Abstract

μεθυλίωση του DNA είναι ένα επιγενετικό φαινόμενο που είναι γνωστό ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του ανθρώπου. Ένζυμο που είναι υπεύθυνο για τη διαδικασία αυτή είναι DNA μεθυλοτρανσφεράση 1 (DNMT1) που διατηρεί ένα αλλαγμένο πρότυπο μεθυλίωσης από την αντιγραφή από το γονέα στο σκέλη κόρη του DNA μετά την αντιγραφή. Η ανώμαλη μεθυλίωση των περιοχών προαγωγού των γονιδίων κρίσιμων για φυσιολογικές κυτταρικές λειτουργίες είναι δυνητικά αναστρέψιμη. Ως εκ τούτου, η απενεργοποίηση του DNMT1 φαίνεται να είναι ένα πολύτιμο στόχο για την ανάπτυξη θεραπειών καρκίνου. Επί του παρόντος, οι πιο δημοφιλείς αναστολείς DNMT (DNMTi) είναι αναλόγων κυτιδίνης σαν 5-αζακυτιδίνη, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (δεκιταβίνη) και πυριμιδιν-2-όνη ριβονουκλεοσίδια (Zebularine). Σε καρκίνο του παχέος εντέρου, επιγενετικές τροποποιήσεις διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο σε κάθε βήμα της καρκινογένεσης. Ως εκ τούτου, έχουμε αντιμετωπίσει την υπόθεση ότι οι αναστολείς μεθυλτρανσφεράσης DNA μπορεί να ενισχύσει ανασταλτικά αποτελέσματα της κλασικής χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, όπως η οξαλιπλατίνη και 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), χρησιμοποιούνται συνήθως σε ορθοκολικό θεραπεία του καρκίνου. Εδώ, η έκθεσή μας δείχνει ότι DNMTi μπορεί να έχει θετικές αλληλεπιδράσεις με το πρότυπο χημειοθεραπευτικά στην παχέος θεραπεία του καρκίνου. Χρησιμοποιώντας φαρμακολογικά μοντέλα για την ανάλυση της αλληλεπίδρασης φαρμάκου-φαρμάκου, έχουμε αποκαλύψει ότι ο συνδυασμός της δεκιταβίνη με 5-FU ή οξαλιπλατίνη εμφανίζει την πιο ελκυστική αλληλεπίδραση (συνεργισμός), ενώ η επίδραση της Zebularine σε συνδυασμούς με χημειοθεραπευτικά είναι μέτρια και μπορεί να εξαρτάται από γενετικό /επιγενετικές φόντο μιας κυτταρικής γραμμής ή δευτερεύουσα ουσία που χρησιμοποιείται σε συνδυασμό. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι DNMTi χορηγείται σε συνδυασμό με το πρότυπο χημειοθεραπευτικά θα μπορούσε να βελτιώσει τη θεραπεία των ασθενών με ορθοκολικό καρκίνους

Παράθεση:. Flis S, Gnyszka Α, Flis Κ (2014) Αναστολείς DNA μεθυλοτρανσφεράσης βελτιώσει την επίδραση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων σε SW48 και ΗΤ-29 Καρκίνος παχέος Cells. PLoS ONE 9 (3): e92305. doi: 10.1371 /journal.pone.0092305

Επιμέλεια: Κατερίνα Cinti, Ινστιτούτο Κλινικής Φυσιολογίας, c /o Toscana Ίδρυμα Επιστημών Ζωής, Ιταλία

Ελήφθη: 18, Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 20 Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 του Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Flis et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από καμία επιχορήγηση. N405 139.139 από το Εθνικό Επιστημονικό Κέντρο της Πολωνίας (https://www.ncn.gov.pl/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον πληθυσμό Απαγορεύεται το κάπνισμα σε όλο τον κόσμο. Εκτιμάται ότι πάνω από 600.000 άνθρωποι πεθαίνουν από αυτό σε παγκόσμιο επίπεδο κάθε χρόνο [1]. Αυτό σημαίνει ότι ο καρκίνος του παχέος είναι η κύρια αιτία του σχετίζονται με τον καρκίνο θανάτους. Δυστυχώς, CRC αναπτύσσεται για μεγάλο χρονικό διάστημα χωρίς συμπτώματα? Ως εκ τούτου, η ασθένεια αναγνωρίζεται σε προχωρημένα στάδια. Γενικά, ο κίνδυνος της CRC αυξάνει με την ηλικία και προκαλείται όχι μόνο από γενετικές μεταβολές που περιλαμβάνουν ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια, αλλά επίσης οδηγείται από επιγενετικές μεταβολές που περιλαμβάνουν μεταβολές στα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης, οι οποίες δεν εξαρτώνται από μεταβολές στην αλληλουχία του DNA. Ένα από τα γεγονότα επιγενετικών προκαλείται από μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs), τα οποία καταλύουν την ομοιοπολική προσθήκη της ομάδας μεθυλίου στη θέση 5 ‘της κυτοσίνης στο δινουκλεοτίδιο CpG από τον δότη

S

-adenosylmethionine. Μεθυλίωση της κυτοσίνης συμβαίνει σε περιοχές του γονιδιώματος που ονομάζεται νησίδες CpG και είναι γνωστό για να αλλάξει τη δομή της χρωματίνης που οδηγεί σε γονιδιακή αποσιώπηση. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος, παρατηρείται μια παγκόσμια απομεθυλίωση γονιδίωμα σε συνδυασμό με την επιλεκτική υπερμεθυλίωση καταστολείς όγκων, ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου και προαποπτωτικά γονίδια [2]. Επειδή επιγενετικές τροποποιήσεις είναι δυνητικά αναστρέψιμη, αποτελούν μια ενδιαφέρουσα θεραπευτική στρατηγική με τη χρήση των αναστολέων DNMT (DNMTi).

