Αφηρημένο

Η Karyopherin περιλαμβάνει υπεροικογένεια πρωτεϊνών πυρηνικής μεταφοράς, που συμμετέχουν στη μετακίνηση των συγκεκριμένων πρωτεϊνών φορτίων εντός και εκτός του πυρήνα. Οι Karyopherin β1 (Kpnβ1) και Karyopherin α2 (Kpnα2) importin πρωτεϊνών, οι οποίες εργάζονται από κοινού για να μεταφέρουν το φορτίο τους στον πυρήνα. Έχουμε προηγουμένως εντοπιστεί αυξημένη έκφραση του Kpnβ1 και Kpnα2 στην αυχενική όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικό επιθήλιο και σε μετασχηματισμένα κύτταρα σε σύγκριση με φυσιολογικά αντίστοιχά τους. Αυτή η μελέτη, επομένως, με στόχο να εντοπιστούν οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί μεταγραφής που σχετίζονται με τα υψηλά επίπεδα Kpnβ1 και Kpnα2 στα καρκινικά κύτταρα. θραύσματα υποκινητή Kpnβ1 (-2013 έως +100) και Kpnα2 (-1.900 έως 69) κλωνοποιήθηκαν ξεχωριστά στον φορέα ρεπόρτερ, pGL3-βασικό, και προσδιορισμούς λουσιφεράσης αποκάλυψε τόσο ως σημαντικά πιο δραστική στον καρκίνο και μετασχηματισμένα κύτταρα σε σύγκριση με το φυσιολογικό. Μια σειρά κατασκευασμάτων διαγραφής εντόπισε τα -637 με -271 Kpnβ1 και -180 έως -24 περιοχές Kpnα2 υποκινητή ως υπεύθυνο για τη δραστηριότητα διαφορικό υποκινητή, και μια σειρά από εξαιρετικά διατηρημένες θέσεις πρόσδεσης E2F εντοπίστηκαν μέσα σε αυτές τις περιοχές. ανάλυση μετάλλαξης επιβεβαίωσε την απαίτηση της E2F θέσεις για τη δραστηριότητα υποκινητή, και η ανάλυση ChIP επιβεβαίωσε E2F2 /DP1 σύνδεση με τους αναδόχους Kpnβ1 και Kpnα2

in vivo

. αναστολή DP1 οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα των αντίστοιχων πρωτεϊνών, επιβεβαιώνοντας το ρόλο της E2F στην υπερέκφραση των πρωτεϊνών Kpnβ1 και Kpnα2 στον καρκίνο. E2F δραστικότητα είναι γνωστό να απελευθερωθεί σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα οφείλεται στην αναστολή του καταστολέα του, Rb, από τον HPV Ε7. Η αναστολή της Ε7 χρησιμοποιώντας siRNA προκάλεσε μειωμένη δραστηριότητα υποκινητή Kpnβ1 και Kpnα2, όπως και η υπερέκφραση του Rb. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή είναι η πρώτη για να δείξει ότι η αυξημένη έκφραση Kpnβ1 και Kpnα2 στα καρκινικά κύτταρα συσχετίζεται με αλλαγμένη ρύθμιση της μεταγραφής που συνδέεται με την απορυθμισμένη /Rb δραστηριότητες E2F

Παράθεση: van der Watt PJ, Ngarande Ε, ισχνότερη VD ( 2011) Η υπερέκφραση του Kpnβ1 και Kpnα2 Importin Πρωτεΐνες στον Καρκίνο προέρχεται από Απελευθερωμένης E2F δραστηριότητας. PLoS ONE 6 (11): e27723. doi: 10.1371 /journal.pone.0027723

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Οκτωβρίου του 2011? Αποδεκτές: 23 Οκτ 2011? Δημοσιεύθηκε: 18 Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 van der Watt et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Πανεπιστήμιο του Κέιπ Τάουν, το Carnegie Corporation της Νέας Υόρκης, CANSA, και το Συμβούλιο Ιατρικής Έρευνας (SA). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο του Κέιπ Τάουν /Carnegie Corporation Ανάπτυξης Νέας Υόρκης επιχορηγήσεις, CANSA, και το Συμβούλιο Ιατρικής Έρευνας (SA). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Karyopherin πρωτεΐνες είναι διαλυτές υποδοχείς πυρηνικής μεταφοράς που λειτουργούν στη μεταφορά πρωτεϊνών φορτίου και ορισμένα RNAs σε και έξω από τον πυρήνα των κυττάρων, μέσω του συμπλέγματος πυρηνικού πόρου (NPC) [1]. Karyopherins μπορούν να ενεργούν ως importins της exportins, ανάλογα με την κατεύθυνση μεταφοράς τους. Karyopherin beta 1 (Kpnβ1, επίσης γνωστή ως Importin β ή p97) είναι μια importin πρωτεΐνη που παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία πυρηνικής εισαγωγής. Πυρηνικής εισαγωγής μέσω Kpnβ1 μπορεί να συμβεί είτε με Kpnβ1 ενεργεί ως αυτόνομη υποδοχέα πυρηνικής μεταφοράς, ή μέσω της σύνδεσης της με πρωτεΐνες προσαρμογέα, όπως Karyopherin άλφα (Kpnα, επίσης γνωστή ως Importin α), περίπτωση κατά την οποία η διαδικασία εισαγωγής είναι γνωστή ως κλασική πυρηνική εισαγωγής [2]. Στην κλασσική οδό πυρηνικής εισαγωγής, η αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού (NLS) που υπάρχει στο φορτίο αναγνωρίζεται και δεσμεύεται από την πρωτεΐνη προσαρμογέα, Kpnα, η οποία στη συνέχεια σχηματίζει ένα σύμπλοκο με τριμερές Kpnβ1. Το φορτίο: Kpnα: συγκρότημα Kpnβ1 μεταφέρεται διαμέσου του συγκροτήματος πυρηνικού πόρου μέσα στον πυρήνα, όπου σε αυτήν διασπάται από τη σύνδεση του RanGTP. Υπάρχουν έξι Kpnα ισομορφές (Kpnα1-6), οι οποίες έχουν προσδιοριστεί να έχουν προνομιακή σύνδεση προς ειδικά υποστρώματα [3]. Η λειτουργία όλων των έξι ισομορφές διευρύνει έτσι την περιοχή του υποστρώματος μεταφέρονται σε όλη την NPC.

