Αφηρημένο

REG4

, το οποίο κωδικοποιεί Καν IV πρωτεΐνη, είναι μέλος του ασβεστίου που εξαρτώνται από λεκτίνη υπερ και ισχυρός ενεργοποιητής του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα /Akt /ενεργοποιητή πρωτεΐνη-1 μονοπάτι σηματοδότησης. Αρκετές ανθρώπινων καρκίνων υπερεκφράζουν Reg IV, και η έκφραση Reg IV συνδέεται με εντερική διαφοροποίηση φαινότυπο. Ωστόσο, η ρύθμιση του

REG4

μεταγραφή παραμένει ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε αν CDX2 ρυθμίζει την έκφραση Καν IV στα κύτταρα του γαστρικού καρκίνου (GC). Έκφραση του Καν IV και CDX2 αναλύθηκε με κηλίδα Western και ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε 9 κυτταρικές σειρές GC και κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου 2. Η λειτουργία του 5′-πλευρική περιοχή του

REG4

γονίδιο χαρακτηρίστηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης. Σε 9 κυτταρικές σειρές GC, ενδογενείς Καν IV και της έκφρασης CDX2 ήταν καλά συσχετίζονται. Χρησιμοποιώντας ένα οιστρογόνο υποδοχέα ρυθμίζονται μορφή CDX2, ταχεία επαγωγή της έκφρασης Καν IV παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΗΤ-29. προσδιορισμούς γονιδίων αναφοράς αποκάλυψε ένα σημαντικό ρόλο στην μεταγραφή για στοιχεία στο 5′-πλευρική περιοχή του

REG4

γονίδιο δεσμευτικός συναίνεση CDX2 DNA. δοκιμασίες ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης έδειξαν ότι CDX2 συνδέεται άμεσα με την περιοχή 5′-πλευρικές του

REG4

. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η πρωτεΐνη CDX2 ρυθμίζει άμεσα την έκφραση Καν IV

Παράθεση:. Naito Υ, Oue Ν, Hinoi Τ, Sakamoto Ν, Sentani Κ, Ohdan H, et al. (2012) Καν IV είναι ένα άμεσο στόχο Εντερική μεταγραφικού παράγοντα CDX2 σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10.1371 /journal.pone.0047545

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 24, 2012? Αποδεκτές: 12 Σεπτεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 2 Νοεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Naito et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την έρευνα από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Επιστήμης, Αθλητισμού και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας, και, εν μέρει, από μια Grant-in-Aid για τον Τρίτο Περιεκτική 10-Year στρατηγική για τον έλεγχο του καρκίνου και Έρευνας για τον Καρκίνο από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας, και για το Εθνικό Ινστιτούτο Βιοϊατρικής Καινοτομίας (Πρόγραμμα για την προώθηση των θεμελιωδών Σπουδών στις Επιστήμες Υγείας). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Γαστρικό καρκίνο (GC) είναι μία από τις πιο κοινές ανθρώπινων καρκίνων στον κόσμο. Καρκίνος αναπτύσσεται ως αποτέλεσμα πολλαπλών γενετικών και επιγενετικών αλλαγών [1]. Έχουμε ήδη πραγματοποιηθεί σειριακή ανάλυση της έκφρασης γονιδίων (SAGE) των τεσσάρων πρωτογενών GCs και εντοπίστηκαν διάφορα γονίδια GC-ειδικά [2]. Από αυτά τα γονίδια,

αναγέννησης νησιδίων προερχόμενο μέλος της οικογένειας 4

(

REG4

, το οποίο κωδικοποιεί Reg IV πρωτεΐνη) είναι ένα υποψήφιο γονίδιο για έκφραση ειδική για τον καρκίνο [3].

REG4

είναι μέλος του

REG

οικογένεια γονιδίων, που ανήκει στην εξαρτώμενη από ασβέστιο λεκτίνη υπεροικογένεια.

REG4

ταυτοποιήθηκε αρχικά με ανάλυση αλληλουχίας υψηλής απόδοσης μιας μεγάλης φλεγμονώδους βιβλιοθήκη cDNA νόσο του εντέρου [4]. Reg IV είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) /Akt /ενεργοποιητή πρωτεΐνης-1 (ΑΡ-1) μονοπάτι σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου και αυξάνει την έκφραση του Bcl-2, Bcl-XL και survivin, τα οποία είναι πρωτεΐνες σχετίζονται με την αναστολή της απόπτωσης [5]. Ενίσχυση του

REG4

γονίδιο έχει αναφερθεί σε καρκίνο του παγκρέατος [6]. Reg IV έχει αναγνωριστεί ως ένα από τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα καρκίνου κίνηση [7]. Έχουμε ήδη εξετάσει την επίδραση της αναγκαστικής έκφρασης του Καν IV στο κελί GC γραμμή. Δείξαμε ότι Reg IV αναστέλλει 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) επαγόμενη απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης EGFR σε GC κύτταρα [8]. Σε αντίθεση, Reg IV-κύτταρα που υπερεκφράζουν δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές στον πολλαπλασιασμό και τη δραστηριότητα εισβολή σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα [8]. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι Καν IV πρωτεΐνη συμμετέχει σε γαστρική καρκινογένεση

