Αφηρημένο

Ο αριθμός των νεφρικών καρκίνων έχει αυξηθεί κατά τα τελευταία δέκα χρόνια και την επιβίωση των ασθενών σε προχωρημένα στάδια παραμένει πολύ κακή. Ως εκ τούτου, οι νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις για καρκίνο του νεφρού είναι απαραίτητη. Englerin Α είναι ένα φυσικό προϊόν με μια πολύ ισχυρή και εκλεκτική κυτταροτοξικότητα εναντίον νεφρικών καρκινικών κυττάρων. Αυτό το καθιστά ένα πολλά υποσχόμενο υποψήφιο φάρμακο που μπορεί να βελτιώσει τα ισχύοντα πρότυπα θεραπείας για ασθενείς με νεφρική καρκίνους σε όλα τα στάδια. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη λειτουργία englerin Α της δράσης που στοχεύουν ειδικά νεφρική καρκινικών κυττάρων. Η μελέτη μας είναι η πρώτη για τη διερεύνηση της βιολογικής μηχανισμό englerin δράση λεπτομερώς. Αναφέρουμε ότι englerin Α είναι ειδικό για κύτταρα νεφρικού όγκου και δεν επηρεάζει τα φυσιολογικά κύτταρα νεφρού. Βρίσκουμε ότι englerin Μια θεραπεία επάγει νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα νεφρού. Δείχνουμε ότι η περαιτέρω αυτοφαγικά και pyroptotic πρωτεΐνες δεν επηρεάζονται από την ένωση και ότι νεκρωτικές σηματοδότηση στα κύτταρα αυτά συνέπεσαν με την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου και την εισροή ασβεστίου στο κυτταρόπλασμα. Καθώς η πρώτη μελέτη για την ανάλυση των βιολογικών αποτελεσμάτων του englerin Α, η εργασία μας παρέχει μια σημαντική βάση για την αξιολόγηση και την επικύρωση της χρήσης της ένωσης σαν ένα φάρμακο κατά του όγκου. Παρέχει επίσης ένα πλαίσιο μέσα στο οποίο να εντοπισθεί ο συγκεκριμένος στόχος ή οι στόχοι των englerin Α σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Sulzmaier FJ, Li Ζ, Nakashige ML, Fash DM, αλυσίδα WJ, Ράμος JW (2012) Englerin Μια επιλεκτικά επάγει νέκρωση στα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του νεφρού. PLoS ONE 7 (10): e48032. doi: 10.1371 /journal.pone.0048032

Επιμέλεια: Kalpana Ghoshal, το Ohio State University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6, Ιούλη του 2012? Αποδεκτές: 26 Σεπτέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 22, Οκτωβρίου 2012

Copyright: © Sulzmaier et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Γενικής Ιατρικής (R01GM088266 να JWR) και η Victoria S. και Bradley Ίδρυμα L. Geist (47.030 έως WJC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του νεφρού είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες στις ΗΠΑ, με εκτιμώμενη 60.920 νέα κρούσματα και 13.120 θανάτους το 2011. Περίπου το 85% όλων των καρκίνων του νεφρού έχουν ταξινομηθεί ως νεφρική-καρκίνωμα, μια κακοήθεια που προκύπτουν από την νεφρική επιθήλιο [1], [2]. Η πρωταρχική θεραπεία για ασθενείς με νεφροκυτταρικό-κυττάρων είναι η χειρουργική εκτομή. Ωστόσο, περίπου 25% των ασθενών παρουσιάζουν σημεία τοπικού εισβολής ή μετάστασης κάνει μια πλήρη εκτομή δύσκολη [2]. Μόλις η ασθένεια είναι σε προχωρημένο στάδιο, η χειρουργική επέμβαση από μόνη της δεν είναι επαρκής και η επιβίωση των ασθενών 5 χρόνια μειώνεται από 70% σε κάτω από 20% [1], [3]. Ιστορικά, η κατάσταση της θεραπείας τέχνης για ασθενείς με νεφροκυτταρικό καρκίνωμα έχει ανοσοτροποποιητική θεραπεία με ιντερφερόνη-α ή ιντερλευκίνη-2 [4]. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αύξηση της χρήσης των πιο στοχευμένες προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση του προχωρημένου σταδίου νεφρική καρκίνους. Η ανακάλυψη του νοη Hippel-Lindau (VHL) γονίδιο οδηγούν ογκοκατασταλτικά στην ανάπτυξη της τυροσίνης του υποδοχέα κινάσης θεραπειών που βασίζονται στοχεύουν στην οδό VEGF ή ΤΟΡ-α σηματοδότηση [5], [6]. VHL ρυθμίζει την αγγειογένεση και την απώλεια αυτού του γονιδίου σε καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε αυξημένη παραγωγή των αυξητικών παραγόντων, όπως ο VEGF [7]. Εναλλακτικά, οι αναστολείς της τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα όπως Sorafenib που μπλοκάρουν την σηματοδότηση μέσω επηρεάζονται μονοπάτια έχουν ήδη εγκριθεί ή σε κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία του προχωρημένου νεφρικού καρκίνων [8]. Ωστόσο, τα φάρμακα αυτά δεν ισχύουν για όλους τους ασθενείς με προχωρημένη νεφρική καρκίνους και σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες έχουν αναφερθεί σε ορισμένες περιπτώσεις [2], [9].

