Αφηρημένο

Η ανώμαλη έκφραση του miR-96 στον καρκίνο του προστάτη έχει ήδη αναφερθεί. Ωστόσο, ο ρόλος και ο μηχανισμός δράσης του miR-96 σε καρκίνο του προστάτη δεν έχει προσδιοριστεί. Σε αυτή τη μελέτη, οι διαγνωστικές και προγνωστικές ιδιότητες του miR-96 επίπεδα έκφρασης ερευνήθηκαν με qRT-PCR σε δύο καλώς τεκμηριωμένες ομάδες καρκίνου του προστάτη. Η έκφραση miR-96 βρέθηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη και συσχετίζονται με το βαθμό της ΠΟΥ, και μειωμένο συνολικό χρόνο επιβίωσης? ασθενείς με χαμηλά επίπεδα του miR-96 έζησαν 1,5 χρόνια περισσότερο από ό, τι οι ασθενείς με υψηλά επίπεδα miR-96. Το θεραπευτικό δυναμικό ερευνήθηκε περαιτέρω in vitro, δείχνοντας ότι η έκτοπη επίπεδα miR-96 ενισχύει την ανάπτυξη και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, γεγονός που συνεπάγεται ότι miR-96 έχει ογκογόνο ιδιότητες σε αυτή τη ρύθμιση. Έχουμε αποδείξει ότι η έκφραση miR-96 μειώνει τα επίπεδα μεταγραφής και πρωτεΐνες του FOXO1 μέσω σύνδεσης σε μία από τις δύο προβλεπόμενες θέσεις πρόσδεσης στην αλληλουχία FOXO1 3’UTR. Μπλόκο αυτή θέση πρόσδεσης ανέστειλε πλήρως την ενίσχυση της ανάπτυξης μεταφέρεται από miR-96. Η διαπίστωση αυτή επιβεβαιώθηκε σε μια μεγάλη εξωτερική ομάδα των ασθενών με καρκίνο του προστάτη, όπου miR-96 έκφρασης αντιστρόφως συσχετίζεται με την έκφραση FOXO1. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι miR-96 παίζει ένα ρόλο κλειδί στον καρκίνο του προστάτη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μπορεί να ενισχύσει την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Αυτή η γνώση θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών εργαλείων για τον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Haflidadóttir BS, Larne O, Martin Μ, Persson Μ, Edsjö Α, Bjartell A, et al. (2013) Η αναβάθμιση του miR-96 αυξάνει την κυτταρική πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη μέσω FOXO1. PLoS ONE 8 (8): e72400. doi: 10.1371 /journal.pone.0072400

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 17η Απριλίου 2013? Αποδεκτές: 10 του Ιούλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Haflidadóttir et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα που οδηγεί σε αυτά τα αποτελέσματα έχει λάβει χρηματοδότηση από την Ένωση έβδομου προγράμματος-πλαισίου της Ευρωπαϊκής (FP7 /2007-2013) στο πλαίσιο της συμφωνίας επιχορήγησης n ° 201438, η σουηδική έρευνα Συμβούλιο, Gunnar Nilssons Καρκίνου Ίδρυμα, Ίδρυμα Jeanssons και Gyllenstiernska Krapperups ίδρυμα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στις ευρωπαϊκές και της Βόρειας Αμερικής άνδρες και μία από τις κύριες αιτίες που σχετίζονται με τον καρκίνο των θανάτων [1]. Ενώ περιορίζεται στον αδένα του προστάτη, ο καρκίνος είναι θεραπεύσιμος με είτε προστατεκτομή ή ακτινοθεραπεία [2]. Καθώς ο όγκος εξελίσσεται, αναπτύσσει τις ικανότητες για να εισβάλλουν περιβάλλοντα ιστό, επάγουν αγγειογένεση, και μεταστάσεις. Θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, είτε χημικό ή χειρουργικό ευνουχισμό, είναι ο χρυσός κανόνας της θεραπείας για προχωρημένους ΣΕΣΣ. Η επιλογή αυτή μεταχείριση έχει ως αποτέλεσμα σημαντική κλινική παλινδρόμηση σε όλους σχεδόν τους ασθενείς [3,4]. Ωστόσο, η πλειονότητα των όγκων γίνει ανθεκτικά ευνουχισμός και συνεχίζει την ανάπτυξη εντός 12-18 μηνών και για υποτροπιάζοντες όγκοι είναι διαθέσιμα μόνο παρηγορητική θεραπεία. Για να επιβιώσουν και να συνεχίσετε την ανάπτυξη σε μια ανδρογόνο εξαντλούνται γύρω, τα κύτταρα πρέπει είτε να προσαρμόσει το (AR) οδού του υποδοχέα ανδρογόνων ή επάγουν εναλλακτικές οδούς επιβίωσης και ανάπτυξης. Μηχανισμοί υποκείμενη προσαρμογή του AR μπορεί να αυξηθεί η έκφραση του AR, αυξημένη τοπική παραγωγή ανδρογόνων, υπερευαισθησίας ή ουσιαστικά δραστική περικομμένες μορφές του AR, ασυδοσία, και /ή συνδέτης ανεξάρτητη ενεργοποίηση μέσω κινάσης cross-talk. Σε PCa απορυθμισμένη microRNA (miRNA) έκφραση έχει αναφερθεί [5-7] και miRNAs πιστεύεται ότι συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου μέσω της εμπλοκής τους στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, την εισβολή, τη μετάσταση και την αντίσταση ευνουχισμός έναρξης [επανεξεταστεί 8-10]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει στο παρελθόν ότι τα επίπεδα miR-96 απορυθμίζεται σε PCa [5,7,11], και ότι είναι επίσης εντόνως εκφρασμένο σε πολλές άλλες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του λεμφώματος, του ήπατος, του μαστού, των ωοθηκών, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, των όρχεων και καρκίνο του παχέος εντέρου [5,12]. miR-96 έχει προταθεί ότι δρα ως oncomiR ρυθμίσεως του πολλαπλασιασμού και στην επιδιόρθωση του DNA [13], αλλά επίσης και ως διέγερση απόπτωσης καταστολέας όγκων σε παγκρεατικά κύτταρα [14]. Στον καρκίνο του μαστού, του miR-96 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της στόχευσης του γονιδίου Forkhead παράγοντα κουτί O μεταγραφής ογκοκατασταλτικό, FOXO3a, και οι αναστολείς κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη p27

