Αφηρημένο

Annonaceous acetogenins, μια μεγάλη οικογένεια φυσικών πολυκετιδίων απομονωθεί από διάφορα είδη του φυτού γένος

Annonaceae

, έχουν βρεθεί να επιδεικνύουν σημαντική κυτταροτοξικότητα έναντι μιας ποικιλίας καρκινικών κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι οι ενώσεις αυτές θα μπορούσαν να δράσουν στα μιτοχόνδρια συγκρότημα-Ι και μπλοκάρουν την αντίστοιχη αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και να τερματίσει την παραγωγή ΑΤΡ. Ωστόσο, περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τους μηχανισμούς της δράσης παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε τις επιδράσεις ενός συνόλου μιμητικά annonaceous acetogenin σε ορισμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές, και αναφέρουν ότι ανάμεσά τους AA005 επιδεικνύει την πιο ισχυρή αντικαρκινική δράση. AA005 εξαντλεί ΑΤΡ, ενεργοποιεί AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) και αναστέλλει συγκρότημα mTOR 1 (mTORC1) οδό σήματος, οδηγώντας σε αναστολή της ανάπτυξης και autophagy του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. αναστολείς ΑΜΡΚ ένωση C και ινοσίνη καταστέλλουν, ενώ ΑΜΡΚ ενεργοποιητή AICAR ενισχύει, AA005-προκάλεσε καταστολή του πολλαπλασιασμού και την επακόλουθη αυτοφαγία των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. AA005 ενισχύει την εξάντληση του ΑΤΡ και την ενεργοποίηση ΑΜΡΚ που προκαλείται από 2-δεοξυγλυκόζη, ένας αναστολέας της μιτοχονδριακής αναπνοής και γλυκόλυσης. AA005 αναστέλλει επίσης χημειοθεραπευτικό παράγοντα σισπλατίνη ενεργοποιείται ανοδική ρύθμιση του mTOR και συνεργεί με αυτό το φάρμακο σε καταστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι AA005 είναι ένας νέος αναστολέας του μεταβολισμού η οποία επιδεικνύει θεραπευτική δυναμικά στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Liu Υ-Q, Cheng Χ, Guo L-X, Mao C, Chen Υ-J, Liu Η-Χ, et al. (2012) Ταυτοποίηση ενός Annonaceous Acetogenin μιμητικό, AA005, ως ΑΜΡΚ ενεργοποιητή και Autophagy επαγωγέα του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 7 (10): e47049. doi: 10.1371 /journal.pone.0047049

Επιμέλεια: Xiaolin Zi, του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια Irvine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 Ιανουαρίου, 2012? Αποδεκτές: 11 Σεπτέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2012 |

Copyright: © Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Πρόγραμμα Κλειδί για τη βασική έρευνα (2012CB910800, 2010CB833200 και 2009CB940900), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (Νο 81071930, 81171925, 20972160 και 21172220), η Ειδική Ίδρυμα του Προέδρου και το Έργο κλειδί της γνώσης Πρόγραμμα Καινοτομίας της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (KSCX1-YW-R-26 και KSCX2-YW-R-235), και το Εθνικό Μείζονος Επιστημονικής και Τεχνολογικής Πρόγραμμα Drug Discovery (2009ZX09103-101). Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σε καρκινικά κύτταρα υπάρχει αυξημένος ένζυμα γλυκολυτικής οδού και μεταφορέων γλυκόζης, ακόμη και με την παρουσία ενός υψηλού O

2 συγκέντρωσης, τελικά οδηγεί σε αυξημένη ATP ρυθμό παραγωγής [1]. Κλινικά στοιχεία έχει συνδέσει το μεταβολισμό των κυττάρων με τα αποτελέσματα του καρκίνου, και το μεταβολισμό επαναπρογραμματισμό της ενέργειας έχει εγκριθεί να είναι μια αναδυόμενη χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου [2]. Αυτές οι παρατηρήσεις έχουν εγείρει το ενδιαφέρον ως προς τη στόχευση του μεταβολισμού ενέργειας για τη θεραπεία του καρκίνου και για τις δύο υποξική (γλυκολυτικό) και οξειδωτική όγκους [1], αν και αφορά επίσης ότι αυτές οι θεραπείες θα έχουν μη αποδεκτές επιδράσεις σε φυσιολογικά κύτταρα. Περιέργως, μερικά από τα πρώτα θεραπείες καρκίνου που στοχεύουν συγκεκριμένες μεταβολικές ανάγκες των καρκινικών κυττάρων παραμένουν αποτελεσματικά στην κλινική σήμερα, εκ νέου αξιέπαινες προσπάθειες για στόχευση εξαρτήσεις μεταβολική καρκινικών κυττάρων ως επιλεκτικός αντικαρκινική στρατηγική [3].

