Αφηρημένο

Το δάχτυλο του ψευδαργύρου (ZNF) 280B πρωτεΐνη ταυτοποιήθηκε ως μια απροσδόκητη στόχο μιας shRNA σχεδιαστεί για sGCα1. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι αυτά τα δύο πρωτεΐνες που συνδέονται με άλλο τρόπο, με 280B πάνω ρύθμιση της έκφρασης sGCα1. Νοκ-κάτω και πάνω-έκφραση πειράματα έδειξαν ότι 280B εξυπηρετεί την προώθηση της ανάπτυξης και των λειτουργιών προ-επιβίωσης στον καρκίνο του προστάτη. Απροσδόκητα ωστόσο, οι λειτουργίες αυτές προ-καρκίνο του 280B δεν διαμεσολαβείται από sGCα1, η οποία έχει παρόμοιες λειτουργίες σε καρκίνο του προστάτη, αλλά από κάτω ρυθμισμένα ρ53. Η πρωτεΐνη p53 είναι ένας δεύτερος στόχος του 280B σε καρκίνο του προστάτη, αλλά σε αντίθεση με sGCα1, ρ53 ρυθμίζεται προς τα κάτω από 280B. 280B επάγει p53 πυρηνική εξαγωγές, οδηγώντας σε επακόλουθη υποβάθμιση του πρωτεασώματος. Η πρωτεΐνη υπεύθυνη για τη ρύθμιση της p53 από 280B είναι Mdm2, η Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης, που προωθεί την υποβάθμιση του p53 με την πρόκληση της πυρηνικής εξαγωγής της. Δείχνουμε εδώ ότι 280B up-ρυθμίζει την έκφραση του Mdm2 στον καρκίνο του προστάτη κύτταρα, και αυτή η ρύθμιση είναι μέσω του υποκινητή Mdm2. Για να δείξει

in vivo

σχέση με αυτή την αλληλεπίδραση, μελέτες έκφρασης δείχνουν ότι τα επίπεδα 280B πρωτεΐνης είναι πάνω ρυθμισμένα σε καρκίνο του προστάτη και τα επίπεδα αυτά αντιστοιχούν σε μειωμένα επίπεδα ρ53. Έτσι, με την ενίσχυση της έκφρασης του Mdm2, η μη χαρακτηρισμένη πρωτεΐνη 280B παρέχει ένα νέο μηχανισμό καταστολής p53 στον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Gao S, Hsieh CL, Zhou J, Shemshedini L (2013) δακτύλου ψευδαργύρου 280B Ρυθμίζει sGCα1 και p53 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (11): e78766. doi: 10.1371 /journal.pone.0078766

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 14 Αυγ, 2013? Αποδεκτές: 23, Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Gao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) R01CA127873-01A1. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καταστολέας όγκου ρ53 έχει κεντρικό ρόλο στο συντονισμό των κυτταρικών αποκρίσεων σε διάφορες καταπονήσεις (συμπεριλαμβανομένων των βλαβών του DNA, υπερ-εκφράζεται ογκογονίδια και ποικίλες μεταβολικές περιορισμούς) [1]. Σε απάντηση στην κυτταρική τονίζει, έκφραση ρ53 επάγεται και η πρωτεΐνη μετατοπίζεται στον πυρήνα για να συνδεθούν με το DNA σε μια αλληλουχία-ειδικό τρόπο, ενεργοποιώντας έτσι ή καταστολή γονιδίων στόχων [2]. Έτσι, p53 μπορεί να ενορχηστρώσει βιολογικά αποτελέσματα, όπως η απόπτωση, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, γήρανση, ή η διαμόρφωση της αυτοφαγία. Αρκετές κατάντη άμεσοι στόχοι που εμπλέκονται στην αντι-πολλαπλασιαστική λειτουργία του p53, συμπεριλαμβανομένων των προ-επιβίωσης

suvivin

[3] και ο αναστολέας του κυτταρικού κύκλου

p21 /Cip1

[4].

Mdm2 (Mouse διπλό λεπτό 2 ομόλογο) είναι ο κύριος ρυθμιστής της p53 [5]. Κυρίως, Mdm2 είναι ένα Ε3 λιγάση που ρυθμίζει προς τα κάτω p53 μέσω πυρηνικής εξαγωγής και ουβικιτίνη-εξαρτώμενη αποδόμηση του πρωτεασώματος [6] – [9]. Επιπλέον, η τρανσφεράση ιστόνης ακετύλιο (ΗΑΤ) πρωτεΐνες ρ300 και CBP (πρωτεΐνη CREB-σύνδεση) σταθεροποιούν ρ53 μέσω ακετυλίωσης, και αυτό το αποτέλεσμα σταθεροποίησης μπορεί να καταργηθεί με Mdm2 μέσω του σχηματισμού ενός τριαδικού συμπλόκου με ρ53 και ρ300 ή CBP [10], [11]. Μεταλλάξεις σε ρ53 ότι οδηγούν σε απώλεια του κύκλου λειτουργίας αντιπροσωπεύουν την πιο κοινή γενετική αλλαγή σε ανθρώπινους καρκίνους [12], [13]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η πλήρης απώλεια της ρ53 βρίσκεται μόνο σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη [14]. Αργότερα προσδιορίσθηκε ότι μία συνδυασμένη απώλεια του ρ53 και ΡΤΕΝ, ένα ογκοκατασταλτικό εμπλέκονται σε ΡΙ3-Ακί σηματοδότησης [15], ήταν επαρκής για να οδηγήσει την ανάπτυξη του διηθητικού καρκίνου του προστάτη [16]. Μια άλλη ογκοκατασταλτικό, NKX3.1, αποδείχθηκε ότι αυξάνει ακετυλίωση και τη σταθερότητα της ρ53 μέσω Mdm2 εξαρτώμενη μηχανισμών [17].