GC μπορεί να υποδιαιρεθεί σε τέσσερις φαινότυποι σύμφωνα με βλεννίνης έκφραση:. Γαστρικό ή foveolar φαινότυπο? εντερικό φαινότυπο? εντερική και η γαστρική μικτό φαινότυπο? και ούτε γαστρικό ούτε εντερικό φαινότυπο [9]. Ξεχωριστά γενετικές αλλαγές φαίνεται να σχετίζονται με γαστρικό και εντερικό GC φαινότυπο [10]. Σε προηγούμενες παρατηρήσεις μας, Καν IV εκφράστηκε στο 30% των περιπτώσεων GC και συσχετίστηκε με εντερικό φαινότυπο [11]. Ένας αριθμός ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις του Καν IV έχουν αναφερθεί σε ανθρώπινους καρκίνους [11] – [20]. Σε γενικές γραμμές, αυτές οι αναλύσεις ανέφερε ότι Reg IV εκφράζεται σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος που εμφανίζουν εντερική φαινότυπο. Έχει αναφερθεί ότι η έκφραση Reg IV επάγεται από GLI1, το οποίο είναι ένας βασικός παράγοντας μεταγραφικά στην οδό Hedgehog σηματοδότησης [21], ή από αυξητικούς παράγοντες όπως EGF, αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού-α (ΤΟΡ-α), παράγοντα ανάπτυξης ηπατοκυττάρου (HGF), ή βασικό παράγοντα ανάπτυξης ινοβλάστης (bFGF) [22]. Ωστόσο, αυτά τα μόρια είναι απίθανο να ευθύνονται για τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Καν IV και του εντέρου διαφοροποίηση φαινότυπο.

Έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι η έκφραση του Καν IV συσχετίστηκε με την έκφραση CDX2 [11]. CDX2 είναι μια εντερική παράγοντας μεταγραφής θηλαστικών ουραίο σχετίζονται και σημαντική για τη διατήρηση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων [23], [24]. Διάφορες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι η εντερική μετάπλαση του στομάχου και του εντερικού GC φαινότυπο συσχετίζονται με έκτοπη έκφραση CDX2 [9], [25]. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε αν CDX2 ρυθμίζει την έκφραση Καν IV στο GC και διαπίστωσε ότι CDX2 συνδέεται άμεσα με το 5′-πλευρική περιοχή του

REG4

γονιδίου και ενισχύει τη δραστηριότητα του υποκινητή.

Αποτελέσματα

Καν IV και έκφραση CDX2 συσχετίζονται με GC κύτταρα

Θα διερευνηθεί πρώτα η επαγωγή της έκφρασης Καν IV από CDX2 σε κυτταρικές σειρές GC. Η ανάλυση στυπώματος Western των CDX2 σε 9 κυτταρικές σειρές GC έδειξε ότι δεν ή χαμηλού επιπέδου έκφραση του CDX2 ανιχνεύθηκε σε ΜΚΝ-7, ΤΜΚ-1, HSC-44PE, και ΚΑΤΟ-ΙΙΙ (Σχ. 1Α). Για να προσδιοριστεί εάν CDX2 και έκφραση Reg IV ήταν στενά συσχετιζόμενων σε κύτταρα GC, κηλίδα Western και ποσοτική αλυσίδα μεταγραφής-αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης (qRT-PCR) αναλύσεις του Καν IV διεξήχθησαν σε κυτταρικές γραμμές 9 GC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, έκφραση πρωτεΐνης Reg IV ανιχνεύθηκε μόνο στις κυτταρικές γραμμές 3 με υψηλά επίπεδα

REG4

μεταγραφές μετράται με qRT-PCR. Από τις κυτταρικές σειρές 5 GC με την έκφραση της πρωτεΐνης CDX2, 2 κυτταρικές σειρές (ΜΚΝ-1 και ΜΚΝ-28) στερούνταν ανιχνεύσιμων έκφραση του

REG4

μεταγραφές και πρωτεΐνες. Οι κυτταρικές σειρές με την έκφραση της πρωτεΐνης ανιχνεύσιμα CDX2 (ΜΚΝ-7, ΤΜΚ-1, HSC-44PE, και ΚΑΤΩ-III) δεν έδειξε

REG4

μεταγραφές ή πρωτεΐνες (Εικ. 1Α).

Α: ανάλυση στυπώματος Western των CDX2 Καν IV, και β-ακτίνη και ανάλυση qRT-PCR του

REG4

σε 9 κυτταρικές σειρές GC. Β: ανάλυση στυπώματος Western των CDX2 Καν IV, και β-ακτίνη και ανάλυση qRT-PCR του

REG4

σε ΗΤ-29 /PGS-CDX2, ΗΤ-29 /PGS-neo, SW480 /PGS-CDX2 και SW480 /PGS-neo. C: Ανάλυση στυπώματος Western του Καν IV και β-ακτίνη και ανάλυση qRT-PCR του

REG4

σε ΗΤ-29 /CDX2-ER. Χρονική πορεία της

REG4

επαγωγή γονιδίου σε απόκριση προς ενεργοποίηση μιας πρωτεΐνης σύντηξης CDX2-ER με 4-ΟΗΤ αναλύθηκε. D: Ανάλυση Western blot των CDX2 Καν IV, και β-ακτίνη και ανάλυση qRT-PCR του

REG4

σε HSC-39 κύτταρα επιμολυσμένα με CDX2 siRNA (siRNA1 και siRNA2) και του αρνητικού ελέγχου siRNA. Οι μονάδες του

REG4

επίπεδο έκφρασης του mRNA είναι αυθαίρετες.

P

τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση t-test του Student. * N.S. = Μη σημαντική.