Decitabine και Zebularine DNMT αναστολείς, η οποία μπορεί δυνητικά να αντιστραφεί επιγενετικές αλλοιώσεις με αποτέλεσμα την επανενεργοποίηση της σιγήσει γονιδίων, μπλοκάροντας τον καρκίνο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και /ή επαγωγής απόπτωσης [3], [4]. Και οι δύο παράγοντες φαίνεται να είναι πολύ ενδιαφέρουσες και πολύτιμες για τη θεραπεία των συμπαγών όγκων. Decitabine, ένα ανάλογο κυτιδίνης, έχει εγκριθεί από τον Αμερικανικό Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) για τη θεραπεία αιματολογικών κακοηθειών [5], ενώ Zebularine σε σύγκριση με άλλα ανάλογα κυτιδίνης είναι σταθερότερο, λιγότερο τοξικά και μπορούν να χορηγούνται από το στόμα [6 ].

φαίνεται ότι είναι λογικό να χρησιμοποιούν πράκτορες απομεθυλιωτικής σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Είναι ενδιαφέρον, ενθαρρυντικά αποτελέσματα ελήφθησαν με συνδυασμό δεκιταβίνη και καρβοπλατίνη σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους [7]. Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι δεκιταβίνη συνδυάζει ασφάλεια με καρβοπλατίνη και ότι η αγωγή προκαλεί επιγενετικές μεταβολές. Σε μία άλλη μελέτη φάσης Ι, ένας συνδυασμός σισπλατίνης με δεκιταβίνη οδήγησε σε μία μερική απόκριση σε ασθενή με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και δύο δευτερεύουσες αντιδράσεις: μία ασθενής με καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου και το άλλο στην ασθενή με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [8]. Ωστόσο, παρά τις γραμμές ενδείξεις ότι απομεθυλιώνοντας πράκτορες θα μπορούσαν να βελτιώσουν αντικαρκινική δράση των κλασικών χημειοθεραπευτικών παραγόντων, η γνώση για τη χρήση τους για συμπαγείς όγκους εξακολουθεί να είναι ανεπαρκής και πρέπει να αξιολογηθούν περαιτέρω.

Ως εκ τούτου, για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, το μοντέλο επιβίωσης κυτταρική σειρά CRC επιλέχθηκε για τη μελέτη αυτών των αλληλεπιδράσεων. Με τη βοήθεια αυτού του μοντέλου και φαρμακολογική ανάλυση έχουμε σχεδιάσει τη μελέτη για να μάθετε το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης μεταξύ DNMT αναστολείς, Decitabine ή Zebularine, και κλασικά αντικαρκινικά χημειοθεραπευτικά που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της CRC, όπως η οξαλιπλατίνη, μια δια- και ενδο- DNA παράγοντα διασυνδέσεως, και 5-φθοριοουρακίλη, έναν αναστολέα θυμιδυλικής συνθάσης. Οι μελέτες των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των χημειοθεραπευτικών παραγόντων και παραγόντων DNMTi φαίνεται να είναι λογικό, διότι όλες αυτές οι ενώσεις έχουν ελεγχθεί για την κυτταροτοξική τους ιδιότητες έναντι των φυσιολογικών κυττάρων [5], [9], [10] και όλοι τους, εκτός από Zebularine έχουν εγκριθεί από το US FDA για ιατρική χρήση.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και φαρμακευτική θεραπεία

Ως μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων, το ΗΤ-29 και SW48 ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κύτταρο γραμμές, που λαμβάνονται από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), χρησιμοποιήθηκαν. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS, Gibco), 2 mM glutamax (Gibco), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 250 ng /ml amphoterycin (Gibco) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5%, CO

2. Τα κύτταρα επωάστηκαν με τα φάρμακα για 24, 48 και 72 ώρες, αλλά μόνο τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν μετά την αγωγή 72 ώρες παρουσιάζονται ως θετικός τους γίνονται πιο έντονες.

Drugs

Τα ακόλουθα φάρμακα μελετήθηκαν : 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), οξαλιπλατίνη, Zebularine και δεκιταβίνη (Sigma, St. Louis, ΜΙ, USA). Οι συγκεντρώσεις των φαρμάκων ήταν στην περιοχή μέχρι 100 μΜ. Ολοι οι παράγοντες διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο Hybri-Max (DMSO, Sigma) και στη συνέχεια αραιώνεται στα μέσα ενημέρωσης για πειράματα. Η τελική συγκέντρωση του DMSO, χωρίς να επηρεάζουν την επιβίωση των κυττάρων, διατηρήθηκε στο 0,2%. Σε όλα τα πειράματα, τα κύτταρα ελέγχου επωάστηκαν με DMSO.

ΜΤΤ δοκιμασία

Η δοκιμασία βασίζεται στην ικανότητα βιώσιμων κυττάρων να μειώσουν μεταβολικά ένα κίτρινο άλας τετραζολίου σε ένα πορφυρό προϊόν φορμαζάνης. Αυτή η αντίδραση απαιτεί την ενεργό μιτοχονδριακών ενζύμων αναγωγάσης.

