Abstract

Η κλινική επιτυχία της θετής ανοσοθεραπείας του καρκίνου βασίζεται στην επιλογή των αντιγόνων-στόχων που είναι εντόνως εκφρασμένες σε κύτταρα όγκου, αλλά απουσιάζει στα ουσιώδη φυσιολογικούς ιστούς. Μια ομάδα γονιδίων που κωδικοποιούν τα αντιγόνα καρκίνου του /των όρχεων ή βλαστικής γραμμής του καρκίνου έχουν προταθεί ως ιδανικοί στόχοι για ανοσοθεραπεία εξαιτίας της υψηλής έκφρασή τους σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου και περιορισμένη έκφρασή τους σε φυσιολογικούς ιστούς ανοσοπρονομιούχων. Στην παρούσα εργασία αναφέρουμε την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό των υποδοχέων ανθρώπινων Τ κυττάρων (TCRs) με ειδικότητα για σάρκωμα αρθρικού υγρού X σημείο διακοπής 2 (SSX2), ένα καρκινικό αντιγόνο /όρχεων εκφράζονται σε μελάνωμα, καρκίνο του προστάτη, το λέμφωμα, πολλαπλό μυέλωμα και καρκίνος του παγκρέατος, μεταξύ άλλων όγκων. Απομονώσαμε επτά HLA-A2 περιορισμένο υποδοχείς Τ κυττάρων από το φυσικό τους κλώνους Τ κυττάρων που προέρχονται από όγκο λεμφαδένες διηθημένους από δύο ασθενείς με μελάνωμα SSX2-οροθετικών και επιλέγονται τέσσερα TCRs για κλωνοποίηση σε φορείς ρετροϊών. Λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBL) μεταγωγή με τρία από τα τέσσερα SSX2 TCRs εμφάνισαν SSX2

41-49 (KASEKIFYV) πεπτίδιο ειδική αντιδραστικότητα, όγκο αναγνώριση κυττάρου και τετραμερές δεσμευτική. Ένα από αυτά, ΤΟΚ-5, επέδειξε δέσμευση στα κύτταρα τόσο CD4 και CD8 τετραμερές και επελέγη για περαιτέρω μελέτες. Αντιγόνου-ειδικές και HLA-A * 0201-περιορισμένο απελευθέρωσης ιντερφερόνης-γ, κυτταρική λύση και λεμφοκυττάρων πολλαπλασιασμός παρατηρήθηκε μετά από καλλιέργεια του TCR μηχανικής ανθρώπινα ΡΒΙ_ με συναφείς κυτταρικές γραμμές όγκου. Η βελτιστοποίηση κωδικονίων βρέθηκε να αυξάνει TCR-5 έκφρασης σε μετατραπέντα κύτταρα Τ, και αυτό το κατασκεύασμα έχει επιλεγεί για την ανάπτυξη των κυττάρων του κλινικού βαθμού ιικό φορέα παραγωγής. Το όγκου-ειδικό πρότυπο έκφρασης του SSX2, μαζί με την ισχυρή και εκλεκτική δράση της TCR-5, κάνει αυτό το ΤΟΚα ένας ελκυστικός υποψήφιος για δυνητικούς γονίδιο TCR θεραπεία για τη θεραπεία του καρκίνου του πολλαπλούς ιστολογίες

Παράθεση:. Abate-Daga D, Speiser DE, Chinnasamy Ν, Zheng Ζ, Xu Η, Feldman SA, et al. (2014) Ανάπτυξη κυττάρων υποδοχέων Τ Στόχευση ένα HLA-A * 0201 περιορισμένο επίτοπο από τον καρκίνο όρχεων αντιγόνου SSX2 για Ανοσοθεραπεία του Καρκίνου. PLoS ONE 9 (3): e93321. doi: 10.1371 /journal.pone.0093321

Επιμέλεια: Nupur Gangopadhyay, Πανεπιστήμιο του Pittsburgh, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Δεκέμβρη του 2013? Αποδεκτές: 4 του Μάρτη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 28, Μαρτίου του 2014

Copyright: © 2014. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια συνεισφορά από το Ίδρυμα Milstein Οικογένεια και από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του το Κέντρο για την Έρευνα του Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Bethesda MD. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πρόσφατες πρόοδοι στους τομείς της ανοσολογίας των όγκων, ο καρκίνος γονιδιωματική και τεχνολογίες μεταφοράς γονιδίων έχουν επιτρέψει την ανάπτυξη θεραπειών με βάση την υιοθετούμενη μεταφορά αυτόλογων καρκινικών-αντιδραστικών Τ κυττάρων για την θεραπευτική αγωγή ανθρώπινων κακοηθειών [1], [2 ]. Tumor-αντιδραστικών Τ-λεμφοκυττάρων μπορεί να είναι φυσικά, όπως στην περίπτωση των διηθητικών λεμφοκυττάρων όγκου (ΤΙΕ) που καθαρίζεται από εκτομή αλλοιώσεων και διεγείρονται

ex vivo

, ή δημιουργούνται από περιφερικό αίμα με εισαγωγή των γονιδίων που κωδικοποιούν για το ανοσοποιητικό τους υποδοχείς [3 ].

Ενώ το υψηλό ποσοστό (50-70%) της αντικειμενικής κλινικές αποκρίσεις επιτευχθεί με κατεργασία TIL σε ασθενείς με προχωρημένο μελάνωμα σταδίου καθιέρωσε ένα στερεό απόδειξη της έννοιας για τη θεραπεία ανθρώπινων καρκίνων με Τ κύτταρα [4 ], [5], ευρεία εφαρμογή της περιορίζεται από τη δυσκολία καλλιέργειας και την επέκταση αυτών των Τ κυττάρων σε κλινικά σχετικούς αριθμούς για κάθε ασθενή. Ως μια εναλλακτική προσέγγιση, η εξειδίκευση αντιγόνου των άμεσα διαθέσιμες Τ κυττάρων περιφερικού αίματος μπορούν να κατευθυνθούν προς τα αντιγόνα που εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα με γενετική τροποποίηση. Η θετή μεταφορά αυτόλογων κυττάρων Τ γενετική μηχανική για να εκφράζουν υποδοχείς Τ κυττάρων (TCRs) ή χιμαιρικά ανοσοποιητικό υποδοχείς που προέρχονται από αντισώματα μπορεί να οδηγήσει σε μια ισχυρή κυτταρική ανοσολογική απόκριση έναντι των ιστών που εκφράζουν τα αντιγόνα στόχους, ακόμη και σε χαμηλά επίπεδα [3], [6] – [ ,,,0],8]. Συνεπώς, είναι καθοριστική για την επιλογή προσεκτικά αντιγόνα που εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα, αλλά απουσιάζει από ουσιώδη φυσιολογικούς ιστούς, προκειμένου να αποφευχθούν ανεπιθύμητα on-στόχος /off-όγκου τοξικότητες.