AMP- ενεργοποιημένης πρωτεϊνικής κινάσης (AMPK) που υπάρχει στα κύτταρα ως ετεροτριμερή συγκρότημα που αποτελείται από μια καταλυτική υπομονάδα κινάσης (α) και δύο ρυθμιστικών υπομονάδων (β και γ), είναι ένας αισθητήρας της κατάστασης της ενέργειας που διατηρεί ομοιόσταση κυτταρικής ενέργειας. Ενεργοποιείται από την πτώση των ΑΤΡ (παράλληλη με την αύξηση ADP και AMP) ή ερεθίσματα που αυξάνουν την αναλογία κυτταρικής ΑΜΡ /ATP, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των καταβολικών διαδρομών και την αναστολή των αναβολικών οδών [4], [5]. Καθοριστική για την ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ φωσφορυλίωση της σε Thr-172 με ένα ανάντι κινάσες ΑΜΡΚ (AMPKKs) [6] και ογκοκατασταλτικά LKB1 [7] η οποία είναι μία κινάση σερίνης /θρεονίνης που σχετίζεται με γαστρεντερική πολυποδίαση και τον καρκίνο [8] και τον καρκίνο του πνεύμονα [ ,,,0],9]. ΑΜΡΚ φωσφορυλιώνει δύο ένζυμα περιορισμού του ρυθμού στο λιπαρό οξύ και τη σύνθεση της χοληστερόλης: ακετυλο-CoA καρβοξυλάσης (ACC) και HMG-CoA αναγωγάσης, καθώς και άλλες κατάντη στόχοι, με αποκορύφωμα την αναστολή των αναβολικών οδών και την ενεργοποίηση των καταβολικών διαδρομών [5] . ενεργοποίηση ΑΜΡΚ περιορίζει άμεσα την έναρξη της μετάφρασης και την πρωτεϊνική σύνθεση [10], μέσω της αναστολής του παράγοντα επιμήκυνσης μετάφρασης 2 (EF2) [11], και έμμεσα, μέσω TSC2, που οδηγεί σε καταστολή της στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) [12] το οποίο μπορεί να φωσφορυλιώσει και ενεργοποιήσει p70 κινάσης S6 και πρωτεΐνες 4Ε-δέσμευσης (4ΕΒΡ) [13].

ενεργοποίηση ΑΜΡΚ από αναλογικό AMP 5-αμινοϊμιδαζόλη-4-καρβοξαμίδιο ριβονουκλεοτίδιο (AICAR) συσσωρεύεται εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολείς κινασών p21 και p27 και ρυθμίζει προς τα κάτω κυκλίνης D1 σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, που οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε φάση G1 [14]. Πληθυσμιακές μελέτες παρέχουν ενδείξεις ότι η χρήση της μετφορμίνης η οποία είναι ένας ενεργοποιητής ΑΜΡΚ, μπορεί να σχετίζεται με μειωμένη επίπτωση και βελτιωμένη πρόγνωση ορισμένων καρκίνων [15], [16]. Στον καρκίνο του μαστού, η μετφορμίνη εξασκεί ανασταλτικά αποτελέσματα μέσω αναστολής της έναρξης μετάφρασης mTOR εξαρτώμενη [17], [18]. Η μετφορμίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και εμποδίζει τον κυτταρικό κύκλο σε G1 φάση σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, και in vivo θεραπεία με μετφορμίνη οδηγεί σε σημαντική μείωση της ανάπτυξης του όγκου σε ποντικούς που φέρουν ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη κύτταρα [19]. Η μετφορμίνη και AICAR επάγουν απόπτωση και καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου του καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116 γραμμής p53 (- /-) ξενομοσχεύματα, και πυροδοτούν autophagy του HCT116 ρ53 (+ /+) κύτταρα [20]. AICAR και πρωτεΐνη αναδίπλωσης αναστολέα 17-AAG, ειδικά όταν συνδυάζεται, δείχνουν αποτελεσματικότητα εναντίον ανευπλοειδές γραμμές ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων [21]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΑΜΡΚ θα μπορούσε να είναι μια ορθολογική στόχος φαρμάκου και να οδηγήσει ενώσεις θα πρέπει να προσδιοριστεί ή να σχεδιαστεί για την ανάπτυξη θεραπευτικών λεωφόρους για καρκίνους.

Annonaceous acetogenins αντιπροσωπεύουν μια κατηγορία φυσικώς απαντώμενων πολυκετιδίων που απομονώνονται από διάφορα είδη του φυτού γένος

Annonaceae

[22]. Αυτές οι ενώσεις εμφανίζουν ποικίλες βιοδραστικότητες, συμπεριλαμβανομένων ελπιδοφόρα cytotoxicites και αντιπαρασιτικές δραστηριότητες [23]. Αν και οι μελέτες δείχνουν ότι annonaceous acetogenins μπορεί να διαταράξει τη μιτοχονδριακή λειτουργία μέσω παρεμπόδισης μιτοχονδρίων συμπλόκου Ι και ουβικινόνη-συνδεδεμένη NADH οξειδάση [23], και δεσμεύουν την τρίτη μήτρα στην πλευρά βρόχου του ND1 υπομονάδας σε μιτοχονδριακό NADH-ουβικινόνης οξειδορεδουκτάσης [23], [24], οι μηχανισμοί δράσης αυτών των ενώσεων στην καταπολέμηση του καρκίνου παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Η ομάδα χημεία της ομάδας μας είχε σχεδιαστεί και συντίθεται μια σειρά από annonaceous μιμητικών acetogenin [25] – [28]. Στην παρούσα εργασία εξετάσαμε τη βιολογική δράση ορισμένων νέων αναλόγων και διερευνήθηκαν οι μηχανισμοί που διέπουν κυτταροτοξικότητες annonaceous acetogenins », και ανέφερε ότι ένα μιμητικό AA005 η οποία έδειξε ισχυρή και εκλεκτική ανασταλτική δραστηριότητες έναντι μιας ποικιλίας καρκινικών κυττάρων, ήταν σε θέση να ενεργοποιήσει ΑΜΡΚ και επάγουν κυτταρικό σύλληψη του κύκλου που ακολουθείται από αυτοφαγία, αποδεικνύοντας θεραπευτικές δυνατότητες της