ευδιάλυτης κυκλάσης του γουανυλυλίου (sGC) είναι το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) του υποδοχέα, και είναι καλά γνωστή για την ενζυματική δραστηριότητα του να μετατρέπει γουανοσίνη 5′-τριφωσφορική (GTP) σε κυκλική 3 ‘, 5’-μονοφωσφορική (cGMP). Αυτή η οδός είναι ως επί το πλείστον εμπλέκονται στις καρδιαγγειακό και νευρικό σύστημα [18]. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η α1 υπομονάδα της SGC (sGCα1? Όνομα γονίδιο

GUCY1A3

) είναι ένας άμεσος στόχος του υποδοχέα ανδρογόνου (AR) και παίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [19]. Προσδιορίσαμε επίσης ότι sGCα1 εξυπηρετεί μία λειτουργία προ-επιβίωσης στον καρκίνο του προστάτη με την αναστολή της δραστικότητας της ρ53 και επιλεκτικά την καταστολή των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση, μέσω ενός μηχανισμού του p53 κυτταροπλασματικής παγίδευσης [20]. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτές οι λειτουργίες προ-καρκίνο του sGCα1 είναι ανεξάρτητες της ενζυμικής δραστικότητας sGC. Πιο πρόσφατα, η θεραπευτική πιθανότητα της στοχοθέτησης sGCα1 αναπτύχθηκε μέσω ενός δεσμευτικού πεπτιδίου το οποίο έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση [21].

δακτύλους ψευδαργύρου (ZNF) είναι μια κοινή σύνδεσης ϋΝΑ μοτίβο που βρέθηκαν σε διάφορους παράγοντες μεταγραφής, και το C

2Η

2 μοτίβο είναι ο πιο κοινός τύπος [22]. Αυτό το μοτίβο χαρακτηρίζεται από δύο κυστεΐνης και δύο ιστιδίνης υπολείμματα συντονίζει μια ή περισσότερες ιόντα ψευδαργύρου και προεξέχει σε μια δομή που μοιάζει με δάκτυλο που αλληλεπιδρά με το DNA [23]. Υπάρχουν ενδείξεις ότι αυτό ZNF πρωτεΐνες παίζουν σημαντικούς ρόλους σε ανθρώπινους καρκίνους. Για παράδειγμα, ZNF23 αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της ενίσχυσης της p27 /kip-1 έκφραση, και τα επίπεδα έκφρασης του ZNF23 πρωτεΐνης είναι πολύ μειωμένη σε ανθρώπινο καρκίνο [24]. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου, ZKSCAN3 (ZNF306) έκφραση ήταν αυξημένα και υπο-έκφραση του ZKSCAN3 μειωμένη ογκογονικότητα [25]. Επιπλέον, αρκετές εκθέσεις δείχνουν ότι ZNF πρωτεΐνες μπορεί να επηρεάσει την δραστηριότητα της ρ53. ZNF668 ταυτοποιήθηκε ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του μαστού, η οποία σταθεροποιεί την ρ53 εμποδίζοντας Mdm2 μεσολάβηση ουβικιτινίωση p53 και την υποβάθμιση [26]. ZNF307 καταστέλλει τη δραστηριότητα των p53 και p21 με την αύξηση της μεταγραφής του Mdm2 και EP300 [22].

Ενώ η μελέτη της λειτουργίας της sGCα1 χρήση RNAi, εντοπίσαμε δάκτυλο ψευδαργύρου 280B (ZNF280B, στη συνέχεια ονομάζεται 280B) ως στόχος της ένα από τα sGCα1 Τα siRNAs. Το περιορισμένες διαθέσιμες πληροφορίες σχετικά με 280B και η πιθανή σχέση των πρωτεϊνών ZNF με p53 μας ενθάρρυνε περαιτέρω ανάλυση 280B για μια πιθανή ρόλο στον καρκίνο του προστάτη. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε μία λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ των 280B, ρ53, και Mdm2. Υπερ-έκφραση του 280B μειώθηκαν σημαντικά τα επίπεδα της ρ53 με μείωση της σταθερότητας του. Αυτή η επίδραση επί της σταθερότητας του ρ53 μεσολαβεί από την ικανότητα του να 280B επάγει την έκφραση της Mdm2, μέσω μιας θετική επίδραση στην υποκινητή Mdm2. Καταστέλλοντας p53, 280B παρέχει λειτουργίες προ-επιβίωση και υπέρ της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη. Προς υποστήριξη αυτού, υψηλή έκφραση 280B συνδέεται με χαμηλά επίπεδα p53 σε ιστούς όγκων του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και siRNA επιμόλυνση

LNCaP, C81 και κύτταρα CWR-22Rv1 αναπτύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Κανονικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (PrEC) καλλιεργήθηκαν σε PrEGM, όπως συνιστάται από τον προμηθευτή (Lonza). Κωδικοποιημένα ελέγχου siRNA, sGCα1 siRNA, MDM2 siRNA (GAACAAGAGACCCUGGUUA) και ZNF280B siRNA (GGAACAAUCAUGUGAGGAA) (Dharmacon) σε 40 nm τελική συγκέντρωση μετασκευάστηκε σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine Simax (Invitrogen).

Δοκιμασία Reporter και πλασμίδιο Επιμόλυνση

κύτταρα C81 αναπτύχθηκαν σε 80-90% συρροή σε RPMI-1640 με 5% FBS. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς ορό και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το πλασμίδιο ανταποκριτή ρ53-Luc ή πλασμίδιο ανταποκριτή Mdm2-Luc, και ελέγχουν siRNA, ή siRNA κατά ZNF280B και ρ53. Το pCH110 πλασμίδιο που κωδικοποιεί β-γαλακτοσιδάση χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας διαμόλυνσης [27]. Το πλασμίδιο p53-Luc παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Andrei Gudkov και περιέχει τρία ρ53 ανταποκρινόμενα στοιχεία. Το πλασμίδιο έκφρασης Mdm2-Luc και Mdm2 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Jason M. Shohet. Η διαμόλυνση εκτελέστηκε με χρήση Lipofectamine 2000 και δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης από την Promega.