Πρόσφατα δείξαμε ότι η έκφραση του Kpnβ1 και της πρωτεΐνης Kpnα, Kpnα2, είναι αυξημένη σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και μετασχηματισμένα κύτταρα τόσο στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης [4]. Βρήκαμε επίσης ότι η αναστολή της έκφρασης Kpnβ1 του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα εξαρτώνται λειτουργικά για Kpnβ1 υπερέκφραση, τονίζοντας τη σημασία της Kpnβ1 ρύθμιση προς τα άνω στη διατήρηση της βιολογίας του καρκίνου. Στη μελέτη μας η αναστολή Kpnα2 δεν είχε καμία επίδραση επί του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων βιωσιμότητα [4]? είναι πιθανό ότι η αναστολή της κατέληξαν στη λειτουργική αποζημίωσης από άλλα μέλη της οικογένειας Kpnα. Noetzel et al. [5] έδειξε ότι τα καρκινικά κύτταρα του μαστού υποβλήθηκαν σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο όταν Kpnα2 ανεστάλη [5], προτείνοντας ότι σε μερικές κυτταρικές σειρές μπορεί να είναι λειτουργικά περιττή, ενώ σε άλλα είναι λειτουργικώς συναφείς. Επιπλέον, πολλές πρόσφατες μελέτες έχουν εντοπίσει υψηλής Kpnα2 στον ιστό του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ρύθμιση προς τα άνω του Kpnα2 συνδέεται με την ανάπτυξη του καρκίνου. Τέτοιοι καρκίνοι περιλαμβάνουν το μελάνωμα [6], του καρκίνου του μαστού [7]? [8], οισοφαγικό καρκίνο [9], τον καρκίνο των ωοθηκών [10], μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [11], του καρκίνου του προστάτη [12], καρκίνος της ουροδόχου κύστης [13] και ο καρκίνος του ήπατος [14]. Είναι ενδιαφέρον, Wang et al. [11] έδειξε ότι Kpnα2 εκκρίνεται εντός του ορού, υποδεικνύοντας ότι έχει πιθανή κλινική χρησιμότητα ως βιοδείκτη καρκίνου. Επιπλέον, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η υψηλή Kpnα2 συνεργάτες έκφρασης με κακή επιβίωση των ασθενών [6] – [10]? [12]? [13], γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή προγνωστική ρόλο για Kpnα2.

Αν και η υπερέκφραση του Kpnβ1 και Kpnα2 σε καρκινικά κύτταρα φαίνεται να είναι σημαντικά γεγονότα, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη ρύθμιση της μεταγραφής τους και τους παράγοντες που ελέγχουν την έκφραση και να οδηγήσει τους στην αυξορρύθμιση τους σε καρκινικά κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, ως εκ τούτου, θα κλωνοποιηθεί και αναλυθεί από τους αναδόχους των Kpnβ1 και Kpnα2, και προσδιόρισε έναν σημαντικό ρόλο για τον παράγοντα μεταγραφής, E2F, στην επαγωγή της έκφρασης Kpnβ1 και Kpnα2 στα καρκινικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

Η αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης Kpnβ1 και Kpnα2 σε μετασχηματισμένα και καρκινικά κύτταρα συσχετίζεται με αυξημένη δραστικότητα προαγωγού

με βάση τα προηγούμενα ευρήματα μας δείχνουν αυξημένη έκφραση Kpnβ1 και Kpnα2 σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα και τα μετασχηματισμένα κύτταρα σε σύγκριση με το κανονικό, ερευνήσαμε Kpnβ1 και η έκφραση πρωτεΐνης Kpnα2 σε ένα αντιπροσωπευτικό κανονικό, μετασχηματίζονται και καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή. Αυτά περιελάμβαναν την κανονική κυτταρική σειρά ινοβλαστών, WI38, την SV40-μετασχηματισμένα κυτταρική σειρά ινοβλαστών, SVWI38, και την αυχενική καρκινική κυτταρική γραμμή, CaSki. Ανάλυση Western Blot έδειξε αυξημένη έκφραση Kpnβ1 και Kpnα2 στα μετασχηματισμένα και καρκινικών κυττάρων, σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα WI38 (Εικ. 1Α). Για τον προσδιορισμό των μεταγραφικών ρυθμιστικών μηχανισμών που συνδέουν με αυξημένη έκφραση Kpnβ1 και Kpnα2 στον καρκίνο και μετασχηματισμένα κύτταρα, κατά προσέγγιση 2 Kb περιοχή ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής των γονιδίων Kpnβ1 και Kpnα2, μαζί με περίπου 100 bp της 5 ‘αμετάφραστες περιοχές τους ( καθοδικά από τη θέση έναρξης μεταγραφής), κλωνοποιήθηκαν ξεχωριστά σε pGL3-Basic για ανάλυση υποκινητή. Η -2.013-100 Kpnβ1 και -1.990 έως 69 Kpnα2 υποστηρικτής κατασκευάζει τόσο παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερη δραστηριότητα στο μετασχηματισμένο και καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τις κανονικές WI38 κύτταρα (Εικ. 1Β και Γ).