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (1 χ 10

4 κύτταρα /200 μΙ /φρεάτιο). Μετά την επώαση με τα αντιδραστήρια, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΐ 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) διάλυμα -2,5-διφαινυλτετραζολίου (ΜΤΤ, Sigma) για 4 ώρες στους 37 ΝΤΟ. Στη συνέχεια, 150 μΐ διαλύματος διαλυτοποίησης (10% δωδεκυλ θειικό νάτριο, SDS) προστέθηκε και το μίγμα επωάστηκε στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Το διαλυτοποιημένο προϊόν φορμαζάνης φασματοφωτομετρικά ποσοτικά χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πλάκας μικροτίτλου, κυματική ενέργεια XS (Bio-Tek, Winooski, VT, USA), σε μήκος κύματος 570 nm.

Ανάλυση των αλληλεπιδράσεων φαρμάκων

Cells του SW48 και κυτταρικές σειρές ΗΤ-29 είχαν ταυτόχρονα επωάστηκαν για 72 ώρες με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και αναστολείς DNMT ή με κάθε παράγοντα μόνο. Η φύση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ φαρμάκων που μελετήθηκαν αναλύθηκε με την βοήθεια της izobologram [11] και ο συνδυασμός-δείκτης (CI) μεθόδους, που προέρχεται από την αρχή μέσου-αποτελέσματος του Chou και Talalay [12], [13]. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από τα πειράματα κυτταροτοξικότητας χρησιμοποιήθηκαν για τη μαθηματική και ποσοτική αξιολόγηση των αλληλεπιδράσεων φαρμάκων.

Isoboles ορίστηκαν από τις επιδράσεις των φαρμάκων σε συνδυασμό μελετήθηκαν. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τη μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση ενός δεύτερου (IC

50) είτε φαρμάκου εντός του ζεύγους αποτέλεσε τη βάση για τη γραμμή προσθετικότητα? συνεργισμού ή ανταγωνισμού ήταν παρούσα, όταν το ίδιο αποτέλεσμα ελήφθη με τον συνδυασμό των φαρμάκων σε χαμηλότερες ή υψηλότερες δόσεις, αντίστοιχα.

Ένα εμπορικό πακέτο λογισμικού, CalcuSyn ver. 2.0 (Biosoft, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο), χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση μέσου-αποτελέσματος. Υπολογίσαμε τις τιμές CI με βάση τον τύπο: CI = (D)

1 /(D

x)

1 + (Δ)

2 /(D

x)

2 για αμοιβαία αποκλειόμενα φάρμακα. Στον παρονομαστή, το (D

x) είναι για το D

1 «μόνο» που αναστέλλει ένα σύστημα

x

%, και (D

x)

2 είναι για το D

2 «μόνο» που αναστέλλει ένα σύστημα

x

%. Στα αριθμητές, (D)

1 + (Δ)

2 «σε συνδυασμό» επίσης αναστέλλουν

x

%. Τιμές CI παρήχθησαν σε διάφορα επίπεδα αποτελέσματος (Fa, το κλάσμα που επηρεάζεται από D, δηλαδή ποσοστό αναστολής /100), από 0,05 να 0,95 (kill 5-95% των κυττάρων). Συνέργεια υποδεικνύεται από τις τιμές CI & lt? 1, προσθετικότητα από τις αξίες CI = 1 και ο ανταγωνισμός από τις αξίες CI & gt?. 1

κυτταρομετρία ροής

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου τα κύτταρα (~ 1 × 10

6) εναιωρήθηκαν σε 4 ml 80% αιθανόλης (-20 ° C) και επωάζεται στους -20 ° C για 24 ώρες, πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και χρωματίστηκαν με 50 μg /ml ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και 100 μg /ml RNase σε διάλυμα PBST 0,1% (PBS συμπληρωμένο με 0,1% Triton Χ-100) για 30 λεπτά στο σκοτάδι στους 4 ° C. Τα δείγματα μετρήθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα BD FACSCalibure κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Τα ιστογράμματα DNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ModFit (BD Biosciences).

Η απόπτωση των κυττάρων μετρήθηκε, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC kit (BD Biosciences). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από αγωγή, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και φυγοκεντρήθηκαν. Το κυτταρικό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό σύνδεσης παγωμένου. Οι αννεξίνη V-FITC και ΡΙ διαλύματα προστέθηκαν στο κυτταρικό εναιώρημα και αναμιγνύεται ήπια. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν για 15 λεπτά στο σκοτάδι πριν από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής.

Για τη χρώση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 1.5% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και διαπερατά με ψυχρή μεθανόλη για 20 λεπτά στους 4 ° C. Μετά την πλύση, τα κύτταρα επωάστηκαν με την επιθυμία πρωτογενές αντίσωμα (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA) έναντι φωσφο-ATR [(Ρ) -Ser428, Cat. Νο 2853] και φωσφο-ATM [(Ρ) -Ser1981, Cat. Νο 5883] σε 1: 100 αραίωση σε 0.5% BSA /PBS για 1 ώρα σε RT. Μετά την πλύση με PBS, κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με FITC (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ΤΧ, USA) προστέθηκαν σε αραίωση 1: 500 σε 0,5% BSA /PBS και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Για όλες τις εφαρμογές 10.000 συμβάματα ανά δείγμα αναλύθηκαν με ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS).