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

Annonaceous acetogenin μιμητικά (Πίνακας 1) διαλύθηκαν σε DMSO και αποθηκεύεται σε. – 20 ° C. Η 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) αγοράστηκε από Amresco Inc. (Solon, ΟΗ). Ένωση C, ραπαμυκίνη, ροτενόνη, ινοσίνη, Rhodamine 123, 2-DG και AICAR αγοράστηκαν από την Sigma. Mitotracker Deep Red FM αγοράστηκε από την Invitrogen. ΑΤΡ Assay Kit αγοράστηκε από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας (Haimen, Jiangsu, Κίνα)

Η

Αντισώματα

Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ως εξής: α. Αντι-β-ακτίνης ( Sigma)? αντι-ρ-AMPKα1, αντι-ρ-ACC, αντι-ρ-mTOR, αντί-ρ-S6K, αντι-AMPKα1, αντι-ACC, αντι-mTOR, αντί-S6K, αντι-PARP, γίδινο αντι-κουνελιού IgG- HRP και κατσίκα αντι-ποντικού IgG-HRP αντισώματος (Cell Signaling Technology)? αντι-CyclinD1 (Abcam), αντι-CDK4 (Santa Cruz Biotechnology), και αντι-LC3 (Sigma).

Cell Culture και διαμόλυνση

Ο πνεύμονας καρκίνου κυτταρική σειρά Α549, ο καρκίνος του μαστού κυττάρων γραμμή MCF-7, του τραχήλου της μήτρας καρκινική κυτταρική σειρά HeLa, κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές LOVO, SW480, HCT116 και ΗΤ29, και ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα ΗΕΚ-293Τ αποκτήθηκαν από την American Tissue Culture Collection (ATCC). Ανθρώπινων εμβρυϊκών πνευμόνων ινοβλαστών MRC-5, γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή SGC7901, και ηπατική κυτταρική σειρά καρκίνου BEL7402 αγοράστηκαν από το κινητό Resource Center, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο). Τα φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBEpiC) αγοράστηκαν από ScienCell (ScienCell Research Laboratories, San Diego, California). Το 293Τ, Α549, BEL7402, HeLa, MCF-7, SGC7901 και οι ανθρώπινες φυσιολογικές βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα BEAS-2Β [29] κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Gibco /BRL , Grand Island, ΝΥ), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. LOVO, SW480, HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. MRC-5 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ΜΕΜ /EBSS συμπληρωμένο με μη απαραίτητα αμινοξέα, 10% FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. κύτταρα HBEpiC καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο βρογχικό επιθηλιακό κύτταρο ελεύθερο ορού (ScienCell Research Laboratories) που περιέχει βρογχικά επιθηλιακά συμπλήρωμα ανάπτυξης κυττάρου (ScienCell Research Laboratories). Τα πλασμίδια pQCXIP-GFP-LC3 και pQCXIP-GFP [30] επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας την LOVO Lipofectamine 2000 (Qiagen) σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Βιωσιμότητας Κυττάρων, κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κλωνογενείς δοκιμασίες

τα καρκινικά κύτταρα (5 × 10

3) σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο των πλακών καλλιέργειας ιστού 96-φρεατίων (Coaster, Charlotte, NC) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με annonaceous μιμητικά acetogenin για 48 ώρες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα. δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη όπως περιγράφεται [31], και το IC

50 τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CalcuSyn (έκδοση 2.0, Biosoft, Cambridge, UK). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με αποκλεισμό trypan blue χρωστικής. Η πιθανή συνεργιστική, προσθετική ή ανταγωνιστική δράση μεταξύ AA005 και 2-DG ή σισπλατίνη αξιολογήθηκε προσεκτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK) όπως περιγράφεται [32]. Οι καμπύλες δόσης-αποτελέσματος του μονού ή συνδυασμένης θεραπείας φαρμάκου αναλύθηκαν με τη μέθοδο μέσου-αποτελέσματος [33], όπου οι δείκτες συνδυασμού (CI) μικρότερη, ίση προς, και μεγαλύτερη από 1 δείχνουν συνεργιστική, πρόσθετο, και ανταγωνιστικά αποτελέσματα, αντίστοιχα .

Για εστίες σχηματισμό, ΗΤ29, LOVO ή HCT116 αντιμετωπίζονται με AA005 σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 35 χιλιοστά (200 κύτταρα ανά πλάκα). Μετά από 8 ημέρες καλλιέργειας, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Giemsa και οι κλώνοι που περιέχουν περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκαν [29].

Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

Για την ανίχνευση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου, του παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα συγχρονίστηκαν με G1 /S όριο από ένα διπλό μπλοκ θυμιδίνης [31] και στη συνέχεια εκτίθενται σε AA005 σε ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, σταθεροποιήθηκαν με 70% ψυχρή αιθανόλη σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και πλύθηκαν με PBS, που ακολουθείται από επώαση με RNase και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (Sigma-Aldrich). Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (FACS Vantage BD Diva, USA). Κυτταρικής απόπτωσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας kit /ανίχνευσης απόπτωσης PI ΡΕ αννεξίνης V (BD Biosciences, San Jose, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ανάλυση των κυττάρων με GFP-LC3 Κυστίδια

Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με pQCX-IP-GFP-LC3 και pQCX-IP-GFP-πλασμιδίων που εκφράζουν για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις AA005 για άλλες 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη /PBS επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία στους 63 × μεγέθυνση. εκτιμήθηκε το ποσοστό των GFP θετικών κυστίδια κύτταρα [30].

