Αφηρημένο

Ιστορικό

πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους μεταξύ ανδρών και γυναικών στον κόσμο. Παρά τις πρόσφατες προόδους στη διάγνωση και τη θεραπεία, τα ποσοστά θνησιμότητας με συνολική επιβίωση 5 ετών μόνο το 15%. Αυτή η υψηλή θνησιμότητα είναι κατά πάσα πιθανότητα οφείλεται στην πρώιμη μετάσταση. Παρά το γεγονός ότι πολλά γνωστά δείκτες συσχετίζονται με κακή /μετάσταση πρόγνωση σε ασθενείς αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα με ανοσοϊστοχημεία αναφέρθηκε, οι μοριακοί μηχανισμοί της ανάπτυξης αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα δεν είναι ακόμη σαφής. Για να εξερευνήσουν νέες μοριακών δεικτών και οδών σηματοδότησης τους θα είναι ζωτικής σημασίας για την υποβοήθηση στη θεραπεία των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Για τον εντοπισμό νέων γονιδίων αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα που σχετίζεται /μετάσταση και να διευκρινίσει οι υποκείμενες μοριακούς μηχανισμούς αυτών των στόχων στην εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα, δημιουργήσαμε ένα σύστημα βιοπληροφορικής που αποτελείται από την ενσωμάτωση συνόλων δεδομένων προφίλ έκφρασης των τριών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων ζεύγη αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, δευτεροβάθμια μεταστατικούς όγκους εναντίον καλοήθεις όγκους, και μια σειρά από επεμβατική κυτταρικές σειρές. Μεταξύ των νέων στόχων που προσδιορίζονται, FLJ10540 υπερεκφράστηκε σε καρκινικούς ιστούς πνεύμονα και σχετίζεται με την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε δύο στρατηγικές συν-έκφραση για την αναγνώριση στην οποία οδό FLJ10540 συμμετείχε. Lung προφίλ συστοιχία αδενοκαρκίνωμα και μικροσυστοιχιών ιστός δεδομένα χρώση IHC έδειξαν ότι FLJ10540 και VEGF-A, όπως επίσης και FLJ10540 και φωσφο-ΑΚΤ έκθεμα θετικές συσχετίσεις, αντίστοιχα. Η διέγερση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με αποτέλεσμα VEGF-A σε μια αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης FLJ10540 και ενισχύει το σχηματισμό συμπλόκου με ΡΙ3Κ. Η θεραπεία με αναστολείς VEGFR2 και ΡΙ3Κ επηρεάζει κυτταρική μετανάστευση και εισβολή ενεργοποιώντας το μονοπάτι ΡΙ3Κ /ΑΚΤ. Επιπλέον, νοκ ντάουν της FLJ10540 αποσταθεροποιεί τον σχηματισμό του P110-α /P85-α- (PI3K) συγκρότημα, περαιτέρω στήριξη της συμμετοχής των FLJ10540 στην VEGF-A /PI3K /AKT οδό.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτό το εύρημα που το στάδιο για περαιτέρω δοκιμές των FLJ10540 ως ένα νέο θεραπευτικό στόχο για την θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα και μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών που είναι σε θέση να εμποδίσουν την ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Παράθεση: Chen CH, Lai JM, Chou ΤΥ, Chen CY, Su LJ, Lee YC, et al. (2009) VEGFA απορυθμίζει FLJ10540 και ρυθμίζει τη μετανάστευση και την εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα μέσω του PI3K /AKT οδό. PLoS ONE 4 (4): e5052. doi: 10.1371 /journal.pone.0005052

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22η Δεκεμβρίου 2008? Αποδεκτές: 12 Φεβρουαρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 1 Απρίλη του 2009

Copyright: © 2009 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από τον Chang Gung Νοσοκομείο (CMRPD140211) και NSC (94-2752-Β-010-002-PAE) για να Τσεν-Kung Chou, NSC (Πρόγραμμα Διεπιστημονικής Έρευνας Έργο: NSC97-2627-B-010 -011 έως Chi-Ying Huang, NSC97-2627-B-030-001 με J.-M. Lai), και NSC97-3112-B-010-025-CC1, Taichung βετεράνος Γενικό Νοσοκομείο (TCVGH-957326D), και το πρόγραμμα για προαγωγής της ακαδημαϊκής αριστείας Πανεπιστημίων (Εθνικό Yang Ming Πανεπιστημίου) σε Chi-Ying Huang, και NSC (95-3112-Β-075-002 και 96-3112-Β-075-001) με τον Γιου-Chung Wu. Η Γονιδιακής Έκφρασης Ανάλυση Πυρήνας διευκόλυνση υποστηρίζεται από το Εθνικό Πρόγραμμα Έρευνας για Genomic Ιατρική (NRPGM), Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους μεταξύ ανδρών και γυναικών στον κόσμο [1] – [2]. Παρά τις πρόσφατες προόδους στη διάγνωση και τη θεραπεία, τα ποσοστά θνησιμότητας παραμένουν υψηλά, με συνολική επιβίωση 5 ετών μόνο το 15%. Χειρουργική παραμένει η πρώτη επιλογή της θεραπείας για εντοπισμένη μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και παρέχει την καλύτερη ευκαιρία για θεραπεία. Ωστόσο, κατά την πρώτη διάγνωση, οι περισσότεροι ασθενείς έχουν ήδη προχωρημένη ασθένεια, και μόνο το 35% των ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) είναι επιλέξιμες για εκτομή [3]. Μυθιστόρημα μοριακών δεικτών ή στόχων βοηθούν στη διάγνωση και θεραπεία θα είναι ζωτικής σημασίας για τη βελτίωση του ποσοστού θνησιμότητας.