Kip1 και p21

Cip1 [15]. miR-96 έχει επίσης δειχθεί να στοχεύσει FOXO1 σε ενδομητρίου [16], του μαστού [17], ηπατοκυτταρικό καρκινικά κύτταρα [18] και λέμφωμα Hodgkin [19]. Forkhead πρωτεΐνες κουτί O FOXO1, FOXO3a, FOXO4 και FOXO6 είναι μεταγραφικοί παράγοντες που εμπλέκονται σε βιολογικές διαδικασίες όπως η επιδιόρθωση της βλάβης του DNA [20], του κυτταρικού κύκλου [21,22] και απόπτωση [21,23]. Ο καταστολέας των όγκων FOXO1 βρίσκεται στο 13q41, μια περιοχή διαγράφονται συχνά σε προστάτη και άλλων μορφών καρκίνου, καθώς και τα επίπεδα τόσο της πυρηνικής FOXO1 και απομαγνητοφώνηση έχει αποδειχθεί να μειωθεί σε προστάτη [24,25]. Φωσφατάση και tensin ομόλογο (PTEN) συχνά χάνεται στον καρκίνο του προστάτη [26,27], η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε απώλεια ή μειωμένη λειτουργία των κατάντη δράστες όπως FOXO1 [21]. FOXO1 έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει την απόπτωση [17,21] και τον πολλαπλασιασμό μείωση [17,21]. Σε προστάτη κύτταρα συγκεκριμένα, FOXO1 επάγει την απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου [21,28], και έχει επίσης αποδειχθεί ότι είναι ένα μέρος ενός κανονιστικού βρόχο ανάδρασης με το AR στην ΣΕΣΣ. FOXO1 καταστέλλει τόσο την εξαρτώμενη από ανδρογόνο και ανεξάρτητου από ανδρογόνο δραστικότητα του AR [24,29,30], και AR αναστέλλει την δραστικότητα δέσμευσης του DNA του FOXO1 με σχηματισμό ενός συμπλόκου πρωτεΐνης-πρωτεΐνης με FOXO1, η οποία καθιστά FOXO1 αδυνατούν να επάγουν απόπτωση και κυτταρική σύλληψη του κύκλου [30].

ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι το ΣΕΣ, miR-96 δρα ως oncomiR, που επηρεάζουν την εξέλιξη του όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, οι προγνωστικοί ιδιότητες του miR-96 αναλύθηκαν σε δύο ομάδες ασθενών προστάτη και την έκφραση συσχετίζεται με κλινικές παραμέτρους. Η επίδραση του miR-96 στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό αξιολογήθηκε

in vitro

και FOXO1 αναγνωρίστηκε ως άμεσο στόχο miR-96 στα κύτταρα του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

η δεοντολογική έγκριση για όλα τα δείγματα που περιγράφεται έχει ληφθεί από «Regionala etikprövningsnämnden i Lund» (τοπικό Ηθική Διοικητικού κριτική στο Lund, Σουηδία), την έγκριση #: LU909-03 και τα προσωπικά δεδομένα ανώνυμα. Η επιτροπή δεοντολογίας παραιτηθεί από την ανάγκη για γραπτή συγκατάθεση και τις πληροφορίες πρότασή τους σχετικά με την έρευνα που περιέχουν οδηγίες του opt-out τη διαδικασία δημοσιεύθηκε σε όλες τις μεγάλες τοπικές εφημερίδες. Μπορούμε να τηρούν τη δήλωση του Ελσίνκι και της οδηγίας για την προστασία των δεδομένων.

Τα δείγματα ασθενών

Cohort 1, που περιγράφηκε προηγουμένως [31,32] και στον πίνακα S1, χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση miR-96 έκφρασης . Αποτελείται από δείγματα ιστών που συλλέγονται από διουρηθρική εκτομή του προστάτη (TURPs), συλλέγονται 1990-1999 στο Malmö της Σουηδίας. Εν συντομία, το υλικό μονιμοποιήθηκε σε 4% ρυθμισμένη παραφορμαλδεϋδη και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Τα δείγματα βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με το πρότυπο του ΠΟΥ και η διάγνωση βασίστηκε σε ιστοπαθολογική διάγνωση σε τυχαία επιλεγμένες περιπτώσεις με ενδείξεις αδενοκαρκίνωμα του προστάτη σε 50 ασθενείς και καλοήθης υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ) (δηλαδή, καμία απόδειξη της PCA) σε άλλα 25 άτομα. Η παρουσία του προστάτη και εκτίμηση του ποσού (%) των καρκινικών κυττάρων έγινε χρησιμοποιώντας τμήματα που γειτνιάζουν με αυτές που χρησιμοποιήθηκαν για miRNA αναλύσεις [31]. ένα δείγμα (1/50) του καρκίνου δεν βρέθηκε να περιέχει PCA σε παρακείμενο τμήμα και αποκλείστηκε από τον τελικό σύνολο δεδομένων. Το ηλικιακό εύρος κατά τη στιγμή της TURP ήταν 63 έως 89, με μέσο όρο 76 ετών για τους άνδρες διαγνώστηκαν με καρκίνο, και 56-86, με μέσο όρο 71 ετών για τους άνδρες με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη. Cohort 2 αποτελείται από 93 φορμόλη σταθερό ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPEs) σε ιστούς που λαμβάνονται από ριζικές προστατεκτομές, κατατάσσονται σύμφωνα με την ΠΟΥ και Gleason. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε Malmö Hospital 1999-2002 και περιγράφονται στον πίνακα S2. Το εύρος ηλικίας κατά τη στιγμή της προστατεκτομή ήταν 48-73 με μέση τα 62 έτη. έχουν τις κατάλληλες ηθικές εγκρίσεις έχουν ληφθεί από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Lund και έχουν προσχωρήσει στη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