ημι-ποσοτική RT-PCR

Τα επίπεδα mRNA του

CCNE1

,

ATM

και

GAPDH

αναλύθηκαν με RT-PCR χρησιμοποιώντας ολικό RNA από ΗΤ-29 και τα κύτταρα SW48 απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το GenElute ™ θηλαστικών Ολικό RNA Miniprep Kit (Sigma), όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Εκατό ng του ολικού RNA χρησιμοποιήθηκαν στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής με Omniscript ανάστροφης μεταγραφάσης (Qiagen, Hilden, Germany) και ολιγο (dT)

18 εκκινητή (Fermentas, Βίλνιους, Λιθουανία). Οι ενισχύσεις PCR διεξήχθησαν σε ένα 50 μΙ συνολικού όγκου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 3 μΙ cDNA ως μήτρα και τα ζεύγη ακόλουθους εκκινητές:

CCNE1

(5′-AACTCAACGTGCAAGCCTCG-3 ‘, 5′-CATCTCCTGAACAAGCTCCA-3’),

ATM

(5′-GCCTTGAGTCTGTGTATTCG-3 ‘, 5′-CCACTCAGAGACTCCACAGC-3’) και

GAPDH

(5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3 ‘, 5′-TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3’). Η

GAPDH

επίπεδα mRNA χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι. Τα ενισχυμένα θραύσματα διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2%, χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφήθηκε κάτω από υπεριώδες φως.

Παρασκευή προϊόντων λύσης πρωτεΐνης και κηλίδωση Western

Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα PBS και στη συνέχεια πρωτεΐνες από πέντε κυτταρικά διαμερίσματα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας την υποκυτταρική Protein και κλασμάτωση Kit για καλλιεργημένα κύτταρα (Pierce, Rockford, IL, USA). Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στα δείγματα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας BCA κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών (Pierce). Δείγματα που περιέχουν 60 μα πρωτεΐνης μετουσιώθηκαν και κλασματώθηκε κατά 7, 12 ή 15% SDS-PAGE. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και διερευνήθηκαν με αντι-ανθρώπινα αντισώματα ειδικά για: κυκλίνη Α1 και D1, PARP, κασπάσης-3 και -8 (Santa Cruz Biotechnology)? (Κατ. Νο 610982, BD Biosciences) p21 (. Cat Νο 554228), p53 (. Cat Νο 610183), Bax? β-ακτίνης (. Cat Νο A1978, Sigma)? και η βλάβη του DNA αντισωμάτων Sampler Kit (φωσφο-Chk1 [(Ρ) -Ser296], φωσφο-Chk2 [(Ρ) -Thr68], φωσφο-ιστόνης H2A.X [γH2A.X, (Ρ) -Ser139], φωσφο- p53 [(Ρ) -Ser15], και φωσφο-BRCA1 [(Ρ) -Ser1524]?. Cat Νο 9947? Cell Signaling Technology). Όλα τα αντισώματα στο Βλάβη DNA αντισωμάτων Sampler Kit αναγνωρίζουν τους στόχους των πρωτεϊνών τους μόνο όταν τροποποιηθεί στις ενδεικνυόμενες περιοχές. Ως εκ τούτου, τα αντισώματα έναντι μη τροποποιημένων πρωτεϊνών δεν χρησιμοποιήθηκαν.

Αντι-Βαχ αντίσωμα αναγνωρίζει ανθρώπινη μορφή Bax-α. Μια εναλλακτική συρραφή του Bax pre-mRNA παράγει το έντυπο αναπόσπαστο μεμβράνη Bax-α και οι δύο μορφές κυτοσολικές β και γ. Το αντίσωμα αυτό συνιστάται από BD εταιρεία για την ανίχνευση της απόπτωσης. αντίσωμα αντι-p53 αναγνωρίζει την τερματική περιοχή C της πρωτεΐνης (το 195-393 Α.Α. χρησιμοποιήθηκε ως ένα αντιγόνο) και είναι σε θέση να αναγνωρίζουν τόσο την άγριου τύπου και τις μορφές R273H του ρ53. Αυτό το αντίσωμα συνιστάται επίσης από BD εταιρεία για την ανίχνευση της απόπτωσης.

Το σήμα επί κηλίδων ανιχνεύθηκε με μία χρωματομετρική μέθοδο με τη χρήση του CN /DAB Substrate Kit (Pierce) και SignalBoost ανοσοαντίδραση Enhancer Kit (Calbiochem, San Diego, CA, USA).

μεμβράνης μιτοχονδριακού δυναμικό (ΔΨ

m)

μέτρησης

Ο Δ

Ψ

m

μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας 10 mg /ml 5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolo- ιωδιούχο καρβοκυανίνη (JC-1 βαφή, Sigma), το οποίο χρωματίζει τα μιτοχόνδρια σε ζωντανά κύτταρα. Σε υγιή κύτταρα, η χρωστική συσσωρεύεται στα μιτοχόνδρια, σχηματίζοντας συσσωματώματα που εκπέμπουν κόκκινο φθορισμό, ενώ σε αποπτωτικά κύτταρα η βαφή παραμένει σε μονομερή μορφή στην κυτταρόπλασμα και εκπέμπει πράσινο φθορισμό. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με χημειοθεραπευτικά, αναστολείς DNMT ή συνδυασμούς τους για 72 ώρες και χρωματίστηκαν όπως περιγράφεται από Mahyar-Roemer

et al.

[14] και στη συνέχεια εξετάστηκαν με FACSCalibure κυτταρόμετρο ροής. Τα μιτοχόνδρια περιέχουν κόκκινο αδρανών JC-1 στα υγιή κύτταρα ήταν ανιχνεύσιμα στο κανάλι FL2, ενώ το πράσινο JC-1 μονομερή σε αποπτωτικά κύτταρα ήταν ανιχνεύσιμα στο κανάλι FL1.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος τιμές ± SD. Οι στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν με t-test ή μονόδρομη ανάλυση του Student διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από Tukey

post hoc

δοκιμή. Σημασία είχε αναλάβει στο

P

& lt? 0.05 (σημειώνονται με αστερίσκους στις γραφικές παραστάσεις).