όγκου εισβολή και τη μετάσταση είναι σημαντικές περιοχές για τη μελέτη, προκειμένου να καθοριστεί η επιθετική φαινότυπο των ανθρώπινων καρκίνων και είναι οι κύριες αιτίες της των θανάτων από καρκίνο [4]. Η διαδικασία της μετάστασης είναι πολύ περίπλοκη και θεωρείται μια καθυστερημένη εκδήλωση στην ογκογένεση, δηλαδή τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται, να χάσουν την επαφή με γειτονικά κύτταρα, μεταναστεύουν μέσω της διάμεσης μήτρας, εισβάλλουν στο αίμα και λεμφικών αγγείων, και κατάθεση σε λεμφαδένες. Μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων φαίνεται να είναι ένα αποτέλεσμα μιας σύνθετης αλληλεπίδρασης μεταξύ των πολυάριθμων οικογενειών πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε αυτή τη διαδικασία. Μηχανισμοί κίνησης των κυττάρων είναι σημαντικές όχι μόνο ως μέρος της βασικής κυτταρικής και αναπτυξιακών διαδικασιών, αλλά επίσης και στην παθογένεση διαφόρων ασθενειών [5]. Για να γίνει μεταστατικά καρκινικά κύτταρα πρέπει να αυξήσει την έκφραση διαφόρων γονιδίων μετάστασης προαγωγής. Ωστόσο, στον καρκίνο του πνεύμονα, τα μόρια και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση ή την εισβολή παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

Παραγωγή και έκκριση του VEGF-A παρατηρείται συνήθως στα περισσότερα επιθετικούς όγκους, και την έκφραση του VEGF-A επηρεάζει βαθιά το πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων εκείνων με καρκίνο του πνεύμονα [6] – [8]. VEGF-A είναι ένας από τους πιο ισχυρούς διεγέρτες της αγγειογένεσης εντοπιστεί μέχρι σήμερα, επηρεάζοντας ενδοθηλιακών κυττάρων αγγειακή διαπερατότητα, τον πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα [7]. Αν και διάφορες οδούς ενδοκυτταρικής σηματοδότησης έχουν προταθεί ότι μεσολαβεί τις βιολογικές δραστηριότητες του VEGF-A σε ενδοθηλιακά κύτταρα, τα γεγονότα σηματοδότησης που εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε απόκριση προς VEGF-A διέγερση στον καρκίνο του πνεύμονα δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

FLJ10540 έχει διάφορα ονόματα, συμπεριλαμβανομένου CEP55 [9], C10orf3 [10], και URCC6. CEP55 με ετικέτα GFP-C εντοπίζεται στο κεντρόσωμα σε κύτταρα μεσόφαση, με την άτρακτο midzone διάρκεια ανάφαση, και στην μέσου σώματος κατά τη διάρκεια κυτοκίνηση [9], [11] – [12]. Επιπλέον, Cdk1, ERK2, και PLK1 συνεργάζονται για την φωσφορυλίωση της CEP55 κατά την διάρκεια της μίτωσης, η οποία απαιτείται για τη σωστή μιτωτική εντοπισμό του CEP55 και τη λειτουργία του κατά τη διάρκεια κυτοκίνηση [9]. FLJ10540 υπερεκφράζεται κατά την διάρκεια ανθρώπινου κόλον [10] και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [13] ογκογένεση, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο στην ανάπτυξη του όγκου. Επιπλέον, στο παρελθόν έδειξε ότι η υπερέκφραση του FLJ10540 συμβάλλει σε κυτταρικό μετασχηματισμό μέσω της ενεργοποίησης του ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [13]. Ωστόσο, καμία ανάλυση μεγάλης κλίμακας έκφραση FLJ10540 και κλινικοπαθολογική και λειτουργική σημασία του στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα έχει εκτελεστεί.

Η επιθετική συμπεριφορά των κακοήθων καρκινικών κυττάρων καθορίζεται από μια σύνθετη σειρά μονοπατιών σηματοδότησης που ρυθμίζουν βασικές λειτουργίες , όπως ανάπτυξη, την επιβίωση, τη μετανάστευση, και εισβολή. Το σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K /AKT έχει αιτιακή σχέση με τα τέσσερα από αυτές τις απαντήσεις. [14] – [17]. Περαιτέρω απόδειξη της σημασίας της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σηματοδότησης στον καρκίνο προέρχεται από μελέτες οι οποίες έχουν ανιχνευθεί υπερέκφραση και υπερενεργοποίηση του ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, και αυτό συνδέεται συχνά με πτωχή πρόγνωση [18]. Συσσωρευμένα στοιχεία από προηγούμενες εκθέσεις υποδηλώνει έναν πιθανό ρόλο του ΡΙ3Κ /ΑΚΤ στη μετανάστευση και την εισβολή των διαφόρων τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του πνεύμονα [19], ο καρκίνος του ήπατος [20], του καρκίνου του μαστού [21], και τον καρκίνο του παγκρέατος [22].

σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι FLJ10540 υπερεκφράζεται σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και ότι η έκτοπη έκφραση της FLJ10540 προάγει κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Σε δείγματα ανθρώπινου πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα, FLJ10540 συσχετίζεται θετικά με VEGF-A έκφραση, όπως προσδιορίζεται με προφίλ γονιδιακής έκφρασης και IHC χρώση μικροσυστοιχίες ιστού. Επιπλέον, η διέγερση με VEGF-A αποτέλεσμα μια αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης FLJ10540 σε ένα εξαρτώμενο από την δόση τρόπο με τον CL

1-0 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Επιπλέον, FLJ10540 μετατοπίζεται μερικώς από το κυτταρόπλασμα στη μεμβράνη του πλάσματος και ενισχύει το σχηματισμό συμπλόκου με ΡΙ3Κ υπό VEGF-A διέγερση. Τέλος, ο VEGF-A επηρεάζει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή ενεργοποιώντας το FLJ10540 /ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση FLJ10540 συνδέεται με μια ενισχυμένη μεταστατικό δυναμικό και μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πιθανή νέα θεραπευτικός στόχος για αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

έκφραση Αυξημένα FLJ10540 σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα και καρκίνο του πνεύμονα επεμβατική γραμμές

Μια σημαντική πρόκληση στη μετα-γονιδιωματική εποχή καθορισμό του τρόπου προτεραιότητα που εκφράζονται διαφορικά και κακώς χαρακτηρίζεται στόχους σε μελέτες μικροσυστοιχιών προφίλ σχετίζονται με τον καρκίνο. Εδώ, έχουμε δημιουργήσει μια πλατφόρμα βιοπληροφορικής, με την ενσωμάτωση τρία διαφορετικά σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών για να αποκαλύψει βασικές ρυθμιστικές αρχές που εμπλέκονται στη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα. Το Σχήμα 1 δείχνει το σχηματικό προσεγγίσεις ενοποίησης δεδομένων και τα δεδομένα έκφρασης FLJ10540 σε διαφορετικές κατηγορίες. Πρώτον, τα δείγματα από 26 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, η οποία επιβεβαιώθηκε με ιστοπαθολογική, υποβλήθηκαν σε Affymetrix microarray προφίλ. Με βάση τα 26 δείγματα πρωτογενών αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, 826 από 22283 μεταγραφές εκφράζονται διαφορικά μεταξύ γειτονικών περιοχών μη-όγκου και του όγκου ήταν συγκεντρωμένα από την Wilcoxon δοκιμή κατάταξης υπογεγραμμένη (

ρ

& lt? 0,01), με βάση δύο φορές διαφορές και ελέγχονται με τη βοήθεια της ψευδούς συσχετισμού ρυθμό ανακάλυψης Benjamini και Hochberg (

σ

& lt? 0,01). Αυτές οι μοριακές πορτρέτα, που περιέχουν 192 έως ρυθμιζόμενα και 634 κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές, θα μπορούσε να διακρίνει με επιτυχία παρακείμενες περιοχές μη-όγκου και του όγκου των ασθενών με ιεραρχική ομαδοποίηση (Σχήμα S1 Α). Δεύτερον, η δημόσια πρόσβαση των μικροσυστοιχιών (κατεβάσει από GEO) χρησιμοποιήθηκαν για την απόκτηση διαφορετικά σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών, η οποία ομαλοποιήθηκαν με ποσοστημόριο Κανονικοποίηση χρησιμοποιώντας R, για να δημιουργήσει το δυναμικό ενός μεταστατικού πλατφόρμα ταυτοποίηση βιοδεικτών. Συγκρίναμε 225 δευτερογενή μεταστατικούς όγκους (συμπεριλαμβανομένων 20 μεταστάσεων όγκου στο λεμφαδένα και 200 ​​μεταστατικών όγκων) και 30 καλοήθεις όγκους για να ληφθούν σύνολα των πιθανών μεταστατικού ογκογονίδια (871) και μεταστατικό γονίδια καταστολής (1042). Τέλος, την ιεράρχηση των στόχων και για την επικύρωση των γονιδίων που σχετίζονται με μετάσταση μας σε κυτταρικές σειρές, μία σειρά αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα κυτταρικών σειρών, συμπεριλαμβανομένης της CL

1-0, CL

1-1, CL

1-5 και CL

1-5-F4, με αυξανόμενους βαθμούς διηθητικότητας [23], υποβλήθηκε επίσης σε μικροσυστοιχία προφίλ. Ένα σύνολο 6238 μετεγγραφής είχαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στην ικανότητα κυτταρικής γραμμής υψηλής εισβολή CL

1-5-F4 από το γονικό CL

1-0 κύτταρα. Η τομή αυτών των τριών συνόλων δεδομένων αποκαλύπτει πολλά νέα στόχους. Εμείς χαρακτηριζόμενη τα γονίδια που είναι συντηρημένες μόνο σε σπονδυλωτά, αλλά όχι σε ασπόνδυλα, να αποκαλύψει ορισμένα νέα ανθρώπινη ειδική για τον καρκίνο ανωμαλίες. Ως αποτέλεσμα, εστιάσαμε στην ανεπαρκώς χαρακτηρισμένο γονίδιο

FLJ10540

.

(Α, αριστερό πάνελ) Τα πρότυπα έκφρασης μικροσυστοιχιών του

FLJ10540

σε ασθενείς αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα ομαλοποιήθηκαν ενάντια τα πρότυπα έκφρασης για τα τσιπ HG_U133A. Ν: γειτονικούς ιστούς μη-όγκου? ιστούς όγκων: Τ. Η boxplot δείχνει την κατανομή των δεδομένων ως ταξινόμηση ομαδοποίηση και υποδεικνύει ότι υπάρχει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (

ρ

& lt? 0,0001) μεταξύ των ιστών του όγκου και των παρακείμενων nont-umor ιστών από τον ίδιο ασθενή με καρκίνο του πνεύμονα. (Α, δεξιός πίνακας) Τα επίπεδα mRNA του

FLJ10540

σε δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα 16 προσδιορίστηκαν με την Q-RT-PCR. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν έναντι των επιπέδων έκφρασης του