Α. Western Blot ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης Kpnβ1 και Kpnα2 στην κανονική WI38, μετασχηματισμένα SVWI38, και τον καρκίνο του τραχήλου κύτταρα CaSki αποκαλύπτει αυξημένη έκφραση στον καρκίνο και μετασχηματισμένα κύτταρα. Β, C. -2013 έως +100 δραστηριότητα Kpnβ1 υποκινητή (Β) και -1900 έως +69 δραστηριότητα υποκινητή Kpnα2 (C) μετρήθηκε στα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από επιμολυσμένα κύτταρα WI38, SVWI38 και CaSki, και παρατηρήθηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη σε τα μετασχηματισμένα και τα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα (* ρ & lt? 0,05). TK-Renilla-Luc χρησιμοποιήθηκε ως ένας έλεγχος για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης και δραστικότητα λουσιφεράσης εκφράζεται σε σχέση με λουσιφεράση της Renilla. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές.

Η

δραστηριότητες υποκινητή Διαφορικό Kpnβ1 και Kpnα2 σε κανονική, μετασχηματίζονται και τα καρκινικά κύτταρα προέρχονται από το -637 -271 και να -180 έως -24 περιοχές των υποκινητών Kpnβ1 και Kpnα2, αντίστοιχα

προκειμένου να προσδιοριστούν οι περιοχές που είναι υπεύθυνες για τη διαφορική δράση των Kpnβ1 και Kpnα2 υποκινητές σε φυσιολογικά και μετασχηματισμένα /καρκινικά κύτταρα, μία σειρά κατασκευασμάτων διαγραφής ήταν παράγονται και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα στα κύτταρα WI38, SVWI38 και CaSki. Όλα τα κατασκευάσματα διαγραφής του υποκινητή Kpnβ1 εμφάνισαν σημαντικά μεγαλύτερη δραστηριότητα σε SVWI38 κυττάρων σε σύγκριση με WI38 κύτταρα (Σχ. 2Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι σε SVWI38 κύτταρα διαδοχική διαγραφή της -2013 να -637 περιοχή δεν μετέβαλε δραστικότητα προαγωγού, ωστόσο, η διαγραφή του -637 -271 να περιοχή σημαντικά μειωμένη δραστικότητα προαγωγέα Kpnβ1 (κατά περίπου πέντε φορές) (Εικ. 2Α). Σε WI38 κύτταρα, η διαγραφή της περιοχής αυτής είχε μικρή επίδραση στην δραστηριότητα προαγωγέα. Σε κύτταρα CaSki παρόμοιες παρατηρήσεις έγιναν με εκείνες SVWI38 κύτταρα, όπου απαλοιφή της περιοχής από την -637 έως -271 σημαντικά μεταβληθεί δραστηριότητα υποκινητή Kpnβ1 (Εικ. 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σημαντικά λειτουργικά στοιχεία, απαραίτητα για την υψηλή δραστηριότητα υποκινητή Kpnβ1 σε μεταμορφωμένα και του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, είναι πιθανό να κατοικούν στο -637 – -271 περιοχή του υποκινητή Kpnβ1. Όσον αφορά την Kpnα2, απαλοιφή της περιοχής από την 1900 να -180 είχε μικρή επίδραση επί της δραστικότητας προαγωγού Kpnα2 σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 2C, D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η περιοχή ανοδικά του -180 στον προαγωγό Kpnα2 δεν παρέχει μεταγραφική δραστηριότητα. Ωστόσο, η διαγραφή της περιοχής από την -180 έως -24 είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μειωμένη δραστικότητα προαγωγού, σχεδόν στο επίπεδο του κενού φορέα, με την μείωση της δραστηριότητας είναι πιο έντονη σε κύτταρα SVWI38 και CaSki, σε σύγκριση με WI38 (Σχ. 2C, ΡΕ). Αυτό υποδηλώνει ότι τα σημαντικά λειτουργικά στοιχεία που είναι απαραίτητα για τη δράση του προαγωγού Kpnα2 υψηλή βασική σε μετασχηματισμένα και του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα βρίσκονται στο -180 έως -24 περιοχή του υποκινητή.

Α. κατασκευάσματα λουσιφεράσης ανταποκριτής που περιέχει διαγράφεται θραύσματα του ανθρώπινου υποκινητή Kpnβ1 επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα WI38 και SVWI38, αντίστοιχα. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ήταν σημαντικά υψηλότερη στα κύτταρα SVWI38 σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα WI38 για όλα τα κατασκευάσματα που δοκιμάστηκαν. Το θραύσμα υποκινητή -637 να +100 Kpnβ1 περιείχε σημαντικά περισσότερη δραστηριότητα υποκινητή από το -271 να +100 θραύσμα σε μετασχηματισμένα κύτταρα (* ρ & lt? 0,05). Β Δραστηριότητα διαγραφής προαγωγού Kpnβ1 κατασκευασμάτων σε κύτταρα CaSki. Γ λουσιφεράσης κατασκευάσματα ανταποκριτή που περιέχει διαγράφεται θραύσματα του ανθρώπινου υποκινητή Kpnα2 επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα WI38 και SVWI38, αντίστοιχα. Η διαγραφή της περιοχής του υποκινητή -180 να -24 οδήγησε σε δραστικότητα προαγωγέα σημαντικά μειωμένη. Δ Δραστηριότητα της Kpnα2 κατασκευάσματα διαγραφής προαγωγό σε κύτταρα CaSki.