Αποτελέσματα

μελέτες ανάπτυξης και τις επιπτώσεις του συνδυασμού θεραπειών χημειοθεραπευτικών παραγόντων με DNMTi

Ως πρώτο βήμα, εξετάσαμε την επίδραση της οι παράγοντες εφαρμόζονται μόνες επί SW48 και η κυτταρική βιωσιμότητα ΗΤ-29. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 έως 100 μΜ των αξιολογούμενων παραγόντων. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης βιωσιμότητας ΜΤΤ κυττάρων έδειξε ότι τα κύτταρα επωάζονται με CRC οξαλιπλατίνη και 5-FU έδειξε την πιο ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων μετά από επώαση 72 h ώρα (Σχήμα 1). Τα ανασταλτικά αποτελέσματα των χημειοθεραπευτικών ήταν δοσοεξαρτώμενη και οι συντελεστές συσχέτισης (που εκτιμάται από τις καμπύλες ανασταλτική δόση-απόκριση) ήταν πάνω από 0,9. Απομεθυλιώνοντας παράγοντες, Decitabine και Zebularine, έχουν δείξει διαφορετικούς τρόπους αναστολής:. Decitabine ήταν ήδη ανασταλτική στην εναρκτήρια συγκέντρωση (20 μΜ) και Zebularine έδειξε ανασταλτική ισχύ από 80 και 40 μΜ για SW48 και τα κύτταρα HT-29, αντίστοιχα

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μεμονωμένα ή σε συνδυασμούς με τις παραπεμφθεί δόσεις των παραγόντων για 72? 5-FU, 5-φθοριοουρακίλη? ΕΑΒ, Decitabine? και Zeb, Zebularine. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει την μέση ± SD (η = 5), αστερίσκοι υποδεικνύουν μια σημασία σε

P

& lt?. 0,05 για σύγκριση με οξαλιπλατίνη ή 5-FU μόνη της

Η

Δοκιμάσαμε επίσης η αντιμετώπιση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων σε συνδυασμό με DNMTi επί CRC κύτταρα επιβίωση (Σχήμα 1). Decitabine ενισχύεται τα ανασταλτικά αποτελέσματα της οξαλιπλατίνης σε συγκέντρωση από 20 μΜ έως 100 μΜ, ενώ επιπτώσεις της στην δραστικότητα 5-FU ξεκινά στις 80 μΜ. Zebularine δοκιμάζονται σε συγκεντρώσεις μέχρι 100 μΜ ελαφρώς ενίσχυσε τα ανασταλτικά αποτελέσματα είτε χημειοθεραπευτικών (Εικόνα 1).

Ο τύπος των αλληλεπιδράσεων φαρμάκων από δύο αξιολογήθηκαν ένωσης ομάδων αναλύθηκαν με τη βοήθεια των isobolographic και διάμεσου μεθόδους αποτέλεσμα. Τα ισοβολογράμματα δείχνουν αποτελέσματα για το επίπεδο του 50% και μόνο επίδραση και δείχνουν ότι η αλληλεπίδραση του δεκιταβίνη με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες οδηγεί σε συνεργική δράση, ενώ η χορήγηση του Zebularine με οξαλιπλατίνη ή 5-FU οδηγεί σε συνεργιστική ή ελαφρώς προσθετικά αποτελέσματα (Σχήμα 2Α).

Ένα. Ισοβολογράμματα σε ένα επίπεδο επίδραση 50%. Οι συγκεντρώσεις των συγκεκριμένων φαρμάκων που αναγράφεται στο Χ και Υ άξονα. Τα ισοβολογράμματα κατασκευάστηκαν με σύνδεση του IC

50 τιμές των παραγόντων απομεθυλίωσης (στην τεταγμένη) με την IC

50 της οξαλιπλατίνης ή 5-FU σημειώνεται επί των τετμημένων. Οταν οι δόσεις των δύο παραγόντων σε συνδυασμό είναι χαμηλότερες ή υψηλότερες από τις δόσεις προσθέτου, η συνέργια ή ανταγωνισμός είναι παρούσα, αντίστοιχα. Οι τιμές του δείκτη Β Συνδυασμός (CI) με διάστημα εμπιστοσύνης 95% σε όλα τα επίπεδα αποτέλεσμα όπως υπολογίζεται από το λογισμικό CalcuSyn. Μία τιμή CI σημαντικά μικρότερη από 1 υποδεικνύει συνέργεια, μια τιμή CI ελάχιστα διαφέρουν από το 1 υποδηλώνει Επιπλέον, και ένα CI σημαντικά υψηλότερη από 1 υποδεικνύει ανταγωνισμό.

Η

Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της μεθόδου του μέσου αποτελέσματος επιβεβαίωσε ότι η συνδυασμός δεκιταβίνη και χημειοθεραπευτικών παραγόντων σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές που παράγονται συνεργιστικά αποτελέσματα σε 50% επίπεδο θανάτωσης κυττάρου (Fa = 0,5), επιτυγχάνοντας CI (δείκτη συνδυασμού) τιμές & lt? 0.9 (Σχήμα 2Β).

Συνδυασμός Zebularine και χημειοθεραπευτικά Fa = 0,5 αναφέρεται ελαφρά συνεργιστική ή αθροιστική δράση.

Ανάλυση της βλάβης του DNA

Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός της απόπτωσης , αναλύσαμε την κατάσταση φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών μείζονος σημείων ελέγχου σηματοδότησης σε απόκριση σε βλάβη του DNA.