Englerin Α είναι μια σεσκιτερπένιο guaiane που έδειξε ενδιαφέρουσα ιδιαιτερότητα ως αναστολέας της νεφρικής ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [10]. Το φυσικό προϊόν απομονώνεται από το φλοιό του

Phyllanthus engleri

, ένα φυτό ιθαγενών στην Τανζανία και τη Ζιμπάμπουε. Englerin Α διαλογή για ειδική κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι μιας ομάδας κυτταρικών σειρών καρκίνου (NCI panel 60-κύτταρο). Σε αυτή την οθόνη, η ένωση έδειξε νεφρικό καρκίνο συγκεκριμένες GI

50 αξίες που ήταν μέχρι 1000fold χαμηλότερο σε σχέση με άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές. GI

50 τιμές που προσδιορίστηκαν ήταν τόσο χαμηλά όσο 11 ηΜ για ορισμένα νεφρικών καρκινικών κυτταρικών σειρών [10], [11]. Englerin Ένα όχι μόνο έδειξε εξαιρετική εξειδίκευση για νεφρική καρκινικών κυττάρων, σε ορισμένες περιπτώσεις, την ισχύ της ήταν ακόμη μεγαλύτερη τότε κατάσταση των θεραπειών τέχνης, όπως Sorafenib [10], [12]. Μετά την αρχική περιγραφή του το 2009, τα εργαστήρια σε όλο τον κόσμο έχουν περιγραφεί συνθετικές στρατηγικές για να κάνουν το φυσικό προϊόν [13], [14], [15], [16], [17], καθώς και οι αυξανόμενες ποσότητες δομής-δραστικότητας σχέση δεδομένων [11], [18], [19], [20], [21], [22]. Παρά την υψηλή επίπτωση της βιβλιογραφίας σχετικά με englerin Α εξακολουθεί να είναι περιορισμένη και να δημοσιεύσει άρθρα ασχολούνται κυρίως με τη σύνθεση της ένωσης. Εμείς τώρα αναφορά, για πρώτη φορά ένας μηχανισμός με τον οποίο englerin Α δρα επί νεφρικά καρκινικά κύτταρα για να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι englerin Α επάγει ειδικά νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο σε ασθενείς με νεφρική καρκινικές κυτταρικές σειρές, αλλά δεν επηρεάζει την βιωσιμότητα ενός γλοιοβλαστώματος κυτταρική σειρά καρκίνου ή φυσιολογικά κύτταρα νεφρού. Η μελέτη μας παρέχει πρόσθετες πληροφορίες για τη βιολογική δραστηριότητα της englerin Α

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Englerin Α συντέθηκε στο εργαστήριο του Δρ William J. Αλυσίδα σύμφωνα με το πρωτόκολλο που δημοσιεύθηκε προηγουμένως [12]. Η σταυροσπορίνη αγοράστηκε από την EMD Chemicals (Merck, Darmstadt, Γερμανία), ιονομυκίνη και διφωσφορική χλωροκίνη αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, ΜΟ).

Γραμμές κυττάρου και κυττάρου Culture

ανθρώπινα νεφρικών γραμμές καρκινώματος Α-498 και UO-31, καθώς επίσης και η κυτταρική σειρά γλοιοβλαστώματος ανθρώπινο SF-295 ελήφθησαν από τον όγκο Repository DCTD του National Cancer Institute, Frederick, Maryland. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Mediatech Inc., Manassas, VA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ), 1% ΜΕΜ μη βασικά αμινοξέα (ΝΕΑΑ, Mediatech) και 1% πενικιλίνη στρεπτομυκίνη (Penstrep, Mediatech). ΗΕΚ293 κύτταρα αγοράστηκαν από την ATCC (Rockville, MD) και διατηρήθηκαν σε DMEM (Mediatech) συμπληρωμένο με 10% FBS, 1% ΝΕΑΑ και 1% Penstrep. Νεφρική εγγύς σωληνοειδή κύτταρα (RPTC) αγοράστηκαν από την Lifeline Cell Technology (Frederick, MD). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RenaLife πλήρες μέσο (τεχνολογία κυψελών Lifeline). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε 90 μΙ RPMI χωρίς ερυθρό φαινόλης και χωρίς αντιβιοτικά, συμπληρωμένο με 10% FBS και 2 mM L-γλουταμίνη. Κυττάρων σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αγκυροβολεί κάτω για 60 λεπτά στους 37 ° C και 5% CO2 σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Μετά από 60 λεπτά, προστέθηκαν 10 μΙ englerin Ένα διάλυμα εργασίας ή ισοδύναμο όγκο DMSO αραιώνονται σε μέσο RPMI. Ένα englerin Ένα αποθεματικό διάλυμα παρασκευάστηκε με διάλυση της ένωσης σε DMSO σε συγκέντρωση 10 mM. Όλα τα επιπλέον englerin Α διαλύματα εργασίας παρασκευάστηκαν με αραίωση αυτού του διαλύματος στοκ με μέσο RPMI στην επιθυμητή τελική συγκέντρωση όπως υποδεικνύεται. Ο όγκος του englerin Ένα διάλυμα αποθέματος ή φορέα DMSO ελέγχου επομένως δεν υπερέβη ποτέ το 0,1% του τελικού όγκου. Μετά την προσθήκη της ένωσης, τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (ΧΤΤ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ).

κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5000 κυττάρων ανά φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων σε 90 μl καλλιέργεια μέσο χωρίς ερυθρό φαινόλης και αντιβιοτικά. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αγκυροβολεί κάτω για 60 λεπτά κάτω από κανονικές συνθήκες καλλιέργειας. Μετά την περίοδο επώασης 10 μΐ englerin Α αραιώσεις ή ο DMSO διαλύτη ως έλεγχος προστέθηκαν στα φρεάτια. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες με την ένωση πριν από την υποβολή τους σε ένα κελί Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (ΧΤΤ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ).