κυτταρικές σειρές προστάτη 22Rv1, LNCaP κλώνος FGC, DU145 και PC3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection και κυτταρικές γραμμές VCAP και ΡΝΤ2 ελήφθησαν από European Collection of Cell Culture. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή. Τα κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με miRIDIAN microRNA Μιμούνται (C-300514-07, καθετήρα 80 ηΜ, Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE) και παράλληλα? κύτταρα επιμολυσμένα με miRIDIAN microRNA Μιμούνται αρνητικού μάρτυρα (CN-001000-01-05). Για την αναστολή της ενδογενούς miR-96, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αναστολείς miRCury LNA (100 ηΜ ανιχνευτή, Exiqon A /S, Vedbaek, Denmark), miR-96 αναστολέα (Cat. Ηο. 410467-00) και παράλληλα με Αρνητικός μάρτυρας Α (Cat . αρ. 199004-00). Κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Oligofectamin (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Απομόνωση RNA

Η απομόνωση του RNA από τα δείγματα προστάτη και ΒΡΗ ιστού σε ομάδα 1 περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Εν συντομία, το RNA εκχυλίσθηκε από 20 μm τομές 75 σταθεροποιημένων με φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPEs) δείγματα ιστού του προστάτη. Μικρές RNAs εκχυλίσθηκαν με ένα ελαφρώς τροποποιημένο πρωτόκολλο του mirVanaTM miRNA Απομόνωση Kit (Ambion)? τα δείγματα αφαιρείται η παραφίνη με επεξεργασία ξυλόλιο και χωνεύεται με πρωτεάση πριν από την οργανική εκχύλιση. Μετά την πλύση του φίλτρου που περιέχει τον μικρό RNA, τα δείγματα ήταν DNase αγωγή (RecoverAll, Ambion), και πλένεται και πάλι. Στην ομάδα 2, το συνολικό RNA εξήχθη από πυρήνες ιστό του προστάτη (1-4mm). Ολικό RNA εκχυλίστηκε σύμφωνα με ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο του

Mir

κιτ απομόνωσης Βάνα ™ miRNA (Ambion) όπως περιγράφεται στο Hagman et al. [31]. Όλες οι συγκεντρώσεις RNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop (ND-1000, Φασματοφωτόμετρο, Thermo Fisher Scientific Inc.). Η εκχύλιση RNA από 27 ανθρώπινους ιστούς ποικίλης προέλευσης έχει περιγραφεί προηγουμένως [33]. Από τις κυτταρικές σειρές, απομονώθηκε ολικό RNA χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση (Promega Biosciences, San Luis Obispo, CA). Η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε με τη χρήση NanoDrop. Για εξωτερική επικύρωση της συσχέτισης μεταξύ miR-96 και τα επίπεδα μεταγραφής FOXO1 αναλύσαμε μια εξωτερικά δεδομένα μικροσυστοιχιών που από Taylor et al. αποτελεί 110 δείγματα ιστού καρκίνου του προστάτη και 28 μη-κακοήθεις γειτονικά δείγματα καλοήθη ιστό του προστάτη [34] (GEO αριθμός ένταξη GSE21036).

Η αντίστροφη αντίδραση μεταγραφής και qRT-PCR

Τα επίπεδα miRNA ήταν ποσοτικά με πρωτόκολλο TaqMan Micro-RNA Δοκιμασίες (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με μικρές αλλαγές. Εν συντομία, 5 ή 10 ng μικρό ΚΝΑς αντίστροφα μεταγράφονται με miR-96 ειδικούς εναρκτήρες (Δοκιμασία αρ. 000186). Το προϊόν RT ενισχύθηκε σε 10 μΙ αντιδράσεων ανά qRT-PCR σε πλάκες 384-φρεατίων σε 7900 ΗΤ Fast PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems). Τα δείγματα τρέχουν εις τετραπλούν, και ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε με τη συγκριτική μέθοδο Delta Ct. Σύνδεση

2-μετασχηματισμένα τιμές ομαλοποιήθηκαν διαιρώντας με τον γεωμετρικό μέσο όρο των 3 γονιδίων housekeeping RNU48, RNU66 και U47 στη μελέτη δειγμάτων ασθενών. Στη μελέτη της έκφρασης miR-96 σε ιστούς των διαφορετικών γραμμών ανθρώπινης προέλευσης και προστάτη των κυττάρων ο γεωμετρικός μέσος των RNU48, RNU66, RNU24 και RNU44 χρησιμοποιήθηκε. Η έκφραση του FOXO1 (εκκινητής: Hs01054576m1) σε κυτταρικές σειρές και μετά miR-96 υπερέκφραση σε κύτταρα 22Rv1, η μέση τιμή της GAPDH (Hs02758991_g1), και PGK1 (Hs9999906) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Αυτές οι υπηρεσίες οροφοκομίας γονίδια επίσης υπηρετήσει ως έλεγχος για την ακεραιότητα του RNA. Μαζί με την αντίστροφη μεταγραφή και την qRT-PCR, αρνητικός έλεγχος δεν ενζύμου και ενός ελέγχου χωρίς πρότυπο έτρεξαν να αποκλείσουν τη μόλυνση PCR και γονιδιακού DNA.