αδενοϊό και λοιμώξεις φακοϊού

κύτταρα C81 μολύνθηκαν με 5-50 ΜΟΙ είτε έναν αδενοϊό που εκφράζει ZNF280B (ABMGood)) ή με ένα κενό αδενοϊό ως έλεγχος. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε RT-PCR και κηλίδωση Western.

sGCα1 shRNA, άδειο shRNA, και οι φορείς πακέτο αγοράστηκαν από Open Biosystems. Τα λεντοϊού σωματίδια που παρασκευάζονται σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Εταιρείας. LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό και επιλέγονται με τη χρήση πουρομυκίνη σε συγκέντρωση 4 mg /ml. Μετά από 4 ημέρες επιλογής, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία ΜΤΤ, qRT-PCR, κηλίδωση Western.

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση του επιπέδου της ZNF280B σε φυσιολογικούς ιστούς προστάτη και ιστούς όγκων που λαμβάνεται από το CHTN. ZNF280B αντίσωμα (αραίωση 1:200? Sigma) χρησιμοποιήθηκε για immunohistochemisty όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

Μετά siRNA επιμόλυνσης για 3 ημέρες, 20.000 κύτταρα από κάθε συνθήκη σπάρθηκαν σε. πλάκες 24 φρεατίων. Η δοκιμασία ΜΤΤ (Sigma) χρησιμοποιήθηκε όπως πριν [21] για τον προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων.

κηλίδωση Western and Cell Κλασμάτωση

κηλίδωση Western διεξήχθη όπως περιγράφεται [19] χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα εναντίον sGCα1 ( Cayman Chemical), ZNF280B (Abgent), MDM2 (Santa Cruz), Survivin (Cell Signaling Technology), ρ21 (Cell Signaling Technology), ρ53 (Santa Cruz), β-τουμπουλίνη (Abcam), ΚΑΚα (Santa Cruz), β- ακτίνης (Abcam).

C81 κύτταρα επεξεργασμένα με siRNA και αδενοϊό συλλέχθηκαν και πλύθηκαν μία φορά με ψυχρό PBS. 10% των κυττάρων είχαν αποθηκευτεί ως είσοδο και το υπόλοιπο τμήμα χωρίστηκε σε πυρηνικά και κυτοσολικά κλάσματα χρησιμοποιώντας Nuclear /Cytotsol Κλασμάτωση Kit (MBL International). Τα κλάσματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε Western Blotting τη μέτρηση των επιπέδων ZNF280B και πρωτεΐνης ρ53.

ημι-ποσοτική RT-PCR και QRT-PCR

Σύνολο mRNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ ακόλουθο πρωτόκολλο από την κατασκευή ( Invitrogen), και υποβλήθηκε σε ημι-ποσοτική RT-PCR και PCR QRT- αναλύσεις όπως περιγράφεται [28]. Τα PCR ανοδικά και καθοδικά εναύσματα που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε γονίδιο ήταν:

Σουρβιβίνη

, 5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3 ‘και 5′-GACAGAAAGGAAAGCGCAAC-3’?

p53

, 5′-GGCCCACT TCACCGTACTAA-3 ‘και 5′-G TGGTTTCAAGGCCAGATGT-3’?

sGCα 1

, 5′-AGCAGTGTGGAGAGCTGGAT-3? και 5′-CTGATCCAGAGTGCAGTCCA-3 ‘?

p21

, 5′-GACACCACTGGAGGGTG ACT-3 ‘και 5’-CAGGTCCACATGGTCTTCCT?

GAPDH

, 5′-CGACCACTT TGTCAAGCTCA-3 ‘και 5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3’.

MDM2

, 5′-TTTCGCAGCCAGGAGCACCG-3 ‘και 5′-AGTTTCCTTCACGGGGCGCG-3’?

ZNF280B

, 5′-TCCCAAAAGGGCTAAACTCA-3 ‘και 5’GTCCTTTGGAAAAGC- TGCTG-3’.

Αποτελέσματα

Μια sGCα1 siRNA στοχεύει 280B σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

για να μελετηθεί ο ρόλος των ενδογενών sGCα1 σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, χρησιμοποιήσαμε shRNA να knockdown αυτό το γονίδιο στα κύτταρα LNCaP. Μεταξύ πέντε διαφορετικών Τα siRNAs, δύο ήταν πιο αποτελεσματικές στην κάτω ρύθμιση έκφρασης πρωτεΐνης sGCα1: shRNA7 και shRNA8 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά Τα siRNAs χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω μελέτη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, shRNA8 ήταν πιο αποτελεσματικό από shRNA7 σε μείωση τόσο των επιπέδων sGCα1 mRNA και της πρωτεΐνης (Σχήμα 1 Β.) (Εικ 1Α.)? Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με siRNA7 και siRNA8 (Σχ. S1B, C). Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, shRNA7 (και siRNA7) ήταν σημαντικά ισχυρότερη από shRNA8 (και siRNA8) σε μπλοκάρισμα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων LNCaP (Εικ. 1C και Εικ. S1c). Αυτό το εκπληκτικό αποτέλεσμα μας οδήγησε να εξετάσουν το ενδεχόμενο επιπτώσεων εκτός στόχου του ενός ή και των δύο Τα siRNAs. Μια αναζήτηση Blast διαπίστωσε ότι 17 από 21 νουκλεοτίδια της siRNA7 ταιριάζει απόλυτα με το μέρος του γονιδίου 280B (Σχήμα 1D.)? ένα σημαντικό μέρος της siRNA8 συμπλήρωσαν το γονίδιο HIF1A (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). shRNA7 και siRNA7 ήταν σε θέση να σημαντικά μειορυθμίζουν 280B τόσο στο επίπεδο του mRNA (σχ. 1 Ε) και σε πρωτεΐνες (Εικ. 1 F), ενώ shRNA8 /siRNA8 δεν είχε καμία επίδραση, στα κύτταρα LNCaP και τα δύο ορμονικά ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές C81 και CWR-22Rv1? Είναι ενδιαφέρον, ούτε shRNA8 ούτε shRNA7 επηρεάζονται έκφραση HIF1A (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Υπό το πρίσμα αυτών των δεδομένων, υποθέσαμε ότι η υψηλότερη αρνητική επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη του shRNA7 /siRNA7, σε σύγκριση με shRNA8 /siRNA8, οφείλεται στην προστιθέμενη επίδραση του shRNA7 /siRNA7 επί 280B. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, χρησιμοποιήσαμε ένα 280B-ειδικό siRNA, που έχει ενδιαφέρον είναι σημαντική αρνητική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP (Εικ. 1). Η υπόθεση ελέγχθηκε απ ‘ευθείας με διεξαγωγή μιας διπλής knockdown του sGCα1 χρησιμοποιώντας το siRNA8 και το 280B-ειδικό siRNA (Σχ. 1G), το οποίο μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων πιο έντονα από ό, τι είτε siRNA8 ή 280B siRNA μόνο και σχεδόν στον ίδιο βαθμό όπως siRNA7 ( Εικ. 1 Η). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν έντονα ότι 280B εξυπηρετεί μία λειτουργία προ-ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