Η

Στη συνέχεια, δημιουργείται ένα πολύκλωνο πληθυσμό ΜΚΝ-7, ΤΜΚ-1, HSC-44PE, και ΚΑΤΟ-ΙΙΙ κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CDX2 με μόλυνση των κυττάρων με αντιγραφή -defective ρετροϊοί μεταφέρουν ένα πλήρους μήκους cDNA ανθρώπινης CDX2 επειδή κανένας ή χαμηλού επιπέδου έκφραση του CDX2 ανιχνεύθηκε σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, η υπερέκφραση του CDX2 απέτυχε να ενεργοποιήσει Reg IV έκφρασης με στύπωμα Western (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επειδή είναι πιθανό ότι CDX2 από μόνη της δεν είναι επαρκής για την ενεργοποίηση Reg IV έκφραση, η έκφραση του

CDH17

(που κωδικοποιεί πρωτεΐνη LI-καδερίνης), που είναι ένας από τους στόχους της CDX2 [24], ερευνήθηκε επίσης. Ωστόσο, η ενεργοποίηση της έκφρασης LI-καντερίνης δεν βρέθηκε σε ΜΚΝ-7, ΤΜΚ-1, HSC-44PE, και ΚΑΤΟ-ΙΙΙ κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CDX2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επειδή δείξαμε ενεργοποίηση της έκφρασης LI-καντερίνης με CDX2 στην κυτταρική σειρά καρκίνου ΗΤ-29 κόλον [24], η επαγωγή της έκφρασης Καν IV διερευνήθηκε στην ίδια κυτταρική γραμμή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, επαγωγή της έκφρασης Καν IV ανιχνεύθηκε σε κύτταρα ΗΤ-29 μολύνθηκαν με ρετροϊούς που μεταφέρουν ένα πλήρους μήκους cDNA ανθρώπινης CDX2. Έχουμε δημιουργείται επίσης ένα πολύκλωνο πληθυσμό κυττάρων SW480 (κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου) που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CDX2 με μόλυνση των κυττάρων με ελαττωματικό αντιγραφής ρετροϊούς που μεταφέρουν ένα πλήρους μήκους cDNA ανθρώπινης CDX2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, επαγωγή της έκφρασης Καν IV βρέθηκε σε κύτταρα SW480 μολύνθηκαν με ρετροϊούς που μεταφέρουν ένα πλήρους μήκους cDNA ανθρώπινης CDX2. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση Reg IV μπορεί να επαχθεί από CDX2 σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καρκίνο του παχέος εντέρου. Επειδή στην εντερική μεταπλασία του στομάχου, CDX2 και έκφραση Καν IV είναι καλά συσχετίζονται [11], η χρήση των άνω και κάτω τελεία κυτταρική σειρά καρκίνου μπορεί να είναι κατάλληλο για το μοντέλο της εντερικής μεταπλασίας.

Για την καλύτερη αξιολόγηση της σχέσης μεταξύ CDX2 και έκφραση Καν IV, μελετήσαμε την έκφραση Καν IV σε ένα ΗΤ-29 που προέρχεται σύμφωνα με τις αυστηρές ρυθμίσεις δραστηριότητα CDX2. Χρησιμοποιήσαμε μία πολύκλωνη γραμμή κυττάρων ΗΤ-29 που είχαν υποστεί μεταγωγή με τον φορέα pCDX2-ER. Ο φορέας pCDX2-ER κωδικοποιεί μια χιμαιρική πρωτεΐνη στην οποία τα αλληλουχίες CDX2 πλήρους μήκους συντήκεται ανοδικά ενός τομέα μεταλλαγμένου υποδοχέα οιστρογόνου (ER) σύνδεσης συνδετήρα. Ο τομέας μεταλλαγμένο ER σύνδεσης συνδετήρα δεν είναι πλέον δεσμεύει οιστρογόνα, αλλά διατηρεί την ικανότητα να δεσμεύει ταμοξιφαίνη. Κατεργασία του ΗΤ-29 /CDX2-ER κυτταρική γραμμή με 4-υδροξυταμοξιφένη (4-ΟΗΤ) οδήγησε σε ισχυρή επαγωγή έκφρασης πρωτεΐνης Καν IV μέσα σε 48 ώρες (Εικ. 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Καν IV είναι μια άμεση ή πρωτογενή γονιδίου στόχου ρυθμίζονται από CDX2. Ωστόσο, CDX2 από μόνη της δεν είναι αρκετή για την ενεργοποίηση της έκφρασης Καν IV.

Η αναστολή της CDX2 με παρεμβολή RNA (RNAi) Αποτελέσματα στο κάτω-ρύθμιση του Καν IV στο GC κύτταρα

Για να προσδιορίσετε αν CDX2 είναι απαραίτητη για την έκφραση Reg IV σε κύτταρα GC, αναλύσαμε την επίδραση της αναστολής της έκφρασης CDX2 από RNAi στο επίπεδο έκφρασης Καν IV σε HSC-39 κυτταρική γραμμή, επειδή υψηλή ενδογενή CDX2 και έκφραση Reg IV ανιχνεύθηκε σε HSC-39 κυτταρική γραμμή. CDX2 ειδικά μικρά RNAs παρεμβολής (siRNAs) κατέστειλε σημαντικά την έκφραση πρωτεΐνης CDX2 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση, και έκφραση του Καν IV μεταγραφής ρυθμίζεται προς τα κάτω περίπου 50% κατά CDX2 siRNAs σε HSC-39 σε σύγκριση με τα επίπεδα της σε κύτταρα ελέγχου siRNA φάρμακο ( Σχ. 1D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CDX2 εμπλέκεται στη διατήρηση της γονιδιακής έκφρασης Καν IV.

Λειτουργική Χαρακτηρισμός το 5′-πλευρική περιοχή

REG4

Gene από λουσιφεράσης Δοκιμασία

Για τον εντοπισμό πιθανών CDX2 που δεσμεύουν θέσεις στο

REG4

περιοχή του υποκινητή, μια αναζήτηση των γονιδιακών αλληλουχιών αμέσως 5 ‘προς το υποθετικό θέση έναρξης της μεταγραφής εκτελέστηκε, χρησιμοποιώντας ένα στοιχείο δεσμευτική για το κοτόπουλο CDXA συναίνεση

ουραίο

ομόλογο (5′-α, α /Τ, Τ, α /Τ, α, Τ, α /G-3 ‘) [26] και ένα περιγράφηκε προηγουμένως αλγόριθμος αναζήτησης [27]. Βρήκαμε τέσσερις πιθανές θέσεις CDX2 δέσμευσης στην 2 χιλιοβάσεων (kb) 5’-πλευρική περιοχή του

