Αφηρημένο

Ως πρόσφατα αναγνωριστεί και χαρακτηριστεί γονίδιο, p42.3 σχετίζεται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την γένεσιν όγκων. Η έκφραση του p42.3 ρυθμίζεται αυξητικά σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο (GC), αλλά υποκείμενων μηχανισμών δράσης της δεν είναι καλά κατανοητοί. Τα microRNAs (miRNAs) είναι γνωστό ότι παίζουν ζωτικό ρυθμιστικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές διεργασίες. Εδώ χρησιμοποιείται η βιοπληροφορική και πειραματικές προσεγγίσεις για τη διερεύνηση του κανονιστικού σχέση μεταξύ miRNAs και το γονίδιο p42.3. Δείξαμε ότι το miR-29a θα μπορούσε να καταστείλει την έκφραση p42.3 τόσο στο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης μέσω απευθείας σύνδεση με 3’ΙΙΤΡ του. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μια αντίστροφη σχέση μεταξύ miR-29a και έκφραση p42.3 σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και δείγματα ιστών GC, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις όπου ρυθμίζεται προς τα κάτω p42.3. Στο σύνολό τους, έχουμε διευκρινιστεί προηγουμένως μη αναγνωρισμένη ρόλους του miR-29a και ανέφερε ότι miR-29a μπορεί να λειτουργήσει, τουλάχιστον εν μέρει, με τη στόχευση του γονιδίου p42.3 στην ανθρώπινη GC

Παράθεση:. Cui Υ, Su WY , Xing J, Wang YC, Wang P, Chen ΧΥ, et al. (2011) MiR-29a αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και προκαλεί κυτταρικού κύκλου σύλληψης μέσω της Ελάττωση της p42.3 στον ανθρώπινο καρκίνο του στομάχου. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10.1371 /journal.pone.0025872

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 28 Φλεβάρη 2011? Αποδεκτές: 13 Σεπτέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Οκτ, 2011

Copyright: © 2011 Cui et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας 973 προγράμματος (2010CB5293, το Εθνικό πρόγραμμα υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και Ανάπτυξης της Κίνας (863 Program) (2006AA02A402, το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών του Key πρόγραμμα (Νο 30830055) και το Υπουργείο . της Δημόσιας Υγείας, Κίνα (Νο 200802094) για να FJY Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

p42.3 είναι ένα νέο γονίδιο που έχει πρόσφατα απομονωθεί και ταυτοποιηθεί από το διαφορικό mRNA οθόνη (mRNADD) τεχνική. το cDNA πλήρους μήκους της P42 0.3 είναι περίπου 4.0 kb, και το γονίδιο κωδικοποιεί μια 389 αμινοξέων (aa) πρωτεΐνη που υπολογίζεται ότι έχει μια μοριακή μάζα των 42,3 kDa. Περαιτέρω έρευνα αποκάλυψε ότι η έκφραση του είναι κυτταρικό κύκλο εξαρτώμενη σε γαστρικό κυτταρικές γραμμές καρκίνου (GC). κορυφές έκφραση πρωτεΐνης της κατά τη φάση Μ του κυτταρικού κύκλου, πριν μειώνεται σταδιακά μετά την κυτταρική διαίρεση? αυτό δείχνει ότι p42.3 μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, σίγηση του p42.3 με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) έχει σαν αποτέλεσμα την προς τα πάνω ρύθμιση του CHK2 και την προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης Β1, τα οποία είναι δύο βασικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [1], [2]. Ενώ RT-PCR και ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις έχουν δείξει ότι p42.3 ρυθμίζεται αυξητικά σε GC σε σύγκριση με δείγματα φυσιολογικού ιστού, λειτουργική έρευνα έχει προτείνει ότι η εξάντληση των p42.3 μπορεί μόνο να μην έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και GC σχηματισμού αποικιών

in vitro

, αλλά μπορούν επίσης να μειώσουν σημαντικά την ογκογονικότητα σε γυμνούς ποντικούς [3]. Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν προτείνει έναν κρίσιμο ρόλο για το γονίδιο p42.3 στην παθολογία του GC, οι ειδικοί υποκείμενοι μηχανισμοί της δράσης της απομένει να αποσαφηνιστεί.