Μέτρηση των μιτοχονδριακών διαμεμβρανικό δυναμικό, ΑΤΡ περιεχόμενο και NAD

+ /NADH Λόγος

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις annonaceous μιμητικά acetogenin για 24 ώρες. Το μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό εξετάστηκε όπως περιγράφεται [34], το περιεχόμενο ΑΤΡ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΤΡ βιοφωταύγεια Assay Kit (Beyotime Ινστιτούτο Biotechnology), και αναλογία NAD

+ /NADH μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Amplite ™ Χρωματομετρική NAD /NADH Assay Kit ( ΑΑΤ BIOQUEST, Inc., Sunnyvale, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ομοεστιακή Μικροσκοπία αναλύσεις

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων και σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη. Μετά από μια σύντομη έκπλυση σε PBS συμπληρωμένο με 100 mM γλυκίνη, πλακίδια μπλοκαρίστηκαν με 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA? Sigma) και 0,3% Triton Χ-100 σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και χρωματίστηκαν για μικροσκοπία φθορισμού όπως περιγράφεται [ ,,,0],31]. Τα κύτταρα κατόπιν AA005-γρίπη εξετάστηκαν με τη χρήση ενός Zeiss LSM μικροσκόπιο 510 META εφοδιασμένο με ελαιοκαταδυτικό αντικειμενικό 63 ×. επεξεργασία και ανάλυση εικόνας έγιναν με την έκδοση Zeiss LSM 510 λογισμικού 3.2, ImageJ Έκδοση 1.42 (National Institutes of Health), και το Adobe Photoshop Έκδοση 7.0 (Adobe Systems).

Δυτική Blotting

Οι σβώλοι κυττάρων λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% δεοξυχολικό, 1% TritonX-100, 1 mM EDTA, 5 mM NaF, 1 mM βαναδικό νάτριο, και κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης ( Sigma). Τα κύτταρα λύθηκαν επί πάγου για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό RIPA, προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν, πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ποσοτικοποιήθηκαν και φορτώθηκαν σε 10% έως 15% γέλη δωδεκυλο θειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου, ηλεκτροφόρηση, και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Whatman). Η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτογενές αντίσωμα, πλύθηκαν και επωάστηκαν με υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός κιτ χημειοφωταύγειας δυτική ανιχνεύσεως (Cell Signaling Technology) [35].

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων δεδομένα αξιολογήθηκαν για σημαντικότητα χρησιμοποιώντας Student

t-test

αζευγάρωτων δεδομένων ή μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης και Bonferroni μετά τη δοκιμή.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

δραστηριότητας Δομή Σχέσεις (SAR) Ανάλυση Annonaceous Acetogenin μιμητικά

Μια σειριακή annonaceous acetogenin μιμητές. είχε συντεθεί με αντικατάσταση και των δύο τετραϋδροφουρανίου (THF) δακτυλίους των φυσικών bullatacin με μια απλή μονάδα διαιθυλενογλυκόλης από την ομάδα χημεία της ομάδας μας [25] – [28]. Εννέα νέα ανάλογα συντέθηκαν σε αυτό το έργο, και βρήκαμε ότι το μιμητικά AA005 [25] και AA093, μία ένωση με την εισαγωγή ενός 10-υδροξυ ομάδα πάνω AA005, αντιπροσώπευαν τα δύο ενώσεων οι οποίες είχαν τις χαμηλότερες τιμές IC50 σε αυτή τη ρύθμιση ( Τραπέζι 1). Η παρατήρηση ότι ένωση AA090 και AA091 λείπει η σωστή μονάδα λακτόνης και αριστερά ουρά 11-άνθρακα παρουσίασαν 17 έως & gt? 170 φορές χαμηλότερη κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα πρότεινε ότι αυτές οι ομάδες είναι απαραίτητες για τη κυτταροτοξικότητα του AA005. AA101 με μια πρόσθετη μονάδα λακτόνης ενσωματωμένο στο αριστερό μέρος αλυσίδα υδρογονάνθρακα εμφάνισαν μια 23 έως 142 φορές χαμηλότερη κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω τη σημασία της μακρά υδρόφοβη ουρά και το δικαίωμα τερματικό λακτόνης στο μιμητισμό. Προσθέτοντας μια μονάδα μέση αιθέρα στα μιμητικά (ενώσεις AA102-105) ελαφρώς ενισχυμένη αντι-πολλαπλασιαστική δράση τους σε σύγκριση με AA101, γεγονός που υποδηλώνει ότι μια μονάδα διαιθυλενογλυκόλης είναι απαραίτητη για την αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα. Η διαφορετική βιολογική δραστικότητα αυτών των μιμητικών δείχνει ότι τα δομικά ανάλογα μπορεί να μην είναι λειτουργικά ανάλογα.

ανασταλτικά αποτελέσματα της AA005 σε καρκινικά κύτταρα

Επειδή AA005 ήταν ο πιο ισχυρός κυτταροτοξικός παράγων μεταξύ αυτών μιμητικά, εμείς δοκιμαστεί περαιτέρω επιδράσεις του στις 11 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές και 4 μη καρκινικό κύτταρο γραμμές (HBEpiC, MRC5, HLF και 293Τ), και βρήκαν ότι AA005 έδειξε διαφορετικές επιδράσεις επί καρκινικών κυττάρων σε ότι είχε ισχυρή ανασταλτική επίδραση επί του κόλου (HCT116, ΗΤ29, LOVO και SW480), γαστρικό (SGC7901), ηπατική (BEL7402), του πνεύμονα (Α549) και μαστού (MCF7) γραμμές καρκίνου, και ασθενή επίδραση επί του τραχήλου της μήτρας (HeLa) καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 1Α). AA005 επέδειξαν ανασταλτικές επιδράσεις στην HCT116 (Σχήμα 1Β), ΗΤ29 (Σχήμα 1 C) και τα κύτταρα LOVO (Σχήμα 1 D) σε ένα δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. Είναι ενδιαφέρον, AA005 έδειξε μια ακόμη πιο αδύναμη δραστικότητα έναντι noncancerous (HBEpiC, MRC5, HLF, BEAS-2Β και 293Τ) κύτταρα (Σχήμα 1Α και Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι σχετικές επιλεκτική ανασταλτική δράση της AA005 επί καρκινικών κυττάρων απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση.