(Α, Β, C) κύτταρα LNCaP μολύνθηκαν με άδειο φακοϊό ή φακοϊούς εκφράζουν μία από δύο διαφορετικές sGCα1 Τα siRNAs (7, 8 ) και η έκφραση sGCα1 μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR (Α) ή κηλίδωση Western (Β), και η κυτταρική πυκνότητα μετρήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία (C). (Δ) Το διάγραμμα δείχνει την νουκλεοτιδική ομολογία μεταξύ siRNA 7 και 280B. (Ε, F) κύτταρα LNCaP, C81, και CWR22-RV1 υποβλήθηκαν στις ίδιες λοιμώξεις και τα επίπεδα 280B μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR (Ε) ή κηλίδωση Western (F). κύτταρα (G, H) C81 επιμολύνθηκαν με Control (Ctrl), sGCα1 siRNA (7,8), 280B siRNA, και 280B plus sGCα1 siRNA 8, και τα επίπεδα sGCα1 μετρήθηκαν με κηλίδωση Western (G), και η κυτταρική πυκνότητα ήταν μέτρο με ΜΤΤ δοκιμασία (H). Όλα τα επίπεδα έκφρασης είναι σε σχέση με την πρώτη προϋπόθεση (A, D), και τέθηκε σε 1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης στις κηλίδες Western. ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν μέσους όρους των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων συν SD. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστική σημασία (Ρ & lt? 0,01).

Η

280B up-ρυθμίζει sGCα1 mRNA και πρωτεΐνης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Για να μελετηθεί ο ρόλος των 280B σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, χρησιμοποιήσαμε ο 280B-ειδικό siRNA (από την Εικ. 1 G). Το 280B siRNA ήταν σε θέση να ρυθμίζουν προς τα κάτω, όπως αναμενόταν, 280B mRNA και πρωτεϊνών (Σχ. 2Α) και, απροσδόκητα, έκφραση sGCα1 (Εικ. 2Α). Μια αναζήτηση Blast της αλληλουχίας 280B siRNA προσδιορίζονται μόνο το γονίδιο 280B ως άμεσο στόχο και δείχνει σαφώς ότι sGCα1 δεν έχει καμία ομοιότητα αλληλουχίας με την αλληλουχία 280B siRNA. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το mRNA sGCα1 και πρωτεΐνης είναι ένας στόχος της πρωτεΐνης 280B, όχι το siRNA.

(Α, Β) κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με τον έλεγχο ή τα επίπεδα 280B siRNA και sGCα1 μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR ή κηλίδωση Western (Α) και η κυτταρική πυκνότητα μετρήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία (Β)? εικόνες αντίθεσης φάσης λήφθηκαν κατά την ημέρα 6 (Β). (C, D) κύτταρα LNCaP μολύνθηκαν με Κενό ή sGCα1 αδενοϊού μετά την επιμόλυνση με τον έλεγχο (-) ή 280B siRNA (+), και sGCα1 επίπεδα μετρήθηκαν με κηλίδωση Western (C), και η κυτταρική πυκνότητα ήταν μέτρο με δοκιμασία ΜΤΤ (D ). Όλα τα επίπεδα έκφρασης είναι σε σχέση με την πρώτη προϋπόθεση (Α), και τέθηκε σε 1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης στις κηλίδες Western. ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν μέσους όρους των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων συν SD. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα (P & lt? 0,01).

Η

Για να καθοριστεί εάν η κάτω-ρυθμίζονται sGCα1 είναι υπεύθυνη για τη μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προκύπτουν από 280B νοκ ντάουν, επαναλάβαμε την επιμόλυνση με το 280B siRNA, η οποία, όπως πριν (βλέπε Σχ. 1) είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική επιβράδυνση στην ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP (Σχ. 2Β). Πράγματι, τα κύτταρα που κατεργάστηκαν με siRNA 280B αλλάξει μορφολογία τους και άρχισαν να πεθαίνουν (Εικ. 2Β). Για να καθοριστεί εάν sGCα1 υπερέκφραση μπορεί να διασώσει τα κύτταρα, siRNA επιμολυσμένα κύτταρα μολύνθηκαν με αδενοϊό sGCα1, με αποτέλεσμα ανακτώνται επίπεδα sGCα1 πρωτεΐνης (Εικ. 2C). Υπερέκφραση του sGCα1 απέτυχε να διασώσει τα κύτταρα (Εικ. 2D), υποδεικνύοντας ότι sGCα1 είτε δεν είναι σε θέση ή δεν επαρκούν για να διασώσει τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη που έχουν μειωμένη έκφραση 280B και έτσι δείχνουν ότι ένας άλλος στόχος 280B εμπλέκεται.