Τα microRNAs (miRNAs) αποτελείται από μια κατηγορία των μικρών (~ 22 νουκλεοτίδια), η ενδογενής, μη κωδικοποιητικού RNA που είναι γνωστό ότι παίζουν σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην γονιδιακή έκφραση [4]. Το πρωτογενές miRNA μεταγραφής ονομάζεται PRI-miRNA [5], το οποίο μεταγράφεται από την RNA πολυμεράση II ή III [6], [7]. Το PRI-miRNA στη συνέχεια διασπάται από το συγκρότημα μικροεπεξεργαστή Drosha-DGCR8 να παράγουν το μόριο πρόδρομος φουρκέτα (pre-miRNA), το οποίο στη συνέχεια εξάγεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα από exportin-5 /Ran-GTP. Με τη βοήθεια ενός συμπλόκου που περιέχει το RNase Dicer και το RNA-πρωτεΐνης συνδέσεως δίκλωνο, TRBP, η ~ 70 νουκλεοτιδίων προ-miRNA υπόκειται σε επεξεργασία σε ώριμο miRNA [8]. Η λειτουργική σκέλος της ώριμης miRNA φορτώνεται στο RNA επαγόμενη φίμωση σύμπλοκο (RISC), το οποίο περιέχει τις πρωτεΐνες, Argonaute (πριν) και Tnrc6, ενώ το άλλο σκέλος είναι συνήθως αποικοδομείται [9]. Το ώριμο miRNA καθοδηγεί τον RISC στα ατελή συμπληρωματικές αλληλουχίες σε mRNAs στόχο να καταστείλει το συγγενές μετάφραση mRNA, την προώθηση της αποσύνθεσης μεταγραφής, ή και τα δύο [10]. Εκτιμάται ότι τα περισσότερα γονίδια που κωδικοποιούν πιθανώς ρυθμίζονται από miRNAs και, ενώ ένας miRNA μπορεί να ρυθμίζει περισσότερα από ένα γονίδια στόχους, ορισμένα γονίδια μπορούν να ρυθμίζονται από πολλαπλούς miRNAs [11].

Καλλιέργεια στοιχεία δείχνουν ότι οι miRNAs εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης, του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης [12.13,14,15]. Αν και έχουν ανωμαλίες της έκφρασης miRNA έχουν προσδιορισθεί σε πολλούς ανθρώπινους όγκους, συμπεριλαμβανομένου του παχέος εντέρου, του στομάχου και του μαστού [16], [17], ο αριθμός αυτών των όγκων εξακολουθεί να επεκτείνεται. Ωστόσο, οι λεπτομερείς λειτουργίες των miRNA σε όγκους μένει να διευκρινιστεί.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το miR-29 έχει σύνθετες λειτουργίες σε διάφορες ασθένειες. MiR-29α μπορεί να συμπεριφέρεται σαν ένα ογκοκατασταλτικό τόσο των πνευμόνων και του παγκρέατος καρκινικές κυτταρικές σειρές, και έτσι η εξωγενής υπερέκφραση των αποτελεσμάτων miR-29a σε μια σημαντική μείωση της επεμβατικής δυναμικό και τον πολλαπλασιασμό αυτών των κυτταρικών γραμμών [18]. Το ογκοκατασταλτικό ρόλος του miR-29a υποστηρίζεται επίσης από παρατηρείται προς τα κάτω ρύθμιση της σε ένα ευρύ φάσμα συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένων του νευροβλαστώματος, τα σαρκώματα και οι όγκοι του εγκεφάλου [19]. Σε αντίθεση, miR-29α αυξορρυθμίζεται νωχελικός ανθρώπινου Β-κυττάρου χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (Β-CLL) [20] και οξεία μυελοειδή λευχαιμία (AML) [21], το οποίο προτείνει ένα πιθανό ρόλο υποκινητή όγκων. Επιπλέον, η παρεκκλίνουσα έκφραση του miR-29a μπορεί να βρεθεί σε πολλές μη-κακοήθεις νόσους, συμπεριλαμβανομένων ηπατική ίνωση [22], ο διαβήτης [23] και της νόσου του Αλτσχάιμερ [24]. Παρά το γεγονός ότι πολλά γονίδια έχουν ήδη επιβεβαιωθεί ότι είναι οι άμεσοι στόχοι του miR-29a, όπως PPM1D [25], PI3K [26] και νευρώνα πλοηγός 3 [24], που αντιπροσωπεύουν ένα πολύ μικρό ποσοστό του συνόλου των γονιδίων που miR-29a στόχους.