REG4

γονίδιο (Εικ. 2Α). Αυτά ήταν: το site Α (5′-AATAATA-3 ‘, -1828000000–1834000000 εκατομμύρια), η περιοχή Β (5′-CTTTACAG-3′, -901 έως -908), το site C (5′-TTTTATGG-3 », -114 έως -121), το site D (5’-AATAATA -3, -90 έως -96). Για να αξιολογηθεί ο ρόλος αυτών των τεκμηρίων θέσεις CDX2 δέσμευσης στη ρύθμιση

REG4

μεταγραφή, διάφορα κατασκευάσματα γονιδίου αναφοράς παρήχθησαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, κατασκευάσματα γονιδίου αναφοράς που περιέχουν 2.1, 1.2, ή 0.6 kb 5′-πλευρικής αλληλουχίας από το

REG4

γονίδιο έδειξε ισχυρή δραστικότητα στα κύτταρα HSC-39, τα οποία εμφανίζουν ισχυρή ενδογενή έκφραση του

REG4

μεταγραφές και πρωτεΐνες. Συγκριτικά, κύτταρα ΜΚΝ-1 έχουν μικρό ενδογενές

REG4

μεταγραφής και εμφανίζεται μικρή ή καθόλου μεταγραφική δραστικότητα που επάγεται από τα 2.1, 1.2, ή 0.6 kb

REG4

κατασκευάσματα γονιδίου αναφοράς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) . Η

REG4

κατασκευάσματα γονιδίου αναφοράς που περιέχει ζεύγη βάσεων -116 έως 58 και -87 έως 58 είχαν μειωμένη δραστηριότητα στα κύτταρα HSC-39 (Σχήμα 2Β.), Υποδεικνύοντας ότι οι αλληλουχίες μεταξύ των ζευγών βάσεων -634 και – 116 διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην ενεργοποίηση

REG4

μεταγραφή. Επιπλέον, αναλύσαμε μονών και πολλαπλών μεταλλάξεων στα υποθετικά θέσεις CDX2 δέσμευσης στην 5′-πλευρική περιοχή του

REG4

γονιδίου χρησιμοποιώντας HSC-39 κύτταρα (Σχ. 2C). Όπως ήταν αναμενόμενο, τεκμαρτή CDX2-θέση δέσμευσης C, η οποία βρίσκεται μεταξύ των ζευγών βάσεων -634 και -116, διαδραματίζει καίριο ρόλο στην ενεργοποίηση

REG4

μεταγραφή.

Ο εντοπισμός των ρυθμιστικών στοιχείων και CDX2 δεσμευτική θέσεις στο 5′-πλευρική περιοχή του

REG4

γονίδιο. Α: Σχηματική αναπαράσταση της 5′-πλευρική περιοχή του

REG4

γονίδιο. Η θέση και η αλληλουχία των θέσεων CDX2 δέσμευσης 4 συναίνεση στην 5′-πλαγιοκοπική περιοχή του

REG4

(δηλαδή, θέσεις Α, Β, C, και D) υποδεικνύεται. Β: Σχηματική αναπαράσταση του

REG4

κατασκευάσματα γονιδίου αναφοράς. Η

REG4

αλληλουχίες γονιδιώματος DNA που υπάρχει στους φορείς του γονιδίου αναφοράς υποδεικνύονται. Βασικές ακολουθίες για

REG4

μεταγραφή κατοικούν μεταξύ των ζευγών βάσεων -634 και -116. δοκιμασίες Reporter με τη σειρά του

REG4

μορφώματα διαγραφής διεξήχθησαν στην CDX2 εκφράζουν GC κυτταρική γραμμή, HSC-39. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της κενής βασικής φορέα pGL4.10 αποδόθηκε τιμή 1. Οι δοκιμασίες ανταποκριτού διεξήχθησαν εις τριπλούν, και η μέση και οι τιμές SD της δραστηριότητας της λουσιφεράσης δείχνεται. C: Μεταφρασμένη μεταλλάξεις στις θέσεις CDX2 δέσμευσης υποψήφιας (δηλαδή, θέσεις Α, Β, C, και D) εισήχθησαν στο κατασκεύασμα -2019 /+ 58, και η σειρά των κατασκευασμάτων που παράγονται απεικονίζεται. Η θέση πρόσδεσης υποψήφιος CDX2 που χαρακτηρίζονται ως «C» παίζει κρίσιμο ρόλο στην

REG4

μεταγραφή. δοκιμασίες Reporter πραγματοποιήθηκαν σε CDX2-κυτταρική γραμμή που εκφράζει GC, HSC-39. Η δραστικότητα του βασικού φορέα pGL4.10 αποδόθηκε τιμή 1. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν. Οι μέσες και οι τιμές δραστηριότητα λουσιφεράσης SD εμφανίζεται.

Η

CDX2 Συνδέεται άμεσα με το 5′-πλευρική περιοχή

REG4

Gene

Για να αναλυθεί το κατά πόσον CDX2 συνδέεται άμεσα με οι πιθανές θέσεις CDX2 δέσμευσης στο

REG4

5′-πλευρική περιοχή, πραγματοποιήσαμε ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασίες χρωματίνης χρησιμοποιώντας HSC-39 κύτταρα. Χρησιμοποιώντας 6 εκκινητές για το

REG4

5′-πλαγιοκοπική περιοχή (Σχ. 3Α), ανακτήσαμε θραύσματα DNA που περιέχει το

REG4

5′-πλευρική περιοχή με εκκινητή 1, η οποία περιλαμβάνει τεκμαρτή CDX2- θέση πρόσδεσης C (Σχ. 3Β). θραύσματα DNA από την 5′-πλαγιοκοπική περιοχή του