GAPDH

mRNA σε κάθε συνδεδεμένο δείγμα και απεικονίζονται με boxplot. (Β) Τα μοτίβα έκφρασης μικροσυστοιχιών του

FLJ10540

συγκρίθηκαν μεταξύ 30 καλοήθεις όγκους, μεταστάσεις όγκου 20 στο λεμφαδένα, και 200 ​​μεταστατικών όγκων, και έγιναν έδειξαν με boxplot. (C, αριστερό πάνελ) Τα επίπεδα mRNA του

FLJ10540

προσδιορίστηκαν με την Q-RT-PCR σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν έναντι του επιπέδου του

GAPDH

mRNA σε κάθε κυτταρική σειρά. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (C, δεξιός πίνακας) Συνολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από CL

1-0 και CL

1-5-F4 κύτταρα και υποβλήθηκε σε ανάλυση ανοσοκηλίδος με αντι-FLJ10540. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε μια εσωτερική ελέγχου φόρτωσης.

Η

FLJ10540

εκθέματα επάνω ρυθμισμένη πρότυπα έκφρασης σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (Σχήμα 1Α, αριστερό πάνελ) και μεταστατικό υπογραφές (Σχήμα 1Β). Για την επικύρωση της γονιδιακής έκφρασης προφίλ δεδομένων για

FLJ10540

, Q-RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε 16-ζευγών όγκου αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και των παρακείμενων δείγματα μη-όγκου. Το Σχήμα S1B δείχνει ότι η υπερέκφραση του

FLJ10540

ήταν παρατηρήσιμη σε δείγματα πνεύμονα ασθενών μας, με 15 από τους 16 όγκους ασθενών πνεύμονα (94%) που εμφανίζει ένα υψηλότερο σήμα μετά από κανονικοποίηση για

GAPDH

για ίση πρότυπο φόρτωση. Το μέσο επίπεδο έκφρασης του

FLJ10540

σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα ήταν 8 φορές υψηλότερη από ότι σε γειτονικό δείγματα πνευμονικού ιστού μη-όγκου, όπως αναλύθηκε με boxplot (Σχήμα 1Α, δεξιό πλαίσιο). Εμείς επόμενη επαλήθευσε την έκφραση του FLJ10540 σε αντιπροσωπευτικά και προσφάτως κατεψυγμένου αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και των παρακείμενων δείγματα μη-όγκου με χρώση ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-ανθρώπινης FLJ10540. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το επίπεδο της FLJ10540 αυξήθηκε στα δείγματα όγκου, σε σύγκριση με εκείνη των γειτονικών ιστών μη-όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Έκφραση FLJ10540 σε μια σειρά του διηθητικού ανθρώπινου πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές σειρές

Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης όγκου πνεύμονα, ένα από τα πιο κρίσιμα μεταβάσεις είναι η εξέλιξη από

in situ

να διηθητικό καρκίνωμα. Για να διερευνήσουν τον πιθανό ρόλο της FLJ10540 στην εισβολής των κυττάρων του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, εξετάσαμε για πρώτη φορά την έκφραση του

FLJ10540

σε ένα πάνελ κυτταρικών σειρών, CL

1-0, CL

1-1 , CL

1-5, και CL

1-5-F4, με χαμηλή ή υψηλή επεμβατική ικανότητες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23] με την Q-RT-PCR. Τα δεδομένα έδειξαν ότι τα επίπεδα του

FLJ10540

mRNA ήταν υψηλά στην CL

1-5 και CL

κύτταρα 1-5-F4 που έχουν υψηλή επεμβατική και μεταστατικό ικανότητες, αλλά ήταν χαμηλότερες στο χαμηλό επεμβατική CL

1-0 κύτταρα (Σχήμα 1Γ, αριστερό πάνελ). επίπεδα πρωτεΐνης FLJ10540 ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερη στην ιδιαίτερα επεμβατική CL

1-5 κύτταρα σε σχέση με το χαμηλό επεμβατική CL

1-0 κύτταρα, όπως φαίνεται με ανάλυση κηλίδος western (Σχήμα 1 C, δεξιό πλαίσιο). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ρύθμιση προς τα άνω του FLJ10540 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης συσχετίστηκε θετικά με την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι προς τα πάνω ρύθμιση του

FLJ10540

μπορούσε να οδηγήσει σε κάποια από τις ανωμαλίες που βρέθηκαν σε αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου πνεύμονα .

η υπερέκφραση του FLJ10540 προάγει την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή

από FLJ10540 υπερεκφράζεται στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και ένα ιδιαίτερα επιθετικό καρκίνο του πνεύμονα γραμμή, φαινόταν πιθανό ότι η έκφρασή της θα μπορούσε να επηρεάσει την κυτταρική κινητικότητα. Να αποσαφηνίσει το ρόλο της FLJ10540 στην κινητικότητα στα κύτταρα των θηλαστικών, εξετάσαμε αν η υπερέκφραση της FLJ10540 ήταν σε θέση να επηρεάσει τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή. Δύο διαφορετικοί τύποι κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί αυτή η πιθανότητα. Κατ ‘αρχάς, CL

1-0 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ) ταμπέλα σήμα FLJ10540 ιδρύθηκαν. Επελέγησαν αρκετές σταθερές επιμολύνσεις με την αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης FLJ10540 (Σχήμα 2Α, αριστερό πάνελ) για περαιτέρω μελέτες. Είναι ενδιαφέρον, FLJ10540 υπερέκφραση στο CL