στην παρούσα έκθεση, δείχνουμε ότι η έκφραση p42.3 ελέγχθηκε στα επίπεδα τόσο του mRNA και της πρωτεΐνης από το miR-29a μέσω της άμεσης στόχευσης του 3’UTR της p42.3. MiR-29α θα μπορούσε να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και να επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της μειορρύθμιση της έκφρασης p42.3. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης p42.3 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση του miR-29a σε ανθρώπινους ιστούς GC.

Αποτελέσματα

p42.3-3’UTR είναι πιθανώς στόχο miR -29a

οι πιθανοί miRNAs που είχαν προβλεφθεί για τη στόχευση του γονιδίου p42.3 περισσότερο από μία βάση δεδομένων αναλύθηκαν. Επελέγησαν Οι δύο κορυφαίες miRNAs που προβλέπεται για τρεις φορές για περαιτέρω επιβεβαίωση και τις άλλες τρεις miRNAs, συμπεριλαμβανομένων miR-29α, του οποίου η υποθετική δεσμευτική περιοχές ήταν κοντά σε εκείνες των δύο κορυφή επελέγησαν επίσης ως υποψήφιοι για επικύρωση. MiR-29α είχε προβλεφθεί από τους TargetScan και miRGEN βάσεις δεδομένων, η οποία ανέφερε ότι υποθετική θέση δέσμευσης της ήταν στις θέσεις 213-219 της p42.3-3’UTR (Εικόνα 1Α). Οι άλλοι υποψήφιοι δεν παρατίθενται εδώ.

Α. Η αλληλουχία του miR-29a με την υποθετική θέση σύνδεσης στο ανθρώπινο γονίδιο p42.3. Η υποθετική θέση σύνδεσης με το μεταλλαγμένο φαίνεται στο κάτω πάνελ. B. Κανονισμός της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς από miR-29a σε ΜΚΝ-45 κύτταρα συν-επιμολυσμένα με το pri-miR-29a και γονίδιο αναφοράς που περιέχει την υποτιθέμενη θέση δέσμευσης. **:

P

Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε αν miR-29a θα μπορούσε να επηρεάσει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω της στόχευσης του γονιδίου p42.3. Μετά ΜΚΝ-45 κύτταρα επιμολύνθηκαν με p42.3 siRNA για 48 ώρες, βρήκαμε ότι ο κυτταρικός κύκλος μπλοκαρίστηκε στη φάση G1 (75.93%,

P

& lt? 0,05), σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα ( 66,18%). Βρήκαμε ότι μιμείται του miR-29a θα μπορούσε επίσης να επάγει τη σύλληψη G1 φάση σε ΜΚΝ-45 κύτταρα όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία για 48 ώρες (75.56%,

P

& lt? 0,05? Σχήμα 5).

Ροή κυτταρομετρίας ανάλυση επιβεβαίωσε ότι οι δύο p42.3 siRNA και miR-29a μιμείται που προκαλείται από τη σύλληψη φάση G1 στην κυτταρική γραμμή ΜΚΝ-45.