REG4

, οι οποίες παρήχθησαν χρησιμοποιώντας εναύσματα 2, 3, 4, 5 και 6 έτσι ώστε δεν περιέχουν συμπερασματική θέσεις δέσμευσης CDX2, δεν είχαν ανακτηθεί από το αντι- αντισώματος CDX2. Η ιδιαιτερότητα της ανάκτησης του

REG4

περιοχή του υποκινητή παρακάτω τσιπ με αντίσωμα αντι-CDX2 φάνηκε από το γεγονός ότι και άλλα θραύσματα άσχετο DNA που στερούνται χώρους CDX2 δέσμευσης (π.χ., εξόνιο 3 του

CDX1

γονίδιο) δεν ανακτήθηκαν (Σχ. 3Β). Επιπλέον, μακέτα ανοσοκατακρήμνιση (IgG ποντικού) έδωσε λίγες

REG4

ή

CDX1

-ειδικά τμήματα DNA (Σχ. 3Β). Όλα αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι CDX2 ενεργοποιεί

REG4

μεταγραφή με απευθείας σύνδεση προς αλληλουχίες στο 5′-πλευρική περιοχή του γονιδίου

Α:. Σχηματική αναπαράσταση του 5′-πλευρική περιοχή του

REG4

γονίδιο. Η θέση του 4 θέσεις συμφωνίας CDX2 δέσμευσης στην 5′-πλευρική περιοχή του

REG4

(θέσεις A, B, C, και D) και εκκινητές PCR (

REG4

Primer 1, 2 , 3, 4, 5, και 6) υποδεικνύονται. Β: σύνδεση με

REG4

περιοχή του υποκινητή φαίνεται από ChIP CDX2. Bulk (εισόδου) DNA παρασκευάστηκε όπως επίσης και DNA που απομονώθηκε από τσιπ με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-CDX2 ή IgG ποντικού. qPCRs πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για κάθε δείγμα σετ εκκινητή, και ο μέσος όρος και SD των τριών πειραμάτων υπολογίστηκε. Γ: Ανάλυση ChIP εμπλουτισμού H3K27me3 στο

REG4

γονίδιο υποκινητή. εμπλουτισμός ChIP μετρήθηκε χρησιμοποιώντας qPCR. qPCRs πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για κάθε δείγμα σετ εκκινητή, και ο μέσος όρος και SD των τριών πειραμάτων υπολογίστηκε.

P

τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση t-test του Student. * N.S. = Δεν είναι σημαντική.

Η

Trimethylation της ιστόνης Η3 Λυσίνη 27 (H3K27me3) για το

REG4

υποστηρικτής του GC τηλέφωνα Γραμμές

Αν και η έκφραση της πρωτεΐνης CDX2 βρέθηκε στην κυτταρικές σειρές ΜΚΝ-28 ΜΚΝ-1, και αυτές οι 2 κυτταρικές σειρές δεν είχε ανιχνεύσιμη έκφραση του

REG4

απομαγνητοφώνηση και πρωτεΐνες. Επειδή έχει αναφερθεί ότι το DNA υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων συνδέεται με αποσιώπηση ορισμένων γονιδίων [28], διερευνούμε αν μεθυλίωσης του DNA που προκαλείται από μεταγραφική αδρανοποίηση των Καν IV σε ΜΚΝ-1 και ΜΚΝ-28 κύτταρα. Εμείς αγωγή αυτών των κυττάρων με έναν παράγοντα απομεθυλίωσης, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (Αζα-dC) και στη συνέχεια διεξήχθη qRT-PCR. Ωστόσο, η έκφραση Reg IV δεν αποκαταστάθηκε σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν δείχνονται), υποδηλώνοντας ότι η μεθυλίωση του DNA δεν είναι πιθανό να επηρεάσει την έκφραση Reg IV. Έχει επίσης αναφερθεί ότι H3K27me3 έχει συσχετιστεί με την έκφραση του γονιδίου καταπιεσμένη [29]. Ερευνήσαμε περαιτέρω H3K27me3 σε κυτταρικές σειρές GC. Για να προσδιορίσετε τον εμπλουτισμό της H3K27me3 στο

REG4

υποστηρικτής στις κυτταρικές σειρές GC, αναλύσεις ChIP πραγματοποιήθηκαν. Σε ΜΚΝ-1 και ΜΚΝ-28 κυτταρικές γραμμές, τα επίπεδα H3K27me3 για το

REG4

περιοχή του υποκινητή ήταν υψηλές, ενώ στην HSC-39 κυτταρική γραμμή, επίπεδο H3K27me3 για το

REG4

περιοχή του υποκινητή ήταν χαμηλή (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι κλειστή δομή της χρωματίνης του

REG4

υποκινητής μπορεί να αναστέλλουν την έκφραση Reg IV από CDX2.

Συζήτηση

Αν και έχει αναφερθεί ότι η έκφραση Reg IV επάγεται με GLI1 [21] ή EGF [22], αυτά τα μόρια είναι απίθανο να ευθύνονται για τη σύνδεση μεταξύ Reg IV και εντερική διαφοροποίηση. Στην παρούσα μελέτη, έδειξε ότι η ενδογενής CDX2 και η έκφραση Καν IV ήταν καλά συσχετισμένη στο κελί GC γραμμές. Επιπλέον, με τη χρήση ενός ER-ρυθμιζόμενη μορφή CDX2, βρήκαμε ότι υπήρχε ταχεία επαγωγή της έκφρασης Καν IV μετά από θεραπεία 4-ΟΗΤ. προσδιορισμούς γονιδίων αναφοράς αποκάλυψε ένα σημαντικό ρόλο για στοιχεία στο

περιοχή υποκινητή REG4

δεσμευτικός συναίνεση CDX2 DNA σε μεταγραφή του. Μετέπειτα αναλύσεις έδειξαν ότι ChIP CDX2 συνδέεται άμεσα με το

REG4

υποκινητή. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι σε πρωτογενή ιστό GC και εντερική μετάπλαση του στομάχου, CDX2 και έκφραση Reg IV ήταν καλά συσχετίζεται [11]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η πρωτεΐνη CDX2 ρυθμίζει άμεσα την έκφραση Reg IV σε GC και εντερική μετάπλαση του στομάχου.