Ο αριθμός των κυττάρων και την ανάπτυξη των κυττάρων

Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε εις τριπλούν δειγμάτων επιμολυσμένα με miR-96 μιμητικό σε σύγκριση με ένα αρνητικό έλεγχο σε τέσσερα χρονικά σημεία, 2, 3, 4 και 5 ημέρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα trypzinised και μετρήθηκαν σε ένα θάλαμο Bürkner. Β (SRB) δοκιμασία Sulforhodamine χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η ανάπτυξη των κυττάρων έμμεσα με χρώση η συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των κυττάρων επιμολυσμένων με miR-96 μιμείται σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον αρνητικό μάρτυρα. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο τριχλωροξικό οξύ 10% και χρωματίστηκαν με 0,4% SRB (S9012-5G από την Sigma-Aldrich Co, St. Louis, ΜΟ) σε 1% οξικό οξύ για 15 λεπτά. Χωρίς περιορισμούς SRB πλύθηκε καλά με 1% οξικό οξύ. Η δεσμευμένη SRB διαλύθηκε σε βάση 10 mM Tris και η απορρόφηση αναγνώστηκε στα 490nm χρησιμοποιώντας ELx808 IU Ultra Microplate Reader (Biotek Instruments, Inc, Winooski, VT). Κύτταρα μετεμβολιασμένα με miR-96 μιμείται συλλέχθηκαν 72-120 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα DU145 συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, κύτταρα PC3 96 h και τα κύτταρα 22Rv1 120 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

κύτταρα μετεμβολιασμένα με miR-96 ή τον αρνητικό μάρτυρα (εις τριπλούν) επώαζαν με 5-βρωμο-2 δεοξυουριδίνη (BrdU, GE Healthcare, Wauwatausa, WI) σε αραίωση 1: 1000 σε κανονικό μέσο ανάπτυξης. Μετά από 1 ώρα, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS και μετρήθηκαν σε ένα θάλαμο Bürkner. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε παγωμένης αιθανόλης 70%. Σταθερή κύτταρα επωάστηκαν με 2Μ HCl που περιείχε 0,2 mg /ml πεψίνης για 20 λεπτά για να αφομοιώσει τις κυτταρικές πρωτεΐνες. Μετά την πλύση, τα δείγματα επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος (1% BSA, 0,5% Tween-20 σε PBS). Τα δείγματα επωάστηκαν με Alexa 488 Fluor® επισημασμένο με BrdU μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Κλώνος MoBU-1) (Cat. Ηο. B35139 από την Invitrogen) σε συγκέντρωση 1:60 σε ρυθμιστικό διάλυμα παρεμπόδισης και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με ήπια ανάμιξη. Τα δείγματα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 5 μΐ του 7-AAD Λύση Κυττάρου Βιωσιμότητας (Cat. Νο. 559925, BD, Franklin Lakes, NJ) σε PBS, στο σκοτάδι όλη τη νύχτα σε 4 ° C. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε CyFlow ® Space Partec κυτταρομετρητής ροής.

κηλίδας Western

λύματα πρωτεΐνη τριών βιολογικών τριπλούν συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο M-PER θηλαστικών πρωτεΐνη Extraction (Pierce επιστημονική, Thermo Fisher Scientific Inc.) συμπληρωμένο με Αλτ

TM κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (1: 100), (Cat Thermo Fisher Scientific Inc. όχι 87.785..) και 0,5 mM EDTA. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε σε Nanodrop και ίση ποσότητα των δειγμάτων πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε ένα NuPAGE

®Novex 4-12% γέλες Bis-Tris προκατασκευασμένα (Cat. ηο. NP0321BOX, Life Technologies, Carlsbad, CA). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε Immobilon

®-P μεμβράνη μεταφοράς, PVDF (Cat. Αρ. IPVH00010, EMD Merck Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με FOXO1 (C29H4), το μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού σε συγκέντρωση 1: 500 (# 2880, Cell Signaling Technology Inc, Danvers, ΜΑ). GAPDH (GAPDH, μονοκλωνικό ποντικού, MAB374, Merck Millipore, Billerica, ΜΑ), χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Σήματα από τους HRP συζευγμένα αντισώματα που παράγονται από ECL

αντιδραστήριο ανίχνευσης TM Prime Western Blotting (RPN2232 από την GE Healthcare) και ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας μια κάμερα CCD (LAS-3000, Fujifilm, Τόκιο, Ιαπωνία) και Συστήματος Απεικόνισης ChemiDoc ™ MP (Bio -Rad Laboratories, Hercules, CA). εντάσεις Band ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ και ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH.

αποκλειστές θέση στόχο

Υπάρχουν δύο προβλεπόμενες θέσεις για miR-96 δέσμευσης στην FOXO1 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (3’UTR) σε τοποθεσία 264-271 και 2139-2146 (Targetscan του Ανθρώπου, Release 6.2, Ιούνιος 2012). αποκλειστές θέση στόχου σχεδιάστηκαν για να συνδέονται προς τις θέσεις προβλεπόμενη δεσμευτική και διάφορες βάσεις και στις δύο τοποθεσίες των θέσεων πρόσδεσης (Σχήμα S1). BLO_FOXO1_miR96-1: TTACT + TcaC + GGT + TTGAGTG και BLO_FOXO1_miR96-2: CTTGAAC + CAC + GGT + TTCATGA. Η + είναι μπροστά από το «κλειδωμένο Τα νουκλεϊκά οξέα» (LNA

TM) στις αλληλουχίες DNA (Exiqon A /S, Vedbaek, Denmark). Οι αποκλειστές θέση στόχο συν-επιμολύνθηκαν με το miR-96 μιμούνται (100 nm) σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις, 300ηΜ, 600ηΜ ή 1 μΜ. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του FOXO1 ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Η ανάπτυξη μετρήθηκε με χρήση της ανάλυσης SRB μετά από επιμόλυνση με miR-96 μιμούνται και 600ηΜ των αναστολέων θέση στόχο.