1-0 κύτταρα συνδέθηκε με εντυπωσιακά αλλαγμένη μορφολογία των κυττάρων. FLJ10540 υπερεκφράζεται κλώνοι μειώθηκαν σε μέγεθος κυττάρου και φάνηκε να είναι πιο ατρακτοειδής και είχε αυξηθεί μεσοκυττάρια διαχωρισμού σε σύγκριση με κλώνους ελέγχου του οχήματος, οι οποίες στρογγυλό σχήμα (Σχήμα 2Α, μεσαίο πλαίσιο). Ωστόσο, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού, όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία ΜΤΤ, δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη του ελέγχου του οχήματος ή κύτταρα που εκφράζουν FLJ10540 κατά την διάρκεια 24 ωρών (Σχήμα 2Α, δεξί πλαίσιο). Για να εξεταστεί η επίδραση της FLJ10540 στην ανθρώπινη μετανάστευση καρκίνο του πνεύμονα, σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν ΗΑ-FLJ10540 ή ελέγχου του οχήματος σπάρθηκαν επί transwell θαλάμους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι FLJ10540 CL

1-0-σταθερούς επιμολυντές θα μπορούσαν να αυξήσουν τη μετανάστευση τους, όπως μετράται με την δοκιμασία μετανάστευσης Transwell? Αυτό συγκρίθηκε με τον έλεγχο του οχήματος, όπου πολύ λίγα κύτταρα μετανάστευσαν (Σχήμα 2Β, αριστερό άνω πίνακας). Από ποσοτική άποψη, η ικανότητα μετανάστευσης των FLJ10540 CL

1-0-σταθερά προϊόντα επιμόλυνσης ήταν περίπου 6-7 φορές υψηλότερη από εκείνη του ελέγχου του οχήματος (Σχήμα 2Β, δεξιά άνω πάνελ). Είμαστε δίπλα διενήργησε

in vitro

δοκιμασία εισβολή χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο φραγμού με Matrigel. Μετά από επώαση 24 ωρών σε ένα Matrigel επικαλυμμένα θαλάμου Transwell, FLJ10540 CL

1-0-σταθερά επιμολυσμένα είχαν εισβάλει το υλικό της βασικής μεμβράνης και διέρχεται μέσω των πόρων για να φτάσει την κάτω πλευρά του φίλτρου (Σχήμα 2Β, αριστερά κάτω πάνελ) . Ομοίως, FLJ10540 CL

1-0 κυττάρων που εκφράζουν έδειξε 10-12 φορές υψηλότερη ικανότητα εισβολής από τα κύτταρα ελέγχου του οχήματος (Εικόνα 2Β, δεξιά κάτω πίνακα).

(Α, αριστερό πάνελ) ΗΑ-ετικέτα -FLJ10540 σταθεροί κλώνοι του Κ.Ν.

ιδρύθηκαν 1-0 κυττάρων. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με αντι-ΗΑ αντίσωμα. (Α, μεσαίο πάνελ) εικόνες αντίθεσης φάσης των καλλιεργειών μονοστιβάδας CL

1-0 κύτταρα που εκφράζουν FLJ10540 και ελέγχου του οχήματος δείχθηκε. (Α, δεξιός πίνακας) Για τη μέτρηση ρυθμούς ανάπτυξης των κυττάρων, 5 × 10

3 κύτταρα του οχήματος CL

1-0 και CL

1-0-FLJ10540 σταθεροί κλώνοι απλώθηκαν κατά την ημέρα 0 σε 96- φρεατίων με 10% FBS. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε δεικνυόμενα χρονικά σημεία με τη δοκιμασία ΜΤΤ (OD

570) για την ποσοτικοποίηση της κυτταρικής ανάπτυξης. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν ενάντια στην

570 τιμή OD την ημέρα 0. Ο ρυθμός αύξησης των CL

1-0 κυττάρων δείχνεται ως η μέση ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β, άνω πίνακας) Για τη δοκιμασία μετανάστευσης, 5 × 10

3 κύτταρα του οχήματος CL-

1-0 και CL

1-0-FLJ10540 σταθεροί κλώνοι σπάρθηκαν σε κορυφή ενός ενθέτου Transwell . Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα στο επάνω μέρος αποξέστηκαν και τα κύτταρα που μετανάστευσαν στον πυθμένα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Giemsa. Η μετανάστευση σχετική φορές οχήματος-CL

1-0 και CL

1-0-FLJ10540 σταθερούς κλώνους ομαλοποιήθηκε με τον έλεγχο του οχήματος και παρουσιάζονται διαγραμματικά. (Β, κάτω πλαίσιο) Για την δοκιμασία εισβολής, 1 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν μετά προστέθηκε Matrigel. Η εισβολή σχετική φορές σταθερών κλώνου ομαλοποιήθηκε έναντι των κυττάρων του οχήματος και αντιπροσωπεύονται διαγραμματικά. Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Δεύτερον, για να αποφευχθεί κλωνική αποτελέσματα, ένας ρετροϊικός που βασίζεται Flag-tagged FLJ10540 μολύνθηκε σε RK3E κυτταρική γραμμή (Σχήμα S2A) που είχαν προηγουμένως χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την αξιολόγηση της μετανάστευσης ή εισβολή που προκαλείται από διαφορετικά γονίδια και τα μονοπάτια σηματοδότησης, όπως αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών 9 (FGF9) [24], k-ras [25], και σαλιγκάρι [26]. κύτταρα RK3E εμφανίζουν πολλαπλές λειτουργίες του επιθήλια, όπως ένα σχεδόν φυσιολογικό καρυότυπο και χαμηλό υπόβαθρο της κυτταρικής μετανάστευσης και της εισβολής. Μεικτών μολυσμένων κυττάρων RK3E χρησιμοποιήθηκαν για τις δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή. Και πάλι, τα κύτταρα που εκφράζουν FLJ10540 έδειξε 4-5 φορές υψηλότερη ικανότητα μετανάστευση από τα κύτταρα ελέγχου του οχήματος (Σχήμα S2B) και 7 φορές υψηλότερη ικανότητα εισβολής από τα κύτταρα ελέγχου του οχήματος (Σχήμα S2C). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την υπόθεση ότι FLJ10540 μπορεί να προωθήσει τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή σε κύτταρα θηλαστικών.