Οι σημερινές προσπάθειες για τον εντοπισμό των βέλτιστων αντιγόνα στόχους για ανοσοθεραπεία εστιάζονται κυρίως στις νεοαντιγόνων δημιουργούνται από σωματικές μεταλλάξεις παρόντες σε όγκους, αλλά απουσιάζουν σε φυσιολογικούς ιστούς [9], [10], σε αντιγόνα που εκφράζονται επί περιττό φυσιολογικούς ιστούς, και σε μια ομάδα γονιδίων που κωδικοποιούν για τον καρκίνο-όρχεων ( CT) αντιγόνα. Οι τελευταίες ορίζονται από το πρότυπο της έκφρασης η οποία, σε ενήλικες, είναι γενικά περιορίζεται σε μη-MHC που εκφράζουν γεννητικά κύτταρα του όρχεως, ότι έτσι δεν παρουσιάζουν αντιγόνα σε Τ κύτταρα, και να καρκινικά κύτταρα διαφορετικής προέλευσης [11] – [13 ]. Η θετή μεταφορά αυτόλογων λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος που εκφράζουν ένα συγκεκριμένο TCR για ένα αντιγόνο καρκίνου των όρχεων, NY-ESO-1, με τη μεσολάβηση στόχου παλινδρομήσεις του όγκου σε ασθενείς με προχωρημένο μελάνωμα και με αρθρικό σάρκωμα, χωρίς ΝΥ-ΕδΟ-1 συναφή τοξικότητα [14 ].

για να επεκτείνει το ρεπερτόριο των αντιγόνων τα οποία μπορούν να απευθύνονται με την προσέγγιση αυτή, ως εκ τούτου, την αύξηση του αριθμού των ασθενών και των τύπων όγκων που μπορεί να αντιμετωπιστεί, έχουμε αναπτύξει μια ΤΟΡ-φορέα έκφρασης στοχεύει σε ένα μέλος της αρθρικό σάρκωμα X οικογένεια breakpoint, SSX2. Οι αρθρικού σαρκώματος X σημείο διακοπής (SSX) γονίδια που βρίσκονται στο χρωμόσωμα Χ και κωδικοποιούν μία οικογένεια δέκα εξαιρετικά ομόλογες πυρηνικές πρωτεΐνες, SSX1-10. SSX2 εντοπίσθηκε αρχικά ως μέρος μιας γονιδιακής μετάθεσης παρούσα στο αρθρικό σάρκωμα [15], [16] και αργότερα βρέθηκε να είναι ταυτόσημη με HOM-MEL-40, μια ανοσογόνο πρωτεΐνη που είναι γνωστό ότι επάγουν αυθόρμητες αποκρίσεις αντισώματος σε 10% των ασθενών με μελάνωμα [17].

Δημιουργήσαμε φορείς ρετροϊών που κωδικοποιεί την άλφα- και βήτα TCR αλυσίδες στοχεύουν στην HLA-A * 0201-περιορισμένο επίτοπο SSX2

41-49, που απομονώνονται από περιγράφηκε προηγουμένως ασθενείς με μελάνωμα εμφανίζει ενεργό ανοσοποιητικό απαντήσεις σε SSX2 [18]. Δείξαμε επίσης ότι Τ κύτταρα με γενετική μηχανική με αυτούς τους φορείς αναγνωρίζουν κυτταρικές σειρές που προέρχονται από πολλαπλές ιστολογίες καρκίνο. Βελτιστοποίηση της έκφρασης και της δραστηριότητας TCR με τροποποίηση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του μας επέτρεψε να προσδιορίσει το βέλτιστο σχεδιασμό για την αποτελεσματική έκφραση και ισχυρό αντιγόνο-ειδική αντιδραστικότητα ενάντια SSX2. Η παραγωγή μιας κλινικής βαθμού κυτταρική γραμμή φορέα ρετροϊού παραγωγός επιδιωχθεί περαιτέρω για τη μελλοντική εφαρμογή της σε θετή ανοσοθεραπεία κλινικές δοκιμές.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και ανθρώπινα PBL

HLA-Α * 0201 κυτταρική γραμμή μελανώματος 624 + /SSX2 +, και μη-HLA-Α * 0201 κυτταρικές σειρές 888 και 938 δημιουργήθηκαν από χειρουργικά μεταστατικών όγκων μελανώματος και διατηρείται στην Χειρουργική Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health ( Bethesda, MD). Το HLA-A κυτταρική σειρά γλοιώματος * 0201 + /SSX2 + U251 ελήφθη από τη διαίρεση των καρκινικών θεραπεία και τη διάγνωση των όγκων Repository, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Frederick, MD). γραμμές Μελάνωμα SKmel23 και SKmel37, και ο καρκίνος του μαστού κυτταρική γραμμή MCF7 αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA). * 0201 293-Α Cos7-Α * 0201 και είχαν ρετροϊό γενετικά για να εκφράζουν HLA-A * 0201, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], [20]. κύτταρα * 0201-SSX2 293-Α Cos7-Α * 0201-SSX2 και μετήχθησαν με ένα ρετροϊικό φορέα που εκφράζει το cDNA του SSX2. Τ2 είναι μια λεμφοβλαστοειδή κυτταρική γραμμή που στερούνται τη λειτουργία του TAP, του οποίου το HLA τάξης Ι πρωτεΐνες μπορεί εύκολα να φορτωθεί με εξωγενή πεπτίδια. PG13 κλώνοι συσκευασίας παρήχθησαν με τη χρήση του γίββωνα ιού λευχαιμίας κυτταρική γραμμή συσκευασίας PG13 (ATCC CRL-10686), και η κυτταρική γραμμή συσκευασίας ανθρώπινη οικοτροπικά, Phoenix ECO (ευγενική προσφορά του Dr. Hans-Peter Kiem, Έρευνας Καρκίνου Fred Hutchinson κέντρο, Σιάτλ , WA). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο D10 που αποτελείται από υψηλής γλυκόζης (4.5 g /L), τροποποιημένο βασικό μέσο Dulbecco (ϋΜΕΜ, Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Hyclone, Logan, UT) και 6 mM γλουταμίνη (τελική συγκέντρωση? Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2.

λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από ασθενείς με μελάνωμα αντιμετωπίζεται με τον Surgery Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health, επί NCI Institutional Review Board-εγκεκριμένα πρωτόκολλα. Οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση για την προμήθεια ιστών και χρήση αυτών για ερευνητικούς σκοπούς, όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο πρωτόκολλο 03-C-0277. Ανθρώπινα λεμφοκύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ΑΙΜ-ν (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 5% ανθρώπινο ορό ΑΒ (Valley Biomedical, Winchester, VA), 50 U /mL πενικιλλίνη, 50 μg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen), και 300 IU /ml IL-2 και διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO2. SSX2 κλώνοι ειδικών Τ κυττάρων που δημιουργήθηκε πρόσφατα από όγκο λεμφαδένα διηθημένο προερχόμενα Τ κύτταρα ασθενών Lau 567 και 672 Lau, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

Συνθετικά πεπτίδια

Η SSX2

41-49 πεπτίδιο (KASEKIFYV) που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 41 έως 49 του SSX2, και ομόλογα πεπτίδια που παράγονται από SSX1 (KYSEKISYV), SSX3 (KVSEKIVYV), SSX4 (KSSEKIVYV), SSX5 (KASEKIIYV), SSX6 (KFSEKISCV), SSX7 (KSLEKISYV), SSX8 (KYSEKISYV), SSX9 (KSSEKIIYV), SSX10 (KASEKILYV), IGSF22 (KESAKIFYD), ARHGAP1 (KFGQKIFYV), GPR82 (SCYEKIFYG), PHF8 (LKGEKIFYL), LIPM (TGQEKIYYV), SYT14 (IVGEKIFYL), TCOF1 (KASEKILQV), RBL2 (SPREKIFYY) και Fras1 (SPREKIYYV) συντέθηκαν με GenScript (Piscataway, NJ). Τα πεπτίδια διαλύθηκαν σε DMSO και αραιώθηκαν σε μέσο RPMI 1640 για την φόρτωση των κυττάρων Τ2. Η συγγένεια δέσμευσης σε HLA-A2 * 0201 είχε προβλεφθεί για κάθε πεπτίδιο με χρήση NetMHC-3,0 [21]. Ταυτοποίηση των πεπτιδίων ομόλογα με SSX2

41-49 με ένα δυναμικό για διασταυρούμενη αντιδραστικότητα διεξήχθη από έκρηξη αναζήτησης (αλγόριθμο BLASTP).

Κατασκευή φορείς ρετροϊών για την έκφραση της SSX2 ειδικών HLA-A * 0201-περιορισμένο TCRs

φορείς ρετροϊών

MSGV1 που βασίζεται κατασκευάστηκαν με επικαλυπτόμενες PCR με την άλφα και βήτα TCR αλυσίδες διατεταγμένα με την ακόλουθη σειρά: TCR άλφα αλυσίδας, συνδετικό πεπτίδιο φουρίνη SGSGP2A, TCR βήτα αλυσίδος , όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Τα κλωνοποιημένα ένθετα TCR επαληθεύτηκαν με ένζυμο περιορισμού προφίλ και άμεση αλληλούχιση του DNA. Το cDNA που κωδικοποιεί για το κωδικόνιο βελτιστοποιημένη εκδοχή του SSX2 ειδικών TCR και ενός βελτιστοποιημένου με κωδικόνιο TCR με σταθερές περιοχές ποντικού συντέθηκαν με GenScript. Η υβριδική έκδοση ανθρώπου-ποντικού του TCR-5 σχεδιάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

μεταγωγή κυττάρων Τ

ρετροϊικοί υπερκείμενα που παράγονται από την επιμόλυνση κάθε πλασμίδιο pMSGV1-SSX2-ΤΟΚ μαζί με ένα διάνυσμα φάκελος που κωδικοποιεί RD114 σε κύτταρα 293-GP χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σε μέσο Opti-ΜΕΜ (Invitrogen) [22]. Viral υπερκείμενα στη συνέχεια φορτώθηκαν σε RetroNectin επικαλυμμένα (Takara Bio, Japan) πλάκες έξι φρεατίων καλλιέργειας επεξεργασμένο μη-ιστό. PBLs διεγέρθηκαν με ΟΚΤ3 (50 ng /mL) και rhIL-2 (300 IU /ml) 48 ώρες πριν από την μεταγωγή, και η μεταγωγή πραγματοποιείται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

τετραμερή χρώση

HLA-A * 0201-περιορισμένο SSX2-πεπτίδιο που προέρχεται από SSX2

41-49 (KASEKIFYV) παρήχθησαν από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας τετραμερούς πυρήνα Facility στο Πανεπιστήμιο Emory (Ατλάντα, GA) χρησιμοποιώντας φυκοερυθρίνη (PE) όπως φθοριοχώματος. Για την αξιολόγηση του TCR αποτελεσματικότητα μεταγωγής σε υποσύνολα κυττάρων Τ, έχουν υποστεί μεταγωγή Τ κύτταρα βάφτηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο αντι-ανθρώπινο CD8 (BD Pharmingen, San Jose, CA) και με ΡΕ-επισημασμένο ΗΙΑ-Α * 0201 τετραμερή. Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACScan κυτταρόμετρο ροής με λογισμικό CellQuest (BD Biosciences) ή λογισμικό FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).

απελευθέρωσης κυτοκίνης δοκιμασία

TCR-μετασχηματισμένων λεμφοκυττάρων δοκιμάστηκαν για το αντιγόνο -ειδικές αντιδραστικότητα σε δοκιμασίες απελευθέρωσης κυτοκίνης χρησιμοποιώντας φορτωμένα με πεπτίδιο κύτταρα Τ2 ή κύτταρα όγκου. Για το σκοπό αυτό, κύτταρα τελεστές και κύτταρα στόχοι καλλιεργήθηκαν σε 1:01 αναλογία (1 × 10

5 από το καθένα) σε 200 υί μέσο ΑΙΜ-ν εις διπλούν φρεάτια μιας μικροπλάκας 96 φρεατίων. υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν 18-24 ώρες μετά την έναρξη της συγκαλλιέργειας και αναλύθηκαν για την ιντερφερόνη-γ (ΙΡΝγ) με ELISA (Thermo Scientific).