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Graphpad Prism 5 και η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με χρήση μη ζευγαρωμένου , δύο-tailed t-test εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά και ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. δοκιμή τάση Cuzick χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της τάσης του miR-96 έκφρασης στο ΠΟΥ Ι, ΙΙ και ΙΙΙ στην ομάδα 1. Για την ανάλυση επιβίωσης ενός Log-rank χρησιμοποιήθηκε (Mantel-Cox) τεστ. Κατάταξη συσχέτιση Spearman χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της συσχέτισης του miR-96 έκφραση στα επίπεδα PSA στο κοόρτη ασθενών 1 και στα επίπεδα FOXO1 στον εξωτερικό σύνολο δεδομένων.

Αποτελέσματα

miR-96 συσχετισμοί έκφραση με κλινικές παραμέτρους

τα επίπεδα του miR-96 έχουν προηγουμένως βρεθεί να είναι σημαντικά υψηλότερη σε PCa ιστό σε σχέση με τους ιστούς μη PCA σε κοόρτη 1 [11]. Εδώ, οι προγνωστικές ιδιότητες των επιπέδων miR-96, μετράται με qRT-PCR σε RNA που εξάγεται από FFPE προστάτη ιστούς, ερευνήθηκαν. Τα κλινικά χαρακτηριστικά της κοόρτης 1 έχουν περιγραφεί λεπτομερώς προηγουμένως [31,32], αλλά μια μικρότερη εκδοχή μπορεί να φανεί στον πίνακα S1. Βρήκαμε επίπεδο miR-96 να είναι χαμηλότερο στην καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (μη-PCA) και αυξάνεται με την άνοδο WHO βαθμού, από τη μέση του miR-96 έκφρασης σε καλοήθη υπερπλασία του προστάτη = 0,1150, ΠΟΥ I = 0,1368, ΠΟΥ ΙΙ = 0,1767, ΠΟΥ ΙΙΙ = 0,2969 (p & lt ? 0,0001, δοκιμή τάση Cuzick του), όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α. Όταν τα δείγματα προστάτη σε σύγκριση χωρίς να συμπεριλαμβάνονται τα δείγματα BPH η αύξηση της έκφρασης του miR-96 με το βαθμό που είναι ακόμα σημαντική (p = 0,0498, δοκιμασία τάση Cuzick του). Αυτό επιβεβαιώθηκε και σε μια δεύτερη ανεξάρτητη ομάδα των 93 σουηδικής άνδρες με προστάτη? η διάμεση miR-96 έκφρασης στο ΠΟΥ I = 1.620, ΠΟΥ ΙΙ = 1.610, ΠΟΥ ΙΙΙ = 2.205. Υπάρχουν μόνο 6 άνδρες στην ομάδα που έχω, αλλά αν ΠΟΥ I και II συνδυάζονται, τα επίπεδα του miR-96 στο ΠΟΥ III είναι σημαντικά υψηλότερη (p = 0,0414) (Εικόνα 1Β). Τα κλινικά χαρακτηριστικά της κοόρτης 2 παρουσιάζονται στον πίνακα S2. Αυξημένη έκφραση του miR-96 συσχετίζεται με αυξημένα επίπεδα PSA σε δείγματα ασθενών στην ομάδα 1 (Σχήμα 1C). Μια ανάλυση Kaplan-Meier του ασθενούς συνολική επιβίωση στην ομάδα 1 έγινε με βάση τα επίπεδα έκφρασης του miR-96. Χαμηλότερη τρίμηνο έκφραση σε σύγκριση με υψηλή έκφραση στα τρία τέταρτα των δειγμάτων των ασθενών, χωρίζει σημαντικά τους ασθενείς του προστάτη σε υψηλού κινδύνου (μέση επιβίωση από 3 ετών) και ασθενείς χαμηλού κινδύνου (διάμεση επιβίωση 4,5 έτη) (p = 0,0389, δοκιμασία log-rank ), με αναλογία κινδύνου 2,2 (95% CI 1,040 έως 4,463), βλέπε Εικόνα 1D. Από ομάδα 2 είναι μια πιο πρόσφατη μια ομάδα αναλύσεων με την επιβίωση ως καταληκτικό σημείο δεν είναι δυνατή ακόμα.

Α. miR-96 έκφραση στα δείγματα ασθενή σε ομάδα 1 είναι η χαμηλότερη στην καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (μη-PCA) δείγματα και αυξάνεται σημαντικά με υψηλότερους βαθμούς ΠΟΥ στα δείγματα προστάτη (Cuzick του τεστ τάσης p & lt? 0,0001). Όταν εξαιρούνται τα δείγματα BPH, η αύξηση στα δείγματα προστάτη και μόνο εξακολουθεί να είναι σημαντική (δοκιμασία τάση Cuzick του, p = 0,0498). B. Στην ομάδα 2, miR-96 έκφραση είναι σημαντικά υψηλότερη σε δείγματα ασθενών προστάτη με διαβάθμιση ΠΟΥ ΙΙΙ σε σύγκριση με δείγματα ασθενών με διαβάθμιση ΠΟΥ Ι και ΙΙ του ΠΟΥ σε συνδυασμό (t-test p = 0,0414). C. Αυξημένα επίπεδα PSA συσχετίζονται με αυξημένα επίπεδα έκφρασης miR-96 στα δείγματα ασθενών σε ομάδα 1 (p = 0,0002, Spearman r = 0,4528). Δ Kaplan-Meier καμπύλη που δεικνύει την επιβίωση σε σχέση με την έκφραση του miR-96 στην ομάδα 1. Η ομάδα των ασθενών με υψηλά επίπεδα miR-96 (συμπαγής γραμμή) έχει μέση επιβίωση των 3 ετών και την ομάδα με χαμηλά επίπεδα miR-96 (διακεκομμένη γραμμή) έχει διάμεση επιβίωση 4,5 έτη. αναλογία κινδύνου είναι 2,2. Χ-άξονες δείχνει το χρόνο σε έτη και Υ-άξονες δείχνει το ποσοστό επιβίωσης (log rank (Mantel-Cox) test p = 0,0389).