Κατά την ανίχνευση της βλάβης του DNA, σειρά κυτταρικών γεγονότων σηματοδότησης σχεδιασμένα για να διατηρούν την ακεραιότητα και την καλή λειτουργία των κυττάρων και βιολογικών οδών είναι εμπλεγμένος. Οι πρωτεΐνες που επιλέγονται για έλεγχο με κηλίδωση Western ξεκινήσει καταρράκτες των γεγονότων που εμποδίζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, είτε να δοθεί χρόνος για την επιδιόρθωση κατεστραμμένων DNA ή ενεργοποιούν μονοπάτια κυτταρικού θανάτου, εάν έχει πραγματοποιηθεί πολύ μεγάλη ζημιά. Φωσφορυλιωμένη ιστόνη H2A.X εντοπίζεται στους χώρους της βλάβης του DNA και ενεργοποιεί τις κινάσες ATM /ATR, τα κεντρικά μεσολαβητές της απάντησης βλάβη του DNA. Με τη σειρά του, ATM /ATR κινάσες κίνηση καταρράκτες, τα οποία αναστέλλουν την πρόοδο στη μίτωση μέσω της ενεργοποίησης των κινασών Chk (Chk1 για ATR και Chk2 για ATM) ή ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη p53, οδηγώντας είτε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου και επιδιόρθωσης του DNA ή απόπτωση μέσω ρύθμισης του p53 κατάντη δράστες. BRCA1, ως θεματοφύλακας της γονιδιωματικής σταθερότητας, είναι επίσης φωσφορυλιώνεται από ΑΤΜ, ATR, και Chk2 σε απόκριση σε βλάβη του DNA και μπορούν να συν-εντοπίζεται με άλλες πρωτεΐνες σε θέσεις βλάβης του DNA [15].

παρατηρήθηκε σημαντική φωσφορυλίωση της ιστόνης H2A.X στο Ser139 σε απόκριση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και οι συνδυασμοί τους με DNMTi, ειδικά σε κύτταρα ΗΤ-29. Χαμηλότερα επίπεδα γH2A.X (φωσφο-H2A.X) παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με μόνο παράγοντες DNMTi. Παρατηρήσαμε επίσης αυξημένα επίπεδα φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών ως ATR σε Ser428, σε ΑΤΜ Ser1981, ρ53 στο Ser15, BRCA1 εις Ser1524 καθώς κινάσες Chk1 και Chk2 σε Ser345 και Thr68, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α και Β). κατάσταση φωσφορυλίωσης των κινασών Chk1 και Chk2 ήταν πιο έντονη σε ΗΤ-29 στη συνέχεια στα κύτταρα SW48. Σε κύτταρα SW48, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των Chk1 και Chk2 κινασών ήταν υψηλότερη μετά τη συνδυασμένη αγωγή με oxaliplain και δεκιταβίνη σε σύγκριση με την θεραπεία με τα δύο χημειοθεραπευτικά και DNMTi εφαρμόζονται απλά (Εικόνα 3Β).

A. Ποσοτικοποίηση των ATR και ΑΤΜ επίπεδο φωσφορυλίωσης μετά από 72 (ΝΧΙ) χρησιμοποιήθηκε. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται την μέση ± SD (η = 3). Σημαντική διαφορά σε

P

≤0.05 υποδεικνύεται με έναν αστερίσκο (*). B. Ανάλυση των επιπέδων φωσφορυλίωσης πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο κηλίδωσης Western. Η ανίχνευση του β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης γέλης. OXA, οξαλιπλατίνη? 5-FU, 5-φθοριοουρακίλη? ΕΑΒ, Decitabine? Zeb, Zebularine? au, αυθαίρετες μονάδες.

Η

Συνδυασμοί χημειοθεραπευτικών με DNMTi επηρεάσουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και επάγουν απόπτωση

Στην καλλιέργεια-μάρτυρα, το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου ήταν σταθερές, ενώ οι ενώσεις που δοκιμάστηκαν είχαν διάφορες επιπτώσεις στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Η θεραπεία με τα χημειοθεραπευτικά οδήγησε σε σταθερή αύξηση του αριθμού των κυττάρων στη φάση S σε βάρος της φάσης G1. Decitabine συνέλαβαν τον κυτταρικό κύκλο στην /M ή S φάση G2 στην SW48 και ΗΤ-29 κύτταρα, αντιστοίχως. Zebularine δεν ασκούσε στατιστικά σημαντικές αλλαγές στις δύο κυτταρικές σειρές, σε σύγκριση με τους ελέγχους.

Ο συνδυασμός της δεκιταβίνη με οξαλιπλατίνη ή 5-FU προκάλεσε μια διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην /G2 /M όριο φάσης S και στη η φάση S, αντίστοιχα, και στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4). Ο συνδυασμός της Zebularine με οξαλιπλατίνη αυξημένο ποσοστό των ΗΤ-29 κυττάρων σε S /G2 /M όριο φάσης, ενώ ο συνδυασμός των Zebularine με 5-FU αυξημένο ποσοστό αυτών των κυττάρων σε φάση S από 12% έως 36%, σε σύγκριση με έλεγχος. Στην περίπτωση των κυττάρων SW48, οι συνδυασμοί της Zebularine με χημειοθεραπευτικών προκάλεσε την σύλληψη των κυττάρων στο G2 /M φάση ή S (Σχήμα 4Α).