(Α) IC

50 τιμές του AA005 (σε 48 ώρες) για διάφορους ανθρώπινων καρκινικών και μη καρκινικό κύτταρο γραμμές. IC

50 τιμές (μέση ± SD, μΜ) υπολογίστηκαν από 3 ανεξάρτητα πειράματα. (Β έως Δ) δοκιμασίες ΜΤΤ κυττάρων HCT116 (Β), ΗΤ29 (C) και LOVO (Δ) κατά AA005 στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση και χρονικά σημεία.

Η

AA005 Καταστέλλει κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της Colony Forming Δραστηριότητα τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

αναλυθούν περαιτέρω τα αποτελέσματα της AA005 για καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Με τη χρήση του αποκλεισμό trypan blue αναλύσεις, δείξαμε ότι η αγωγή με AA005 στους 50 έως 200 ηΜ για 24 έως 48 ώρες αξιοσημείωτα ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ΗΤ29, LOVO και HCT116, αλλά όχι HBEpiC ή κύτταρα BEAS-2Β (Σχήμα 2, Α και Β) . δοκιμασία σχηματισμού Εστίες έδειξαν ισχυρή ανασταλτική δράση AA005 για δραστηριότητα των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου (Σχήμα 2C) σχηματισμού αποικίας. Αναλύσαμε τις επιδράσεις της AA005 επί του κυτταρικού κύκλου και διαπίστωσε ότι AA005 προκάλεσε σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου σε φάση G1 σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2D).

(Α, Β) που υποδεικνύεται κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς AA005 για 48 ώρες ή υποδεικνύεται χρονικά σημεία και αναλύθηκαν με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. δοκιμασία σχηματισμού (C) Colony για την κλωνογόνο δραστικότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου σε επεξεργασία κυττάρων με ή χωρίς AA005. (D) τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με AA005 σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. κατανομή του κυτταρικού κύκλου καθορίστηκε με κυτταρομετρία ροής.

Η

AA005 Στόχοι μιτοχόνδρια, εξαντλεί ΑΤΡ και ενεργοποιεί AMPK στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

Φλουορεσκεΐνης-επισημασμένο AA005 (AA005-γρίπη, Σχήμα 3Α) ήταν ολοκλήρωσε με επιτυχία από ένα πρωτόκολλο αξιολόγησης με τη βοήθεια βιολογική δραστηριότητα αφού εξέτασε μια σειρά πιθανών θέσεων παραγώγων παράλληλα [36]. AA005-γρίπης βρέθηκε να παρουσιάζουν παρόμοια επιλεκτικότητα των κυττάρων με τη γονική μόριο του, και συσσωρεύονται στα μιτοχόνδρια των ηπατικών καρκίνου, αλλά όχι κανονικά κύτταρα [36]. Με τη χρήση ανοσοφθορισμού συνεστιακής ανάλυσης μικροσκοπία, αποδείξαμε ότι AA005-γρίπης θα μπορούσε να συν-εντοπίζεται με μιτοχόνδρια σε ΗΤ29, HCT116 και κυττάρων LOVO (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, το σήμα AA005-γρίπης ήταν πολύ ασθενής σε μιτοχόνδρια των HBEpiC ή 293Τ κύτταρα (Σχήμα 3Β). Ενώ AA005-γρίπη ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των LOVO, ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, κυτταροτοξική δράση της επί HBEpiC ήταν αδύναμη (Σχέδιο 3C). Επιπλέον, αναφέρθηκε ότι AA005 θα μπορούσε να αυξήσει Rhodamine 123-αρνητικά κλάσματα σε ΗΤ29 και LOVO αλλά όχι HBEpiC κύτταρα (Σχήμα 3D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι AA005 θα μπορούσε να στοχεύσει μιτοχονδριακό μόρια και έτσι να διαταράξει ενεργητικός μονοπάτι των καρκινικών κυττάρων.

(Α) Χημική δομή της AA005-φλουορεσκεΐνης. (Β) Το ενδοκυτταρικό εντοπισμό της AA005. Τα κύτταρα συν-επωάστηκαν με AA005-γρίπη στα 100 ηΜ για 12 ώρες, και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιώντας ένα Mitotracker (κόκκινο) για την αντιμετώπιση-λεκέ μιτοχόνδρια. (C) ΜΤΤ δοκιμασία του LOVO, ΗΤ29, HCT116 και τα κύτταρα HBEpiC κατόπιν AA005-γρίπης σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. (D) AA005 μειώνει την μιτοχονδριακή διαμεμβρανικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου αποκάλυψε αύξηση Rhodamine 123-αρνητικά κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AA005 στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση για 24 ώρες και αναλύθηκε με χρώση ροδαμίνη 123 και κυτταρομετρία ροής. (Ε) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς AA005 στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση για 24 ώρες, NAD + λόγος /NADH

μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα AmpliteTM Χρωματομετρική NAD /NADH Assay Kit. (F) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς AA005 στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση για 24 ώρες, και το περιεχόμενο ΑΤΡ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΤΡ βιοφωταύγεια Assay Kit. (G) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AA005 στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση και χρονικά σημεία, λύθηκαν, και ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

Τα μιτοχόνδρια παραγόντων στόχευσης (mitocans) είναι επιρρεπείς σε διαταραχές μονοπάτι φωσφορυλίωσης οξείδωση και μειώνοντας NAD αναλογία

+ /NADH, με αποτέλεσμα την αναστολή της ΑΤΡ παραγωγής και την ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ που αντανακλάται από φωσφορυλίωση και απενεργοποίηση του ακετυλ-ΟοΑ καρβοξυλάση (ACC) (Ser79) η οποία είναι ένας δείκτης για την δραστικότητα ΑΜΡΚ [37]. Ελέγξαμε την επίδραση του AA005 επί της κυτταρικής NAD

+ /αναλογία NADH και το περιεχόμενο του ΑΤΡ, και βρήκαν ότι σε κύτταρα ΗΤ29 και LOVO, η θεραπεία με AA005 στους 50 έως 200 ηΜ για 24 ώρες μειώνεται NAD αναλογία

+ /NADH ( Σχήμα 3Ε) και απεμπλουτισμένο ΑΤΡ σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3F), ενώ κατά τρόπο ενδιαφέροντα, AA005 δεν θα μπορούσε να μειωθεί σημαντικά NAD

+ /NADH αναλογία και το περιεχόμενο ΑΤΡ στα κύτταρα HBEpiC (Σχήμα 3Ε και F). Επιπλέον, AA005 σημαντικά επάνω ρυθμισμένη ρ-ΑΜΡΚ και π-ACC σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3G). Ωστόσο, αυτά τα φαινόμενα δεν παρατηρήθηκαν σε κύτταρα HBEpiC (Εικόνα 3G).

Δείξαμε ότι AA005 καθώς και οι mitocans AICAR ροτενόνη και προκαλείται εξάντληση του ΑΤΡ στα κύτταρα ΗΤ29 και LOVO, ενώ ΑΜΡΚ αναστολείς ένωση Γ και ινοσίνη εξασθενημένο Αυτό το αποτέλεσμα (Σχήμα 4Α). AA005, AICAR ροτενόνη και πάνω ρυθμισμένα ρ-ΑΜΡΚ και π-ACC, ενώ η ένωση C και ινοσίνη μειωμένη AA005-ενεργοποιείται ανοδική ρύθμιση των δύο μορίων (Εικόνα 4Β). Επιπλέον, ενώ AA005 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΗΤ29 και LOVO, ένωση Γ και ινοσίνη μειώνεται αυτό το αποτέλεσμα (Σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση ΑΜΡΚ απαιτείται για AA005-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου.

(Α) Τα αναφερόμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο του ή συνδυαστικά με AA005 (100 ηΜ), AICAR (ΑΑ, 1 mM), retenone (1 μΜ), η ένωση Γ (CC, 10 μΜ), ή ινοσίνη (20 mM) για 24 ώρες, και το περιεχόμενο ΑΤΡ μετρήθηκε. (Β) ΗΤ29 και κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενο πρωτόκολλο, λύθηκαν, και κηλίδωση Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Γ) ΗΤ29 και κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές θεραπευτικές αγωγές για 48 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ.

Η

ΑΜΡΚ Ενεργοποίηση Μεσολαβεί AA005 επαγόμενη mTOR σύμπλοκο 1 (mTORC1) Αναστολή in vitro

Ενεργός ΑΜΡΚ φωσφορυλιώνει TSC2 σε Thr-1227 και Ser-1345 και αυξάνει τη δραστηριότητα των TSC1-TSC2 συγκρότημα να αναστέλλει την πρωτεΐνη mTOR [12]. Δοκιμάσαμε τις επιδράσεις της AA005 για mTORC1, και ανέφερε ότι AA005 μειώθηκε π-mTOR και π-S6K (p85 και p70 S6K) σε LOVO και ΗΤ29 αλλά όχι HBEpiC κύτταρα (Σχήμα 3G). AICAR ροτενόνη και επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω π-mTOR σε ΗΤ29 και κύτταρα LOVO (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, AA005 που προκαλείται από π-mTOR κάτω ρύθμιση θα μπορούσε να κατασταλεί εν μέρει από ινοσίνη και η ένωση Γ (Εικόνα 4Β). Ένωση Γ και ινοσίνη επίσης μερικώς εξασθενημένα κυκλίνη D1 κάτω ρύθμιση που προκαλείται από AA005 (Εικόνα 4Β).