η

η έκφραση του miR-29a και της πρωτεΐνης p42.3 στο GC και την αντιστοιχία τους με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά

Χρησιμοποιώντας μια τεχνική PCR ποσοτική πραγματικού χρόνου, miR-29a ανιχνεύθηκε σε 60 ζεύγη ιστών GC και συμφωνημένα μη καρκινικές παρακείμενους ιστούς τους, ενώ το επίπεδο της πρωτεΐνης p42.3 αξιολογήθηκε επίσης σε αυτούς τους ιστούς με κηλίδωση Western. Από δείγματα ιστών 60 GC, η έκφραση p42.3 ήταν υψηλή σε 35 περιπτώσεις (35/60, 58.33%) σε σχέση με συμφωνημένα μη καρκινικά γειτονικούς ιστούς τους. Στις 25 περιπτώσεις στις οποίες η κατιούσα ρύθμιση της έκφρασης p42.3, η έκφραση του miR-29a ήταν υψηλή σε 21 περιπτώσεις. έκφραση MiR-29α ήταν χαμηλή σε 27 περιπτώσεις (27/60, 45%). Τα παραπάνω δεδομένα δείχνουν μια αντίστροφη σχέση μεταξύ miR-29a και η έκφραση πρωτεΐνης p42.3 σε δείγματα ιστού (

P

= 0,000, Πίνακας 1 και Σχήμα 6), αλλά ο συντελεστής συσχέτισης δεν ήταν καλή (r = -0.316 .)

Υπήρξε μια αντίστροφη σχέση μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης p42.3 και miR-29a και την εξίσωση της σχέσης τους ήταν y = -0.3458x + 2,8126 (y: η έκφραση του miR-29a, x :. η έκφραση της πρωτεΐνης p42.3)

η

Επιπλέον, miR-29a και η έκφραση της πρωτεΐνης p42.3 αξιολογήθηκαν σε σχέση με τις κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των 60 ασθενών από τους οποίους ελήφθησαν δείγματα ιστού. Τα ευρήματά μας πρότεινε ότι δεν υπήρχαν προφανείς συσχετίσεις μεταξύ πρωτεΐνης p42.3 και την έκφραση του miR-29a, αντίστοιχα, με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά (Πίνακας 2).

Η

Συζήτηση

Η γονίδιο p42.3 είναι εντόνως διατηρημένο σε θηλαστικά και, ως ένα ογκογονίδιο, μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην προοδευτική μετατροπή των φυσιολογικών κυττάρων του γαστρικού επιθηλίου σε καρκινικά κύτταρα. διαφορική έκφραση του κατά τη διάρκεια των σταδίων του κυτταρικού κύκλου αποκαλύπτει ότι p42.3 μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από τα αποτελέσματά μας, η οποία έδειξε ότι p42.3 σίγηση θα μπορούσαν να αλλάξουν την έκφραση των δύο βασικών πρωτεϊνών, CHK2 και κυκλίνης Β1, που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Χρησιμοποιώντας πειράματα απώλειας λειτουργίας, αποδείξαμε ότι p42.3 μπορεί να διεγείρουν κυτταρικό πολλαπλασιασμό και όπως αναφέρθηκε, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι p42.3 υπερεκφράστηκε σε ιστούς GC σε σχέση με το παρακείμενο βλεννογόνο μη καρκινικά [3]. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί που προκύπτουν σε αυτό το παρεκκλίνουσα έκφραση του γονιδίου p42.3 σε GC είναι ελάχιστα κατανοητή, όπως είναι εμφανές από την έλλειψη διαθέσιμης βιβλιογραφίας. MiRNAs μπορεί να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση με στόχευση τις θέσεις δέσμευσης των mRNAs στόχο [27] και, σε ανθρώπινους καρκίνους, πολλοί miRNAs έχουν ήδη εμπλακεί. Ωστόσο, η λειτουργία μερικών μόνο έχει γίνει κατανοητό μέχρι σήμερα, ειδικά σε GC [28].

Στην έκθεση αυτή, επιλέξαμε miR-29a για περαιτέρω διερεύνηση από ένα σύστημα γονιδίου αναφοράς και τελικά διαπίστωσε ότι P42. 3 ήταν μια άμεση γονίδιο στόχο του miR-29a. Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι οι τέσσερις βάσεις δεδομένων (TargetScan, microRNA.org, MicroCosm Στόχοι έκδοση 5 και miRGen) που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αποτελεσματική, αλλά δεν είναι τέλεια, τα εργαλεία για την πρόβλεψη των στόχων των miRNAs και παρέχονται πειραματικές αποδείξεις για βελτιώσεις στο υποκείμενο αλγόριθμο.