Μικροσκοπία

μικροφωτογραφίες φωτεινού ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Axiovert200M μικροσκόπιο με στόχο 40x. Κεκτημένα εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό AxioVision. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 20 μm.

αννεξίνη V /PI δοκιμασία

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία είτε με 1 μΜ englerin Α, φορέα DMSO ή 5 μΜ σταυροσπορίνη για την υποδεικνυόμενη χρονικό διάστημα (1 ώρα ή 3 ώρες) . Μετά την επώαση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για έκφραση σερίνη εξωκυτταρικό φωσφατιδυλο χρησιμοποιώντας FITC-επισημασμένο Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) ως συν-χρώση για τη δοκιμή ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης (BD Biosciences, San Jose, CA). Βαφές χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACScan κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences) και CellQuest Pro λογισμικό ανάλυσης.

Η λύση των κυττάρων και ανοσοστύπωμα

Κυτταρολύματα παρασκευάσθηκαν χρησιμοποιώντας MLB ρυθμιστικού λύσης (1% ΝΡ-40, 25 mM HEPES-ΚΟΗ (ρΗ 7,5), 150 mM NaCl, 0.25% δεοξυχολικό νάτριο, 10% γλυκερόλη, 10 mM MgCl

2, 1 mM EDTA και αναστολείς πρωτεάσης /φωσφατάσης). Κυτταρολύματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE, ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση. Η έκφραση πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε με ειδικά πρωτογενή αντισώματα έναντι PARP, κασπάσης 3 και GAPDH (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), όπως επίσης και κασπάση 1 (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ), Beclin-1 (Epitomics, Burlingame, CA) και LC-3 (Novus Biologicals, Littleton, CO). Η σύνδεση των πρωτογενών αντισωμάτων ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας IRDye 680 κατσίκας αντι-ποντικού και IRDye δευτερεύοντα αντισώματα αντι-κουνελιού κατσίκας 800. Συγκροτήματα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Οδύσσεια υπερύθρων απεικόνισης (Li-Cor Βιοεπιστημών, Lincoln, NE).

κασπάσης 3 δραστηριότητα δοκιμασία

κασπάσης 3 σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με englerin Α, σταυροσπορίνη ή DMSO φορέα έλεγχος αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ προσδιορισμού κασπάσης 3 Δραστηριότητα (Roche Diagnostics). Μετά από επώαση με την ένωση κύτταρα λύθηκαν και τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ROS δοκιμασία ανίχνευσης

Κύτταρα κατεργασμένα με englerin Α, σταυροσπορίνη ή ελέγχου φορέα DMSO δοκιμάστηκαν για την παραγωγή τους αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και αζώτου χρησιμοποιώντας την Total ROS Detection Kit (Enzo Lifesciences, Farmingdale, ΝΥ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η σχετική μεταβολή στην αντιδραστική οξυγόνο ή αντιδραστικά είδη αζώτου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοαη (BD Biosciences) και CellQuest Pro λογισμικό ανάλυσης.

ενδοκυτταρικού Ca

2+ δοκιμασία

Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση ασβεστίου μετρήθηκε αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με englerin Α, φορέα DMSO ή ιονομυκίνη θετικός έλεγχος. Μετά από επώαση 30 λεπτά με την ένωση 2 μΜ Fluo-3 ΑΜ (Life Technologies) προστέθηκε για μεταγενέστερη επώαση 30min. Μετά την επώαση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και πλύθηκαν με 1χ PBS. Fluo-3 σύνδεση σε Ca

2+ ιόντων μετρήθηκε μέσω της αυξημένης εκπομπής φθορισμού της χρωστικής στα 520 nm μετά από διέγερση στα 485 nm. Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACScan κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences) και CellQuest Pro λογισμικό ανάλυσης.

Αποτελέσματα

χημικώς συντίθενται englerin Α μειώνει τη βιωσιμότητα των νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών

Englerin A έχει περιγραφεί ότι έχουν ισχυρή δραστικότητα στην αναστολή της νεφρικής ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [10]. Πρόσφατες δημοσιεύσεις περιγράφουν μεθόδους για την συνθετική παραγωγή englerin Α χωρίς την ανάγκη της απομόνωσης του φυσικού προϊόντος [13], [14], [16], [17]. Όλα englerin Α σε μελέτη μας (χημική δομή βλέπε Εικ. 1

A

) έχει συντεθεί ακολουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο πρόσφατο άρθρο μας από τους Li και συνεργάτες [12]. Προκειμένου να αξιολογηθεί η δραστικότητα του συνθετικού englerin Α εμείς διαλογή κυτταροτοξικών επιδράσεων της σε δύο ανθρώπινων νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών (UO-31 και Α-498) που έχουν περιγραφεί πριν να είναι ευαίσθητη στο φυσικό προϊόν. Όπως κυτταρική γραμμή ελέγχου χρησιμοποιήσαμε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά γλοιοβλαστώματος (SF-295), έχουν αναφερθεί στο παρελθόν να είναι αδιάφορη για englerin Α [10]. Επιπλέον αναλύσαμε τις επιδράσεις της englerin Μια θεραπεία για τη βιωσιμότητα μιας αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά νεφρού προερχόμενα από φυσιολογικά ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (ΗΕΚ293) και φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα νεφρού (νεφρικών εγγύς σωληνοειδή κύτταρα, RPTC). Η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με μέτρηση της μεταβολικής δραστηριότητας των κυττάρων.