280B την έκφραση της πρωτεΐνης p53 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Από την προηγούμενη εργασία μας έδειξε ότι sGCα1 αναστέλλει τη δράση της p53 στον καρκίνο του προστάτη [20], καθώς και άλλες εργασίες που έχει δηλώσει ότι ZNF πρωτεΐνες μπορεί να επηρεάσει το σηματοδοτικό μονοπάτι p53 [29] , θελήσαμε να καθορίσει εάν 280B επηρεάζει p53. Είναι ενδιαφέρον, siRNA knock-down της 280B οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης p53 σε LNCaP, C81 και τα κύτταρα CWR-22RV1 (Εικ. 3Α). Αντίθετα, αδενοϊό μεσολάβηση υπερ-έκφραση του 280B σημαντικά μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 (Εικ. 3Β). Η επίδραση παρατηρήθηκε μόνο στην πρωτεΐνη ρ53, δεδομένου ότι τα επίπεδα του mRNA p53 δεν επηρεάστηκαν από 280B (Σχ. 3C, D). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι 280B ρυθμίζει αρνητικά ρ53 μόνο στο επίπεδο της πρωτεΐνης και έτσι είναι διακριτή από την επίδρασή της επί sGCα1, η οποία είναι θετική και παρατηρήθηκε τόσο στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης.

(A, C) LNCaP , κύτταρα C81, CWR22-RV1 επιμολύνθηκαν με έλεγχο (-) ή τα επίπεδα έκφρασης 280B siRNA (+) και ρ53, survivin, ρ21, και 280B μετρήθηκαν με κηλίδωση Western (Α) ή σε πραγματικό χρόνο PCR (C). κύτταρα (Β, D) C81 μολύνθηκαν με άδειο (-) ή 280B αδενοϊό (+) και ρ53, survivin, ρ21 και τα επίπεδα έκφρασης 280B μετρήθηκαν με κηλίδωση Western (Β) ή σε πραγματικό χρόνο PCR (D). Όλα τα επίπεδα έκφρασης είναι σε σχέση με την πρώτη προϋπόθεση (Γ και Δ), και τέθηκε σε 1. κύτταρα (Ε) C81 επιμολύνθηκαν με 0.2 μg ρ53-Luc και ελέγχου (-), ή 280B (+) siRNA, με την παρουσία έλεγχο ή p53 siRNA. Η μεταγραφική δραστικότητα της δραστικότητας ρ53 προσδιορίστηκε ποσοτικά με μέτρηση της δραστικότητα λουσιφεράσης. Όλες οι δραστηριότητες είναι σε σχέση με την πρώτη προϋπόθεση, και η δραστηριότητα αυτή ορίζεται σε 1. (F, G) Κύτταρα από (Ε) υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για ρ53, Survivin, ρ21, και 280B (F), και μέτρηση της κυτταρικής πυκνότητας με ΜΤΤ δοκιμασία (G). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης στις κηλίδες Western. ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν μέσους όρους των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων συν SD. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα (P & lt? 0,02).

Η

Επειδή τα επίπεδα της πρωτεΐνης 280B αλλάζει p53, θα περιμέναμε να επηρεάσει p53 μεταγραφική δραστηριότητα. Αυτό παρακολουθήθηκε με προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς ή έκφραση των ενδογενών γονιδίων ρ53-ρυθμιζόμενες. Χρησιμοποιώντας μια λουσιφεράση πλασμίδιο ρεπόρτερ που περιέχει ρ53 στοιχεία απόκρισης [30], παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα της ρ53 σε απόκριση προς 280B siRNA διαμόλυνση (Σχ. 3Ε). Παροδική διαμόλυνση πλασμιδίου έκφρασης 280B προκάλεσε μικρή, αλλά σημαντική μείωση στη δραστικότητα της ρ53 (Εικ. S2). Για τη μελέτη ενδογενή γονίδια, εστιάσαμε στην έκφραση του survivin και ρ21, επειδή 280B siRNA αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη (βλέπε Σχ. 2Β). Survivin είναι ένα γονίδιο p53-κατασταλεί που διαμεσολαβεί επιβίωση των κυττάρων και ρ21 είναι ένα γονίδιο ρ53 προκαλούμενη που αναστέλλει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Σε απάντηση στην εξάντληση 280B, Survivin πρωτεΐνη μειώθηκε και ρ21 αυξήθηκε σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές (Σχ. 3Α). Real-time PCR δεδομένα επιβεβαίωσαν ότι 280B επηρεάζει survivin και ρ21 σε επίπεδο mRNA (Σχ. 3C). Εν τω μεταξύ, οι αντίθετες επιδράσεις παρατηρήθηκαν όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 280B υπερ-έκφραση, αποδίδοντας αυξημένη Survivin και μειωμένη πρωτεΐνες ρ21 (Εικ. 3Β) και mRNAs (Σχ. 3D).

Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι 280B δύναται εξυπηρετούν μια λειτουργία προ-επιβίωσης στον καρκίνο του προστάτη. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, παρακολουθήσαμε την απόπτωση με μέτρηση διάσπαση PARP. Τόσο LNCaP και CWR-22Rv1 κύτταρα εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα διασπασμένη PARP σε απόκριση σε 280B knockdown (Εικ. S3). Για τη μελέτη του ρόλου της ρ53 σε αυτή τη διαδικασία, χρησιμοποιήσαμε Ετοποσίδη, η οποία, όπως αναμενόταν, προκάλεσε υψηλά επίπεδα ρ53 και αυξημένα διάσπαση PARP (Σχ. 3F). Σημαντικά, οι ενέργειες αυτές ήταν μειωμένη ή φύγει όταν 280B υπερεκφράστηκε (Εικ. 3F), καταδεικνύοντας σαφώς ότι 280B μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από Ετοποσίδη επαγόμενη απόπτωση.