A. Αλλαγές στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου SW48 και ΗΤ-29 κυττάρων μετά από 72 ώρες θεραπείας με τα αξιολογήθηκαν παράγοντες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ModFit LT ™ (έκδοση 3.0). Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± Τ.Α. (N≥4). Σημαντική διαφορά σε

P

& lt? 0,05 υποδεικνύονται με αστερίσκο (*). B. Ανάλυση του

CCNE1

και

ATM

επίπεδα mRNA με μέθοδο ημι-ποσοτικής RT-PCR μετά από 72 ώρες επώαση κυττάρων CRC με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, DNMTi και οι συνδυασμοί τους σε συγκεντρώσεις, όπως υποδεικνύεται. Μ, δείκτης [bp]?

GAPDH

, μεταγραφή κωδικοποιεί αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής, ένα ιδιοσυστατικά εκφραζόμενο γονίδιο, χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. κηλίδωση ανάλυση Γ Western των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης γέλης. OXA, οξαλιπλατίνη? 5-FU, 5-φθοριοουρακίλη? ΕΑΒ, Decitabine? Zeb, Zebularine.

Η

Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε ότι ο συνδυασμός της δεκιταβίνη με οξαλιπλατίνη, σε σύγκριση με οξαλιπλατίνη μόνο, αυξημένο επίπεδο mRNA του

ATM

στις δύο κυτταρικές σειρές, καθώς και ως

CCNE1

στην κυτταρική σειρά SW48 (Σχήμα 4Β). Οι συνδυασμοί των παραγόντων απομεθυλίωση με 5-FU παρουσίασε μια παρόμοια τάση, αλλά σε χαμηλότερο επίπεδο από ό, τι τους συνδυασμούς με οξαλιπλατίνη. Η ανάλυση των πρωτεϊνών που είναι ειδικές για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι ο συνδυασμός της DNMTi με χημειοθεραπευτικά, σε σύγκριση με οξαλιπλατίνη /μόνη 5-FU, αύξησε το επίπεδο της κυκλίνης Α1 και πρωτεΐνη ρ53 και μείωσε το επίπεδο της κυκλίνης D1 (αλλά όχι στο SW48 κύτταρα) (Σχήμα 4C και 5Β). Ο συνδυασμός των Zebularine με χημειοθεραπευτικά αύξησε το επίπεδο της ρ21 στα κύτταρα SW48 (Σχήμα 4C).

Α. Ανίχνευση απόπτωσης με την αννεξίνη V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) /ιωδιούχο porpidium ανάλυση (PI). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ± Τ.Α. (N≥4). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει ότι η επαγωγή της απόπτωσης από τους αξιολογήθηκαν παράγοντες ήταν σημαντική σε σύγκριση με το συνδυασμό χημειοθεραπευτικών παραγόντων και αναστολέων DNMT

έναντι

χημειοθεραπευτικούς παράγοντες εφαρμόζεται μόνο του (

P

& lt? 0,05 ). κηλίδωση ανάλυση Β Western των προ-αποπτωτικών επίπεδα πρωτεΐνης. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης γέλης. Γ Αντιπροσωπευτικά cytograms κυτταρομετρίας ροής πειραμάτων που καταδεικνύουν αλλαγές στο Δ

Ψ

m

σε CRC κυτταρικές σειρές μετά από 72 ώρες επώασης με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, αναστολείς DNMT και οι συνδυασμοί τους. Τα κύτταρα βάφτηκαν με JC-1. Τα κύτταρα στο τεταρτημόριο R2 μετρήθηκαν ως κύτταρα στερούνται δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Ένας αστερίσκος (*) υποδηλώνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ των πειραματικών ομάδων και της ομάδας ελέγχου σε

P

& lt? 0,05. OXA, οξαλιπλατίνη? 5-FU, 5-φθοριοουρακίλη? ΕΑΒ, Decitabine? Zeb, Zebularine.

Η

Από την παρατεταμένη θεραπεία με χημειοθεραπευτικά ή DNMTi μπορεί να προκαλεί κυτταρικό θάνατο, νωρίς το αποπτωτικό δείκτη Έτσι αναλύθηκαν. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε αννεξίνη V, η οποία αναγνωρίζει φωσφατιδυλο σερίνη (PS). Κατά τη διάρκεια της διέγερσης απόπτωσης, ασυμμετρίας μεμβράνη χάνεται και μετατόπιση της PS από ενδοκυτταρικές σε εξωτερικούς φύλλο της μεμβράνης πλάσματος λαμβάνει χώρα. Όπως ήταν αναμενόμενο, η κατεργασία των κυττάρων CRC με οξαλιπλατίνη ή 5-FU μόνη επαγόμενη απόπτωση σε περίπου 30% των κυττάρων, ενώ συνδυασμοί των παραγόντων αξιολογούνται γενικά αύξησε τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων από -45% έως 60% (Σχήμα 5Α ) με την εξαίρεση των κυττάρων ΗΤ-29 επωάζεται με παράγοντες απομεθυλίωσης και οξαλιπλατίνη μαζί. Στην περίπτωση αυτή, η επαγωγή της απόπτωσης ήταν σε χαμηλότερο επίπεδο από ό, τι για άλλους συνδυασμούς, αλλά ακόμα στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με οξαλιπλατίνη εφαρμόζεται μόνη. Επιπλέον, η επαγωγή της απόπτωσης στα κύτταρα CRC με συνδυασμό χημειοθεραπευτικών παραγόντων με απομεθυλίωσης επιβεβαιώθηκε από τις αλλαγές στο επίπεδο της πρωτεΐνης προ-κασπάσης-3 και -8. Η πρωτεολυτική διάσπαση της πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) ενισχύθηκε μετά από επώαση των κυττάρων με χημειοθεραπευτικών παραγόντων και απομεθυλίωση (Σχήμα 5Β).