Σας έδειξαν ότι η έκφραση p42.3 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση του miR-29a σε τέσσερις κυτταρικές GC γραμμές. Σε τρία από αυτά, ΜΚΝ-45, MGC-803 και AGS, αυτό ήταν εμφανής τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης, αλλά αυτό δεν ήταν η περίπτωση στην SGC-7901 κυτταρική γραμμή. Επιπλέον, η έκφραση του miR-29a δεν ήταν χαμηλή στις κυτταρικές σειρές ΜΚΝ-28 και SNU-1. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις μας επέτρεψε να υποθέσει ότι ο ρυθμιστικός ρόλος του miR-29a περιπλέκεται σε κυτταρικές σειρές GC και ότι miR-29a μπορεί να παίζει διαφορετικούς ρόλους σε διαφορετικές κυτταρικές υπόβαθρα. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μηχανισμοί των λειτουργιών miR-29a σε κυτταρικές σειρές GC απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση.

Στη μελέτη μας, miR-29a υπερέκφραση μπορούσαν να προκαλέσουν παρόμοια αποτελέσματα με εκείνα που επιτυγχάνονται από την αποσιώπηση των p42.3 από p42.3 siRNA. Και οι δύο mRNA p42.3 και πρωτεΐνης ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με p42.3 siRNA ή μιμείται miR-29a και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου κατεστάλησαν όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν την ίδια παρεμβολή. Πρότεινε ότι miR-29a μπορεί να εμπλέκεται στην παθογένεση της GC μέσω της καταστολής της έκφρασης του γονιδίου p42.3. Ωστόσο, βρήκαμε από τις καμπύλες ανάπτυξης που ο βαθμός της καταστολής από μιμείται miR-29a ήταν μεγαλύτερη παρά από p42.3 siRNA. Κατά τη γνώμη μας, ο κύριος λόγος για αυτό μπορεί να είναι ότι οι συγκεκριμένες miRNAs θα μπορούσε να ρυθμίσει εκατοντάδες γονίδια για τον έλεγχο της κυτταρικής λειτουργίας. Στην παρούσα μελέτη, miR-29a μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τουλάχιστον εν μέρει, στοχεύοντας p42.3.

Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι, αν και ο ρυθμός υψηλή έκφραση του miR-29a ήταν 55% (33 /60) σε GC, η έκφραση p42.3 ήταν χαμηλή σε 21 από αυτές τις περιπτώσεις. Αυτό πρότεινε ότι το miR-29a μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στους ιστούς GC με χαμηλά επίπεδα έκφρασης του p42.3.

Στην παρούσα μελέτη, επικυρωμένη ότι p42.3 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-29a. Έχουμε αποδείξει επίσης ότι miR-29a μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και να μπλοκάρει τον κυτταρικό κύκλο, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της καταστολής της έκφρασης p42.3 σε GC. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι miR-29a μπορεί να παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης του p42.3 σε GC. Είναι ενδιαφέρον βρήκαμε ότι το γονίδιο p42.3 θα μπορούσε επίσης να ρυθμίζουν την έκφραση του miR-29a (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται εδώ), αλλά η βασική ρυθμιστικός μηχανισμός θα πρέπει να διερευνηθούν στο μέλλον.

Υλικά και Μέθοδοι

Βιοπληροφορική

Τέσσερις αποτελεσματική υπολογιστικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούν διαφορετικά συστήματα αξιολόγηση [29] – [32] χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη των ρυθμιστικών miRNAs που στοχεύουν το γονίδιο p42.3, συμπεριλαμβανομένων TargetScan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), MicroCosm Στόχοι Έκδοση 5 (https://www.ebi.ac.uk/enright-srv /μικρόκοσμο /htdocs /στόχων /v5 /) και miRGen (https://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Στόχοι επιλέχθηκαν για περαιτέρω επιβεβαίωση από την ομάδα των miRNAs που ήταν κοινά με τα αποτελέσματα που προκύπτουν από περισσότερες από μία αναζήτηση.