Η

miR-96 έκφρασης σε ιστούς και κυτταρικές σειρές

Η έκφραση του miR-96 μετρήθηκε σε δείγματα ιστών διαφόρων προελεύσεων και σε έξι κυτταρικές σειρές προστάτη (22Rv1, LNCaP, vcap, DU145, ΡΝΤ2 και PC3). Στα δείγματα ιστού, υψηλή έκφραση miR-96 ανιχνεύθηκε σε επιδιδυμίδα, το αίμα, τα επινεφρίδια και του προστάτη. Τα επίπεδα στις κυτταρικές σειρές προστάτη ήταν υψηλότερες από ό, τι στο φυσιολογικό προστάτη, με την υψηλότερη έκφραση στο PC3 και χαμηλότερες σε κύτταρα DU145 (Σχήμα 2).

miR-96 επίπεδα έκφρασης σε δείγματα ανθρώπινου ιστού (μαύρες μπάρες ) και κυτταρικές γραμμές προστάτη (ριγέ ράβδοι) μετρήθηκαν με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς το γεωμετρικό μέσο όρο των RNU48, RNU66, RNU24 και RNU44. Υψηλότερη έκφραση παρατηρήθηκε στις κυτταρικές σειρές και του προστάτη (βέλος) είχαν υψηλή έκφραση σε σύγκριση με άλλους ιστούς.

Η

miR-96 αυξάνει τον αριθμό των κυττάρων και την ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα προστάτη μέσω κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Συνεχίσαμε να διερευνηθεί ο βιολογικός ρόλος του miR-96 στα κύτταρα του προστάτη

in vitro

. Η έκτοπη έκφραση του miR-96 σε διάφορες καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη όπως μετρήθηκε με δοκιμασία SRB? σε DU145 κύτταρα (p = 0,0006), κύτταρα 22Rv1 (p = 0,0061) και PC3 κυττάρων (ρ = 0.0211) (Σχήμα 3Α, Β και C αντίστοιχα). Πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι η αναστολή miR-96 με αναστολείς miRCury LNA σε DU145, PC3 ή 22Rv1 δεν είχε ως αποτέλεσμα αλλαγή στην ανάπτυξη των κυττάρων όπως μετράται με SRB (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η επίδραση του miR-96 στην κυτταρική ανάπτυξη αντιστοιχούσε σε ένα αποτέλεσμα επί του αριθμού των κυττάρων των κυττάρων DU145, όπως μετράται με απαρίθμηση κυττάρων. Η έκτοπη έκφραση του miR-96 αυξάνει σημαντικά την αριθμούς κυττάρων τέσσερα (p = 0,0316) και πέντε (p = 0,0396) ημέρες μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 3D). Αυτό αποδείχθηκε ότι οφείλεται σε μία αύξηση του πολλαπλασιασμού, ως έκτοπη έκφραση της miR-96 αύξησε σημαντικά την ενσωμάτωση BrdU σε DU145 σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα (ρ = 0.0091) (Σχήμα 3Ε). Εμείς δεν ανίχνευσε μια σημαντική αλλαγή στα κύτταρα σε G1, G2 ή S-φάσης μεταξύ των κυττάρων επιμολυσμένα με miR-96 και τον αρνητικό μάρτυρα.

Η έκτοπη έκφραση του miR-96 αύξηση αύξηση των κυττάρων σε κύτταρα του προστάτη. κύτταρα Α DU145 (p = 0,0006). κύτταρα Β 22Rv1 (p = 0,0061). κύτταρα Γ PC3 (p = 0,0211). Η ανάπτυξη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία SRB. D. Η έκτοπη έκφραση του miR-96 αυξάνει τον αριθμό των κυττάρων σε κύτταρα DU145 τέσσερα (p = 0,0316) και πέντε (p = 0,0396) ημέρες μετά την επιμόλυνση. Ε Ο πολλαπλασιασμός αυξάνεται σημαντικά σε κύτταρα DU145 κατόπιν υπερέκφραση του miR-96 (p = 0,0091), μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ενσωμάτωση BrdU και 7-AAD σε έναν κυτταρομετρητή ροής. Η μέση αντιπροσωπεύεται από μια κάθετη γραμμή και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση μη ζευγαρωμένα, δύο-tailed t-test.

Η

miR-96 υπερέκφραση μειώνει το mRNA FOXO1 και τα επίπεδα πρωτεΐνης

Όπως έχει δειχθεί σε άλλους τύπους καρκίνου που miR -96 μπορεί να ρυθμίσει τα επίπεδα FOXO1 και FOXO1 έχει περιγραφεί να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει την πολλαπλασιαστική φαινότυπο του miR-96. Ως εκ τούτου, έθεσε ως στόχο να διερευνηθεί η επίδραση του miR-96 σε FOXO1 στα κύτταρα του προστάτη. Πρώτα ερευνήσαμε τα ενδογενή επίπεδα FOXO1 στις κυτταρικές γραμμές του προστάτη. Η υψηλότερη έκφραση της FOXO1 βρέθηκε σε 22Rv1 και PC3 και το χαμηλότερο στα κύτταρα DU 145 (Σχ. 4Α). Εμείς επιλέξαμε 22Rv1, LNCaP και DU145 ως συστήματα μοντέλου. Υπερεκφράζουν miR-96 μειώνεται σημαντικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης FOXO1 σε 22Rv1 κύτταρα (p = 0,0065), κύτταρα LNCaP (p = 0,0030) και DU145 κύτταρα (p = 0,0082) (Εικ. 4Β). Τα επίπεδα FOXO1 επίσης μειώθηκαν κατά miR-96 υπερέκφραση σε κύτταρα VCAP (p = 0,0096), αν και τα ενδογενή επίπεδα FOXO1 είναι χαμηλά σε αυτόν τον τύπο του κυττάρου (Εικ. 4Β). Από το αποτέλεσμα μείωσης του miR-96 σε FOXO1 ήταν πιο έντονη σε 22Rv1 κύτταρα, αποφασίσαμε να διερευνήσει το επίπεδο της μεταγραφής FOXO1 σε αυτή την κυτταρική σειρά. Βρήκαμε ότι miR-96 υπερέκφραση μείωσε σημαντικά τα επίπεδα mRNA σε FOXO1 22Rv1 κύτταρα (p = 0,0341) (Σχ. 4C). Αυτό όμως δεν ήταν τόσο έντονη όσο η επίδραση στα επίπεδα της πρωτεΐνης, υποδεικνύοντας ότι το miR-96 δρα τόσο, υποβαθμίζοντας την απομαγνητοφώνηση FOXO1 και μπλοκάροντας την πρωτεΐνη μεταφραστικής. FOXO1 περιέχει δύο περιοχές