CDX2 υπερεκφράζεται στην εντερική φαινότυπο GC και στην εντερική μεταπλασία του στομάχου [9], [25]. Σε αντίθεση, η απώλεια της έκφρασης CDX2 παρατηρήθηκε σε ένα υποσύνολο των πρωτογενών ορθοκολικών καρκίνων, συνήθως σε ασθενώς διαφοροποιημένες ορθοκολικούς καρκίνους [30]. Η σημασία της μεταβολής της έκφρασης CDX2 σε ανθρώπινους καρκίνους παραμένει ασαφής, και ως εκ τούτου είναι σημαντικό να καθοριστούν τα γονίδια-στόχους τα οποία είναι καθοδικά του CDX2. Έχουμε εντοπίσει διάφορα γονίδια CDX2 ρυθμίζονται όπως

CDH17

(το οποίο κωδικοποιεί LI-cadherin) [24],

HEPH

(το οποίο κωδικοποιεί hephaestin) [31],

ABCB1

(το οποίο κωδικοποιεί την αντίσταση σε πολλά φάρμακα 1) [32], και

DSC2

(το οποίο κωδικοποιεί desmocollin 2) [33]. Μεταξύ αυτών των γονιδίων,

ABCB1

ταυτοποιήθηκε αρχικά ως υπερεκφράζεται και ενισχυμένο γονίδιο σε πολλαπλά κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο, και των προϊόντων της, η Ρ-γλυκοπρωτεΐνη, φαίνεται να παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αντίσταση του φαρμάκου [34]. Προηγουμένως, αναφέραμε ότι η αναγκαστική έκφραση του Καν IV σε κύτταρα GC ανέστειλε 5-FU-επαγόμενη απόπτωση μέσω επαγωγής του Bcl-2 και διυδροπυριμιδίνης αφυδρογονάσης [8]. Στο σύνολό τους, είναι πιθανό ότι στο εντερικό GC φαινότυπο, έκφραση (ή έκτοπη έκφραση) του CDX2 επάγει Καν IV και πολυφαρμακευτική αντίσταση έκφρασης 1, με αποτέλεσμα την αύξηση της φαρμακευτικής αντίστασης. Στην πραγματικότητα, έχει αναφερθεί ότι η μετεγχειρητική χημειοθεραπεία δεν είναι ευεργετική για τους ασθενείς με εντερική φαινότυπο GC [35].

Παρά το γεγονός ότι τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την άποψη ότι CDX2 παίζει ρόλο στη ρύθμιση

REG4

μεταγραφή μέσω σύνδεσης προς την περιοχή προαγωγού, διάφορα ευρήματα δείχνουν ότι CDX2 μόνη της δεν είναι επαρκής για την ενεργοποίηση

REG4

έκφρασης. Στην παρούσα μελέτη, δημιουργήσαμε ένα πολύκλωνο πληθυσμό ΜΚΝ-7, ΤΜΚ-1, HSC-44PE, και ΚΑΤΟ-ΙΙΙ κύτταρα τα οποία εκφράζουν υψηλά επίπεδα του CDX2 από μόλυνση με ρετροϊούς που μεταφέρουν ένα πλήρους μήκους cDNA ανθρώπινης CDX2. Ωστόσο, η υπερέκφραση του CDX2 απέτυχε να ενεργοποιήσει την έκφραση Καν IV. Σε κυτταρικές σειρές GC, καμία από τις κυτταρικές σειρές με την έκφραση μη ανιχνεύσιμη πρωτεΐνη CDX2 είχαν ανιχνεύσιμο

REG4

μεταγραφές και πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου, CDX2 απαιτείται για την έκφραση Καν IV, αλλά CDX2 από μόνη της δεν είναι αρκετή για την ενεργοποίηση της έκφρασης Καν IV. Στην παρούσα μελέτη, εννέα GC κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Η προέλευση των κυτταρικών σειρών ήταν ως εξής. Οι κυτταρικές σειρές ΜΚΝ-74 ΜΚΝ-7, ΜΚΝ-28, και καθιερώθηκαν από εντερικό τύπο GC. Οι κυτταρικές σειρές ΤΜΚ-1 και ΜΚΝ-45 καθιερώθηκαν από διάσπαρτες τύπου GC. Κάτω-ΙΙΙ, HSC-39, και HSC-44PE κυτταρικές σειρές καθιερώθηκαν από καρκίνωμα σφραγίδα κυττάρων δαχτυλίδι. Η κυτταρική γραμμή ΜΚΝ-1 καθορίστηκε από καρκίνωμα αδενοχοληδωτό κυττάρων. Επειδή στην εντερική μεταπλασία του στομάχου, CDX2 και έκφραση Καν IV είναι καλά συσχετίζονται, κυτταρικές σειρές GC ιδρύθηκε από διάχυτες GC τύπου ή καρκίνωμα σφραγιστικό δαχτυλίδι μπορεί να μην είναι κατάλληλο για την ανάλυση της επαγωγής Καν IV από CDX2. Στην πραγματικότητα, η έκφραση Reg IV μπορεί να επαχθεί από CDX2 σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καρκίνο του παχέος εντέρου στην παρούσα μελέτη. Επιπλέον, δείξαμε ότι τα επίπεδα H3K27me3 στην περιοχή του υποκινητή του

REG4

ήταν υψηλά σε κυτταρικές σειρές ΜΚΝ-1 και ΜΚΝ-28 GC. Αυτά τα 2 κυτταρικές σειρές δεν είχε ανιχνεύσιμη έκφραση του

REG4

αν και η έκφραση της πρωτεΐνης CDX2 βρέθηκε. Ως εκ τούτου, τα επίπεδα H3K27me3 για το

REG4

περιοχή του υποκινητή μπορεί να είναι υψηλή σε ΜΚΝ-7, ΤΜΚ-1, HSC-44PE, και ΚΑΤΩ-ΙΙΙ κύτταρα, στα οποία η υπερέκφραση του CDX2 απέτυχε να ενεργοποιήσει την έκφραση Καν IV.