[

51Cr] δοκιμασία απελευθέρωσης

Η ικανότητα των μεταχθέντα PBLs να λύουν HLA-Α * 0201 + SSX2 + κύτταρα όγκου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο [

51Cr] δοκιμασία απελευθέρωσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25] Εν συντομία, TCR-μηχανικής PBLs καλλιεργήθηκαν με φθίνουσα αναλογίες

51Cr-σημασμένα κύτταρα-στόχους (Ε: Τ αναλογία) σε μέσο ΑΙΜ-V σε τρυβλία 96 φρεατίων U στους 37 ° C για 4 ώρες. Λύσης μετρήθηκε από [

51Cr] απελευθέρωση στο μέσο σύμφωνα με τον τύπο: τοις εκατό λύση = (απελευθέρωση δείγματος – ελάχιστη απελευθέρωση) /(μέγιστη απελευθέρωση – ελάχιστη απελευθέρωση) χ 100%. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος διπλών δειγμάτων.

Δημιουργία ενός κλώνου συσκευασίας PG13 που κωδικοποιεί ένα SSX2 ειδικό TCR

Ένας κλώνος των κυττάρων συσκευασίας ρετροϊικού PG13 δημιουργήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως με τις ακόλουθες αλλαγές [24] . κύτταρα Phoenix ECO επιμολύνθηκαν με 9.5 μg του πλασμιδίου DNA (pMSGV1-SSX2.567.5-συν) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipofectamine 2000cd διαμόλυνσης (LifeTechnologies, Carlsbad, CA). Μετά από 48 ώρες το υπερκείμενο συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για την μεταγωγή ρετροϊικού κυτταρική γραμμή συσκευασίας, PG13. Μη ιστοκαλλιέργειας αγωγή τρυβλία 6 φρεατίων επικαλυμμένα με 20 μg /mL RetroNectin όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. υπερκείμενο ρετροϊικού φορέα (4 mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο που ακολουθείται από φυγοκέντρηση (2000 χ g) στους 32 ° C. Μετά από 2 ώρες, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και 5 × 10

5 PG13 κύτταρα προστέθηκαν στο φρεάτιο, φυγοκεντρήθηκαν (1000 χ g) επί 10 λεπτά στους 32 ° C. Δύο γύροι μεταγωγής διεξήχθησαν και οι κλώνοι στη συνέχεια PG13 συσκευασίας παρήχθησαν με κλωνοποίηση οριακής αραίωσης. Λόγω της έλλειψης ενός επιλέξιμου δείκτη, υψηλή κλώνοι τίτλου ταυτοποιήθηκαν από την RNA dot blot όπως περιγράφεται προηγουμένως [24], [26]. Ρετροϊικός φορέας από τις 6 υψηλότερα κλώνους τίτλου παράχθηκε όπως περιγράφεται. Εν συντομία, 175 εκατοστά

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού (Nunc, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) σπάρθηκαν σε 4 × 10

4 κύτταρα /cm

2, που ακολουθείται από ένα μέσο ανταλλαγής (30 mL) την ημέρα 3. υπερκείμενο συλλέχθηκε 24 ώρες αργότερα, δειγματίστηκε και φυλάχθηκε στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. Το υπερκείμενο από κάθε κλώνο εκτιμήθηκε για την ικανότητα να μετάγουν αποτελεσματικά τα ανθρώπινα PBL και εκμαιεύσει IFNg σε μία δοκιμασία απελευθέρωσης κυτοκίνης. Ένα υψηλό κλώνος τίτλος θα επιλεγούν για την παραγωγή μιας τράπεζας κύριων κυττάρων και την επακόλουθη GMP ρετροϊικό υπερκείμενο φορέα.

Δημιουργία του υπερκείμενου ρετροϊικού φορέα GMP

Ένα σύνολο 26 1700 εκατοστά

2 επεκταθεί κυλιόμενες φιάλες επιφάνεια σπάρθηκαν την ημέρα 0 σε μία πυκνότητα κυττάρων 4 Χ 10

4 κύτταρα /cm

2 σε 200 mL μέσου D10. Την ημέρα 3, το μέσο αλλάχθηκε και αντικαταστάθηκε με 120 mL μέσου D10. Μέσο που περιέχει τον φορέα ρετροϊού συλλέχθηκε καθημερινά με φιάλες που επανατροφοδοτήθηκαν με 120 mL του μέσου. Τα επίπεδα γλυκόζης παρακολουθήθηκαν καθημερινά χρησιμοποιώντας σύστημα Accu-ελέγχου της Roche (Roche, Basal, Ελβετία). Αν τα επίπεδα γλυκόζης έπεσαν κάτω από 2 g /L, ο όγκος του μέσου εναλλαγής διπλασιάστηκε σε 240 mL /περιστρεφόμενη φιάλη για όλες τις επόμενες συγκομιδές. Όλες οι συγκομιδές δειγματίστηκαν και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. Ένα δείγμα από κάθε συγκομιδή δοκιμάστηκε για αποτελεσματικότητα μεταγωγής και την απελευθέρωση κυτοκινών όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Όλες οι κλινικές προϊόντα υποβλήθηκαν σε ένα εκτεταμένο πρόγραμμα δοκιμών βιοασφάλειας σύμφωνα με τις ισχύουσες κανονιστικές κατευθυντήριες γραμμές (US Food and Drug Administration, Κέντρο Βιολογικών Αξιολόγησης και Έρευνας? Σημεία αναφοράς που εξετάζουν στην παραγωγή και δοκιμή νέων φαρμάκων και Biologicals Παράγεται με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA , 1985? Σημεία που εξετάζουν κατά την Χαρακτηρισμός γραμμών κυττάρων χρησιμοποιούνται για την παραγωγή Biologicals, 1993? Καθοδήγηση για τη βιομηχανία: Καθοδήγηση για τα Ανθρώπινα σωματικών κυττάρων η γονιδιακή θεραπεία, 1998? Καθοδήγηση για τη Βιομηχανία, Inds – Προσεγγίσεις σε συμμόρφωση με CGMP κατά τη διάρκεια της φάσης Ι, 2006).