in silico

προέβλεψε δεσμευτικές για miR-96 (σχ. 5Α). Για να διερευνηθεί αν miR-96 συνδέεται άμεσα με τις δύο αυτές θέσεις, η επίδραση του αποκλεισμού κάθε ένα από τα δύο προβλεπόμενες θέσεις πρόσδεσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αποκλειστές θέση στόχο ειδικά σχεδιασμένα για κάθε θέση σύνδεσης (εικ. S1) και συν-επιμολύνθηκαν με miR-96 μιμείται σε κύτταρα 22Rv1. Χρησιμοποιώντας αντι-FOXO1 αντίσωμα και συγκρίνοντας τις εντάσεις ζωνών για GAPDH, δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στο επίπεδο πρωτεΐνης FOXO1 όταν η προβλεπόμενη θέση σύνδεσης μπλοκαρίστηκε 96.1, (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, το επίπεδο της πρωτεΐνης αυξήθηκε σημαντικά όταν η δεύτερη θέση σύνδεσης, 96,2 μπλοκαρίστηκε, χρησιμοποιώντας συγκέντρωση 6-πλάσια του αναστολέα σε σύγκριση με τα μιμητικά miR-96 (Σχήμα 5C). Αυτό δείχνει ότι η επίδραση του miR-96 ήταν εξαρτάται από την πρόσβαση στην δεύτερη θέση να είναι σε θέση να μειώσει τα επίπεδα FOXO1. Αξιοσημείωτο είναι επίσης ότι, όταν συνδυάστηκαν και οι δύο στόχοι sites αποκλειστές η επίδραση χάθηκε. Η ρύθμιση των FOXO1 Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε σε ένα εξωτερικό σύνολο δεδομένων 110 ασθενών προστάτη και 28 μη κακοήθεις δείγματα καλοήθη ιστό προστάτη [34], ήταν η έκφραση του miR-96 συσχετίζεται αντιστρόφως με την έκφραση της FOXO1 στα δείγματα καρκίνου του προστάτη ιστού (ρ = 0,0193 , Spearman, r = -2.228) και στα δείγματα μη κακοήθη ιστό (p = 0,0029, Spearman, r = -0,5424) ξεχωριστά, καθώς και όταν όλα τα δείγματα συνδυάζονται (p = 0,0013, Spearman, r = -0,2717) (Σχήμα 6).

Α. Ενδογενή επίπεδα FOXO1 mRNA σε κυτταρικές σειρές του προστάτη. mRNA επίπεδα μετρήθηκαν με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς τη μέση τιμή του GAPDH και PGK1. Τα επίπεδα πρωτεΐνης Β FOXO1 μειώθηκε σημαντικά σε 22Rv1 κύτταρα (p = 0,0065), κύτταρα LNCaP (p = 0,0030), κύτταρα DU145 (p = 0,0082) και vCap κυττάρων (p = 0,0096) κατά miR-96 υπερέκφραση. Τα δείγματα δείχνουν βιολογικές τριπλούν και τα επίπεδα της πρωτεΐνης FOXO1 ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα της πρωτεΐνης GAPDH. Τα επίπεδα Γ FOXO1 mRNA μειώθηκε σημαντικά σε 22Rv1 κύτταρα μετά από υπερέκφραση του miR-96 (p = 0,0341). Μετρημένη με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς τη μέση τιμή του GAPDH και PGK1. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

Α. Υπάρχουν δύο προβλεπόμενες miR-96 θέσεις πρόσδεσης στην αλληλουχία FOXO1 3’UTR. Η περιοχή σπόρος του ώριμου miR-96 και τις προβλεπόμενες θέσεις σύνδεσης στην αλληλουχία 3’UTR είναι υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα. Οι θέσεις από τις θέσεις σύνδεσης, σύμφωνα με Targetscan, (Release 6.2, Ιούνιος 2012). κύτταρα Β 22Rv1 συν-επιμολύνθηκαν εις τριπλούν με miR-96 μιμητικό και ενός αναστολέα θέση στόχο για θέση δέσμευσης 96,1 σε τρεις συγκεντρώσεις. πρωτεϊνικό επίπεδο FOXO1 δεν αυξάνει όταν το site 96,1 δεσμευτική έχει αποκλειστεί. C. Ο αποκλεισμός θέση σύνδεσης 96.2 με 6x της συγκέντρωσης της θέσης στόχου blocker σε σύγκριση με το μιμητικό miR-96 είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης FOXO1 (p = 0,0118). τα επίπεδα πρωτεΐνης FOXO1 κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

επίπεδα FOXO1 mRNA αντιστρόφως συσχετίζονται με miR-96 επίπεδα έκφρασης σε ένα εξωτερικό σύνολο δεδομένων [34]. Το σύνολο δεδομένων περιλαμβάνει 110 δείγματα προστάτη ιστών και 28 μη-κακοήθεις δείγματα καλοήθη ιστό του προστάτη (GEO αριθμός ένταξης GSE21036) (p = 0,0013? Spearman r = -0,2717)