(Α) Χημική δομή του englerin Α (Β) γλοιοβλάστωμα (SF-295), η κανονική αθανατοποιημένα κύτταρα νεφρού (ΗΕΚ-293), η νεφρική εγγύς σωληναρίου κύτταρα (RPTC) και νεφρικά καρκινικά κύτταρα (UO-31, Α-498) επωάστηκαν με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του englerin Α για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΧΤΤ Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται σε% βιωσιμότητα σε σύγκριση με ένα δείγμα κυττάρων υποβάλλεται σε επεξεργασία με τον φορέα DMSO. Οι τιμές που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τη μέση ± SEM όλων των πειραμάτων (n≥6). Οι τιμές IC50 υπολογίστηκαν με Prism 5 χρησιμοποιώντας μια μη-γραμμική προσαρμογή παλινδρόμησης (log (αναστολέα) έναντι κανονικοποιημένη απόκριση – μεταβλητή κλίση).

Η

Βρήκαμε ότι englerin Α μείωσε τη βιωσιμότητα των νεφρικών καρκινικών κυττάρων ενώ δεν είχε κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί της κυτταρικής ελέγχου γλοιοβλαστώματος γραμμή (Σχ. 1

B

). Είναι ενδιαφέρον ότι, η ένωση δεν επηρέασε την βιωσιμότητα των κυττάρων ΗΕΚ293 είτε και μόνο αλλαγμένο βιωσιμότητα των κυττάρων σε RPTCs σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις (σχ. 1

B

,

αριστερά

). IC

50 τιμές προσδιορίστηκαν ως 140.3 ηΜ για UO-31 κύτταρα και 53.25 nm και 498-κύτταρα. Το IC

50 για RPTCs ήταν περίπου επτά μεγέθη υψηλότερα και υπολογίστηκε ως 2,53 Μ

Englerin Α προκαλεί μορφολογικές αλλαγές διαφορετικό από σταυροσπορίνη απόπτωση

Για να εξαιρέσετε englerin Α επιπτώσεις στην κυτταρική πολλαπλασιασμό που θα αντιπροσώπευε για την παρατηρούμενη μείωση της μεταβολικής δραστηριότητας αναλύσαμε τη μορφολογία των κυττάρων μετά από θεραπεία με englerin Α χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτεινού. Μορφολογικές αλλαγές επέτρεψε επίσης να διακρίνουμε μεταξύ αποπτωτικών και νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο. Για την ανάλυση αυτή μπορούμε επιπλέον σύγκριση το κύτταρο μορφολογία σε απόκριση σε επώαση με σταυροσπορίνη, μία γνωστή επαγωγέας απόπτωσης [23].

Βρήκαμε ότι englerin Μια θεραπεία νεφρικών καρκινικών κυττάρων οδήγησε σε μια προφανή αλλαγή στην κυτταρική μορφολογία κατάδειξης σε κυτταρικό θάνατο (Εικ. 2). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στο σχήμα ή τη δομή των κυττάρων θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε γλοιοβλαστώματος κύτταρα SF-295 αγωγή με την ένωση. Νεφρική καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με englerin Α έχασε επεκτάσεις filopodia, φθάνοντας τελικά ένα γύρο, συμμετρική δομή, πριν την αποσύνδεση πλήρως από τη μήτρα. Η σταυροσπορίνη απόπτωση που επάγεται τόσο γλοιοβλάστωμα και νεφρικά καρκινικά κύτταρα. Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος χαρακτηρίζεται από συρρίκνωση των κυττάρων και το σχηματισμό αποπτωτικών σωμάτων που περιβάλλει το κύτταρο πεθαίνει. Αν και η θεραπεία με englerin Α προκάλεσε μια σχετική μείωση του όγκου των κυττάρων, δεν θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε το σχηματισμό σαφούς αποπτωτικών σωμάτων. Τόσο σταυροσπορίνη και englerin Α προκάλεσε τα νεφρικά καρκινικά κύτταρα να πεθάνουν, αλλά σε μορφολογικά διαφορετικούς τρόπους.

Μικρογραφίες δείχνουν τη μορφολογία των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με englerin Α ή σταυροσπορίνη, έναν γνωστό επαγωγέα απόπτωσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 1 μΜ englerin Α ή φορέα DMSO επί 60 λεπτά, ή 1 μΜ σταυροσπορίνη για 5 ώρες. Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Zeiss Axiovert200 Μ με στόχο φάση 40 ×. Για κάθε θεραπεία, αποκτήθηκαν 5-10 τυχαία οπτικά πεδία. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές, μικρογραφήματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά του μέσου όρου της κυτταρικής μορφολογίας κατά την κατεργασία. Ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 20 μm.

Η

Englerin A αποτελέσματα της θεραπείας σε απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης, αλλά όχι στο πάνω ρύθμιση των εξωτερικών φωσφατιδυλο σερίνη ενδεικτικό των πρώιμων αποπτωτικών στάδια