Η

Οι υποστηρικτές Kpnβ1 και Kpnα2 περιέχουν λειτουργικές E2F sites

Μια βιοπληροφορική ανάλυση των περιοχών -637 έως -271 του Kpnβ1 υποκινητή και -180 έως -24 του υποκινητή Kpnα2 (χρησιμοποιώντας Conreal προγράμματα λογισμικού MatInspector και) προσδιόρισε μια σειρά από πιθανές θέσεις πρόσδεσης για το E2F. Απορυθμισμένη E2F δραστηριότητα είναι γνωστό ότι παίζει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου? ως εκ τούτου η λειτουργικότητα αυτών των υποθετικών E2F θέσεις διερευνήθηκε. Πέντε πιθανές θέσεις πρόσδεσης E2F ταυτοποιήθηκαν στο Kpnβ1 (-637 να -271) περιοχή προαγωγέα, και χρησιμοποιώντας τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (και μεταλλάσσοντας τουλάχιστον τρεις βάσεις εντός της θέσεις σύνδεσης συναινετική), μεταλλαγμένες κατασκευάσματα παρήχθησαν. Τρεις E2F θέσεις βρέθηκαν να είναι λειτουργικό, ως μετάλλαξη τους οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη δραστικότητα προαγωγέα Kpnβ1 (Εικ. 3Α). Αυτό περιελάμβανε τις υποθετικές θέσεις επισημαίνονται ως E2F (α), E2F (β) και E2F (γ). Είναι ενδιαφέρον ότι, η μετάλλαξη αυτών των τριών τόπων ταυτόχρονα δεν παρέχει κανένα περαιτέρω μείωση της δραστηριότητας προαγωγού, σε σύγκριση με μετάλλαξη των θέσεων E2F μεμονωμένα, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να λειτουργήσει από κοινού για να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση Kpnβ1 (Σχ. 3Α). Αξίζει να σημειωθεί, επίσης, ήταν το εύρημα ότι η μετάλλαξη των E2F θέσεις οδήγησε σε δραστικότητα προαγωγέα συγκρίσιμη με εκείνη του -271 έως +100 κατασκεύασμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι οι θέσεις E2F που είναι υπεύθυνα για την αύξηση της δραστηριότητας προαγωγού στην περιοχή από -271 – -637. Μετάλλαξη των τριών E2F θέσεις στον υποκινητή Kpnβ1 είχε πιο έντονη επίδραση επί της δραστικότητας προαγωγού σε κύτταρα SVWI38 και CaSki συγκρίθηκε με εκείνη σε κύτταρα WI38. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι υπάρχει αυξημένη εξάρτηση από τις E2F τοποθεσίες σε μετασχηματισμένα και τα καρκινικά κύτταρα, σε σύγκριση με το φυσιολογικό (Σχ. 3Β).

Α. Μετάλλαξη των πέντε υποθετικών E2F θέσεις στο Kpnβ1 (-637 να +100) προαγωγό διεξήχθη με τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση. Μετάλλαξη των τριών άπω E2F θέσεις να οδηγήσει σε σημαντική μείωση στην Kpnβ1 (-637 έως +100) δραστηριότητα υποκινητή, όπως υποδεικνύεται από προσδιορισμούς λουσιφεράσης. Μετάλλαξη των τριών λειτουργικών E2F θέσεις ταυτοχρόνως δεν οδήγησε σε καμία περαιτέρω μείωση της δραστηριότητας του υποκινητή. B. Η μετάλλαξη των τριών E2F θέσεις σε κύτταρα SVWI38 και CaSki είχε πιο βαθιά επίδραση στη δραστηριότητα υποκινητή Kpnβ1 σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα WI38 (αριθμοί υποδεικνύουν φορές καταστολή). Γ Μετάλλαξη του ενιαίου E2F ιστοσελίδα στον υποκινητή Kpnα2 καταργηθεί τελείως δραστηριότητα του υποκινητή. D. Η μετάλλαξη της E2F θέση σε κύτταρα SVWI38 και CaSki είχε πιο βαθιά επίδραση στη δραστηριότητα υποκινητή Kpnα2 σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα WI38. Τα πειράματα που δείχνονται ως μέσος όρος ± SE των πειραμάτων εις τετραπλούν εκτελείται τουλάχιστον δύο φορές (* ρ & lt? 0,05).

Η

βιοπληροφορική ανάλυση του υποκινητή Kpnα2, από την άλλη πλευρά, αποκάλυψε την παρουσία μόνον μία υποθετική E2F θέση στο -180 να -24 περιοχή. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με τις θέσεις E2F στον υποκινητή Kpnβ1, η μετάλλαξη αυτού του ενιαίου E2F ιστοσελίδα καταργηθεί τελείως δραστηριότητα υποκινητή Kpnα2 (Σχ. 3C). Η μετάλλαξη της E2F θέση σε κύτταρα SVWI38 και CaSki οδήγησε σε 84- και 57-πλάσια καταστολή της δραστηριότητας προαγωγού, αντίστοιχα, ενώ μετάλλαξη στα κύτταρα WI38 οδήγησε μόνο 4-φορές καταστολή του υποκινητή (Σχ. 3D).

Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο υποκινητής Kpnβ1 περιέχει E2F θέσεις που δρουν για να ενισχύουν την δραστικότητα προωθητή, ενώ ο υποκινητής Kpnα2 περιέχει μια E2F θέση που εμπλέκεται στην ενεργοποίηση βασικό υποκινητή. Επιπλέον, η E2F ενεργοποίηση και των δύο υποκινητών είναι πιο έντονη σε μετασχηματισμένα και τα καρκινικά κύτταρα, σε σύγκριση με το φυσιολογικό.