δείγματα ιστών

Εξήντα ζεύγη ιστοπαθολογικά επιβεβαίωσε GC και των παρακείμενων ιστών μη-καρκίνου δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή στο Νοσοκομείο Renji συνδεδεμένες με την Σαγκάη Πανεπιστήμιο Jiaotong της Ιατρικής Σχολής, η Κίνα από τον Ιούλιο του 2007 και τον Ιανουάριο του 2009. το συμφωνημένα μη καρκινικά παρακείμενους ιστούς ελήφθησαν τουλάχιστον 5 cm μακριά από την περιοχή του όγκου. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας της Σαγκάης Jiaotong Πανεπιστήμιο και ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς, ενώ η γραπτή συγκατάθεση ελήφθησαν από κάθε ασθενή.

Οι κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Ανθρώπινο GC κυτταρικές σειρές, SGC-7901, ΜΚΝ-28, ΜΚΝ-45, MGC-803, SNU-1 και AGS, και η κανονική γαστρικό επιθήλιο κυτταρική γραμμή GES-1, που αγοράστηκαν από την ATCC (ΗΠΑ), διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Ένα διάλυμα θρυψίνης (0,25%) χρησιμοποιήθηκε για να αποκολληθούν τα κύτταρα από το δοχείο καλλιέργειας.

Vector κατασκευή

Για την κατασκευή του φορείς έκφρασης PRI-miR-29a ενισχύθηκε πρώτα με τους εκκινητές που σχεδιάστηκε από Primer Premier 5.0 λογισμικό (Πίνακας 3) και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε σε pcDNA3.1 (Invitrogen). Για να παραχθούν τα πλασμίδια που περιείχαν την υποθετική θέση συνδέσεως του miR-29a, αμφότερα άγριου τύπου και μεταλλαγμένες αλληλουχίες από τη θέση 111 έως 380 του p42.3-3’UTR συντέθηκαν χημικά (Σχήμα 1Α) και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκαν στο κατάντη του γονιδίου EGFP σε

Bam HI

και

Eco

τοποθεσίες RI στο φορέα pcDNA3 /EGFP (Saierbio, Tianjin, Κίνα).

η

προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς

ΜΚΝ-45 κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν φρεάτια μιας πλάκας 24 φρεατίων την ημέρα πριν την επιμόλυνση. PcDNA3.1 (+) /πρωτογενείς-miR-29a είχαν συν-επιμολυσμένα με άγριου τύπου και mut-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR αντίστοιχα. Στη συνέχεια, 0.5 μα του pcDNA3.1 (+) /πρωτογενούς miR-29a και 0,5 μg pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR προστέθηκαν σε καθένα από τα φρεάτια, ενώ 0,1 μg του φορέα pDsRed-C1 (Clontech ), η οποία εξέφρασε την RFP, προστέθηκαν σε κάθε καθώς και ένα ενδογενές αναφοράς. Τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν μόνο με pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR ή pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR + pcDNA3.1 (+) χρησιμοποιήθηκαν ως οι έλεγχοι. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και αναλύθηκαν με βάση την ένταση της EGFP και φθορισμού RFP ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο φθορισμού F-4500 (Hitachi, Japan).

διαμόλυνση κυττάρων

Η επιμόλυνση των ΜΚΝ-45 κύτταρα διεξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. ΜΚΝ-45 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων ή πλάκες 96-φρεατίων σε 30% συρροή την ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Μιμείται (100 nM, GenePharma) και αναστολείς (200 nM, RIBOBIO) του miR-29a χρησιμοποιήθηκαν για να εξωγενώς πάνω και ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του miR-29a. Να φιμώσουν τη γονιδιακή έκφραση p42.3, τα κύτταρα ΜΚΝ-45 ήταν επιμολυσμένα με siRNA έναντι p42.3 (si-p42.3, 100 nM, GenePharma). Το RNA ελέγχου (που ονομάζεται ως NC) ήταν μη ομόλογες με οποιαδήποτε ανθρώπινη αλληλουχία γονιδιώματος. Οι αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων ολιγο φαίνονται στον Πίνακα 4.

