γραμμή λήφθηκε από ECACC (Sigma-Aldrich, Λυών, Γαλλία). Το ευαίσθητο σε ανδρογόνο LNCaP και τα ανδρογόνα ανεξάρτητο C4-2 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος προστάτη αγοράστηκαν από ViroMed Laboratories (Minnetonka, ΜΝ). Αυτές οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Οι επιμολύνσεις με miR-143 πρόδρομο, αντι-miR 143 (HSA-mir-143, Ambion) πραγματοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 50 ηΜ με Dharmafect 2 (Dharmacon, Lafayette, CO). Ο έλεγχος είναι μια μη-σχετικές πρόδρομες Mir, η οποία θα ωριμάσει σε σταθερή μορφή από τον μηχανισμό RNAi. Το αντι-miR-143 είναι ικανή να αναστείλει miR-143 που υπάρχει στα κύτταρα με υβριδισμό. Για knockdown επιμολύνσεις επίπεδο πρωτεΐνης ERK5 πραγματοποιήθηκαν με 2 μ§ πλασμιδίου pSuper-shERK5 ή με έναν αρνητικό μάρτυρα, pSuper-shNeo με JetPEI επιμόλυνσης. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BrdU και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για περαιτέρω ανάλυση.

απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

πειράματα

Ολικό RNA και QPCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [17] .Οι ακολουθίες ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται για διάφορα πειράματα σε αυτό το χειρόγραφο είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR για τις ώριμες microRNA

το cDNA μεταγράφεται αντίστροφα από 10 ng του συνολικού δείγματα RNA χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές από Taq Man microRNA Δοκιμασίες και αντιδραστήρια από την Taq Man κιτ microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή (Applied Biosystems). Το προκύπτον cDNA ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας Taq Man microRNA Δοκιμασία εκκινητές με Taq Man καθολική PCR Master Mix και αναλύθηκαν με τις οδηγίες ενός ΑΒΙ PRISM 7300 Sequence Detector Σύστημα σύμφωνα κατασκευαστή (Applied Biosystems). Χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο CT, χρησιμοποιήσαμε ενδογενούς ελέγχου (RNU48) για να ομαλοποιήσει τα επίπεδα έκφρασης του miRNA. Τα ονόματα δοκιμασία για miR-143 και U48 ήταν τα εξής:. HSA-mir-143 για miR-143 και RNU48 για U48 RNA

πρόβλεψη στόχο microRNA

Χρησιμοποιήσαμε Στόχοι miRBase (http: //microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/) και TargetScan (https://www.targetscan.org/) για την πρόβλεψη-στόχο microRNA.

miR Reporter λουσιφεράσης

το 3’UTR ή μεταλλαγμένες 3’UTR του ERK5 κλωνοποιήθηκαν στη θέση Xbal του pGL3-Control Vector, αμέσως προς τα κάτω του κωδικονίου στοπ του λουσιφεράσης κωδικοποιητική αλληλουχία. Τα κύτταρα COS συν-επιμολύνθηκαν με 0.5 μg των φορέων pGL3-based και διαφορετικές συγκεντρώσεις του miR-143 πρόδρομος όπως υποδεικνύεται, χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. μετρήσεις δραστικότητας λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκαν για δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης για να διορθώσει για τις διαφορές στην αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής.

ανοσοστυπώματα

εκχύλιση πρωτεΐνης και αναλύσεις Western blot

διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Τα φίλτρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντι-ERK5 αντίσωμα κουνελιού (Cell Σηματοδότηση Technology, Danvers, ΜΑ) και, στη συνέχεια, επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ένα δευτερεύον αντίσωμα υπεροξειδάσης συζυγούς αντι-κουνελιού. Το συγκρότημα οπτικοποιήθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Interchim, Montluçon, France).