E2F /DP1 ετεροδιμερή δεσμεύουν και ενεργοποιούν οι υποστηρικτές Kpnβ1 και Kpnα2

in vivo

Η

E2F λειτουργεί ως ετεροδιμερικός παράγοντας μεταγραφής που αποτελείται από δύο υπομονάδες: ένα E2F μέλος της οικογένειας και ένα μέλος της οικογένειας Dp. Αν και υπάρχουν πολλαπλές E2F μέλη της οικογένειας που πιστεύεται ότι δεσμεύουν το ίδιο συναινετική αλληλουχία (5′-TTTSSCGS-3 ‘? S αναφέρεται σε C ή G), E2F1, E2F2 και E2F3 έχουν δειχθεί ότι περιέχουν ισχυρές ογκογόνο ικανότητα [15], ως εκ τούτου δέσμευση της E2F στους υποστηρικτές Kpnβ1 και Kpnα2 ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ενάντια E2F2 που αντιδρά εγκάρσια με E2F1, E2F2 και E2F3. Η οικογένεια πρωτεϊνών Dp περιλαμβάνει πρωτεΐνες Dp1-3, με DP1 έχει προηγουμένως συνδεθεί με τον καρκίνο. Για την εκτίμηση E2F2 /δεσμευτική DP1

in vivo

, προσδιορισμοί ChIP πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της χρωματίνης που παρασκευάζονται από κύτταρα SVWI38 και CaSki. DNA ανοσοκατακρημνίστηκε χρησιμοποιώντας α-E2F2 ή α-DP1 αντισώματα και χρησιμοποιούνται σε μια PCR με εκκινητές που εκτείνονται τις θέσεις E2F στους προαγωγούς Kpnβ1 και Kpnα2 (Σχ. 4Α, Β). Θετική ενίσχυση στις δύο κυτταρικές σειρές SVWI38 και CaSki επιβεβαίωσε σύνδεσης μεταξύ E2F2 /DP1 και τις θέσεις E2F και στις δύο προαγωγούς Kpnβ1 και Kpnα2 (Εικ. 4Α, Β).

Α, Β Δείγματα επεξεργασμένου με υπερήχους χρωματίνη ήταν ανοσοκατακρημνίστηκαν με ένα α-E2F2 αντίσωμα, ένα αντίσωμα α-DP1, ή κανένα αντίσωμα, όπως υποδεικνύεται. DNA που απομονώθηκε από ανοσοκαταβυθισμένο υλικό ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που εκτείνονται τις E2F θέσεις που υπάρχουν στο Kpnβ1 (Α) ή Kpnα2 (Β) υποκινητές. Τα ενισχυμένα θραύσματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε δύο κυτταρικές σειρές SVWI38 και CaSki. Γ Western Blot δείχνει τα επίπεδα πρωτεΐνης Kpnβ1 και Kpnα2 μετά την αναστολή DP1 χρησιμοποιώντας siRNA. β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Δ, Ε Kpnβ1 και Kpnα2 δραστηριότητες υποστηρικτής μετά την αναστολή της DP1. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος ± SE των πειραμάτων εις τετραπλούν εκτελούνται τουλάχιστον δύο φορές (* p & lt? 0,05).

Η

Επιπλέον, για να καθοριστεί αν η δέσμευση της E2F /DP1 στους υποστηρικτές Kpnβ1 και Kpnα2 ήταν υπεύθυνη για τα αυξημένα επίπεδα και των δύο πρωτεϊνών Kpnβ1 και Kpnα2

in vivo

, E2F δραστικότητα ανεστάλη με αποσιώπηση της έκφρασης DP1, χωρίς την οποία η E2F μπορεί πλέον να λειτουργήσει. επίπεδα πρωτεΐνης Kpnβ1 και Kpnα2 μετρήθηκαν με ανάλυση Western Blot μετά DP1 knock-down με τη χρήση siRNA, και βρέθηκαν να μειώνονται μετά την αναστολή DP1 (Εικ. 4C). δραστηριότητες υποστηρικτής Kpnβ1 και Kpnα2 ομοίως κατασταλεί κατά DP1 αναστολής (Σχ. 4D, E).

HPV Ε7 ρυθμίζει τις δραστηριότητες υποστηρικτής Kpnβ1 και Kpnα2 του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα μέσω της καταστολής της Rb

Σε τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα η πρωτεΐνη ΗΡν Ε7 είναι γνωστό ότι δεσμεύουν το ρετινοβλάστωμα πρωτεΐνη (Rb), που οδηγεί σε φωσφορυλίωση της και τελικά αποικοδόμηση. Είναι για αυτόν τον λόγο ότι η E2F γονιδίων στόχων συχνά υπερεκφράζεται σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, όπως E2F δεν είναι πλέον καταστέλλεται από Rb και έτσι είναι ελεύθερος να ενεργοποιήσει γονίδια-στόχους της. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η αναστολή του HPV Ε7 σε αυχενικό καρκινικά κύτταρα θα οδηγούσε σε αποκατασταθεί η λειτουργία Rb, προκαλώντας μειωμένη E2F δραστηριοτήτων, και συνεπώς μειωμένη δραστηριότητες υποκινητή Kpnβ1 και Kpnα2. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, κύτταρα CaSki επιμολύνθηκαν με HPV16 Ε7 siRNA (Σχ. 5Α), και μετά την επιβεβαίωση της αποκατάστασης της Rb (καταδεικνύεται στο Σχ. 5Β από μια μείωση στα επίπεδα φωσφορυλιωμένης Rb και μια σχετική αύξηση της σε μη φωσφορυλιωμένη Rb), Kpnβ1 (-637 έως 100) και Kpnα2 (-180 έως 69) δραστηριοτήτων υποστηρικτής μετρήθηκαν. δραστηριότητες υποκινητή Kpnβ1 και Kpnα2 μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα knock-down Ε7, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, αν και σε διαφορετικό βαθμό (Σχ. 5C και D). Για να επιβεβαιωθεί ότι η μειωμένη δραστηριότητα υποκινητή Kpnβ1 και Kpnα2 ήταν μέσω της αποκατάστασης της λειτουργίας Rb, Rb υπερεκφράστηκε σε CaSki καρκίνο του τραχήλου κύτταρα και δραστηριότητες υποκινητή Kpnβ1 και Kpnα2 μετρηθεί. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι δραστηριότητες υποκινητή Kpnβ1 και Kpnα2 ήταν και οι δύο σημαντικά μειωμένη σε υπερέκφραση του Rb (Σχ. 5Ε και F). Μαζί, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης Kpnβ1 και Kpnα2 του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα οφείλεται εν μέρει στην Ε7-μεσολάβηση αναστολή της Rb, και την επακόλουθη αυξημένη ενεργοποίηση των υποκινητών Kpnβ1 και Kpnα2 από E2F.