Νοκ-κάτω της ενδογενούς FLJ10540 από siRNA καταστέλλει τη μετανάστευση καρκίνο του πνεύμονα και εισβολή

Για να επιβεβαιώσετε ότι FLJ10540 επηρεάζει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση siRNA για την αναστολή της έκφρασης ενδογενούς του FLJ10540 και έπειτα ανιχνεύθηκαν τα μετανάστευση και εισβολή ικανότητες των CL

1-5 και Η1299 κύτταρα. Πρώτον, για να εξεταστεί η εξειδίκευση του siRNAs, ένα ΗΑ-tagged κατασκεύασμα έκφρασης FLJ10540 συν-επιμολύνθηκε με τρία διαφορετικά siRNAs? αυτά αποτελούνταν από δύο συντεθούν χημικά siRNAs ειδικό για FLJ10540 (siFLJ10540-1 και siFLJ10540-2) και ένας αρνητικός έλεγχος siRNA, τα οποία κάθε επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Αμφότερα FLJ10540 siRNAs έδειξαν σχεδόν πλήρη αναστολή της ΗΑ-tagged έκφραση FLJ10540, όπως φαίνεται με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-ΗΑ, ενώ το επίπεδο του ΗΑ-tagged FLJ10540 παρέμεινε υψηλός με τον αρνητικό μάρτυρα siRNA (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Δεύτερον, για να εξετάσει εάν οι ειδικές FLJ10540 siRNAs θα μπορούσε να αναστείλει την έκφραση ενδογενούς FLJ10540 σε CL

1-5 και Η1299 κυττάρων, επιμολύναμε siRNAs σε CL

1-5 και Η1299 κυττάρων για 24 ώρες, ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος western με χρήση ένα αντίσωμα έναντι FLJ10540. Τα δεδομένα έδειξαν μία δραματική μείωση των επιπέδων πρωτεΐνης FLJ10540 με δύο FLJ10540 siRNAs, και δεν υπήρχε σημαντική μείωση του FLJ10540 όταν η αρνητική siRNA χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα 3Α και Β, αριστερό πάνελ). Ωστόσο, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού, όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία ΜΤΤ, δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των αρνητικών κύτταρα ελέγχου και κύτταρα που εκφράζουν FLJ10540 siRNAs κατά τη διάρκεια 24 ωρών (Σχήμα 3Α και Β, μεσαίο πλαίσιο). Τρίτον, για να μελετηθεί η επίδραση της siRNA FLJ10540 διαμόλυνσης για τη μετανάστευση, αρνητικό έλεγχο και siRNA FLJ10540 επιμολυσμένα CL

1-5 ή Η1299 κύτταρα χωριστά σπάρθηκαν επί Transwell θαλάμους με μη επικαλυμμένα φίλτρα. Μετά από επώαση 24 ωρών, η δυνατότητα κινητικότητας των κυττάρων siRNA FLJ10540 βρέθηκε να έχουν έντονα αναστέλλεται από τα siRNAs (Εικόνα 3Α και Β, δεξί πάνελ). Τέλος, οι ίδιες πλάκες του αρνητικού ή FLJ10540 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε επικαλυμμένα με Matrigel θαλάμου Transwell. Μετά από 24 ώρες επώασης, η επεμβατική δυναμικό των κυττάρων siRNA FLJ10540 φάνηκε να μειώνεται σημαντικά (Σχήμα 3Α και Β, δεξί πάνελ). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά την ιδέα ότι FLJ10540 παίζει ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

(Α και Β, αριστερό πάνελ) Ένα αρνητικό siRNA ελέγχου με δύο διαφορετικές FLJ10540 siRNAs (siFLJ10540-1 και siFLJ10540-2) επιμολύνθηκαν σε CL

1-5 και Η1299 κυττάρων για 24 ώρες. Μετά την επιμόλυνση, κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-FLJ10540 και αντι-β-ακτίνης αντισώματα. (Α και Β, μεσαίο πάνελ) Για τη μέτρηση ρυθμούς ανάπτυξης των κυττάρων, 5 × 10

3 κύτταρα του αρνητικού ελέγχου-CL

1-5, CL

1-5-FLJ10540 siRNAs, αρνητικό μάρτυρα-Η1299, και Η1299-FLJ10540 siRNAs απλώθηκαν κατά την ημέρα 0 σε πλάκες 96 με 10% FBS. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε δεικνυόμενα χρονικά σημεία με τη δοκιμασία ΜΤΤ (OD

570) για την ποσοτικοποίηση της κυτταρικής ανάπτυξης. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν ενάντια στην OD

570 τιμή κατά την ημέρα 0 της κάθε θεραπείας. Ο ρυθμός αύξησης των CL είναι

1-5 και Η1299 κύτταρα φαίνονται ως μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Α και Β, δεξιός πίνακας) Η μετανάστευση σχετική φορές και η εισβολή σχετική φορές του Κ.Ν.