επόμενο διερευνηθεί εάν p53 εμπλέκεται στην αναστολή της ανάπτυξης που προκαλείται από την 280B siRNA. Για να γίνει αυτό, χρησιμοποιήσαμε siRNA να μειώσει την έκφραση των ενδογενών ρ53 σε κύτταρα C81, η οποία επιβεβαιώθηκε από τη μειωμένη δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς (Σχ. 3Ε) και η έκφραση της ρ53-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες (Εικ. 3G). Σημαντικά, siRNA knockdown του p53 ήταν σε θέση να σχεδόν τελείως την ανάπτυξη των κυττάρων διάσωση αναστέλλεται με εξάντληση 280B siRNA (Σχ. 3Η), γεγονός που δείχνει ότι τα αυξημένα ρ53 είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη των κυττάρων καταστέλλεται από 280B knockdown.

280B αποσταθεροποιεί την πρωτεΐνη ρ53 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη με up-ρύθμιση Mdm2

Τα δεδομένα ανωτέρω δείχνουν ότι 280B αναστέλλει τη δράση μεταγραφικής ρ53 και μειώνει τα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 χωρίς αλλαγή του επιπέδου του mRNA του υποδηλώνουν ότι 280B στοχεύει την πρωτεΐνη ρ53. Για να προσδιορίσετε αν 280B μπορεί να επηρεάσει τη σταθερότητα της πρωτεΐνης p53, χρησιμοποιήσαμε κυκλοεξιμίδιο (CHX) για τη μέτρηση της p53 ημίσειας ζωής. Υπο-έκφραση του 280B από ειδικές siRNA οδηγεί σε μία αύξηση σε ρ53 ημίσειας ζωής από 14 λεπτά έως 24 λεπτά (Εικ. 4Α), ενώ η υπερ-έκφραση του 280B μειώθηκε ασθενώς την ημιζωή (Εικ. 4Β).

(Α, Β) τα κύτταρα C81 επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή 280B siRNA (Α) ή μολύνθηκαν με άδειο αδενοϊό ή 280B αδενοϊό (Β) για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 mg /ml κυκλοεξιμίδη (CHX) για την υποδεικνυόμενη χρόνους, μετά την οποία κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθούν τα επίπεδα ρ53. Αριστερό πάνελ αντιπροσωπεύουν ποσοτικά Western blots. κύτταρα (C, D) C81 επιμολύνθηκαν με 280B siRNA ή μολύνθηκαν με αδενοϊό 280B και υποβλήθηκε σε κύτταρο κλασμάτωση, ακολουθούμενη από κηλίδωση Western για να μετρηθεί η κυτοσολική (C) ή των επιπέδων πυρηνικής (Ν) του ρ53 και 280B. Σημειώστε ότι οι αριθμοί πάνω από τις διαδρομές αντιπροσωπεύουν σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης ρ53, τυποποιήθηκε για β-ακτίνη επίπεδα, με την πρώτη λωρίδα ορίζεται σε 1. κύτταρα (Ε) C81 μολύνθηκαν με άδειο αδενοϊό ή 280B αδενοϊού για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 mM νουτλίνη-3A ή οχήματος, που ακολουθείται από κηλίδωση Western για να μετρηθεί η κυτοσολική (C) ή πυρηνικά επίπεδα ρ53 και 280B (Ν). Για όλα τα πειράματα, β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-τουμπουλίνης και RAR, που χρησιμοποιούνται ως δείκτες για κυτοσολικά και πυρηνικά κλάσματα, αντίστοιχα (C, D, E).

Η

Για την καλύτερη κατανόηση της επίδρασης 280B για τη σταθερότητα της πρωτεΐνης p53, που παρακολουθείται p53 υποκυτταρικό εντοπισμό. Σημειώστε ότι κηλίδωση Western για β-τουμπουλίνη (κυτοσολική) και ΚΑΚα (πυρηνική) επιβεβαίωσε την καθαρότητα των δύο κλασμάτων των κυττάρων και ότι η 280B είναι κυρίως ή αποκλειστικά μια πυρηνική πρωτεΐνη (Εικ. 4C). Η μείωση της ενδογενούς επίπεδα πρωτεΐνης 280B οδήγησε σε σημαντικά αυξημένα πυρηνικών p53 αλλά καμία αλλαγή σε κυτοσολική επίπεδα (Σχ. 4C). Το συμπληρωματικό πείραμα, η υπερέκφραση του 280B, μειωμένη πυρηνική ρ53 χωρίς πάλι αλλαγή των κυτοσολική επίπεδα (Σχ. 4D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι 280B προωθεί την υποβάθμιση του πρωτεασώματος p53 με την πρόκληση p53 πυρηνικής εξαγωγής. Για να ληφθεί απόδειξη για αυτό, ρ53 υποκυτταρική εντόπιση παρακολουθήθηκε παρουσία νουτλίνη 3Α, ενός αναστολέα της Mdm2 αλληλεπίδραση με την ρ53 και έτσι πυρηνική εξαγωγή [31]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Ε, νουτλίνη-3A σχεδόν εξαλειφθεί εντελώς το 280B-μεσολάβηση μείωση των επιπέδων πυρηνικής p53, ένα αποτέλεσμα σύμφωνο με ένα ρόλο 280B στο p53 πυρηνικής εξαγωγής.