, Β HPV16 Ε7 siRNA χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλουν την έκφραση Ε7 στα κύτταρα CaSki και ανάλυση κηλίδας Western εκτελέστηκε για ανάλυση HPV Ε7 (Α) και τα επίπεδα Rb (Β) μετά από HPV Ε7 knock-down. C, D. Kpnβ1 (C) και Kpnα2 (D) δραστηριότητες υποκινητή μετρήθηκαν μετά Ε7 siRNA επιμόλυνση, και βρέθηκαν να παρεμποδίζεται σημαντικά μετά από αναστολή HPV Ε7. Ε, F. Rb υπερεκφράστηκε σε κύτταρα CaSki και Kpnβ1 (Ε) και δραστηριότητες Kpnα2 (F) προαγωγό βρέθηκαν να παρεμποδίζεται σημαντικά. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος ± SE των πειραμάτων εις τετραπλούν εκτελούνται τουλάχιστον δύο φορές (* p & lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη κλωνοποιηθεί και ανέλυσε την Kpnβ1 και Kpnα2 προωθητές με στόχο τον εντοπισμό πιθανών ρυθμιστικών μηχανισμών που θα μπορούσαν να οδηγήσουν υψηλή έκφραση τους σε καρκινικά κύτταρα. Αυτή η μελέτη είναι νέα κατά το ότι είναι η πρώτη που γνώσεις μας που περιγράφει E2F ως σημαντικός μεταγραφικός ρυθμιστής της έκφρασης Kpnβ1 και Kpnα2 σε καρκινικά κύτταρα. E2F παίζει ένα ρόλο σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών διεργασιών και έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην διαφοροποίηση, την ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση [16]. Έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι η E2F παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου RanBP1 [17], ένα σημαντικό εταίρο της ΟΤΡάσης Ran και αναπόσπαστο μέρος της διαδικασίας της πυρηνικής μεταφοράς, καθώς και η μελέτη μας, περιγράφοντας E2F-ρύθμιση των πρωτεϊνών πυρηνικής εισαγωγέα Kpnβ1 και Kpnα2 , εμπλέκει περαιτέρω E2F στη ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην πυρηνική μεταφορά.

E2F δραστηριότητα ελέγχεται από την οδό Rb, σύμφωνα με την οποία, υπό κανονικές συνθήκες RB σύνδεση προς E2F καταστέλλει E2F δραστηριότητα, μέχρι την G1 /S φάση του κυτταρικού κύκλος, οπότε Rb καθίσταται φωσφορυλιωθεί από σύμπλοκα cdk4 /κυκλίνη D, και E2F απελευθερώνεται για να ενεργοποιήσει τα γονίδια-στόχους της. Ωστόσο, η E2F δραστικότητα συχνά απορυθμισμένη στον καρκίνο, ως αποτέλεσμα της συχνής διακοπής της οδού Rb [18] – [21]. Οι μεταλλάξεις Rb έχουν παρατηρηθεί σε ένα ευρύ φάσμα όγκων, συμπεριλαμβανομένων οστεοσαρκώματα, μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, καρκινώματα του μαστού, και άλλα. Επιπλέον, σε πολλούς καρκίνους του ρ16

αναστολέας ΙΝΚ4 & cdk είναι μεταλλαγμένο, ή η λειτουργία του είναι η απώλεια. Αυτό οδηγεί σε αυξημένη δραστικότητα cdk4 /κυκλίνη D, με αποτέλεσμα την αυξημένη φωσφορυλίωση Rb και έτσι E2F συσσώρευσης. Τέλος, απορρυθμισμένη έκφραση ή /και ενίσχυση των γονιδίων κυκλίνης D και CDK4 έχουν επίσης παρατηρηθεί σε πολλούς καρκίνους. Αυτό οδηγεί σε αυξημένο επίπεδο δραστικότητας cdk4 /κυκλίνη D και επομένως ομοίως απορρύθμιση της οδού E2F [21]. Στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, η αδρανοποίηση του καταστολέα E2F, Rb, από τον ιό HPV Ε7, έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη δραστικότητα E2F. Ως αποτέλεσμα της συχνής διακοπής της οδού που ρυθμίζει E2F λειτουργία, E2F γονιδίων στόχων συχνά υπερεκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα λόγω της ενισχυμένης μετενεργοποίηση E2F [22].

Δείχνουμε ότι overexpresion του Kpnβ1 και Kpnα2 στον καρκίνο οφείλεται σε, εν μέρει, αυξημένη ενεργοποίηση των υποκινητών τους με E2F. Μια ποντικού μελέτη από Ishida et al. [23] εντοπίσει ένα πιθανό ρόλο για E2F στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης Kpnα2 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Η μελέτη μας επεκτείνει αυτό το εύρημα και δείχνει ένα ρόλο για E2F στη ρύθμιση της ανθρώπινης Kpnα2, μέσω ενός ειδικού E2F θέση βρίσκεται στη θέση -34 να -27 του υποκινητή Kpnα2. Αυτό το E2F το site φαίνεται απαραίτητη τόσο για τη βασική και ενεργοποιείται η έκφραση του γονιδίου Kpnα2. Επιπλέον, εντοπίσαμε τρεις λειτουργικές θέσεις E2F στον υποκινητή Kpnβ1 που εμφανίζονται να ενεργούν σε συνεννόηση για τη ρύθμιση της έκφρασης Kpnβ1. Έχει αναφερθεί ότι οι πολλαπλές E2F περιοχές μπορεί να υπάρχουν στην περιοχή του υποκινητή ενός γονιδίου, και ότι αυτές οι περιοχές συχνά συνεργάζονται για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης [24].