Αποτελέσματα

Κλωνοποίηση ανθρώπινου SSX2-δραστικής TCRs

Οι περιοχές κωδικοποίησης TCR άλφα και βήτα αλυσίδες κλωνοποιήθηκαν από περιγράφηκε προηγουμένως φυσικά SSX2-αντιδρώσα Τ κύτταρα από δύο ασθενείς με μελάνωμα [18]. Αυτά τα HLA-Α2-περιορισμένα κύτταρα CD8 αναγνωρίζουν έναν επίτοπο που καλύπτει τα υπολείμματα 41 έως 49. cDNA συντέθηκε με 5 ‘RACE χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για τη σταθερή περιοχή των γονιδίων TCR και τα προϊόντα υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας, ταυτοποίηση επτά διαφορετικά ζεύγη TRAV και γονιδίων TRBV ( Τραπέζι 1). κασέτες έκφρασης που περιέχουν τις αλυσίδες άλφα και βήτα TCR διαχωρίστηκε από το πεπτίδιο 2Α συνδετήρα [27], [28] δημιουργήθηκαν με επικαλυπτόμενες PCR και κλωνοποιήθηκε στον pMSGV1 για την παραγωγή ρετροϊικών φορέων έκφρασης για τους κλώνους 5, 8, 9 και 11 ( Σχήμα 1Α).

Η περιοχή κωδικοποίησης του TCR κάθε άλφα-αλυσίδα ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που πλαισιώνεται από μια θέση περιορισμού NcoI στο 5 ‘άκρο και μια επικρεμάμενη αλληλούχισης που περιέχει το στοιχείο στο 3’ άκρο. Παράλληλα, κάθε TCR βήτα-αλυσίδας ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας πρόσθιο εκκινητή που περιέχει ένα ‘προεξοχή που επικαλύπτεται με το 3’ 5 προεξοχή που υπάρχει στο αρχικό τεμάχιο που χρησιμοποιείται για την ενίσχυση του α-αλυσίδα. Ο αντίστροφος εκκινητής που χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση του βήτα-αλυσίδα περιείχε ένα κωδικόνιο στοπ και μία

Eco

θέση περιορισμού RI. Σε ένα δεύτερο γύρο PCR, τα προϊόντα των άλφα- και βήτα-αλυσίδας ενισχύσεις συνενώθηκαν, και σύνδεση των δύο θραυσμάτων cDNA μέσω των επικαλυπτόμενων προεξοχές επιτεύχθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εξωτερικούς εκκινητές. Τα προκύπτοντα PCR προϊόντα κλωνοποιήθηκαν σε φορέα pMSGV1 για την παραγωγή ρετροϊού. LTR: μακριά τερματική επανάληψη, sd: δότη ματίσματος, sa: αποδέκτη ματίσματος, ψ:. Σήμα εγκαψιδίωσης ρετροϊό

Η

Η έκφραση των κλωνοποιημένων TCRs σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα

φορέα ρετροϊού υπερκείμενα παρήχθησαν με παροδική επιμόλυνση των 293GP και χρησιμοποιήθηκε για μεταγωγή των ΟΚΤ3-διεγερμένα ανθρώπινα Τ κύτταρα. Έκφραση και σωστή συναρμολόγηση των TCRs αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας σημασμένο με φθορισμό HLA-A2-SSX2

41-49 τετραμερή. TCR5 ήταν αποτελεσματικά εκφράζεται σε αμφότερα τα CD8 και CD4 κυττάρων, TCR9 και TCR11 εκφράστηκαν μόνο σε κύτταρα CD8, ενώ η έκφραση του TCR8 δεν ανιχνεύθηκε με αυτήν την τεχνική (Σχήμα 2 Α).

Α) Ανάλυση της έκφραση επιφανείας SSX2

41-49-ειδική TCRs σε πληθυσμούς κυττάρων CD8 και CD4 Τ με κυτταρομετρία ροής. Ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος διεγέρθηκαν με ΟΚΤ3 και μεταγωγή με τις υποδεικνυόμενες ρετροϊικούς φορείς έκφρασης. Μία εβδομάδα αργότερα, τα κύτταρα βάφτηκαν με CD3, CD8 αντισώματα αντι-ανθρώπινης και με ένα σημασμένο με φθορισμό τετραμερές που περιέχει το SSX2

41-49 πεπτίδιο. Τα αποτελέσματα από ένα αντιπροσωπευτικό δότη από τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. Εκδηλώσεις με περίφραξη σε λεμφικού, ενιαία, βιώσιμη, CD3 + κυττάρων. Β) – D) Συγκέντρωση IFNg σε υπερκείμενα TCR-μετατραπέντα κύτταρα Τ καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα με τις υποδεικνυόμενες στόχοι (1 χ 10

5 τελεστές vs 1 × 10

5 στόχοι). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος των εις διπλούν για δύο αντιπροσωπευτικά δότες από τα τέσσερα. UT:. Untranduced

Η

Η αντιδραστικότητα της PBL μεταγωγή με ανθρώπινο αντι-SSX2 TCRs εναντίον των καρκινικών κυττάρων SSX2 θετικά

Η σωστή επεξεργασία και παρουσίαση του SSX2

41-49 επιτόπου , και αναγνώριση από TCR-μηχανικής PBL ελέγχθηκαν in vitro με την καλλιέργεια του PBL με παράγωγα του Cos-7 και ΗΕΚ293 κύτταρα που εκφράζουν HLA-A * 0201 με ή χωρίς ταυτόχρονη έκφραση του SSX2 αντιγόνου (Cos-A2, Cos-A2 SSX2 , 293-Α2 και 293-Α2 SSX2, αντίστοιχα). Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Β, τα Τ κύτταρα σε μεταγωγή με TCR-5, -9 και -11 εκκρίνονται υψηλά επίπεδα ΙΡΝγ (της τάξης του 1 × 10