Πυρηνική εξαγωγή ρ53 εξαρτάται από την Mdm2, το οποίο είναι ένα σημαντικό βήμα που οδηγεί σε αποικοδόμηση ρ53 πρωτεασωμική [6], [7]. Επιβεβαιώσαμε αυτό το αποτέλεσμα σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, στην οποία Mdm2 siRNA επαγόμενη υψηλότερα επίπεδα των πυρηνικών p53 ενώ παροδική υπερέκφραση του Mdm2 μειωμένων αυτών των επιπέδων (Εικ. S4), μιμούμενη το 280 επίδραση στην ρ53. Από ZNF πρωτεΐνες έχουν την ικανότητα να ρυθμίζουν μεταγραφή, υποθέσαμε ότι μπορεί να επηρεάσει 280B ρ53 με τη ρύθμιση της έκφρασης του Mdm2. Αρχίσαμε να διερευνήσει τη δυνατότητα αυτή με μέτρηση της έκφρασης του Mdm2, η οποία είναι σημαντικά μειωμένη σε αμφότερα τα mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης όταν 280B είναι εξαντλημένο (Εικ. 5Α). Σε αντίθεση, 280B υπερ-έκφραση έχει το αντίθετο αποτέλεσμα, με αποτέλεσμα αξιοσημείωτες αυξήσεις σε αμφότερες

Mdm2

mRNA και η πρωτεΐνη έκφρασης (Εικ. 5Β). Δεδομένου ότι το

Mdm2

mRNA επηρεάζεται από 280B, είναι πιθανό ότι το αποτέλεσμα είναι μεταγραφικό. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, αναλύσαμε ένα δυνητικό δραστικότητα 280B στο

Mdm2

υποκινητή, χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης. Η παροδική έκφραση του 280B σε κύτταρα C81 αυξηθεί

Mdm2

δράση προαγωγού με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 5C) και εξάντληση siRNA του 280B μπλοκαριστεί

Mdm2

δραστικότητα προαγωγέα (Σχ. 5D). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ξεκάθαρα ότι 280B δρα στο

Mdm2

υποκινητή και δείχνουν ότι ο υποκινητής μπορεί να είναι ένας άμεσος στόχος 280B.

(Α, Β, Ε) κύτταρα C81 επιμολύνονται με (Α , Ε) ελέγχου siRNA (-) ή 280B siRNA (+) ή (Β, Ε) μολυσμένα με Empty αδενοϊό (-) και 280B αδενοϊό (+) και υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR και κηλίδωση Western για να μετρηθεί η έκφραση του MDM2 και 280B. (C, D) C81cells επιμολύνθηκαν με 0.1 μg Mdm2-Luc και συν-επιμολύνθηκαν με (C) ελέγχου siRNA (-) και 280B siRNA (+), (D) Κενές ρΟΙηεο (-) και 0,2 μg και 0,4 μg 280B, και παρακολουθούνται για 280B δραστικότητα με μέτρηση λουσιφεράσης δραστηριότητα. (Ε) C81cells συν-επιμολύνθηκαν με άδειο ρΟΙηεο (-) ή Mdm2 (+) και τον έλεγχο siRNA (-) ή Mdm2 siRNA (+), που ακολουθείται από κηλίδωση Western για να μετρηθεί η κυτοσολική (C) ή πυρηνικά επίπεδα (Ν) p53, 280B, και Mdm2. Για όλα τα πειράματα, β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-τουμπουλίνης και RARA χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτες για κυτοσολικά και πυρηνικά κλάσματα, αντίστοιχα (Ε). Όλα τα επίπεδα της πρωτεΐνης p53 ήταν σε σχέση με την πρώτη προϋπόθεση, και τέθηκε σε 1. Οι αστερίσκοι * και ** δείχνουν τα στατιστικά έννοιες της P & lt? 0.05 και η P & lt?. 0.01, αντίστοιχα

Η

Για να ξεκινήσετε τη μελέτη της συμμετοχή των Mdm2 σε 280B μεσολάβηση πυρηνική εξαγωγή του p53, η έκφραση Mdm2 μεταβλήθηκε σε κύτταρα C81 για να διαπιστώσετε αν αυτό θα επηρεάσει τη δραστηριότητα 280B στο p53 υποκυτταρικό εντοπισμό. Πράγματι, αυτό ήταν η περίπτωση, ως υπερ-έκφραση του Mdm2 μείωσε σημαντικά την πυρηνική συσσώρευση της ρ53 που προκλήθηκε από 280B knockdown (Σχ. 5Ε). Στο συμπληρωματικό πείραμα, Mdm2 knockdown εξαλειφθεί η αρνητική δραστηριότητα που 280B υπερ-έκφραση έχει στα επίπεδα της πυρηνικής ρ53 (Σχ. 5Ε). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι η επίδραση επί 280B ρ53 προκαλείται μέσω ρύθμισης της έκφρασης 280B Mdm2. Σημειώστε ότι Mdm2 είναι πρωτίστως κυτταροπλασματική σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

280B είναι υπερ-εκφράζεται σε όγκους του προστάτη και συσχετίζεται με μειωμένη πρωτεΐνη p53