Η διαπίστωση ότι οι Kpnβ1 και Kpnα2 γονίδια που ρυθμίζονται από E2F υποδηλώνει ότι ρυθμίζονται σε ένα κυτταρικό κύκλο-εξαρτώμενο τρόπο. Έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι η πυρηνική εισαγωγή του karyopherin α /β-υποστρώματα είναι πιο αποτελεσματική σε ορισμένα στάδια του κυτταρικού κύκλου [25], σε συμφωνία με τα δεδομένα μας δείχνουν E2F-ρύθμιση του Kpnβ1 και Kpnα2. Συνολικά, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η απορυθμισμένη δραστηριότητα της E2F σε καρκινικά κύτταρα προκαλεί αυξημένη ενεργοποίηση των υποκινητών Kpnβ1 και Kpnα2, οδηγώντας σε αυξημένα επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών, και τελικά επηρεάζουν τον φαινότυπο καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

WI38 φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα, SVWI38 μετασχηματισμένα WI38 ινοβλάστες, και CaSki καρκίνου του τραχήλου κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με πενικιλλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) (Gibco, Paisley, Σκωτία). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Protein συγκομιδή και Western Blot ανάλυση

Τα κύτταρα σε καλλιέργεια αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή και λύθηκαν σε πάγο σε ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ (10 mM Tris-Cl, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1% δεοξυχολικό, 0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 1 Χ Complete κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Βασιλεία, Ελβετία)). Western Blot αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του κουνελιού αντι-Kpnβ1 (Η-300) (sc-11367, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), κατσίκα αντι-Kpnα2 (C-20) (sc-6917), αντι κουνελιού -Dp1 (Κ-20) (sc-610), ποντικού αντι-HPV 16 Ε7 (ED17) (sc-6981), ποντικού αντι-Rb (4H1) (# 9309, Cell Signaling), και αντι-β-τουμπουλίνης κουνελιού ( H-235) (sc-9104, Santa Cruz Biotechnology) αντισώματα

PCR ενίσχυση του Kpnβ1 (-2013 με 100) υποστηρικτής

οι εκκινητές σχεδιάστηκαν που θα ενισχύουν την περιοχή από. – 2013-100 του γονιδίου Kpnβ1 (Genbank αριθμός: NC_000017): Kpnβ1F 5 ‘AGGCTAGCCCAGCTACATCCAATTACCC 3’ και Kpnβ1R 5 ‘AGAAGCTTCTGGGGGCAGCTCAGA 3’ (NheI ιστοσελίδα υπογραμμίζεται και HindIII site είναι με έντονα γράμματα), και -1992 έως 69 του Kpnα2 γονίδιο (αριθμός πρόσβασης GenBank: NC_000017): Kpnα2F 5 ‘AGTT

CCCGGG

GCAAAAGAAACTCAACTTGGC 3′ και Kpnα2R 5 ‘AGAAGCTTGGGAATCAGCGGCTGTAG 3’ (SmaI site είναι με πλάγια και HindIII site είναι με έντονα γράμματα). PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 100 ng κανονικό DNA του αίματος σαν εκμαγείο, και η υψηλή πιστότητα Άνοιγμα Plus DNA πολυμεράση (Roche). 5% DMSO περιελήφθη στην PCR για Kpnβ1 να βελτιώσει την ειδικότητα. Ο υποστηρικτής PCR προϊόντα υποκλωνοποιήθηκαν στον φορέα ρΟΕΜ-Τ Easy (Promega) και η Kpnβ1 (-2,013 να +100) θραύσμα αποκόπηκε με NheI και HindIII ένζυμα περιορισμού, και η Kpnα2 (-1 992 να 69) θραύσμα αποκόπηκε με SmaI και HindIII ένζυμα περιορισμού, για υποκλωνοποίηση εντός του πλασμιδίου αναφοράς λουσιφεράσης, pGL3 βασικό φορέα (Promega). Υπήρξαν δυσκολίες με το SmaI πέψης, ως εκ τούτου, SacI χρησιμοποιήθηκε αντ ‘αυτού, ως μια θέση SacI ήταν παρούσα στη θέση -1900 του υποκινητή Kpnα2. Υποκλωνοποίηση σε pGL3 Basic τοποθετείται η Kpnβ1 (-2013 να +100) και Kpnα2 (-1990 να 69) θραύσματα υποκινητή ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης προαγωγό-λιγότερο για ανάλυση δραστηριότητα προαγωγέα. Κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση χρησιμοποιώντας την αλληλούχιση Μονάδα UCT Human Genetics.

Δημιουργία Kpnβ1 και Kpnα2 μορφώματα διαγραφής υποστηρικτής

Ανάδοχος μορφώματα διαγραφής για Kpnβ1 παράχθηκαν χρησιμοποιώντας είτε περιοριστικές θέσεις που είναι κοινές στα δύο το κλωνοποιημένο υποκινητή θραύσμα και η περιοχή pGL3-Basic πολλαπλής κλωνοποίησης (ΚρηΙ για την -637 να +100 κατασκεύασμα? SacI για την -271 να +100 κατασκεύασμα), ή το γονίδιο-ειδικούς εναρκτήρες προς τα εμπρός (5 ‘AGGCTAGCGCCGTCAGGAGAGCTTGA 3’ για την -861 να +100 κατασκευάσει? 5 ‘AGGCTAGCAGCGCCTGGCCAGTTAG 3’ για το κατασκεύασμα -108 να +100? NheI θέση περιορισμού είναι υπογραμμισμένη) και ο εκκινητής Kpnβ1 R. Το κατασκεύασμα -180 να +69 διαγραφή για Kpnα2 δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας NruI και SacI ένζυμα περιορισμού, το οποίο κυκλοφόρησε το -1900 να -180 θραύσμα, ενώ το κατασκεύασμα -24 να +69 διαγραφή δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας δννβΙ και SacI ένζυμα περιορισμού, το οποίο αποδεσμεύεται η -1900 να -24 θραύσμα.