Το μορφολογικά διαφορετικό αποτέλεσμα στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τη σταυροσπορίνη απόπτωση-επαγωγέα μας οδήγησε να αναλύσουμε αν η νεφρική τα καρκινικά κύτταρα να πεθάνουν μέσα από τις διαδικασίες σηματοδότησης νεκρωτικό παρά απόπτωση όταν επωάστηκαν με englerin A. Ωστόσο, τα άμεσα μέτρα της νέκρωσης είναι λιγοστές και ο πιο συνηθισμένος τρόπος για να επιβεβαιώσετε νεκρωτικό κυτταρικό ο θάνατος είναι αποκλείοντας ότι ένα κύτταρο πεθαίνει μέσω απόπτωσης [24]. Πρόωρη Τα αποπτωτικά στάδια που χαρακτηρίζεται από αύξηση του φωσφατιδυλοσερίνη (PS) στην εξωκυτταρική πλευρά της μεμβράνης των κυττάρων που ακολουθείται από την απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης στα τέλη της αποπτωτικών στάδια [25]. Χρησιμοποιήσαμε FITC-επισημασμένο αννεξίνης V και ιωδιούχου προπιδίου για την ανάλυση αυτών των δύο παραμέτρων με κυτταρομετρία ροής, η οποία είναι μια κοινή προσέγγιση για να καθορίσει εάν ο κυτταρικός θάνατος είναι αποπτωτικού ή νεκρωτικού [26], [27]. Εμείς ποσοτικά τις υποπληθυσμών κυττάρων που αντιστοιχούν σε πρώιμων αποπτωτικών και αργά αποπτωτικών /νεκρωτική στάδια μετρώντας το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν εξωκυτταρικού PS με ή χωρίς την απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης (Εικ. 3).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 1 μΜ englerin Α ή φορέας DMSO για 60 λεπτά, ή 5 μΜ σταυροσπορίνη για 3 ώρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για έκφραση σερίνη εξωκυτταρικό φωσφατιδυλο χρησιμοποιώντας FITC-επισημασμένο Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) ως συν-χρώση για τη δοκιμή ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης. Ορατή είναι αποτέλεσμα αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραματικών επαναλήψεων. Οι ποσοτικοί προσδιορισμοί και τα στατιστικά στοιχεία όλων των δεδομένων που απεικονίζονται ως γραφήματα μπαρ και δείχνουν την κατανομή των κυττάρων βρέθηκε θετικός για δέσμευση αννεξίνης V (πρώιμων αποπτωτικών στάδια) ή δέσμευση αννεξίνης V και την πρόσληψη ιωδιούχου προπιδίου (τέλη αποπτωτικών στάδια /νεκρωτικό θάνατο). Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι μέσοι ± SEM (n = 3), οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές επισημαίνονται με αστερίσκους (*** ρ & lt? 0.001), N.S. = Δεν είναι σημαντική.

Η

Όπως ήταν αναμενόμενο, η κυτταρική γραμμή SF-295 δεν δείχνουν σημαντική αύξηση των αποπτωτικών κυτταρικών πληθυσμών όταν έλαβαν θεραπεία με englerin Α ή τον έλεγχο φορέα DMSO. θεραπεία σταυροσπορίνη προκαλείται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε όλες τις κυτταρικές σειρές που συνοδεύεται από μία αύξηση σε αμφότερες τις πρώιμη και όψιμη κυτταρικών πληθυσμών αποπτωτικά. Νεφρική καρκινικά κύτταρα Α-498 ήταν το πιο ευαίσθητο, που δείχνει το υψηλότερο ποσοστό (27%) της καθυστερημένης αποπτωτικών /νεκρών κυττάρων. SF-295 και UO-31 κυτταρικές σειρές έδειξαν αυξημένα πληθυσμών στα πρώτα στάδια της αποπτωτικών περίπου 12-20%. Μια σαφής αύξηση των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων ήταν επίσης ορατή μετά από 1 ώρα από τη θεραπεία με σταυροσπορίνη (Εικ. S1).

Είναι ενδιαφέρον, englerin Μια θεραπεία δεν επηρέασε τα κυτταρικών πληθυσμών με τον ίδιο τρόπο. Βρήκαμε καμία σημαντική μεταβολή των πρώιμων αποπτωτικών κυτταρικών πληθυσμών (αννεξίνης V μοναδική θετική) είτε σε UO-31 ή Α-498 κύτταρα μετά από κατεργασία με englerin Α Η θεραπεία προκάλεσε τα κύτταρα να χάνουν την ακεραιότητα της μεμβράνης νωρίς, που οδηγεί σε μια διπλή θετική χρώση τα κύτταρα. Ενώ το ποσοστό των κυττάρων στην αποπτωτική τομέα νωρίς δεν αυξήθηκε, παρατηρήσαμε μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε νεκρά κύτταρα περίπου 10-15% σε δείγματα κυττάρων UO-31 και ένα διπλό θετικό πληθυσμό έως και 27% σε Α-498 κύτταρα μετά από 1 ώρα της θεραπείας (Εικ. 3, γραφήματα bar). Ακόμη και σε μεταγενέστερο χρονικό σημείο, ο αριθμός των μοναδική θετική, πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων δεν αυξήθηκαν στις θεραπείες englerin Α (Εικ. S1). θεραπεία DMSO αμφοτέρων των νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών (UO-31 και Α-498) δεν προκάλεσε σημαντική αυξητική ρύθμιση του είτε μοναδική θετική (αννεξίνη V) ή διπλά θετικά (αννεξίνη V και ΡΙ) πληθυσμούς.

Englerin Ένας θάνατος που επάγεται κύτταρο είναι ανεξάρτητη από τη διάσπαση PARP και κασπάσης 3 δραστηριότητα

Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος είναι εν μέρει μεσολαβείται από κασπάσες ενέργειας, όπως κασπάση 3, που διασπούν και ενεργοποιούν κατάντη στόχοι όπως πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) . PARP πιστεύεται ότι βοηθά στην αποπτωτική σηματοδότηση με τη μείωση των κυττάρων ενεργειακών πόρων [28]. Διάσπαση και ενεργοποίηση αυτών των πρωτεϊνών είναι επομένως ένας δείκτης για ένα ενεργοποιημένο αποπτωτικού καταρράκτη σηματοδότησης. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι η νεφρική καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με englerin Α δεν πεθαίνουν μέσω απόπτωσης ελέγξαμε τη διάσπαση της PARP (Εικ. 4