4 pg /mL) όταν συν-καλλιεργήθηκαν με SSX2-μετεμβολιασμού. TCR-8-μετατραπέντα κύτταρα Τ που εκκρίνεται μόνο βασικά επίπεδα των ΙΡΝγ, σύμφωνα με την έλλειψη τετραμερούς δέσμευσης που παρουσιάζεται στο σχήμα 2Α. Προκειμένου να επαληθευτεί η HLA-A * 0201 περιορισμός αυτών των TCR, μια * 0201-αρνητική κυτταρική σειρά μελανώματος SSX2-θετικά HLA-A (938) ή το παράγωγό της με γενετική μηχανική για να εκφράσουν HLA-A * 0201 (938-Α2) χρησιμοποιήθηκαν ως στόχοι για πειράματα συγκαλλιέργειας. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2C, τα λεμφοκύτταρα που εκφράζουν TCR-5, -9 και -11 εκκρίνεται IFNg μόνο όταν καλλιεργούνται σε παρουσία κυττάρων 938-Α2. Αναγνώριση των 938-A2 ενδογενούς SSX2 ήταν ισχυρότερη σε TCR-5-μετάγονται λεμφοκύτταρα, όπως αποδεικνύεται από ένα 2-φορές υψηλότερη έκκριση ΙΡΝγ από τα κύτταρα αυτά σε σύγκριση με εκείνη των Τ κυττάρων που μεταδιεγείρονται με TCR-9 και -11 (Εικόνα 2C).

για να δοκιμαστεί η ικανότητα αυτών των TCRs να αναγνωρίσει την ενδογενή SSX2 που εκφράζεται από τα καρκινικά κύτταρα, καλλιεργήσαμε PBLs (μεταγωγή με TCR-5, -8, -9, -11) με κυτταρικές σειρές που προέρχονται από μελάνωμα (888, SKMEL-23, 624), γλοίωμα (U251), και του καρκίνου του μαστού (MCF-7). Όπως φαίνεται στο σχήμα 2D, TCR-5, -9 και -11 μεσολαβούμενη απελευθέρωση IFNg από μετασχηματισμένα λεμφοκύτταρα όταν καλλιεργούνται σε παρουσία του HLA-A * 0201-θετικά SSX2-θετικά καρκινικά κύτταρα από γλοίωμα και μελάνωμα. Της σημείωσης, ΤΟΡ-5 μεσολάβηση την ισχυρότερη αναγνώριση στόχων μεταξύ των διαφόρων τεστ TCRs. Με βάση αυτό, καθώς και για αποτελεσματική έκφραση του στα δύο CD8 και CD4 Τ κύτταρα, επιλέξαμε TCR-5 για περαιτέρω χαρακτηρισμό.

διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με τα άλλα μέλη της οικογένειας SSX και μη SSX πρωτεΐνες

Η οικογένεια SSX περιλαμβάνει 10 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που είναι πολύ ομόλογες μεταξύ τους. Συγκεκριμένα, ο επίτοπος του SSX2 στοχεύονται από ΤΟΚ-5 βρίσκεται σε μια από τις περιοχές ομολογίας μεταξύ των μελών της οικογένειας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η αλληλουχία αμινοξέων του SSX5 και SSX10 διαφέρουν από SSX2

41-49 σε ένα μόνο κατάλοιπο? SSX1, SSX3, SSX4, SSX8 και SSX9 διαφέρουν από SSX2

41-49 σε δύο αμινοξέα? και SSX6 και SSX7 διαφέρουν από SSX2

41-49 σε τρία αμινοξέα. Εκτός από SSX2, SSX3 και SSX5 είχαν προβλεφθεί να δεσμεύουν τα μόρια HLA-A2 με υψηλή συγγένεια. Πεπτίδια που προέρχονται από SSX4, SSX7, SSX9 και SSX10 είχαν προβλεφθεί να συνδέονται προς HLA-A2 με χαμηλότερη συγγένεια. Δραστικότητα του TCR-5 έναντι καθενός από αυτά τα πεπτίδια δοκιμάστηκε σε πειράματα συγκαλλιέργειας, χρησιμοποιώντας ανθρώπινα λεμφοκύτταρα που εκφράζουν TCR-5 ως τελεστές και εμφυτευμένα πεπτίδια Τ2 κύτταρα ως στόχους, και έκκριση ΙΡΝγ αξιολογήθηκε ως ένας δείκτης της αναγνώρισης αντιγόνου. Ενώ TCR-5 κύτταρα που εκφράζουν εκκρίνεται IFNg κατά την έκθεση σε SSX2

41-49 σε χαμηλή συγκέντρωση του πεπτιδίου (& gt? 0,01 ng /mL), αντέδρασαν σε SSX3-, SSX4-, SSX5-, SSX9- και SSX10- πεπτίδια προερχόμενα μόνο όταν εκτίθενται σε υψηλές συγκεντρώσεις πεπτιδίου (πάνω από 10 ng πεπτιδίου /mL, το σχήμα 3 Α). Αυτή η διαφορά στην αντιδραστικότητα των τριών έως τέσσερις τάξεις μεγέθους δείχνει ότι TCR-5 είναι σχετικά ειδικός για SSX2

41-49, και προτείνει ότι η αναγνώριση των κυττάρων που εκφράζουν ομόλογα πεπτίδια που προέρχονται από άλλα γονίδια SSX μπορούν να είναι απίθανη.

Τ κυττάρων περιφερικού αίματος που εκφράζουν TCR-5 συνκαλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα με κύτταρα Τ2 παλλόμενα με προηγουμένως τις σειριακές αραιώσεις των υποδεικνυόμενων πεπτιδίων. Τα αποτελέσματα της συγκέντρωσης IFNg σε υπερκείμενα καλλιέργειας εκφράζονται ως μέσος όρος των εις διπλούν σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. ευθυγράμμιση αλληλουχίας των δοκιμαζόμενων πεπτιδίων δείχνεται στο υπόμνημα εικόνα για Α) SSX-οικογένεια γονιδίων και Β) γονίδια μη-SSX με επικαλυπτόμενες αλληλουχίες. IGSF22: ανοσοσφαιρίνης μέλος υπεροικογένειας 22, ARHGAP1: Rho ΟΤΡάσης-ενεργοποίηση πρωτεϊνών 1, GPR82: Πιθανή G-πρωτεΐνη υποδοχέα 82, PHF8: ιστονών λυσίνη διμεθυλάση PHF8, LIPM: λιπάση μέλος M, SYT14: synaptotagmin-14, TCOF1: πρωτεΐνη μελάσα, RBL2: ρετινοβλάστωμα-όπως πρωτεΐνη 2, Fras1: εξωκυττάρια μήτρα πρωτεΐνες Fras1. Πρόβλεψη της συγγένειας δέσμευσης σε HLA-A2 * 0201 δείχνεται για κάθε πεπτίδιο, εκφράζεται ως σταθερά διάστασης (Κ

D, ηΜ).