ΑΜΡΚ /mTOR Σηματοδοσίας εμπλέκεται σε AA005 Induced Autophagy in vitro

ενεργοποίηση ΑΜΡΚ μπορεί να προκαλέσει αυτοφαγία μέσω αναστολή της mTOR (49). Δοκιμάσαμε εάν AA005 θα μπορούσε να προκαλέσει αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ή όχι με ανίχνευση των αλλαγών του κυτοσολίου μορφής (LC3-I) και λιπιδιωμένη μορφή (LC3-II) της LC3 δείκτη αυτοφαγία. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι AA005 επαγόμενη συσσώρευση LC3-ΙΙ σε κύτταρα LOVO με χρονο και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5Α). Το πλασμίδιο pQCXIP-GFP-LC3 επιμολύνθηκε σε κύτταρα LOVO τα οποία στη συνέχεια κατεργάζεται με AA005 στα 100 ηΜ για 24 ώρες, ακολουθούμενη από συνεστιακή μικροσκοπία εκτίμηση. Δείξαμε ότι ενώ τα κύτταρα ελέγχου επέδειξαν διάχυτη χρώση, τα κύτταρα LOVO κατόπιν AA005 ή mTOR αναστολέας ραπαμυκίνη (100 ηΜ) εμφάνισε μια διάστικτα φθορίζουσα πρότυπο χρώσης, υποδηλώνοντας την ανακατανομή των LC3 να αυτοφαγοσώματα (Σχήμα 5Β). Είναι ενδιαφέρον, ινοσίνη εξασθενημένο AA005-προκάλεσε σχηματισμό LC3 αυτοφαγοσώματα (Σχήμα 5Β) και τη συσσώρευση των LC3-ΙΙ (Σχήμα 5C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι AA005 προκαλεί αυτοφαγία των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω της οδού σηματοδότησης ΑΜΡΚ /mTOR. Ωστόσο, η θεραπεία με AA005 σε 50-200 ηΜ για 24 ώρες ή 100 ηΜ για 12-48 ώρες δεν είχε ως αποτέλεσμα σημαντική απόπτωση των κυττάρων LOVO, που αντικατοπτρίζεται με χρώση Αηηβχίη V /PI και κυτταρομετρία ροής εκτίμηση (Εικόνα 5D) ή ανάλυση στυπώματος Western της διάσπασης της PARP, ενός υποστρώματος ενεργοποιημένου Casp-3 (Σχήμα 5Ε).

(Α) ανάλυση ανοσοκηλίδος των επιπέδων LC3-ΙΙ LC3-Ι και σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με LOVO AA005. κύτταρα (Β) LOVO επιμολυσμένα με pQCXIP-GFP ή πλασμίδιο pQCXIP-GFP-LC3 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με AA005 (100 ηΜ) και /ή ινοσίνη (20 mM), και η ραπαμυκίνη (100 ηΜ), και αξιολογούνται από αναλύσεις ανοσοφθορισμού. (Γ) Κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη πρωτόκολλα, λύθηκαν, και δοκιμασία κηλίδος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα. (D) Κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AA005 ή σισπλατίνη (20 μΜ) για 24 ώρες, ή AA005 στα 100 ηΜ για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με χρώση V /ΡΙ αννεξίνης και κυτταρομετρία ροής. (Ε) κηλίδας Western αναλύσεις των προϊόντων λύσης κυττάρων LOVO σε επεξεργασία με AA005 ή σισπλατίνη (20 μΜ για 24 ώρες).

Η

AA005 συνεργεί με 2-δεοξυγλυκόζη και Cisplatin σε ανασταλτική Colon του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων με τροποποίηση της ΑΜΡΚ και mTOR

2-δεοξυγλυκόζης (2-DG) είναι ένα συνθετικό ανάλογο της γλυκόζης ικανό να αναστέλλει τη γλυκόλυση και την παραγωγή του ATP [38]. Δοκιμάσαμε τις συνδυασμένες επιδράσεις της AA005 και 2-DG σε κύτταρα LOVO, και βρήκαν ότι η συνδυασμένη χρήση των δύο παραγόντων που ασκείται συνέργεια σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα 6Α και Β) και η καταστολή της ΑΤΡ γενιάς (Σχήμα 6C). AA005 σε συνδυασμό με 2-DG οδήγησε σε αυξημένη up-ρύθμιση του π-ΑΜΡΚ και p-ACC, και προς τα κάτω ρύθμιση του π-mTOR και CDK4 (Σχήμα 6D).

(Α, Β) κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε θεραπεία ενδείκνυται πρωτόκολλα για 48 ώρες, αναλύθηκαν με ΜΤΤ δοκιμασία (Α), και τα συνδυασμένα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με την μέθοδο Chou-Talay και λογισμικό CalcuSyn (Β). Οι συνδυασμό δείκτες (CI) μικρότερη, ίση και μεγαλύτερη από 1 δείχνουν συνεργιστική, πρόσθετο, και ανταγωνιστικές επιδράσεις, αντίστοιχα. (Γ) Κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ηΜ AA005 και /ή 5 mM 2-DG για 24 ώρες, και το περιεχόμενο του ΑΤΡ εκτιμήθηκε όπως περιγράφηκε παραπάνω. (D) κηλίδος Western αναλύσεις των προϊόντων λύσης κυττάρων LOVO σε επεξεργασία με AA005 και /ή 2-DG χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Ε, F) Κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε αγωγή ενδείκνυται πρωτόκολλα για 48 ώρες, αναλύθηκαν με ανάλυση ΜΤΤ (Ε), και τα συνδυασμένα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με την μέθοδο Chou-Talay και λογισμικό CalcuSyn (F). (G) κηλίδας Western αναλύσεις των προϊόντων λύσης κυττάρων LOVO σε επεξεργασία με AA005 και /ή σισπλατίνη χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα. (H) κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AA005 και /ή σισπλατίνη, και αναλύθηκαν με χρώση Αηηβχίη V /PI και κυτταρομετρία ροής. (Ι) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AA005 και /ή σισπλατίνη για 24 ώρες, και το περιεχόμενο ΑΤΡ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΤΡ βιοφωταύγεια Assay Kit. (J) κύτταρα LOVO υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AA005 και /ή σισπλατίνη για 24 ώρες, και η κατανομή του κυτταρικού κύκλου καθορίστηκε με κυτταρομετρία ροής.