Η

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase-free ϋΝάσης Ι (Fermentas, San Diego, CA, USA). Ολικό RNA (500 ng) υπέστη αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας την PrimeScript RT Kit αντιδραστήριο (Takara, Dalian, Japan). Οι αλληλουχίες εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση p42.3 και GAPDH παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Για την ανάλυση της έκφρασης του ώριμου miR-29a, 2 μg του ολικού RNA υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή με τη χρήση του All-in-One miRNA Q-PCR Κιτ ανίχνευσης (GeneCopoeia, Guangzhou, Κίνα). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου για τις ώριμες miR-29a και U6 διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας το σύστημα πραγματικού χρόνου PCR ΑΒΙ 7300 και ειδικών εκκινητών σχεδιάστηκε από GeneCopoeia, Κίνα. Η σχετική έκφραση του p42.3 και miR-29a κανονικοποιήθηκε σε έναν ενδογενή αναφοράς (GAPDH και U6 μικρού πυρηνικού RNA, αντίστοιχα) και σε σχέση με τον μάρτυρα. Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως φορές μεταβολής, που υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2 (-ΔΔCT) [33]? μια σχετική αναλογία έκφραση του & lt? 1,0 θεωρήθηκε ως χαμηλό, ενώ μία αναλογία & gt? 1,0 θεωρήθηκε ως υψηλής έκφρασης [14]

κηλίδωση Western

Η ολική πρωτεΐνη από καλλιεργημένα κύτταρα και τους ιστούς. εκχυλίστηκαν με RIPA ρυθμιστικό λύσης που περιέχει PMSF, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford [34]. Συνολικά, 40 μg πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν μέσω πηκτωμάτων SDS πολυακρυλαμιδίου 10% και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Millipore). Η μεμβράνη επωάστηκε με αντίσωμα p42.3 (1:500, Abmart, Κίνα), το αντίσωμα CHK2 (1:1,000, CST), το αντίσωμα cyclinB1 (1:1,000, CST) ή GAPDH (1:5,000, Kang Chen, Κίνα) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Δευτερεύοντα αντισώματα σημάνθηκαν με HRP (Kang Chen, Κίνα) και τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA). Στη συνέχεια, οι εικόνες αναλύθηκαν με ImageJ 1.43 του λογισμικού. Η έκφραση της πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε σε έναν ενδογενή αναφοράς (GAPDH) και σε σχέση με τον μάρτυρα. Μια σχετική αναλογία έκφρασης & lt? 1,0 θεωρήθηκε ως χαμηλή έκφραση, ενώ η αναλογία & gt? 1,0 θεωρήθηκε ως υψηλής έκφρασης [14]

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Η συγκομιδή ΜΚΝ-45 κύτταρα. (περίπου 5 χ 10

4 κύτταρα) σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 96 φρεατίων. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός μετρήθηκε σε 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, αντιστοίχως, με τη χρήση του Κυττάρου Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η απορρόφηση σε μήκος κύματος 450 nm, η οποία δείχνει θετική σχέση με τη χωρητικότητα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, προσδιορίστηκε με ένα φασματοφωτόμετρο (Ε-ΛΙΖΑ MAT-3000).

κυτταρικού κύκλου δοκιμασία

Σαράντα -eight ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη και πλύθηκαν σε DPBS (Gibco)? αυτοί στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους -20 ° C για 24 ώρες. Για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (EPICS XL Beckman Coulter), τα κύτταρα επωάστηκαν σε RNAse (Fermentas) στους 37 ° C για 30 λεπτά, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΡΙ (Sigma) και αιωρήθηκε σε 300 μΙ DPBS.

Στατιστική ανάλυση

τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος ± SD από τρία τουλάχιστον ξεχωριστά πειράματα. Η σημασία αναλύθηκε με t-test του Student και μη παραμετρικές δοκιμές (Mann-Whitney U test και δοκιμή Kruskal-Wallis H). Η στατιστική σημαντικότητα της συσχέτισης μεταξύ της έκφρασης του-29α miR και p42.3 πρωτεΐνη υπολογίστηκε από το chi-square test και το βαθμό συσχέτισης Spearman του. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση SPSS 13.0 λογισμικού (IBM, ΗΠΑ) και οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

P

& lt? 0.05.