Α

) και η διάσπαση και η δράση της κασπάσης 3 (Εικ. 4

Α και Β

). Ως μάρτυρας, η κατεργασία του SF-295 κυττάρων με σταυροσπορίνη για 4 ή 5 ώρες είχε ως αποτέλεσμα διασπασμένης πρωτεΐνης ζώνες στα 17 και 19 kDa είναι ενδεικτικά των ενεργών θραυσμάτων πρωτεΐνης. Ομοίως, σταυροσπορίνη θεραπεία του SF-295 κύτταρα προκάλεσε την διάσπαση της PARP όπως υποδεικνύεται από το 89kDa διασπάστηκε θραύσμα. Βρήκαμε ότι englerin Α δεν επηρέασε την διάσπαση αυτών των δύο πρωτεϊνών σε SF-295 ή των νεφρικών καρκινικών κυττάρων (UO-31 και Α-498). Εμείς δεν θα μπορούσε να ανιχνεύσει ζώνες για διασπασμένης κασπάσης 3 ή PARP κατά την επεξεργασία των κυτταρικών σειρών με englerin Α για 1 ή 4 ώρες (Εικ. 4

Α

). θεραπείες ελέγχου όλων των κυτταρικών σειρών με τον φορέα DMSO για το ίδιο χρονικό διάστημα δεν είχε ως αποτέλεσμα ανιχνεύσιμες διάσπαση της κασπάσης 3 ή PARP (Εικ. 4

Α,

δεξιός πίνακας).

Cells υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 1 μΜ englerin Α, φορέα DMSO ή 5 μΜ σταυροσπορίνη για την ενδεδειγμένη ποσότητα χρόνου. (Α) Μετά την επώαση, τα κύτταρα λύθηκαν και λύματα αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση για διάσπαση PARP ή πλήρους μήκους και διασπασμένη κασπάση 3 (Casp3-fl, Casp3-CL). Ίση φόρτωση πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με διερεύνηση για GAPDH. Πλήρους μήκους και διασπασμένο ζώνες υποδεικνύονται. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. (Β) Εναλλακτικά, μετά την επώαση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε λύση και η δραστικότητα κασπάσης 3 δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας δραστικότητας κασπάσης 3. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι μέσοι ± SEM (n = 6), τα στατιστικά σημαντικές διαφορές που σημειώνονται με αστερίσκους (*** ρ & lt? 0.001). (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 1 μΜ englerin Α, φορέα DMSO για 60 λεπτά ή 50 μΜ διφωσφορικής χλωροκίνης (χλωρο) για 18 ώρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα λύθηκαν και λύματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση για Beclin-1, LC3-Ι /ΙΙ και κασπάσης 1 διάσπασης (ρ45 προένζυμο και διασπάται δραστική ρ20 υπομονάδα). Ίση φόρτωση πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με διερεύνηση για GAPDH. Όλες οι μεμβράνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας IRDye δευτερεύοντα αντισώματα και ένα σύστημα Οδύσσεια Licor. Μεμβράνες που παρουσιάζονται είναι από αντιπροσωπευτικά πειράματα.

Η

Για να επιβεβαιώσετε αυτό το αποτέλεσμα αναλύσαμε κασπάσης 3 δραστηριότητας με βάση ανάλυση ELISA που μετρά την ενζυματική δραστηριότητα άμεσα μέσω της διάσπασης ενός υποστρώματος κασπάσης 3. Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία σταυροσπορίνης σαν αποτέλεσμα την αύξηση της δραστικότητας κασπάσης 3 τόσο στην κυτταρική γραμμή ελέγχου γλοιοβλαστώματος και τη νεφρική καρκινική κυτταρική γραμμή Α-498. Englerin Μια θεραπεία δεν οδήγησε σε σημαντικές αυξήσεις στη δραστηριότητα του ενζύμου ενδεικτικό της κασπάσης 3 ενεργοποίηση (Εικ. 4

Β

).

Englerin Α δεν προκαλεί κασπάσης 1 διάσπασης

Pyroptosis είναι ένας τρόπος κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από οδούς φλεγμονής. Σηματοδοσίας είναι ανεξάρτητη από τις απόπτωση που σχετίζονται κασπάσες ενέργειας 3 και 7, αλλά περιλαμβάνει την απελευθέρωση του δραστικού ιντερλευκίνης-1β που διαμεσολαβείται από την κασπάση 1 [29], [30]. Εδώ μετριέται κασπάσης 1 διάσπασης ως δείκτης της pyroptotic κυτταρικού θανάτου. Ακολουθήσαμε τη δυναμική της κασπάσης 1 ενεργοποίησης από την ανίχνευση των επιπέδων του 45 kDa προ-ένζυμο και τα 20 kDa μειωμένη κασπάσης 1 ισομορφή μετά τη θεραπεία με englerin Α (Σχ. 4

C

). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι κασπάσης 1 ενεργοποιείται σε χαμηλό επίπεδο στις δύο δοκιμάστηκαν τύπους κυτταρικών σειρών, με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης που είναι υψηλότερα σε SF-295 κύτταρα και χαμηλότερα σε Α-498 κύτταρα. Διαπιστώσαμε ελαφρά ζώνες για διασπασμένη κασπάση 1 ισομορφών σε δείγματα SF-295 κύτταρα γλοιοβλαστώματος και UO-31 νεφρικά καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, η θεραπεία με englerin Α δεν αυξάνει σημαντικά τα επίπεδα της κασπάσης 1 διάσπασης ενδεικτική της pyroptotic σηματοδότησης. εντάσεις Band για τη διασπασμένη κασπάση 1 θραύσμα είναι εξίσου χαμηλά. Τα επίπεδα της p45 προ-ένζυμο αλλάξει ελάχιστα κατά englerin A θεραπείας (Εικ. 4