έχει αναφερθεί ότι em

REG4

mRNA έκφραση ενισχύθηκε με διέγερση με ΤΟΡ-α, EGF, HGF, ή bFGF μέσω της ενεργοποίησης του μιτογόνου ενεργοποιημένης πρωτεΐνης κινάσης (ΜΑΡΚ) [22] . Έτσι, θα μπορούσε να υποτεθεί ότι Καν IV ρυθμίζεται επίσης από τους μεταγενέστερους μεταγραφικών παραγόντων της ΜΑΡΚ. Πραγματοποιήσαμε

in silico

αναλύσεις των

REG4

γονίδιο 5′-πλευρική περιοχή, και βρέθηκε τουλάχιστον ένα υποθετικό ακολουθίες συναίνεσης AP-1 (σε -883 ζεύγη βάσεων του

REG4

γονίδιο 5′-πλευρική περιοχή), η οποία είναι μεταγενέστερος παράγοντας μεταγραφική του ΜΑΡΚ σηματοδότησης. Στην παρούσα μελέτη, η HSC-39 κύτταρα έδειξαν παρόμοια μεταγραφική δραστικότητα κατασκευασμάτων γονιδίου αναφοράς που περιέχει 1,2 kb και 0,6 kb του

REG4

5′-πλευρικής αλληλουχίας. Καθώς η επίδραση του EGF ή ΤΟΡ-α στο

REG4

μεταγραφή δεν διερευνήθηκε στην παρούσα μελέτη, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να διευκρινιστούν οι μηχανισμοί σηματοδότησης που επάγουν ρύθμιση του

REG4

μεταγραφής.

Εν κατακλείδι, το παρόν τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η πρωτεΐνη CDX2 ρυθμίζει άμεσα την έκφραση Καν IV. Reg IV ενεργοποιεί το μονοπάτι σηματοδότησης EGFR /Akt /ΑΡ-1. Όπως εντερικό φαινότυπο GC εκφράζει συχνά EGFR [36], προτείνεται ότι αυτή η Reg IV-ενεργοποιημένη οδός παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε αυτόν τον υπότυπο του GC. Επειδή CDX2 επάγει επίσης την έκφραση του γονιδίου αντοχής πολυφαρμάκου,

ABCB1

, αντι-ΕΟΡΚ θεραπεία αλλά όχι χημειοθεραπεία μπορεί να είναι ευεργετική για τους ασθενείς με εντερική φαινότυπο GC.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα πλασμίδια

το cDNA CDX2 εισήχθη εντός της θέσης πολλαπλής κλωνοποίησης του ρετροϊικού φορέα έκφρασης PPGs-CMV-CITE-neo, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Η πλήρους μήκους, άγριου τύπου CDX2 cDNA επίσης υποκλωνοποιήθηκε στον ρετροϊικό φορέα pBabe-Puro ER όπως περιγράφηκε προηγουμένως για να δημιουργήσει pCDX2-ER [24]. Ο φορέας pCDX2-ER κωδικοποιεί μια χιμαιρική πρωτεΐνη στην οποία τα αλληλουχίες CDX2 πλήρους μήκους συντήκεται ανοδικά ενός τομέα μεταλλαγμένου ER σύνδεσης συνδετήρα. Ο τομέας μεταλλαγμένο ER σύνδεσης συνδετήρα δεν είναι πλέον δεσμεύει οιστρογόνα, αλλά διατηρεί την ικανότητα να δεσμεύει ταμοξιφαίνη. Γονιδιωματικές αλληλουχίες DNA από την 5′-πλευρική περιοχή του ανθρώπινου

REG4

γονίδιο ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας γονιδιωματικό DNA καθαρίζεται από HSC-39 κύτταρα ως πρότυπο και υποκλωνοποιήθηκε στον pGL4.10 [luc2] φορέα (Promega , Madison, WI). προσεγγίσεις που βασίζονται σε PCR χρησιμοποιήθηκαν για να εισάγουν μεταλλάξεις σε θέσεις τους επίδοξους CDX2 δέσμευσης στο κατασκεύασμα γονιδίου αναφοράς pGL4.10-REG4 χρησιμοποιώντας QuikChange τοπο-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Τέσσερις πιθανές θέσεις CDX2 δέσμευσης άλλαξαν. Όλα τα θραύσματα που δημιουργούνται με PCR επιβεβαιώθηκαν με αυτοματοποιημένη αλληλούχιση. Ο φορέας πλασμίδιο pGL4.74 [hRluc /TK] (Promega) χρησιμοποιήθηκε ως ένας έλεγχος για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης σε δοκιμασίες ανταποκριτή.