1-5 και Η1299 ομαλοποιήθηκαν ενάντια κύτταρα αρνητικού ελέγχου και αντιπροσωπεύονται διαγραμματικά. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Χρήση της έννοιας του syn-έκφρασης για να αποκαλύψει VEGF-A, αλλά όχι VEGF-Β, όπως το ανάντη ρυθμιστή της FLJ10540

Τα γονίδια που ανήκουν στον ίδιο μονοπάτι συχνά δείχνουν τα ίδια προφίλ έκφρασης, η οποία αναφέρεται ως syn-έκφραση [27]. Ως εκ τούτου, για να χαρτογραφήσει την πιθανή οδό σηματοδότησης ή ανάντη ρυθμιστή (ες) που συμμετέχουν στην FLJ10540-προκάλεσε τη μετανάστευση και την εισβολή χαρακτηριστικά, χρησιμοποιήσαμε τον καρκίνο του πνεύμονα μικροσυστοιχιών σύνολο δεδομένων μας, όπως περιγράφεται παραπάνω, για να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με την λειτουργική αντιστοιχία των συν-εκφρασμένων γονιδίων. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, εξετάσαμε πρώτα αν το προφίλ έκφρασης του mRNA της

FLJ10540

συσχετίζεται με οποιοδήποτε συνδετήρα ή υποδοχέα στη βάση δεδομένων μικροσυστοιχιών καρκίνο του πνεύμονα μας (Εικόνα 1). Από αυτές τις συν-εκφρασμένων γονιδίων, η κορυφαία υποψήφιος είναι

VEGF-A

, η οποία ήταν ιδιαίτερα θετικά με το επίπεδο έκφρασης των

FLJ10540

σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα ζεύγη (r = 0.7 ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 4Α). VEGF-A είναι γνωστό ότι είναι ένα κρίσιμο προ-αγγειογόνο παράγοντα, με τις ικανότητες να ρυθμίζουν πολλά βήματα στη διαδικασία αγγειογένεσης, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, εισβολή, και επιβίωση [28], [29]. Στην πραγματικότητα, ο VEGF-A εκφράζεται έντονα σε πολλούς κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [30], [31], [32], και την έκφραση του VEGF-A συνδέεται με κακή πρόγνωση [33], [34] και το παρουσία της μετάστασης λεμφαδένα [35], αυξάνοντας την πιθανότητα ότι οι βιολογικοί ρόλοι του FLJ10540 και VEGF-A θα μπορούσε να συνδεθεί λειτουργικά σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα.

(Α) τα μοτίβα έκφρασης μικροσυστοιχιών του

VEGF-A

και

FLJ10540

σε ασθενείς αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα είχαν δείξει. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν έναντι των προτύπων έκφρασης των 56 τσιπ (HG_U133A). Ν: γειτονικούς ιστούς μη-όγκου? ιστούς όγκων: Τ. (Β, αριστερό πάνελ) VEGF-A προκάλεσε μια αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης FLJ10540 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Μετά την επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του VEGF-A (αριστερό πλαίσιο) ή VEGF-B (δεξί πάνελ) για 10 λεπτά σε CL

1-0 κύτταρα, οι συνολικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από CL

1-0 κύτταρα και διερευνήθηκε με αντίσωμα κατά του FLJ10540. (Β, μεσαίο πάνελ) άνευ ορού CL

1-0 κύτταρα προ-επεξεργασία με ή χωρίς διάφορες συγκεντρώσεις SU5416 για 2 ώρες? κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 20 ng /ml VEGF-A για 10 λεπτά. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. (C) άνευ ορού CL

1-0 κύτταρα προεπεξεργασμένα με ή χωρίς SU5416 για 2 ώρες? κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν με VEGF-Α (σε συγκέντρωση 20 ng /ml) για 3 ώρες. Οι μετανάστευση και την εισβολή σχετική-πτυχώσεις ομαλοποιήθηκαν έναντι των κυττάρων του οχήματος. (D, αριστερά, άνω φωτογραφία) Για τη δοκιμασία μετανάστευσης, 5 × 10

3 κύτταρα του οχήματος CL-

1-0 και CL

1-0-FLJ10540 σταθεροί κλώνοι σπάρθηκαν σε κορυφή ενός Transwell εισάγετε και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 12 ώρες, και στη συνέχεια επωάστηκαν με ή χωρίς VEGF-Α (20 ng /ml) για 3 ώρες. Στο τέλος της δοκιμασίας, τα κύτταρα στο επάνω μέρος αποξέστηκαν και τα κύτταρα που μετανάστευσαν στον πυθμένα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Giemsa. (D, αριστερά, κάτω πλαίσιο) Για την δοκιμασία εισβολής, 1 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν μετά προστέθηκε Matrigel, και στη συνέχεια επωάστηκαν με ή χωρίς VEGF-Α (20 ng /ml) για 3 ώρες. Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Ε) Έμμεση ανάλυση ανοσοφθορισμού της FLJ10540 σε κύτταρα VEGF-A-θεραπεία. Η έκφραση της πρωτεΐνης και το υποκυτταρική εντόπιση του FLJ10540 αναλύθηκαν με την παρουσία ή απουσία του VEGF-Α (20 ng /ml) σε CL

1-0 κύτταρα χρησιμοποιώντας μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Αφού επωάστηκαν με ή χωρίς VEGF-A για 30 λεπτά ή 180 λεπτά, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για έμμεσο μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. FLJ10540 μετατοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη κατά την VEGF-A θεραπεία (κεφαλή βέλους). Bar:. 10 μm

Η

Με δεδομένο το σημαντικό ρόλο του VEGF-A στη ρύθμιση της μετανάστευσης και της εισβολής, μας ενδιαφέρει πρώτα για το αν ο VEGF-A θα μπορούσαν να διαμορφώσουν την έκφραση της πρωτεΐνης FLJ10540. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης του FLJ10540 ρυθμίζεται αυξητικά σε ένα VEGF-A με δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε CL