Η

χημειοθεραπευτικοί σισπλατίνη παράγοντας μπορεί πλειορύθμιση mTOR μονοπάτι επιβίωσης που προσδίδει αντίσταση στο φάρμακο σε καρκινικά κύτταρα [39]. Δείξαμε ότι ενώ AA005 και σισπλατίνη που προκαλείται συνεργιστική ανασταλτική επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού LOVO (Σχήμα 6Ε και F), AA005 μειώθηκε σισπλατίνη ενεργοποιείται ανοδική ρύθμιση του mTOR και S6K (Σχήμα 6G). Συνδυασμένη χρήση AA005 και σισπλατίνη οδήγησε σε αυξημένη αποπτωτική δράση στα κύτταρα LOVO, που αντικατοπτρίζεται με χρώση Αηηβχίη V /PI και κυτταρομετρία ροής εκτίμηση (Σχήμα 6Η) ή ανάλυση στυπώματος Western της διάσπασης της PARP (Σχήμα 6G). Ωστόσο, ο συνδυασμός αυτών των δύο παραγόντων δεν προκάλεσαν συνέργεια σε εξάντληση του περιεχομένου ΑΤΡ (Σχήμα 6θ), διακοπή του κυτταρικού κύκλου (σχήμα 6J), ή autophagy (που αντικατοπτρίζεται από την έκφραση LC3-ΙΙ, Σχήμα 6G) σε κύτταρα LOVO.

Συζήτηση

Annonaceous acetogenins αντιπροσωπεύουν μια σειρά από C-35 /C-37 φυσικά προϊόντα με υδροξυλιωμένα THF και τις γ-λακτόνη δακτυλίων δομές [25], [26], [28]. Πολλά μέλη της οικογένειας αυτής παρουσιάζουν κυτταροτοξική δραστικότητα από διαταραχή του τερματικού σταδίου μεταφοράς ηλεκτρονίων σε συγκρότημα Ι των μιτοχονδρίων [40]. AA005 είναι ένα μιμητικό annonaceous acetogenin στην οποία και οι δύο δακτύλιοι ΤΗΡ αντικατασταθεί από μια μονάδα αιθυλενογλυκόλης. AA005 διατηρεί τις βασικές λειτουργίες των φυσικών acetogenins και δείχνει πιο ισχυρή βιολογική δράση [41]. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι AA005 είναι σε θέση να ενεργοποιήσει AMPK και αναστέλλει την πρωτεΐνη mTOR, ως εκ τούτου, συλλαμβάνει κυτταρικού κύκλου στην φάση G1 και προκαλεί αυτοφαγία των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. συνέργειες AA005 με αναστολέα γλυκόλυση 2-DG για αισθητή αποκλεισμό ΑΤΡ παραγωγή, και ανταγωνίζεται σισπλατίνη που προκαλείται ανοδική ρύθμιση του π-mTOR, οδηγώντας σε αυξημένη αναστολή πολλαπλασιασμού και διέγερση απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι AA005 φέρει θεραπευτικές δυνατότητες, τουλάχιστον σε αυτό το είδος των κακοήθων νεοπλασμάτων

Στόχευση μεταβολισμό των κυττάρων του καρκίνου, ειδικά αναστολή γλυκόλυση, έχει αναδειχθεί ως μια νέα πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την καταπολέμηση του καρκίνου [42] – [44].. Μιτοχόνδρια διαχειρίζεται όχι μόνο την παραγωγή ενέργειας μέσω κύκλο του κιτρικού οξέος (κύκλος τρικαρβοξυλικού οξέος, του κύκλου TCA), αλλά και να παίξουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης μέσω της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος C. Αν και έχει υπάρξει πολλή συζήτηση για το αν μιτοχόνδρια έχουν ελαττώματα στην οξειδωτική φωσφορυλίωση μονοπάτι, αυτό θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος για θεραπεία του καρκίνου [42], [45]. Ορισμένες mitocans όπως metaformin και βιταμίνη Ε ανάλογα τα οποία αναστέλλουν συγκρότημα Ι και II δείχνουν την αποτελεσματική και εκλεκτική αντικαρκινική δραστικότητα. Αυτοί οι παράγοντες επάγουν θάνατο των καρκινικών κυττάρων μέσω της γενιάς του υπεροξειδίου και μιτοχονδριακή αποσταθεροποίηση [46]. ΑΤΡ θα μπορούσαν επίσης να εξαντληθούν σε κάποιο βαθμό κατά την αγωγή του mitocans [42], [45]. Μιτοχόνδρια συγκρότημα Ι έχει δειχθεί ότι στοχεύονται από annonaceous acetogenin [40]. Αναφέρουμε ότι μπορεί να AA005 συν-εντοπίζονται με μιτοχόνδρια σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά όχι HBEpiC ή 293Τ κύτταρα (Σχήμα 3Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να μειώσει AA005 NAD

+ αναλογία /NADH και παραγωγή ΑΤΡ σε καρκινικά κύτταρα. Η δυνατότητα αυτή επιβεβαιώνεται LOVO, ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 (Σχήμα 3C). Ωστόσο, γιατί μιτοχόνδρια των καρκινικών κυττάρων είναι πιο επιρρεπείς να απευθύνονται από AA005 παραμένει ένα ανοιχτό ερώτημα. Αναστολή των μιτοχονδρίων από metaformin και ροτενόνη μπορεί να οδηγήσει σε ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ [42]. Δείχνουμε ότι AA005 μπορούν επίσης να καταστείλουν τα μιτοχόνδρια και ενεργοποιούν ΑΜΡΚ (Σχήμα 3).