Η

Εννέα επιπλέον γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με αναζήτηση έκρηξη ως μερικώς ομόλογο με το SSX2

41-49 επιτόπου: IGSF22, ARHGAP1, GPR82, PHF8, LIPM, SYT14, TCOF1, RBL2 και Fras1. Τα επικαλυπτόμενα πεπτίδια σε δύο από αυτές τις πρωτεΐνες, IGSF22 και TCOF1, διέφεραν μόνο σε δύο υπολείμματα από το στοχευόμενο επίτοπο SSX2. Επιπλέον, πεπτίδια που προέρχονται από SYT14 και TCOF1 είχαν προβλεφθεί να είναι ισχυρή και ασθενή συνδετικά HLA-A2, αντίστοιχα (σχήμα 3Β). Αναλύσαμε την αναγνώριση αυτών των πεπτιδίων με εννεαμερές TCR-5 σε πειράματα συγκαλλιέργειας, χρησιμοποιώντας πεπτίδιο-παλμική Τ2 κύτταρα. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 3Β, η απελευθέρωση IFNg επάγεται από SSX2

41-49 πεπτιδίου Ήταν δύο έως τέσσερις τάξεις μεγέθους ανώτερη από εκείνη που προκαλείται από τα ομόλογα πεπτίδια, επιβεβαιώνοντας την ειδικότητα του TCR-5.

Η βελτιστοποίηση κωδικονίων και murinization του TCR-5

επόμενο αξιολογηθεί αν βελτιστοποίηση της χρήσης κωδικονίων στην αλληλουχία κωδικοποίησης του TCR-5 ή /και τη χρήση υβριδικών TCRs ανθρώπου-ποντικού θα μπορούσε να ενισχύσει ΤΟΚ-5 έκφρασης ή /και βιολογική δραστικότητα . cDNA που κωδικοποιεί για την ίδια αλληλουχία αμινοξέων όπως TCR-5, αλλά με μία αλληλουχία νουκλεοτιδίων βελτιστοποιημένη για χρήση κωδικονίων στον άνθρωπο συνετέθη και κλωνοποιήθηκε σε pMSGV1 για την παραγωγή ρετροϊικών φορέων. Παρομοίως, ένα κωδικόνιο-βελτιστοποιημένη εκδοχή του TCR-5 στο οποίο οι σταθερές περιοχές TCR αντικαταστάθηκαν με τη σταθερή περιοχή ενός TCR ποντικού [23] συντέθηκε και κλωνοποιήθηκε σε pMSGV1. Οι τρεις εκδοχές της TCR-5 (WT, βελτιστοποιημένου κωδικονίου και βελτιστοποιημένων κωδικονίων + σταθερή περιοχή ποντικού, σχήμα 4Α) ήταν δίπλα σύγκριση στην έκφραση και την ικανότητα να αναγνωρίζουν το αντιγόνο και διαμεσολαβούν κυτταρική λύση τους.

Α) Σχηματική αναπαράσταση από τα τρία κατασκευάσματα που δημιουργούνται για την έκφραση του TCR-5 και παράγωγα. LTR: μακριά τερματική επανάληψη, sd: δότη ματίσματος, sa: αποδέκτη ματίσματος, ψ: σήμα εγκαψιδίωσης ρετροϊό, MC: σταθερή περιοχή ποντίκι TCR, 2Α: συνδετικού πεπτιδίου. Β) Ανάλυση της έκφρασης του TCR-5 παραλλαγές με χρώση τετραμερούς. ΟΚΤ3-διεγερμένα λεμφοκύτταρα μετάγονται δύο φορές με το αντίστοιχο διάνυσμα TCR που εκφράζουν και χρωματίστηκαν με αντι-CD3, αντι-CD8 και SSX2

41-49 τετραμερή μία εβδομάδα μετά την μεταγωγή. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι τιμές στις παρενθέσεις αντιπροσωπεύουν την μέση ένταση φθορισμού της χρώσης τετραμερούς εντός του πληθυσμού CD8 Τ κυττάρων. C)

δοκιμασία 51Cr-απελευθέρωσης για την αξιολόγηση των ειδικών για το αντιγόνο κυτταρόλυση που προκαλείται από ΤΟΚ-5-μετάγονται λεμφοκύτταρα μετά από τέσσερις ώρες συγκαλλιέργειας με τις υποδεικνυόμενες κύτταρα-στόχους. Ποσοστό λύσης που απεικονίζεται για κάθε κυτταρική σειρά στόχου σε διαφορετικές αναλογίες τελεστή: στόχος είναι ο μέσος όρος των εις διπλούν σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. UT: μη μεταδιηγερμένα Τ κύτταρα που χρησιμοποιούνται ως αρνητικός μάρτυρας της μη ειδικής λύσης, WT: Άγρια τύπου TCR, Co Op: copon βελτιστοποιημένη TCR, MCR:. Βελτιστοποιημένων κωδικονίων TCR με σταθερή περιοχή ποντίκι

Η

Μετά την ρετροϊική μεταγωγή του ΟΚΤ3 διεγερμένα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, χρώση τετραμερούς χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η έκφραση των τριών κατασκευασμάτων. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4 Β, κωδικόνιο βελτιστοποίηση αύξησε την πυκνότητα της έκφρασης μεμβράνης του TCR σε CD8 Τ κυττάρων όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη μέση ένταση φθορισμού (MFI) του SSX2