Η

Η επίδραση του miR-96 σε. ανάπτυξη των κυττάρων διαμεσολαβείται από FOXO1

Είμαστε δίπλα έθεσε ως στόχο να διερευνήσει αν FOXO1 είναι ο κύριος στόχος μεταφορά της προαγωγής της ανάπτυξης miR-96 φαινότυπο στα κύτταρα του προστάτη. Είναι ενδιαφέρον, αναστέλλοντας τη δεύτερη θέση σύνδεσης miR-96 (96,2) στην FOXO1 αλληλουχία 3 ‘UTR με τη θέση blocker στόχου, miR-96 δεν είναι πλέον σε θέση να ενισχύσει την ανάπτυξη των κυττάρων DU145 όπως μετράται με μια δοκιμασία SRB (Εικόνα 7). Αυτό ενισχύει την υπόθεση ότι η επίδραση του miR-96 σχετικά με την ανάπτυξη των κυττάρων προωθείται αποκλειστικά μέσω FOXO1. Εμποδίζοντας την πρώτη θέση δέσμευσης miR-96 δεν μειώνουν την ανάπτυξη σημαντικά που επιβεβαιώνει περαιτέρω την διαπίστωση ότι το miR-96 χρησιμοποιεί την δεύτερη θέση δέσμευσης miR-96 για την αναστολή FOXO1.

miR-96 ενισχύει την ανάπτυξη των κυττάρων DU145 σημαντικά (ρ = 0,0005). Ο αποκλεισμός της δεύτερη θέση miR-96 δέσμευσης (96,2) στην ακολουθία FOXO1 3’UTR με μια θέση στόχο αποκλειστή εξαλείφει πλήρως την επίδραση της miR-96 επί της αναπτύξεως των κυττάρων (p = 0,002). Ο αποκλεισμός της πρώτης θέσης δέσμευσης miR-96 (96,1) δεν αναστέλλει την επίδραση της miR-96 σχετικά με την ανάπτυξη των κυττάρων. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία SRB. Η μέση αντιπροσωπεύεται από μια κάθετη γραμμή και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

Συζήτηση

Τα υψηλά επίπεδα του miR-96 έχουν ανιχνευθεί στον καρκίνο του προστάτη [5,7, 11] και διάφορες μελέτες δείχνουν τη σημασία του miR-96 στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι η αυξημένη miR-96 συνεργάτες έκφρασης με την εξέλιξη της ΣΕΣΣ ως του miR-96 αυξάνει την έκφραση με αυξημένο βαθμό ΠΟΥ στην ομάδα 1. Αυτό δεν φαίνεται στην ομάδα 2, η οποία είναι μια πιο ομοιογενής ομάδα των ριζών που συνιστούν των 63% WHOII. Περαιτέρω, η συνολική επιβίωση είναι σημαντικά μικρότερη σε ασθενείς που έχουν τα υψηλότερα επίπεδα miR-96. Αυτό έχει επίσης αποδειχθεί για miR-96 έκφραση σε δείγματα ασθενών όγκου και του ορού του καρκίνου του πνεύμονα. Το επίπεδο έκφρασης του miR-96 συσχετίζεται με κακή μετεγχειρητική επιβίωση [35].

In vitro

, διαπιστώνουμε ότι η υπερέκφραση του miR-96 σε προστάτη κυτταρικές σειρές αποτελέσματα στην αύξηση της ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω τη συμμετοχή του miR-96 στην εξέλιξη της ΣΕΣΣ. Λίγες στόχους του miR-96 έχουν ταυτοποιηθεί που εξηγούν την επίδραση του miR-96 στα κύτταρα του προστάτη. Σε ενδομητρίου [16], του μαστού [17] και ηπατοκυτταρικό καρκίνο [18], miR-96 έχει δειχθεί να στοχεύουν το ογκοκατασταλτικό FOXO1. FOXO1 έχει αναφερθεί να μειωθεί σε PCa [24,25] και αναστολή από miR-96 μπορεί να συμβάλλουν σε αυτό. Εδώ έχουμε εντοπίσει FOXO1 ως στόχος του miR-96 σε τέσσερις διαφορετικές κυτταρικές σειρές προστάτη τόσο με υψηλή ενδογενή επίπεδα FOXO1 (22Rv1) καθώς και χαμηλά επίπεδα ενδογενούς (VCAP), υποδεικνύοντας ότι miR-96 είναι ένας ισχυρός αναστολέας της παραγωγής πρωτεΐνης FOXO1. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ο κανονισμός λαμβάνει χώρα τόσο σε μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδα, όπως mRNA και σε ακόμη μεγαλύτερο βαθμό επηρεάστηκαν το επίπεδο της πρωτεΐνης. Αυτός ο κύριος ρύθμιση συμβαίνει σε επίπεδο μεταφραστικό θα μπορούσε να είναι μια εξήγηση για το γεγονός ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-96 και FOXO1 mRNA στις κυτταρικές γραμμές του προστάτη συσχετίζονται θετικά, ενώ τα χαμηλότερα επίπεδα σε DU145 και με την υψηλότερη έκφραση τόσο βρεθεί σε κύτταρα PC3. Υποθετικά η τάση αντιστοιχεί στην ποσότητα του miR-96 που απαιτούνται σε κάθε τύπο κυττάρου, προκειμένου να διατηρηθεί χαμηλά επίπεδα πρωτεΐνης FOXO1. miR-96 έχει αποδειχθεί ότι μειώνει το επίπεδο του mRNA της FOXO1 σημαντικά σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και να μειώσει τα επίπεδα της πρωτεΐνης ελαφρώς [18]. Εδώ, δείχνουμε σε ένα προστάτη κυτταρική γραμμή 22Rv1, ότι miR-96 δεσμεύει παρά μόνο με τη δεύτερη από τις δύο προβλεπόμενη θέση πρόσδεσης (96.2) στο 3 ‘UTR της FOXO1. Αντίθετα, η ρύθμιση miR-96 σε καρκινικά κύτταρα του μαστού αποδείχθηκε ότι εξαρτάται από την πρόσβαση σε δύο θέσεις δέσμευσης [17].