Οι αλλαγές στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ

m)

κατά τη διάρκεια πρώιμη απόπτωση τη διακοπή της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό Δ

Ψ

m

μπορεί να συμβούν ως αποτέλεσμα την ταχεία κατάρρευση της ηλεκτροχημικής κλίσης. Σε αυτή την εργασία, διερευνήσαμε την επίδραση της DNMTi, χημειοθεραπευτικών ή συνδυασμούς τους στο Δ

Ψ

m

με χρώση των κυττάρων με JC-1 βαφή. Η ανάλυση του cytograms έδειξε ότι τα κύτταρα ελέγχου που εκπέμπονται το κόκκινο φθορισμό λόγω της υψηλής Δ

Ψ

m

, ενώ τα κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με χημειοθεραπευτικά και παράγοντες DNMTi παρουσίασαν αυξημένη αποπόλωση της μεμβράνης, ανιχνεύεται με πράσινο φθορισμό, και το αποτέλεσμα διατηρήθηκε (οξαλιπλατίνη + DNMTi σε ΗΤ-29 κυτταρική γραμμή) ή ισχυρότερη όταν τα κύτταρα συν-επωάστηκαν με τις ενώσεις αυτές (Σχήμα 5C).

Συζήτηση

στη δεκαετία του ’90 έχει επιβεβαιωθεί ότι τα CRC αποτελέσματα όχι μόνο από συσσώρευση γενετικές μεταλλάξεις, αλλά και ως συνέπεια της επιγενετικές μεταβολές του κυτταρικού γονιδιώματος που μετατρέπει ένα φυσιολογικό αδενικό επιθήλιο σε αδενοκαρκίνωμα. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η πιο εκτεταμένα χαρακτηρίζεται από επιγενετικές μεταβολές σε CRCs είναι υπερμεθυλίωση προαγωγού γονιδίου, η οποία εμφανίζεται σε CpG νησίδες που είναι συχνά παρόντες στο 5 ‘περιοχή περίπου 60% των γονιδίων. Αυτό το φαινόμενο προκύπτει από την αυξημένη δράση του ενζύμου DNMT των οποίων η υπερέκφραση είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα σχεδόν όλων των μετασχηματισμένων κυττάρων [16]. Ένας αυξανόμενος αριθμός γονιδίων που εκφράζονται στο κόλον έχουν τώρα δειχθεί ότι υπερμεθυλιωμένο και σιγήσει σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Αυτά περιλαμβάνουν γονίδια που εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, την αγγειογένεση, την προσκόλληση, μετάσταση ή επιδιόρθωση του DNA [17]. Δεδομένου ότι επιγενετικές τροποποιήσεις είναι δυνητικά αναστρέψιμη, έχει προκύψει η ιδέα ότι η απασχόληση των αναστολέων DNMT μπορεί να βελτιώσει τη θεραπεία του ΚΕΣ, ιδίως δεδομένου ότι τα κλασικά χημειοθεραπευτικούς παράγοντες είναι περιορισμένης αποτελεσματικότητας στην παχέος θεραπεία του καρκίνου. Ως εκ τούτου, την ανάπτυξη ορισμένων νέων στρατηγικών για τη θεραπεία τέτοιων όγκων είναι μια πρόκληση στον τομέα της ογκολογίας [18]. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο έχουμε παρουσίασε τα αποτελέσματα των

in vitro

μελέτη σχετικά με τις αλληλεπιδράσεις του προτύπου κυτταροτοξικών φαρμάκων, 5-FU και οξαλιπλατίνη [19], με αναστολείς μεθυλτρανσφεράσης DNA (DNMTi) όπως Decitabine και Zebularine.

DNMTis έχουν αποκτήσει πρόσφατα πολλή προσοχή ως παράγοντες αναστολής της ανάπτυξης καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου ορθοκολικού καρκινώματος [20]. Ωστόσο, ο ρόλος του θεραπευτικού δυναμικού τους μπορεί να αξιολογηθεί κατάλληλα μόνο σε συνδυασμό με την κλασική παράγοντες που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία CRC, επειδή όλα τα νέα θεραπευτικά μέσα εισαχθεί ως πρόσθετο επιλογές. Από 5-φθοριοουρακίλη και οξαλιπλατίνη αποτελούν τη ραχοκοκαλιά της θεραπείας CRC [19], μελετήσαμε τις επιδράσεις στην CRC κύτταρα επιβίωση προσθέτοντας Decitabine ή Zebularine – οι αναστολείς μεθυλοτρανσφεράσης DNA – σε αυτά τα χημειοθεραπευτικά

Έχουμε επιβεβαιώσει κάτω από

in vitro

συνθήκες που οι μελέτησαν παράγοντες δίνονται μόνο είναι σε θέση να επάγουν την αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων με συγκρίσιμη σειρά ισχύος που υπολογίζεται με βάση το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων (Σχήμα 1). Επιπλέον, έχουμε βρει μια αυξημένη αναστολή της ανάπτυξης CRC κυττάρων μετά την επεξεργασία με τα αντικαρκινικά μέσα που εφαρμόζονται σε συνδυασμό (Σχήμα 1). Οι ισοβολογραμμάτων, κατασκευάστηκε με βάση του IC

50 αξίες, ανέφερε συνεργιστική ή πρόσθετο αλληλεπιδράσεις μεταξύ χημειοθεραπευτικών παραγόντων και DNMTi. Decitabine είχαν τις πιο ευνοϊκές αλληλεπιδράσεις (συνεργίας) σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά στις δύο κυτταρικές σειρές?