41-49 χρώση τετραμερούς σε κύτταρα που μετατρέπονται με το κωδικόνιο βελτιστοποιημένο TCR-5 (910 μονάδες φθορισμού), σε σύγκριση με εκείνους σε μεταγωγή με την έκδοση άγριου τύπου (656 μονάδες φθορισμού). Ωστόσο, η χρήση μιας σταθερής περιοχής ποντικού εκτός της βελτιστοποίησης κωδικονίων μόνο ελάχιστα αύξησε την σύνδεση κατά του TCR (949 μονάδες φθορισμού) τετραμερές. Η βιολογική δράση του ΤΟΡ δοκιμάστηκε σε πειράματα συγκαλλιέργειας όπου οι TCR-μεταδιηγερμένα λεμφοκύτταρα εκτέθηκαν σε * 0201-θετικά κύτταρα στόχους πολλαπλών HLA-Α που ήταν θετικοί για SSX2 (COS-A2-SSX2, 293-Α2-SSX2, K562- Α2, 624, 938-Α2 και U251). Η συγκέντρωση των IFNg στα υπερκείμενα μετρήθηκε με ELISA μετά από ολονύκτια συγκαλλιέργεια και τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα 2. Τα λεμφοκύτταρα μεταγόμενα με το κωδικόνιο βελτιστοποιημένη εκδοχή του TCR-5 εκκρίνεται, κατά μέσο όρο, 30% περισσότερο από ό, τι εκείνοι IFNg με μεταγωγή με τον άγριου τύπου TCR. Η παρουσία ενός ποντικού TCR σταθερή περιοχή αυξήθηκε επίσης έκκριση ΙΡΝγ σε σύγκριση με τον άγριου-τύπου TCR, αλλά αυτή η τροποποίηση δεν αύξησε την έκκριση IFNg της παραλλαγής βελτιστοποιημένων κωδικονίων (πίνακας 2). Τα τρία κατασκευάσματα εμφανίζονται παρόμοιες ιδιότητες όσον αφορά την επαγωγή των ειδικών για το αντιγόνο πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων σε προσδιορισμούς πρόσληψης θυμιδίνης (εικόνα S1A), την ενεργοποίηση των κυττάρων Τ μετά την αναγνώριση του αντιγόνου (αποδεικνύεται από τα άνω ρύθμιση του δείκτη ενεργοποίησης CD137, σχήμα S1B) και ιντερλευκίνη -2 (IL-2) παραγωγή (εικόνα S1c).

Η

Διέγερση κυτταρική λύση των κυττάρων του όγκου που εκφράζουν SSX2

Η ικανότητα της κάθε παραλλαγής της TCR-5 να επάγει αντιγόνου ειδική λύση των κυττάρων στόχων όγκου με ανθρώπινα λεμφοκύτταρα προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία απελευθέρωσης χρωμίου. Χρώμιο (

51Cr) -σημασμένου 938, 938-Α2, Cos-A2, Cos-Α2-SSX2, 624, SKmel37 και 888 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με ανθρώπινα κύτταρα Τ περιφερικού αίματος σε μεταγωγή του άγριου τύπου TCR-5 ή κωδικόνιο του βελτιστοποιημένη ή βελτιστοποιημένων κωδικονίων murinized παραλλαγές, σε διαφορετικές αναλογίες τελεστή: στόχου. Μη μεταδιηγερμένα Τ κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 4 C, τα λεμφοκύτταρα μεταγόμενα με οποιοδήποτε από τα SSX2

41-49-ειδική TCRs που προκαλείται ισχυρή κυτταρολυτικό αποτέλεσμα επί 938-A2 κύτταρα αλλά όχι σε 938 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η λύση είναι HLA-A * 0201-περιορισμένο. Επιπλέον, τα κύτταρα Cos-Α2-SSX2 λύθηκαν με TCR-5 κύτταρα που εκφράζουν, αλλά όχι Cos-Α2, οι οποίες δεν έχουν έκφραση SSX2, υποδεικνύοντας ότι η επίδραση αυτή είναι αντιγόνου-ειδική. Παρομοίως, 624 και SKmel37 κύτταρα, τα οποία είναι HLA-A * 0201 θετικό και φυσικά ρητή SSX2, λύθηκαν με λεμφοκύτταρα μεταγωγή με είτε TCR-5 παραλλαγή, ενώ * 0201-αρνητικά 888 κύτταρα HLA-A δεν ήταν. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι TCR-5-προερχόμενα κατασκευάσματα είναι βιολογικά δραστικές σε ανθρώπινα Τ κύτταρα περιφερικού αίματος, και ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να ανακατευθύνουν ειδικότητα αντιγόνου τους να SSX2, σε ένα HLA-A * 0201-ειδικό τρόπο. Ούτε η βελτιστοποίηση κωδικονίων ή murinization του ΤΟΡ είχε επίδραση στην ΤΟΡ-5-μεσολάβηση λύσης.

Ανάπτυξη και δοκιμή των κλινικών βαθμού υπερκείμενα φορέα ρετροϊού

Λόγω του όγκου-εκλεκτική μοτίβο έκφρασης των SSX2 , και οι ισχυροί ακόμη επιλεκτικές ιδιότητες αναγνώρισης αντιγόνου του TCR-5, αποφασίσαμε να παράγουν και να ελέγχουν κλινικού βαθμού ρετροϊικοί φορείς κατάλληλοι για την έκφραση της TCR-5 σε Τ κύτταρα περιφερικού αίματος ασθενών με καρκίνο. Σταθερές γραμμές συσκευασίας καθιερώθηκαν με μεταγωγή των κυττάρων PG13 με ρετροϊικό φορέα που κωδικοποιεί το κωδικόνιο βελτιστοποιημένη εκδοχή του TCR-5. Μετά από δύο μεταγωγές, τα κύτταρα PG13 κλωνοποιήθηκαν με περιοριστική αραίωση και οι κλώνοι εξετάστηκαν για έκφραση ιικού RNA χρησιμοποιώντας dot-plot (δεν φαίνεται). Οι έξι κλώνοι που εκφράζουν τα υψηλότερα επίπεδα του φορέα RNA (Α8, Α10, C3, D8, F2 και Η2) ενισχύθηκαν και τα υπερκείμενα ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητά τους να επάγουν έκφραση TCR σε ΟΚΤ3-διεγερμένα ΡΒί από τρεις διαφορετικούς δότες. τετραμερή χρώση των μετατραπέντων κυττάρων Τ αποκάλυψε ότι υπερκείμενα των έξι κλώνους μεσολάβηση αποδοτική μεταγωγή των λεμφοκυττάρων (Σχήμα 5 Α).