C

)

Englerin Α δεν προκαλεί αυτοφαγία

Η αυτοφαγία είναι μια κυτταρική διαδικασία στην οποία κυτταροπλασματική υλικό αποικοδομείται με τη βοήθεια των λυσοσωμάτων. Ο μηχανισμός per se είναι ένα μονοπάτι ανακύκλωσης που γενικά συνδέεται με την κυτταρική επιβίωση. Ωστόσο, υπάρχουν αναφορές των κυττάρων που υποβάλλονται σε λειτουργία του κυτταρικού θανάτου στην οποία τα κύτταρα ρυθμίζουν σηματοδότηση αυτοφαγικά (αν αυτοφαγία δεν είναι η αιτία του κυτταρικού θανάτου σε αυτό το σενάριο). Το αποτέλεσμα ονομάζεται αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο [31], [32]. Η ενεργοποίηση του autophagy μπορούν να αναλυθούν ακολουθώντας την επεξεργασία της αυτοφαγικά LC3 δείκτη και τη μετατροπή της από την LC3 Ι ισόμορφου στη φόρμα LC3 II που συνοδεύεται από αλλαγή στο μοριακό βάρος [31]. Ένα άλλο νωρίτερα δείκτης για αυτοφαγία είναι Beclin-1, η οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά την επαγωγή της αυτοφαγία και ενεργοποιεί το σχηματισμό αυτοφαγοσώματα [33], [34].

Εμείς προσδιορίζεται αν englerin Μια θεραπεία που προκαλείται από αυτοφαγία στην πειραματική κυτταρικές σειρές ακολουθώντας τις αλλαγές στην LC3 και Beclin-1 (Εικ. 4

C

). Ως θετικός έλεγχος για την ανίχνευση της ισομορφής LC3 II αντιμετωπίσαμε όλες τις κυτταρικές σειρές με 50 μΜ χλωροκίνη (χλωρο) για 18 ώρες, μια ουσία που φαίνεται να συλλάβουν autophagy στο στάδιο autophagosomal αποτέλεσμα αυξημένα επίπεδα της LC3 II [35], [ ,,,0],36]. Η θεραπεία με χλωροκίνη οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων της LC3 II σε όλες τις ελεγχόμενες κύτταρα. Η ισομορφή LC3 Ι ήταν ανιχνεύσιμη σε όλες τις κυτταρικές σειρές υπό όλες τις συνθήκες θεραπείας. Ωστόσο, η θεραπεία με englerin Α ή το DMSO φορέα δεν οδήγησε σε σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση της LC3 II. Ακόμα κι αν ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει αμυδρά ζώνες για αυτό το LC3 ισομορφές σε SF-295 και UO-31 κύτταρα, το επίπεδο, αν LC3 ΙΙ δεν αυξάνει σημαντικά μετά englerin Μια θεραπεία (Εικ. 4

C

).

Beclin-1 θα μπορούσε να ανιχνευθεί επίπεδα σε όλες τις πειραματικές κυτταρικές σειρές. Χαμηλότερα επίπεδα βρέθηκαν σε SF-295 κύτταρα, τα υψηλότερα επίπεδα σε Α-498 κύτταρα. Η θεραπεία με englerin Α ή χλωροκίνη δεν οδήγησε σε διαφορές στα επίπεδα Beclin-1 είτε σε γλοιοβλάστωμα ή νεφρικά καρκινικά κύτταρα. Englerin Α δεν οδήγησε σε σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του 1 Beclin-επίπεδα έκφρασης (Εικ. 4

C

).

Englerin Α προκαλεί την παραγωγή των δραστικών μορφών οξυγόνου

το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την υπερβολική παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) είναι ένας γνωστός παράγοντας που προκαλεί νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο [24]. Ως εκ τούτου, προσπάθησε να αναλύσει αν englerin Μια προκάλεσε αύξηση των ενδοκυττάριων ROS. Εμείς αγωγή SF-295 και τα κύτταρα Α-498 με την ένωση και μετρήθηκε το περιεχόμενο του συνόλου των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και αζώτου (Εικ. 5

A

).

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με είτε 1 μΜ englerin Α ή φορέα DMSO επί 60 λεπτά. Η σχετική μεταβολή στην αντιδραστικού οξυγόνου (ROS) ή αντιδραστικά είδη αζώτου (RNS) σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με το DMSO φορέα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης Σύνολο ROS. Ιστογράμματα δείχνουν εντάσεις φθορισμού σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα (αριστερό πάνελ). Ποσοτικά σχετικές μεταβολές στην ROS /RNS εμφανίζονται (δεξιά πάνελ) είναι μέσα ± SEM (n = 5), οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές επισημαίνονται με αστερίσκους (* ρ & lt? 0,05). (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 1 μΜ englerin Α ή φορέα DMSO επί 60 λεπτά, ή 10 μΜ ιονομυκίνη για 50 λεπτά. Fluo-3 σύνδεση σε Ca

2+ ιόντων μετρήθηκε μέσω της αυξημένης εκπομπής φθορισμού της χρωστικής στα 520 nm μετά από διέγερση στα 485 nm. Ιστογράμματα δείχνουν εντάσεις φθορισμού σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα (αριστερό πάνελ). Ποσοτική σχετικές μεταβολές στην ενδοκυτταρική ιόντων ασβεστίου εμφανίζονται (δεξιά πάνελ) είναι μέσα ± SEM (n = 3), οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές επισημαίνονται με αστερίσκους (* ρ & lt? 0,05, *** ρ & lt? 0.001).