δοκιμασίες λουσιφεράσης

100 ng από κάθε κατασκεύασμα υποκινητή επιμολύνθηκε σε 30 000 CaSki καρκίνο του τραχήλου κύτταρα /φρεάτιο μιας πλάκας 24 φρεατίων, με τη χρήση 0,3 μΐ Transfectin ( Bio-Rad). Για την κανονικοποίηση για αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 10 ng του πλασμιδίου pRL-ΤΚ (που κωδικοποιεί λουσιφεράση της Renilla). Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα 24 ώρες μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας 1 Χ Παθητική ρυθμιστικού λύσης (Promega) και πυγολαμπίδας δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το διπλής λουσιφεράση Kit (Promega). Η φωταύγεια παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας την Glomax 96 μικροπλάκα φωτόμετρο (Promega). Δραστηριότητα κανονικοποιήθηκε ως προς τη δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla από pRL-ΤΚ στο ίδιο εκχύλισμα.

Η τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση του υποτιθέμενου E2F θέσεις

Μεταλλάξεις στις θέσεις πρόσδεσης E2F του υποκινητή Kpnβ1 παρασκευάστηκαν με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση, χρησιμοποιώντας μεταλλαξογόνα εκκινητήρια μόρια: E2Fa: F: 5 ‘CGCTCAGGCCCGCtAgcACCTCGCGCAACAC 3’? E2Fa: R: 5 ‘GTGTTGCGCGAGGTgcTaGCGGGCCTGAGCG 3’? E2Fb: F: 5 ‘GAACCCAGCTCCGCCTCTTgCtaGcGGCGTCCCATCGTGCCCC 3’? E2Fb: R: 5 ‘GGGGCACGATGGGACGCCgCtaGcAAGAGGCGGAGCTGGGTTC 3’? E2Fc: F: 5 ‘GCTCCTAGGGTTGCtaGcCACCTCCCGCCTTCC 3’? E2Fc: R: 5 ‘GGAAGGCGGGAGGTGgCtaGCAACCCTAGGAGC 3’? E2Fd: F: 5 ‘CGGGCACCTCCCGCCTgCtaGCGCCCCGACCCCGAAC 3’? E2Fd: R: 5 ‘GTTCGGGGTCGGGGCGCtaGcAGGCGGGAGGTGCCCG 3’? E2Fe: F: 5 ‘CTCCTCTCCTTAGTTCTCgCtaGCACCCTATCCTATCAAC 3’? E2Fe: R: 5 ‘GTTGATAGGATAGGGTGCtaGcGAGAACTAAGGAGAGGAG 3’ (οι μεταλλαγμένες βάσεις υποδεικνύονται με πεζά? Θέση περιορισμού NheI είναι υπογραμμισμένη). Η μετάλλαξη της θέσης δέσμευσης E2F στον υποκινητή Kpnα2 διεξήχθη χρησιμοποιώντας μεταλλαξογόνα εκκινητήρια μόρια: F 5 ‘CAATCGGAATGCGGAGTCgCtaGcAAATTTAAATCGCGCCGGGC 3’ και R5 ‘GCCCGGCGCGATTTAAATTTgCtaGcGACTCCGCATTCCGATTG 3’. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες: 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενη από 18 κύκλους των 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 61 ° C για 1 λεπτό, και 72 ° C για 6 λεπτά, που ακολουθείται από ένα τελικό στάδιο επέκτασης των 72 ° C για 20 λεπτά. Μετά την ενίσχυση PCR, 10 U ϋρηΙ (Promega) προστέθηκε και η πέψη πραγματοποιήθηκε στους 37 ° C για 90 λεπτά, πριν από τη μετατροπή σε JM109 εξαιρετικά ικανών κυττάρων (Promega). Ανάλυση πέψης περιορισμού χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των κλώνων που φέρουν τη μετάλλαξη.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασία

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή και συμπλέγματα πρωτεΐνης-ΟΝΑ περίπου το 90% με σταυροειδείς δεσμούς με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, ακολουθούμενο από την προσθήκη 0.125 Μ γλυκίνη, ρΗ 2,5. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-Cl, ρΗ 8,1, 1 χ Complete Protease Inhibitor (Roche)), και επεξεργασία με υπερήχους σε μήκη μεταξύ 400 και 1000 bp. Κυτταρολύματα αραιώθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl, ρΗ 8,1, 1 χ Complete Protease Inhibitor) και στη συνέχεια προκαταρκτική διαύγαση με σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης-Α (Merck, NJ, USA) για 2 ώρες. Χάντρες είχε προηγουμένως αποκλειστεί στο 100 μg /ml DNA σπέρματος σολομού και 5% BSA. Χρωματίνης επωάστηκε με 2 αντίσωμα μg (α-E2F 2 (C-20 X, SC-633 X, Santa Cruz Biotechnology)? Α-DP1 (Κ-20, SC-610, Santa Cruz Biotechnology)? Ή καθόλου αρνητικός μάρτυρας αντισώματος ) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. σφαιρίδια Protein-Α αγαρόζης προστέθηκαν για περαιτέρω 2 ώρες στους 4 ° C, και ανοσοσυμπλέγματα που δεσμεύονται από τα σφαιρίδια ανακτήθηκαν με φυγοκέντρηση και πλύθηκαν δύο φορές διαδοχικά σε TSE I (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, ρΗ 8,1, 150 mM NaCl), TSE II (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, ρΗ 8,1, 500 mM NaCl), Ρυθμιστικό III (0,25 Μ LiCl, 1% ΝΡ-40, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, ρΗ 8.1) και ΤΕ, ρΗ 7,4.