Για να αποδείξει τη σημασία των 280B σε καρκίνο του προστάτη, εξετάσαμε πρώτα η έκφραση του 280B σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου του προστάτη και μία κανονική κυτταρική σειρά. RT-PCR αποτελέσματα έδειξαν επίπεδα 280B mRNA ήταν 6-7 φορές υψηλότερη σε καρκινικά κύτταρα από τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη (PrEC) (Σχ. 6Α). Western κηλίδωση έδειξε την ίδια διαπίστωση, με σημαντικά επίπεδα πρωτεΐνης στα κύτταρα καρκίνου του προστάτη και τίποτα ανιχνεύσιμη στα κύτταρα PrEC (Σχ. 6Α). Να επεκτείνει τις παρατηρήσεις μας στο κλινικό περιβάλλον, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημεία σε αγώνα-ζεύγη ιστούς από 4 ασθενείς. Οι ασθενείς 2 και 4 έδειξαν ισχυρότερη 280B ανοσοαντιδραστικότητα από τους φυσιολογικούς ιστούς (Σχ. 6Β), δείχνοντας ότι η έκφραση 280B είναι αυξημένη σε μερικούς όγκους καρκίνου του προστάτη. Όπως θα ήταν αναμενόμενο για έναν παράγοντα μεταγραφής, 280B εκφράζεται αποκλειστικά στις κυτταρικές πυρήνες όλων των όγκων (Σχ. 6Β). Η μελέτη ιστός επεκτάθηκε για να συμπεριλάβει περισσότερους ιστούς και να ψάξει για μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ 280B και της έκφρασης p53. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, 280B πρωτεΐνη εκφράζεται σε 6 από 10 όγκους του προστάτη, ενώ μόνο σε 1 από 3 από φυσιολογικό προστάτη. Είναι ενδιαφέρον ότι, η πρωτεΐνη ρ53 εκφράζεται πιο υψηλά σε αυτούς τους όγκους (# 1 και # 7), που δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα 280B, και το χαμηλότερο επίπεδο p53 βρίσκεται στον όγκο με την υψηλότερη έκφραση 280B. Αυτά τα δεδομένα εμφανίζουν μία αντίστροφη σχέση στην έκφραση 280B και ρ53 σε όγκους του προστάτη και επομένως είναι συνεπείς με σημαντικό ρόλο για 280B ως αρνητικός ρυθμιστής του p53 στον καρκίνο του προστάτη.

(Α) PCR πραγματικού χρόνου και Western blotting χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης 280B σε κανονικό προστάτη (PrEC) και κυτταρικές σειρές καρκίνου προστάτη (LNCaP, C81, και CWR-22Rv1). (Β) Ανοσο-χρώση 280B σε 4 ζεύγη των ιστών του προστάτη, φυσιολογικό έναντι όγκου. εκχυλίσματος (C) Cell από 4 φυσιολογικούς ιστούς προστάτη και 9 ιστούς όγκων υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για την ανίχνευση 280B, ρ53, και τα επίπεδα έκφρασης Mdm2. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Πριν από αυτή τη μελέτη, 280B ήταν μια μη χαρακτηρισμένη πρωτεΐνη, με τη μόνη διαθέσιμες πληροφορίες που περιγράφουν τη σχέση του με την μεγάλη οικογένεια του ψευδαργύρου παράγοντες μεταγραφής δάχτυλο [32]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εντοπίσει δύο στόχους του 280B, sGCα1 και ρ53, οι οποίες έχουν σημαντικές λειτουργίες σε καρκίνο του προστάτη. Η πρώτη, sGCα1, έχει ένα καλά χαρακτηρισμένο ρόλο στην ΝΟ σηματοδοσίας και ένα λιγότερο γνωστά ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Όσον αφορά το τελευταίο αυτό το ρόλο, τα προηγούμενα δεδομένα μας έδειξαν ότι sGCα1 είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της ανδρογόνου υποστήριξη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [33] και ένα καταστολέα του ρ53 που παρέχει κύτταρα καρκίνου προστάτη μια λειτουργία προ-επιβίωσης [20]. Το εύρημά μας ότι 280B ενισχύει την έκφραση του sGCα1 είναι συνεπής με 280B έχοντας λειτουργίες προ-καρκίνου, τα οποία είναι σαφώς από την υψηλή έκφραση του σε καρκίνο του προστάτη και pro-πολλαπλασιαστική λειτουργία του σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Είναι ενδιαφέρον ότι η θετική επίδραση της 280B παρατηρήθηκε τόσο στο mRNA sGCα1 και πρωτεΐνες, γεγονός που υποδηλώνει ότι το mRNA, και ίσως ο υποκινητής sGCα1, μπορεί να είναι ο στόχος του 280B. Χρησιμοποιώντας ένα 1-kb τέντωμα του υποκινητή sGCα1 στην οποία AR πράξεων [33], παρατηρήσαμε καμία δραστηριότητα 280B (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται είτε η επίδραση 280B για sGCα1 είναι έξω 1-kb περιοχή μας, ή μετα-μεταγραφικό, κάτι που θα πρέπει να μελετηθεί στο μέλλον. Αξίζει να σημειωθεί ότι 280B μοιράζεται ένα περιορισμένο κοινό ακολουθία DNA με sGCα1, την ακολουθία που στοχεύεται από siRNA7, η οποία μας οδήγησε να προσδιορίσει 280B. Εν όψει αυτών των δεδομένων, είναι ενδιαφέρον να εξετάσει το ενδεχόμενο μιας κοινής ενδογενούς miRNA ή siRNA που δρα τόσο sGCα1 και 280B. Εάν υπάρχει μία τέτοια ρυθμιστική RNA, αυτό το RNA θα αναμενόταν να ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκίνο του προστάτη καθώς τόσο sGCα1 και 280B είναι υπερ-εκφράζεται σε αυτή την ασθένεια. Ταυτοποίηση ενός τέτοιου ειδικού RNA είναι ένα σημαντικό μελλοντικό στόχο του εργαστηρίου.

Παρά τη θετική ρύθμιση από 280B της sGCα1, υπερέκφραση του sGCα1 εκπληκτικά απέτυχε να διασώσει κύτταρα αναστέλλεται από 280B εξάντληση, προτείνοντας έναν άλλο στόχο 280B . αναζήτηση μας οδήγησε σε p53. Σε αντίθεση με sGCα1, ρ53 ρυθμίζεται αρνητικά από 280B και αυτός ο κανονισμός στρέφεται κατά του ρ53 πρωτεΐνη. Υπο-έκφραση της ρ53 είναι σε θέση να σχεδόν εξ ολοκλήρου κύτταρα διάσωση αναστέλλονται από μειωμένη έκφραση 280B. Έτσι, στο πλαίσιο της μείωσης έκφρασης 280B σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, η οποία οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα sGCα1 και αυξημένη ρ53, η αύξηση του p53 ήταν κυρίως ή αποκλειστικά υπεύθυνη για τη μειωμένη κυτταρική ανάπτυξη και πιθανώς την ενισχυμένη απόπτωση.