Η

στη μελέτη μας, englerin Α δεν επηρέασε την σχετική ποσότητα των ROS σε SF-295 κύτταρα σε σύγκριση με μια αγωγή με το DMSO ελέγχου φορέα. Ωστόσο, Α-498 κύτταρα αντέδρασαν έντονα στην englerin Ένας παράγοντας συγκεντρώσεις ROS σημαντικά υψηλότερο σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Το συνολικό ποσό των αντιδραστικών ειδών ήταν περίπου 2,5 φορές υψηλότερη όταν ένας-498 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με englerin Α

Englerin Α προκαλεί αύξηση του ενδοκυτταρικού Ca

2+ συγκέντρωση

Ασβέστιο έχει δειχθεί ότι ρυθμίζει νεκρωτικές σηματοδότηση. Η υπερβολική εισροή εξωκυττάριου Ca

2+ στα κύτταρα μπορεί να διεγείρει τόσο την παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο [24]. Μετρήσαμε τις επιδράσεις της englerin Α στην ενδοκυτταρική Ca

2+ συγκεντρώσεις και με το δείκτη ασβεστίου Fluo-3. Αυτή η χρωστική μας επέτρεψε να προσδιοριστεί ποσοτικά η ποσότητα του ενδοκυτταρικού ιόντων ασβεστίου μετά από θεραπεία με englerin Α (Σχ. 5

B

). Η σχετική Ca

2+ συγκέντρωση δεν αλλάζει όταν SF-295 κύτταρα επωάστηκαν με englerin Α ιονομυκίνη, ένα γνωστό επαγωγέα του Ca

2 + εισροή στο κύτταρο, διπλασίασε τις μετρούμενες ιόντα [37]. Θεραπεία των A-498 νεφρικά καρκινικά κύτταρα με englerin Α αύξησε σημαντικά το ενδοκυτταρικό ασβέστιο σε ακόμη μεγαλύτερο βαθμό τότε ιονομυκίνη. Ενώ ιονομυκίνης διπλασίασε την ποσότητα του ενδοκυτταρικού ασβεστίου, englerin Α οδήγησε σε 4-φορές υψηλότερες συγκεντρώσεις.

Συζήτηση

Η αυξημένη συχνότητα εμφάνισης νεφρικών όγκων σε όλο τον κόσμο παρουσιάζει σοβαρό πρόβλημα [1], [ ,,,0],38]. Οι ασθενείς με νεφρική όγκους σε προχωρημένα στάδια, την αποτελεσματική χημειοθεραπευτικά είναι λιγοστές και φάρμακα που χρησιμοποιούνται συχνά, όπως Το sunitinib έχουν συσχετιστεί με σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες [9]. Ως εκ τούτου, η αναζήτηση νέων θεραπευτικών πρέπει να επικεντρωθεί στις θεραπείες που δεν είναι αποτελεσματικά μόνο στην καταπολέμηση των όγκων, αλλά και αρκετά συγκεκριμένη να μην βλάψει μη καρκινικά κύτταρα και να αποφευχθούν οι αρνητικές παρενέργειες. Το φυσικό προϊόν englerin Α είναι μια ένωση που ταιριάζει ενδεχομένως αυτά τα κριτήρια. υψηλή εκλεκτικότητα και δραστικότητα της κατά των νεφρών καρκινικών κυττάρων έθεσε στο επίκεντρο πολλών ερευνητικών ομάδων. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον τρόπο δράσης του, εκτός από τη στόχευση αυτών των κυττάρων με υψηλή εξειδίκευση [10]. Προκειμένου να αξιολογηθεί πλήρως η χρήση englerin Α ως θεραπευτικού παράγοντα και να προβλέψει τις πιθανές παρενέργειες, είναι αναγκαίο να κατανοήσουμε το μηχανισμό με τον οποίο η ένωση επηρεάζει νεφρικά καρκινικά κύτταρα.

Εδώ δείχνουμε για πρώτη φορά πώς englerin A σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα νεφρών. Είναι σημαντικό, μπορούμε επίσης να αναφέρουμε ότι englerin Α είναι στην πραγματικότητα ειδικά για καρκινικά νεφρικών κυττάρων και δεν επηρεάζει τα φυσιολογικά κύτταρα του νεφρού. Όσον αφορά τον τρόπο δράσης, βρήκαμε ότι englerin Α επάγει μία νεκρωτική μορφή κυτταρικού θανάτου στα ευαίσθητα κύτταρα. Τα αποπτωτικά δείκτες σαν εξωτερίκευση φωσφατιδυλο σερίνη, την ενεργοποίηση της κασπάσης τελεστή ή διάσπαση PARP δεν είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά την αγωγή με englerin Α διαπερατοποίηση μεμβράνης πλάσματος συμβαίνει γρήγορα και τα κύτταρα που δεν σχηματίζουν αποπτωτικά σώματα. Ταυτόχρονα επίπεδα autophagy δεν επηρεάζονται από τη θεραπεία και η ένωση δεν φαίνεται να επάγει διαδικασίες pyroptosis-όπως. Ωστόσο, η λειτουργία του κυτταρικού θανάτου περιλαμβάνει μια αυξημένη παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και η άνοδος της στάθμης των ενδοκυττάριων ιόντων ασβεστίου είτε ως μέρος της νεκρωτικής σηματοδότησης ή αποτέλεσμα αυτής.

Η δραστικότητα μιας ένωσης είναι ένα σημαντικό μέτρο της χαρακτηρισμό του ως φάρμακο. μέγιστες συγκεντρώσεις αναστολής μισό (IC

50) στην περιοχή nanomolar ή μικρότερο είναι επιθυμητές.