Ανοσοϊστοχημεία των ERK5

ιστικών συστοιχιών (TMA) AccuMax Array περιέχουν 7 κανονικό και 39 σημεία αδενοκαρκίνωμα από διαφορετικούς ασθενείς ελήφθησαν από Alphelys (Plaisir, Γαλλία). Για ανοσοϊστοχημική χρώση, TMAs αφαιρέθηκαν από παραφίνη με ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν και βραστά (95 ° C, 30 λεπτά) σε ρυθμιστικό κιτρικού 0,01 Μ νάτριο. Μετά τον αποκλεισμό των υποδοχέων Fc με PBS που περιέχει 5% ορό κατσίκας, οι τομές επωάστηκαν με αντι-ERK5 πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η ανοσοχρώση αποκαλύφθηκε χρησιμοποιώντας συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-κουνελιού ή δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) και διαμινοβενζιδίνη χρωμογόνο (Dako, Carpinteria, CA) ως υπόστρωμα. Οι τομές με αιματοξυλίνη (Vector, Burlingame, CA). διάλυμα στερέωσης (Dako) και καλυπτρίδες προστέθηκαν στα τμήματα.

BrdU χρώση

Πολλαπλασιαζόμενα C4-2, LNCaP και ΡΝΤ2 κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες με BrdU. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες στερεώθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη σε PBS για 15 λεπτά στους 4 ° C και στη συνέχεια πλένονται σε PBS και κατέστησαν διαπερατά για 10 λεπτά σε 0,25% Triton Χ-100 σε PBS. Μετά διαπερατότητας, το DNA μετουσιώθηκαν σε 2Ν HCl για 10 λεπτά, και τα κύτταρα επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (PBS-1% BSA). BrdU στη συνέχεια ανιχνεύθηκε με το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-BrdU (Dako, Carpinteria, CA) και απεικονίστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα FITC αντι-ποντικού (Jackson ImmunoResearch, West Grove, ΡΑ).

Ιη situ υβριδισμός

LNA-τροποποιημένο ανιχνευτές (Exiqon) ήταν 3′-άκρο σημασμένο με διγοξιγενίνη-ddUTP με τερματική τρανσφεράση χρησιμοποιώντας το κιτ επισήμανσης Dig-3′-άκρο (Roche Diagnostics, France). 5 μm λεπτές τομές παραφίνης εξαντλούνται με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε μια σειριακή αραίωση αιθανόλης (2 χ 100%, 75%, 50%, 25%). Τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS, υποβλήθηκαν σε πέψη με πρωτεϊνάση Κ (10 μg /ml) για 5 λεπτά στους 37 ° C, ξεπλύθηκαν σε 0,2% γλυκίνη /PBS στη συνέχεια σε PBS, και σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλδεΰδη σε PBS (10 λεπτά). Τα πλακίδια στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS (2 Χ). Τα πλακίδια στη συνέχεια προ-υβριδοποιήθηκαν στους 54 ° C για 2 ώρες σε ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης (50% φορμαμίδιο, 5xSSC, 0,1% Tween-20, ρυθμίστηκε σε ρΗ 6,0 με 9,2 mM κιτρικό οξύ, 50 μg /ml ηπαρίνη, 500 μg /ml tRNA ζύμης) . Στη συνέχεια, τα πλακίδια υβριδοποιήθηκαν σε θαλάμους επώασης όλη τη νύκτα στους 54 ° C σε ένα φούρνο με συνεχή κίνηση, με τη χρήση 2 μΐ ανιχνευτή σε -200 μλ προθερμανθέντος ρυθμιστικού διαλύματος υβριδισμού. Οι τομές ξεπλύθηκαν δύο φορές σε 2xSSC, ακολουθούμενο από 3 πλύσεις των 30 λεπτών στους 54 ° C σε 50% φορμαμίδιο /2xSSC. Τα τμήματα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν 5 φορές σε PBS /0.1% Tween-20 (PBST), και αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε διάλυμα φραγμού (2% ορός προβάτου, 2 mg /ml BSA σε PBST). Αντίσωμα αντι-διγοξιγενίνης (Roche) προαπορροφήθηκε σε 1:1000 αραίωση σε διάλυμα αποκλεισμού επί 2 ώρες και στη συνέχεια εφαρμόζεται σε τμήματα επί μία νύκτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, τα πλακίδια πλύθηκαν 3 φορές σε PBST και πλύθηκε 2 φορές σε ρυθμιστικό ΑΡ (100 mM Tris-HCl ρΗ 9,5, 50 mM MgCl

2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20), ακολουθούμενη από ΝΒΤ /ΒΟΙΡ αναπτυσσόμενες διαλύματος (50 ml διαλύματος χρώσης, 240 μΙ 50 mg /ml ΝΒΤ, 175 μΙ 50 mg /ml BCIP, 1 mM λεβαμισόλη).