κυτταρικές γραμμές, Retrovirus Λοιμώξεις, and Drug Θεραπεία

Το αμφοτροπικό Phoenix κυτταρική γραμμή συσκευασίας δόθηκαν από τον Γ Nolan (Πανεπιστήμιο του Stanford, Stanford, CA) [37]. Χρησιμοποιήθηκαν εννέα κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ανθρώπινα GC και 2 κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Η κυτταρική σειρά ΤΜΚ-1 ιδρύθηκε το εργαστήριό μας [38]. Οι κυτταρικές σειρές HSC-39 και HSC-44PE ιδρύθηκαν από έναν από τους συγγραφείς (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Πέντε GC κυτταρικές σειρές της σειράς ΜΚΝ παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Toshimitsu Suzuki [41], [42]. Η κυτταρική σειρά ΚΑΤΟ-ΙΙΙ παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Morimasa Sekiguchi [43]. Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου ΗΤ-29 και SW480 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα αποθηκεύθηκαν σε υγρό άζωτο μέχρι την έναρξη της μελέτης. Μετά την απόψυξη από κατεψυγμένο απόθεμα, τα κύτταρα διατηρούνται σε χαμηλά πέρασμα διάρκεια της μελέτης. Συνεπής η μορφολογία των κυττάρων παρακολουθήθηκε με σύγκριση των μικροσκοπικών εικόνων. Τα κύτταρα συσκευασίας Phoenix επιμολύνθηκαν με ρετροϊικό κατασκευάσματα έκφρασης (PPGs-CDX2, PPGs-neo, και pCDX2-ER) και το υπερκείμενο που περιέχει μη αντιγράψημο αμφοτροπικό ιός συλλέχθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Σε ΗΤ-29 κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη σύντηξης CDX2-ER (ΗΤ-29 /CDX2-ER), τη λειτουργία CDX2 ενεργοποιήθηκε με προσθήκη 4-υδροξυταμοξιφένη (4-ΟΗΤ) (Sigma Chemical, St. Louis, ΜΟ) προς την ανάπτυξη μέσο σε μια τελική συγκέντρωση 500 nmol. Για να διερευνηθεί αν μεθυλίωσης του DNA που προκαλείται από μεταγραφική αδρανοποίηση των Reg IV, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μία τελική συγκέντρωση 1 μΜ Αζα-dC (Sigma Chemical) για 5 ημέρες πριν από την συλλέχθηκαν για εξαγωγή RNA.

Ανάλυση Western Blot

Για την ανάλυση στυπώματος Western, τα κύτταρα λύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [44]. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με προσδιορισμό πρωτεΐνης Bradford (BioRad, Richmond, CA) με BSA χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο. Τα προϊόντα λύσης (20 μg) διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli που με βρασμό και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου 12% που ακολουθείται από ηλεκτρο-μεταφορά σε ένα φίλτρο νιτροκυτταρίνης. Το φίλτρο επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με αντίσωμα αντι-Reg IV (πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο μας, Ref. 10) ή αντίσωμα αντι-CDX2 (BioGenex, San Ramon, CA). Υπεροξειδάση συζευγμένο αντι-κουνελιού IgG ή αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκε στη δευτερογενή αντίδραση. Ανοσοσύμπλοκα έγιναν ορατά με ECL Plus Western Blot Σύστημα Ανίχνευσης (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-ακτίνης (Sigma Chemical) ανιχνεύθηκε επίσης ως έλεγχος φόρτωσης.

qRT-PCR Ανάλυση

Ολικό RNA εξήχθη με RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) και 1 μg ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA με κιτ First Strand cDNA Synthesis (Amersham Biosciences). Η ποσοτικοποίηση του

REG4

επίπεδα mRNA εκτελέστηκε με ανίχνευση φθορισμού σε πραγματικό χρόνο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [45]. PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR Green PCR Πυρήνας Αντιδραστήρια Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο της έντασης εκπομπής του SYBR πράσινο δεσμεύεται σε δίκλωνο DNA πραγματοποιήθηκε με ένα ΑΒΙ PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) όπως περιγράφεται προηγουμένως [46].

ACTB

-ειδικές προϊόντα PCR ενισχύθηκαν από τα ίδια RNA δείγματα και υπηρέτησε ως εσωτερικός έλεγχος. Ακολουθίες των εκκινητών για το

REG4

qRT-PCR φαίνονται στον Πίνακα 1. qRT-PCRs διεξήχθησαν εις τριπλούν για κάθε σετ εκκινητή δείγμα, και η μέση και τυπική απόκλιση (SD) των τριών πειραμάτων υπολογίστηκε ως ο σχετική αξία ποσοτικοποίηση. Στο τέλος της 40 κύκλους PCR, τα προϊόντα της αντίδρασης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 8% μη-μετουσίωσης για την οπτική επιβεβαίωση των PCR προϊόντων.

Η

RNAi

Για να knockdown του ενδογενούς CDX2, RNAi έγινε. Δύο διπλά μόρια siRNA που στοχεύει CDX2 (5′-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ‘, CDX2 siRNA1? Και 5′-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3′, CDX2 siRNA2) και ένα nonsilencing siRNA duplex (5’-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ‘) συντέθηκαν (Qiagen). Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 60 pmol του siRNA και 10 μι Lipofectamine RNAiMAX αναμίχθηκαν σε 1 mL μέσου RPMI (/L τελική συγκέντρωση siRNA 10 nmol). Μετά από 20 λεπτά επώασης, το μείγμα προστέθηκε στα κύτταρα και αυτά καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία για κάθε δοκιμασία. Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα αναλύθηκαν για όλα τα πειράματα.

Reporter Gene Δοκιμασίες

HSC-39 και ΜΚΝ-1 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). Η επιμόλυνση των κυττάρων σε 50% -80% συρροή διεξήχθη με 3 μί αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Fugene6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ), 0,8 μg των κατασκευασμάτων γονιδίου αναφοράς pGL4.10, και 0.2 μg pGL4.74 [hRluc /TK] διάνυσμα (Promega). Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε παθητική ρυθμιστικού λύσης (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε με ένα σύστημα δοκιμασίας διπλής λουσιφεράσης (GloMax 96 Microplate Luminometer, Promega).

ChIP Δοκιμασίες

Οι προσδιορισμοί ChIP διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το EZ-chip χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση Kit (Millipore, Billerica , ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες παρασκευής. Για να αναλυθεί το κατά πόσον CDX2 συνδέεται άμεσα με τις πιθανές θέσεις CDX2 δέσμευσης στο

REG4

5′-πλευρική περιοχή, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις ChIP χρησιμοποιώντας HSC-39 κύτταρα.