1-0 καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (Σχήμα 4Β, αριστερό πάνελ). Εμείς επόμενο ερώτημα αν η ανταγωνιστική δράση του SU5416, ένας αναστολέας τυροσινικής κινάσης VEGFR-2, για την βιολογική δράση του VEGF-A θα μπορούσε να αποδοθεί στην αναστολή της FLJ10540 πρωτεΐνης υπερέκφραση που διεγείρεται από VEGF-A στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι προς τα πάνω ρύθμιση του FLJ10540 παρουσία VEGF-Α ανεστάλη με ταυτόχρονη προσθήκη SU5416 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β, μεσαίο πλαίσιο). Αντιθέτως, το επίπεδο πρωτεΐνης FLJ10540 δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία με VEGF-B (Σχήμα 4Β, δεξιό πλαίσιο). Στην πραγματικότητα,

FLJ10540

δεν μοιράζονται παρόμοια πρότυπα έκφρασης με

VEGF-B

, τουλάχιστον όχι σε μικροσυστοιχιών καρκίνο του πνεύμονα μας, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι τα πρότυπα synexpression θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να συναχθεί η λειτουργία της άγνωστων γονιδίων [27].

VEGF-Α-επαγόμενη FLJ10540 υπερέκφραση και μετατόπιση ενισχύει τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα και εισβολή μέσω ενός ΕΜΤ-ανεξάρτητο μονοπάτι

Για να ελεγχθεί η βιολογική σημασία του VEGF-A- επαγόμενη αυξορρύθμιση του FLJ10540, εξετάσαμε την επίδραση της FLJ10540 για τη μετανάστευση και εισβολή σε παρουσία ή απουσία του VEGF-A. Κατ ‘αρχάς, εξετάσαμε αν η γονική CL

1-0 κύτταρα θα μπορούσε να εμφανίσει κυτταρική κινητικότητα μετά από διέγερση με VEGF-A. Στο σχήμα 4C, CL

1-0 κύτταρα παρουσίασαν περισσότερο τη μετανάστευση και την επεμβατική ικανότητες παρουσία του VEGF-A και μόνο από VEGF-A σε συνδυασμό με SU5416 ή όχημα μόνο, προτείνοντας ότι η προσθήκη της αυξημένης VEGF-A σημαντικά την μετανάστευση και εισβολή του CL

1-0 κύτταρα, τα οποία παράλληλα με την αύξηση της FLJ10540 επίπεδα. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν σε FLJ10540 CL

1-0 σταθερές επιμολύνσεις, με ή χωρίς VEGF-A διέγερση (Εικόνα 4D).

Για να δοκιμαστεί εάν η υποκυτταρική εντόπιση του FLJ10540 μπορούσε να μεταβληθεί σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα κατόπιν VEGF-A διέγερση, υιοθετήσαμε την έμμεση προσέγγιση ανοσοφθορισμού να παρατηρήσει FLJ10540 εντοπισμού στο CL

1-0 καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων είτε με ή χωρίς τον VEGF-A διέγερση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Ε, VEGF-A θεραπεία όχι μόνο οδήγησε σε μια αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης FLJ10540, αλλά προώθησε επίσης τη μετατόπιση ενός κλάσματος του FLJ10540 στην κυτταρική μεμβράνη. Επιπλέον, οι διαφορές στην μορφολογία των κυττάρων ήταν πιο εμφανής, τονίζοντας την επέκταση του VEGF Α-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 4Ε, 30 λεπτά και 180 λεπτά) σε σύγκριση με τη στρογγυλεμένη CL

1-0 κύτταρα (Σχήμα 4Ε, 0 λεπτά ). Αυτές οι μορφολογικές αλλαγές μας ώθησε να εξετάσουμε το φαινόμενο της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης (ΕΜΤ). Κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, ΕΜΤ μπορεί να αυξήσει την κινητικότητα και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων, και κακοήθους μετασχηματισμού μπορεί να σχετίζεται με οδούς σηματοδότησης προώθηση ΕΜΤ [36]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε επίσης ότι εξωκυτταρικά σήματα που επάγεται από VEGF-A εμπλέκονται έντονα σε ΕΜΤ σε ανθρώπινα κύτταρα παγκρεατικού καρκινώματος [37]. Να εξετάσει κατά πόσον FLJ10540 μπορεί να μεσολαβήσει VEGF-A-επαγόμενη EMT, ενισχύοντας έτσι την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή, χρησιμοποιήσαμε Η1299 και CL

1-0 καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων, με ή χωρίς τον VEGF-A διέγερση, για να αντιμετωπίσουμε αυτό το ζήτημα. Ωστόσο, παρά την αυξανόμενη κυτταρική κινητικότητα με υπερέκφραση FLJ10540 ή μειώνοντας κυτταρική κινητικότητα με FLJ10540 μεσολάβηση siRNAs, οι διαφορές στην FLJ10540 επίπεδα δεν είχε κατ ‘ουδένα τρόπο μεταβάλλει τα επίπεδα έκφρασης οποιασδήποτε από τις πρωτεΐνες δείκτη που σχετίζεται με EMT, όπως Ε-καδερίνης και βιμεντίνης ( τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, FLJ10540 φαίνεται να μεσολαβούν μετανάστευση και εισβολή επιδράσεις του VEGF-A ανεξαρτήτως του ΕΜΤ και δεν φαίνεται να παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση της ΕΜΤ, τουλάχιστον στα καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές αναλύσαμε.

Μια θετική β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης.