Αφηρημένο

Μετάσταση οδηγεί σε κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, και υπάρχει μια αυξανόμενη ανάγκη για νέα θεραπευτικούς στόχους. TMEM16A (ANO1, DOG1 ή TAOS2) έχει πρόσφατα ταυτοποιηθεί ως κανάλι χλωριούχο ασβέστιο ενεργοποιούμενη (CACC) και έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε διάφορους κακοήθειες? Ωστόσο, η έκφραση και η λειτουργία του σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε έκφραση TMEM16A mRNA και της πρωτεΐνης σε υψηλού μεταστατικού δυναμικού SW620, HCT116 και LS174T κύτταρα, αλλά όχι στην πρωτογενή HCT8 και SW480 κύτταρα, χρησιμοποιώντας RT-PCR, κηλίδωση Western και την επισήμανση ανοσοφθορισμού. καταγραφές patch-clamp ανιχνεύεται CACC ρεύματα ρυθμίζεται από ενδοκυτταρικό Ca

2+ και τάσης στα κύτταρα SW620. Εξόντωση TMEM16A από σύντομες RNAs φουρκέτας (shRNA) είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της ανάπτυξης, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων SW620 όπως ανιχνεύεται με ΜΤΤ, την επούλωση πληγών και επικοινωνούντα δοκιμασίες. Μηχανιστικά, εξάντληση TMEM16A συνοδεύτηκε από την απορύθμιση της φωσφο-ΜΕΚ, φωσφο-ERK1 /2 και την έκφραση της κυκλίνης D1. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι τα κύτταρα SW620 ανεστάλησαν από την G1 στην S φάση του κυτταρικού κύκλου στην ομάδα TMEM16A shRNA σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι TMEM16A CACC εμπλέκεται στην ανάπτυξη, τη μετανάστευση και την εισβολή των μεταστατικών κυττάρων CRC και παρέχουν ενδείξεις για TMEM16A ως πιθανός στόχος φαρμάκου για τη θεραπεία του μεταστατικού ορθοκολικού καρκινώματος

Παράθεση:. Sui Υ, Sun M , Wu F, Γιανγκ L, Di W, Zhang G, et al. (2014) Αναστολή της TMEM16A Έκφραση καταστέλλει την ανάπτυξη και την εισβολή σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (12): e115443. doi: 10.1371 /journal.pone.0115443

Επιμέλεια: Χονγκ Wanjin, Ινστιτούτο Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Biopolis, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Ιούν του 2014? Αποδεκτές: 23 Νοέμ 2014? Δημοσιεύθηκε: 26 Δεκ 2014

Copyright: © 2014 Sui et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81173109, 31471099, και 31301179), η Κίνα Ίδρυμα Μεταδιδακτορικός Επιστήμη (Νο 2014M551198), και την υγεία επαρχία Jilin και Οικογενειακού Προγραμματισμού Έργου της Επιτροπής (Αρ 2014Q024). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνή κακοήθεια σε όλο τον κόσμο [1], [2], και η μετάσταση είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την κακή πρόγνωση των ασθενών με CRC [3]. Μεταβολές των πολλαπλών γονιδίων, όπως η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, που εμπλέκονται στην εξέλιξη της κανονικής επιθήλιο του κόλου σε αδενώματος και σε κακοήθη αδενοκαρκίνωμα [4], [5] Εντούτοις, υπάρχουν περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με τις μοριακές αλλαγές που προσδίδουν στο ορθοκολικό μετάστασης του καρκίνου [6], [7]. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο για την ταυτοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με τη μετάσταση και-μοριακών οδών τους, η οποία μπορεί να παρέχει νέους στόχους για τη θεραπεία του μεταστατικού CRC.

Η χρωμοσωμική ζώνη 11q13 αμπλικόνιο είναι ένα από τα πιο συχνά ενισχυμένες περιοχές στις ανθρώπινες κακοήθειες , όπως κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (HNSCC) και του μαστού, της ουροδόχου κύστης και ο καρκίνος του οισοφάγου [8]. Η ανάλυση της διαφορικής έκφρασης των γονιδίων που βρίσκονται στην περιοχή αυτή οδήγησε στην ταυτοποίηση του

TMEM16A

, η οποία καλείται επίσης

ANO1

(anoctamin-1),

DOG1

( ανακαλύφθηκε στο γαστρεντερικό στρωματικών όγκων πρωτεΐνη 1),

ORAOV2

(καρκίνο του στόματος υπερεκφράζεται 2) και

TAOS2

(όγκου-ενισχύεται και υπερεκφράζεται ακολουθία 2) [9], [10], [11] [12], [13]. TMEM16A αποτελείται από 26 εξώνια και περιέχει οκτώ διαμεμβρανική segaments με τα Ν- και C-άκρα αντιμετωπίσει το κυτταρόπλασμα και ένα βρόχο επανεισόδου που βρίσκεται ανάμεσα ΤΜ5 και ΤΜ6 πιθανώς σχηματίζει την περιοχή πόρου [14].

TMEM16A έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι είναι ένας ασβέστιο ενεργοποιούμενη χλωριούχου διαύλου [14], [15], [16] και εκφράζεται ευρέως σε διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των εκκριτικών επιθηλίων, των λείων μυών, αισθητήριων νευρώνων και σε άλλους ιστούς [17], [18]. TMEM16A παίζει πολλές σημαντικές φυσιολογικούς ρόλους στον έλεγχο των επιθηλιακών μεταφοράς ρευστού, αγγειακή σύσπαση των λείων μυών, την παραγωγή σάλιου και την κινητικότητα του γαστρεντερικού σωλήνα [19], [20], [21], [22]. Δυσλειτουργία του TMEM16A προκαλεί ανθρώπινων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων κυστική ίνωση, υπέρταση, πνευμονική ασθένειες και διάρροια [23], [24], [25]? νοκ-άουτ από TMEM16A είναι εμβρυονικώς θανατηφόρος επειδή τραχειομαλακίας [26].

Η έκφραση του TMEM16A είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων HNSCC και του οισοφάγου, του μαστού και του καρκίνου του προστάτη. υπερέκφραση του είναι επίσης συσχετίζεται με την ανάπτυξη των μακρινών μετάσταση και φτωχή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο με HNSCC [27], [28], [29]. Πρόσφατα, TMEM16A έχει βρεθεί για την προώθηση HNSCC ογκογένεσης και εισβολή μέσω ενεργοποίησης του ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) σηματοδότησης. Επιπλέον, TMEM16A έχει αναφερθεί να συμβάλλει στην εξέλιξη του καρκίνου με διέγερση της ενεργοποίησης των επιθηλιακών υποδοχέα αυξητικού παράγοντα (EGFR) και εξαρτώμενη από καλμοδουλίνη πρωτεϊνική κινάση II (CaMK II) και εν συνεχεία ενεργοποίηση ΑΚΤ και σηματοδότηση ΜΑΡΚ στον καρκίνο του μαστού και HNSCC [30] , [31]. Αν και TMEM16A εκφράζεται παντού σε γαστρεντερικά στρωματικά όγκους [32], ο ρόλος του στην CRC μετάσταση είναι ελάχιστα ερευνηθεί.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε για πρώτη φορά την έκφραση του TMEM16A διαύλων χλωριούχου ασβεστίου που ενεργοποιείται (CaCCs) σε διάφορες δυναμικό του ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές metastatics. Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος των TMEM16A στα κύτταρα SW620 μετάσταση και την πιθανή μοριακός μηχανισμός της με τη χρήση μικρών RNAs φουρκέτα in vitro.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο καρκίνωμα του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές HCT8, SW480, SW620, HCT116 και LS174T κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). SW480 και SW620 καλλιεργήθηκαν σε L15 Medium (Sigma, USA). HCT8 και HCT116 αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Sigma, USA). κύτταρα LS174T καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (Sigma, USA). Fisher θυρεοειδούς αρουραίου (FRT) κύτταρα και κύτταρα FRT επιμολύνονται σταθερά με ανθρώπινο TMEM16A ελήφθησαν από τον Alan Verkman (University of California, San Francisco, CA, USA) [33] και καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο F12 Coon του. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 και 95% αέρα.

εξαγωγή RNA και RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις εισαγωγές του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση, καθαρότητα και την ακεραιότητα του RNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop2000 (Thermo Scientific). Πεντακόσια νανογραμμάρια ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας την ανάστροφη μεταγραφάση με το κιτ αντιδραστηρίου PrimeScriptTM RT (Takara). Το προϊόν cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για ενίσχυση PCR σε έναν συνολικό όγκο 30 μΐ, και οι συνθήκες PCR ήταν ως εξής: 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 30 κύκλους των 94 ° C για 30 s? 60 ° C για 30 s? και 72 ° C για 60 s. Για ενίσχυση TMEM16A cDNA, χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές: αίσθηση εκκινητή, 5 ‘-AACGGGA CCATGCACGGCTT-3’? αντιπληροφοριακό εκκινητή, 5 ‘-TGTTGTGGTGGTTGCACGGC-3’. Τα προϊόντα PCR (424 bp) αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος για την κανονικοποίηση των δεδομένων εκφράσεως.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με πάγο κρύο αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και διαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 5 mM EDTA, ρΗ 7.5, 1% Triton Χ-100 και συμπληρωμένο με 1 mM PMSF). Μετά πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση, τα δείγματα που περιείχαν 100 μg πρωτεΐνες μετουσιώθηκαν και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας 10% SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Μετά τον αποκλεισμό με 5% (w /v) άπαχο γάλα και πλύση με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris-Tween διάλυμα (TBST), οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτογενές πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-TMEM16A (Abcam, ab53212? 1:100 ) και ποντικού αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (Cell Signaling? 1:500), αντίστοιχα. Όλα τα άλλα πρωτεύοντα αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology. Μετά την πλύση, οι κηλίδες επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Sigma? 1:5,000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ενισχυμένη κιτ χημειοφωταύγειας (Amersham, Little Chalfont, UK) σε φιλμ ακτίνων Χ (Millipore Corporation , Billerica, USA).

ανοσοφθορισμού ανάλυση

χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη για τον εντοπισμό της εκφράσεως του TMEM16A. Καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα σε προτιμώμενες γυάλινες καλυπτρίδες (Fisher, USA) και σταθεροποιήθηκαν για 15 λεπτά σε 4% (w /v) παραφορμαλδεϋδη (PFA). Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν 3 φορές με PBS για 5 λεπτά, διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 /PBS για 20 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα σε 3% διάλυμα BSA /PBS Αποκλεισμός. Για την ανίχνευση TMEM16A, τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 3 ώρες με DOG1 μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπινης ποντικού (zhongshanjinqiao, Κίνα? Δύο παρα δέκα), που ακολουθείται από έκθεση σε ένα δευτερογενές αντίσωμα Cy3-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG (Sigma? 1 :1,000) στους 37 ° C για 1 ώρα. Για την οπτικοποίηση πυρήνες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA? 40,6- διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη), και οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε πλακίδια με αντιξεθωριάσματος διάλυμα (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) . Φθορισμού εικόνες εξετάστηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan).

καταγραφές Patch clamp

Ανθρώπινο ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα σπάρθηκαν επί γυάλινων καλυπτρίδων και καταγραφές patch clamp έγιναν χρησιμοποιώντας ένας ενισχυτής EPC10 (ΗΕΚΑ, Lambrecht /Pfalz, Γερμανία) σε συνδυασμό με Patchmaster (ΗΕΚΑ) σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πιπέτες παρασκευάστηκαν από βοριοπυριτικό γυαλί τριχοειδές χρησιμοποιώντας ένα εξολκέα μικροσιφωνίου (PC-10, Narishige, Japan) και στη συνέχεια φωτιά στιλβωμένο με μικροκάμινο (MF-900, Narishige, Japan). Η αντίσταση των πιπετών στο διάλυμα του λουτρού ήταν 2-5 ΜΩ. Τα κύτταρα διαποτίστηκαν με ένα διάλυμα λουτρού που περιείχε: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl

2, 1 mM ΟαΟ

2, 5 mM γλυκόζη, 5 mM HEPES και 20 mM σουκρόζη (ρΗ 7.4 με NaOH) . Για τη διαμόρφωση ολόκληρου κυττάρου, η μηδενική Ca

2+ ενδοκυτταρικό διάλυμα περιείχε τα ακόλουθα: 146 mM Ν-μεθυλ-D-γλυκαμίνης χλωρίδιο (NMDG-Cl), 2 mM MgCl

2, 5 mM EGTA και 8 mM HEPES (ρΗ 7,4 με NMDG). Η high-Ca

2+ λύση πιπέτας περιείχε 5 mM Ca

2 + -EGTA αντί EGTA (ελεύθερη Ca

2 + περίπου 25 μΜ). Διαφορετικές δωρεάν [Ca

2 +] λύσεις έγιναν με ανάμιξη της μηδενικής Ca

2+ και υψηλής Ca

2+ λύσεις. Το κύτταρο συσφίγγεται από το δυναμικό εκμετάλλευσης (0 mV) σε τάσεις μεταξύ -100 έως 100 mV σε 20 βήματα mV. Για τη διαμόρφωση μέσα-έξω, το διάλυμα της πιπέτας περιείχε: 140 mM NMDG-Cl, 2 mM MgCl

2, 5 mM ΟαΟ

2 και 10 mM HEPES (ρΗ 7,4 με NMDG)? και το διάλυμα έγχυσης περιείχε: 150 mM NMDG-Cl, 2 mM MgCl

2, 10 mM EGTA, 8 mM Tris και 10 mM HEPES (ρΗ 7,4 με NMDG). Αφού η αντίσταση σφράγισης έφθασε & gt? 40 GΩ, η μεμβράνη αποκόπηκε, και το δυναμικό της μεμβράνης διατηρήθηκε στους -50 mV. Τα δεδομένα φιλτράρονται στα 100 Hz με φίλτρο οκτώ pole Bessel (LPF-8, Warner Instruments, LLC, Hamden, CT, USA), και ψηφιοποιημένων χρησιμοποιώντας έναν υπολογιστή με ρυθμό δειγματοληψίας 500 Hz. Νιφλουμικό οξύ (NFA) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich. Όλα τα πειράματα εμπλάστρου μέσα-έξω διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα γρήγορο σύστημα ανταλλαγής διάλυμα αιμάτωσης (SF-77Β, Warner Instruments). Ο νεκρός χρόνος της αλλαγής του διαλύματος ήταν 30 ms, και η ανάλυση των δεδομένων έγινε για εγγραφές που περιέχουν ολόκληρα κύτταρα σε ένα μόνο κανάλι χρησιμοποιώντας το λογισμικό Ιγκόρ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34].

RNA παρεμβολής

TMEM16A /ANO1 μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) και του αρνητικού ελέγχου shRNA πλασμίδιο κατασκευάστηκαν από GeneChem Co, Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Η περιοχή για siRNA που στοχεύει του ανθρώπινου TMEM16A /ANO1 γονίδιο (GenBank NM_018043) ήταν ως ακολούθως: # 1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA (1077-1095 nt)? και # 2, CGAAGAAGA TGTACCACAT (837-855 nt). παρεμβολή RNA διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

ρυθμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, 5000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε πλάκα 96 φρεατίων για 24 ώρες, επιμολυσμένα με TMEM16A shRNA ή ομελέτα shRNA και επωάστηκαν περαιτέρω για 1, 2, 3 και 4 d, αντίστοιχα. αντιδραστήριο ΜΤΤ (10 μΙ? 500 μg /mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 4 ώρες. Ακολούθως, 150 μΐ DMSO προστέθηκαν για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μετριέται η απορρόφηση στα 570 nm με έναν αναγνώστη μικροπλάκας (Thermo Scientific, USA).

In vitro

επούλωσης πληγών

κινητικότητα των κυττάρων αξιολογείται από μία ανίχνευση γρατσουνιά πληγή in vitro. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων μέχρι συρροή, ξύνεται με ένα αποστειρωμένο, 200 μλ άκρο και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Μετά την επώαση με μέσο L15 που περιείχε 1% ορό εμβρύου μόσχου, τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν σε 0 ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες ή 72 ώρες κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan) σε μεγέθυνση 100 Χ. Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Οι αποστάσεις μεταξύ των ακμών του τραύματος μετρήθηκαν με βαθμολογημένο χάρακα, και η σχετική πλάτος μηδέν προσδιορίστηκε με αναλογία μέσης πλάτος σε κύτταρα αγωγή έναντι του μέσου όρου πλάτος σε κύτταρα ελέγχου.

Δοκιμασίες

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

In vitro

καρκίνος κυτταρική μετανάστευση και εισβολή δραστηριότητες αξιολογήθηκαν σε transwells, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με τροποποιήσεις [23]. SW620 κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε μέσο L15 με 10% FBS μέχρι συρροής σε πλάκες 6 φρεατίων, επιμολυσμένα με το TMEM16A shRNA ή ομελέτα shRNA για 24 ώρες, και στη συνέχεια επεξεργασία με θρυψίνη, πλύθηκαν και μετρήθηκαν. Για την κυτταρική μετανάστευση, 1 × 10

5 κύτταρα σε 200 μΙ μέσου με 1% FBS σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο ένθετο transwell που περιέχει ένα φίλτρο από πολυανθρακικό (διάμετρος 6.5-mm, 8-μm πόρους? Corning Costar, Coming, ΝΥ , ΗΠΑ). μέσο L15 (600 μλ) με 10% FBS (χημειοελκτική) προστέθηκε στον κάτω θάλαμο, και οι πλάκες επωάστηκαν για 72 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO

2. Για κύτταρο εισβολή, τα transwells επικαλύφθηκαν με Matrigel. Τα κύτταρα που δεν μεταναστεύουν απομακρύνθηκαν από την κορυφή των φίλτρων μεταξύ φρεατίων με απόξεση. Τα διεισδύσει κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με Coomassie blue και μετρήθηκαν υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (100 χ μεγέθυνση). Ο αριθμός των κυττάρων που αντιπροσωπεύεται δραστικότητα μετανάστευσης.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Μετά την επιμόλυνση των κυττάρων με TMEM16A ή ομελέτα Τα siRNAs για 3 ημέρες, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας θρυψίνη, επαναιωρήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης και μετρήθηκαν. Στη συνέχεια, 1 × 10

6 κύτταρα πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα με 70% (ο /ο) αιθανόλη στους 4 ° C. Μετά από πλύσιμο δύο φορές με PBS, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα που περιέχει 50 μg /mL των ΡΙ και 100 μg /mL RNase Α για 30 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Beckman Coulter, Epics XL).

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση στατιστικών SPSS (έκδοση 17.0) με δύο ουρά του Student

t-test

.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ±

SD

.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της TMEM16A σε κυτταρικές σειρές CRC

Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίστηκε για πρώτη φορά

TMEM16A

επίπεδα mRNA με RT-PCR με τον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές HCT8, SW480, SW620, HCT116 και τα κύτταρα LS174T. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, ένα 424-bp θραύσμα του ανθρώπινου

TMEM16A

ενισχύθηκε από SW620, HCT116 και τα κύτταρα LS174T και τα κύτταρα FRT θετικού μάρτυρος επιμολυσμένα σταθερώς με ανθρώπινο

TMEM16A

, αλλά όχι από HCT8, SW480 κύτταρα και αρνητικά ελέγχου κύτταρα null-FRT. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με τη χρήση αντι-TMEM16A πολυκλωνικό αντίσωμα προσδιορίσει μια πρωτεϊνική ζώνη περίπου 110-kDa σε SW620, HCT116 και τα κύτταρα LS174T (Εικ. 1Β). Σε αντίθεση, ταινία πρωτεΐνης TMEM16A ήταν απούσα σε SW480, HCT8 και αρνητικό μάρτυρα κύτταρα null-FRT. Εξετάσαμε περαιτέρω την έκφραση και υποκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης σε κύτταρα TMEM16A CRC χρησιμοποιώντας χρώση ανοσοφθορισμού. επισήμανσης ανοσοφθορισμού αποκάλυψε ότι TMEM16A ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται επί της κυτταρικής μεμβράνης και το πλάσμα του SW620, HCT116 και τα κύτταρα LS174T (S1 Σχ.), ενώ TMEM16A ήταν σχεδόν παρατηρήθηκε σε HCT8 και τα κύτταρα SW480 (Σχ. 2). Ένα κυψελοειδές, ισογονιδιακές μοντέλο (κυτταρικές σειρές SW480 και SW620) ανθρώπινης μετάβασης μετάστασης CRC επιλέχθηκε για μεταγενέστερη μελέτη.

Α, RT-PCR αποκαλύπτει έκφραση TMEM16A mRNA σε SW620, HCT116 και LS174T κύτταρα, αλλά όχι σε HCT8 και SW480 κύτταρα. Β, η έκφραση πρωτεΐνης TMEM16A σε HCT8 και SW480, SW620, HCT116 και τα κύτταρα LS174T ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. Null κύτταρα FRT δρα ως αρνητικός έλεγχος. κύτταρα FRT επιμολυσμένα με ανθρώπινο TMEM16A χρησιμοποιηθεί ως θετικός έλεγχος.

Η

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων και χρωματίστηκαν με αντι-TMEM16A αντισώματα. Αριστερή στήλη, αντι-TMEM16A ανοσοφθορισμού (Cy3, κόκκινο). Μεσαία στήλη, χρώση DAPI να απεικονίσει πυρήνες. Δεξιά στήλη, συγχωνεύθηκαν οι εικόνες είναι σύνθετα αντι-TMEM16A ανοσοφθορισμού και τη χρώση DAPI (200 ×).

Η

Λειτουργική έκφραση του καναλιού TMEM16A στα κύτταρα CRC

Για να επικυρώσετε την λειτουργική έκφραση της το κανάλι TMEM16A στις κυτταρικές γραμμές CRC, εκτελέσαμε ολόκληρων κυττάρων καταγραφές patch clamp των κυττάρων SW480 και μέσα-έξω καταγραφές patch clamp των κυττάρων SW620. Σύκο. 3Α δείχνει μια οικογένεια ρεύματα σε απόκριση προς τις βαθμίδες της τάσης των ερεθισμάτων με την παρουσία 1 μΜ Ca από ένα κύτταρο SW480. Η καμπύλη ρεύματος-τάσης (Σχ. 3Β) έδειξαν ότι το δυναμικό αναστροφής (V

rev) αυτού του ρεύματος είναι κατά προσέγγιση -50 mV, αλλά το V

rev του καναλιού χλωριδίου εκτιμήθηκε ότι είναι περίπου 0 mV με τη χρήση η εξίσωση Nernst σύμφωνα με την εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών Cl

-. Αυτό το αποτέλεσμα καταδεικνύει ότι τα ρεύματα καταγράφηκαν από το κύτταρο SW480 δεν είναι από τα κανάλια χλωριούχο.

Α, Αντιπροσωπευτικές ρεύματα ολόκληρων κυττάρων σε κύτταρα SW480 ενεργοποιήθηκαν με 1 μΜ Ca. Τα ρεύματα καταγράφηκαν σε δυναμικό εκμετάλλευσης από το 0 mV ακολουθούμενο από πάλλεται τάσεις μεταξύ ± 100 mV σε βήματα των 20 mV. Β, καμπύλη ρεύματος-τάσης από τον πίνακα Α που δηλώνει ότι τα ρεύματα δεν είναι από τα κανάλια χλωρίδιο. C, ένας εκπρόσωπος τρέχον ίχνος καταγράφεται από ένα μέσα-έξω μπάλωμα ενός κυττάρου SW620. Μια τρέχουσα CACC προκλήθηκε με 1 μΜ Ca

2+, όπως σημειώνεται. Διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν μηδενικό ρεύμα. Η τάση της μεμβράνης πραγματοποιήθηκε στο -50 mV? και προς τα πάνω εκτροπές αντιπροσωπεύουν το άνοιγμα του καναλιού. D, A σταθερή τρέχον ίχνος μετά από μια τρέχουσα CACC από τον πίνακα C τρέχει προς τα κάτω. Ε, ένα συνεχές ρεύμα καταγραφή δείχνει την ενεργοποίηση των CaCCs και εφαρμογές ράμπες τάσης στην απουσία (Α και C) ή παρουσία (β) του Ca. ράμπες Τάση: +50 έως -100 mV για μια διάρκεια του 2000 ms. F, καμπύλες τάσης-ρεύματος από τον πίνακα Ε που εμφανίζουν τυπικά εξωτερικά χαρακτηριστικά διόρθωση του CaCCs. Σημειώστε ότι ελάχιστη αγωγιμότητα παρατηρήθηκε απουσία Ca. G και Η, CaCCs ρεύματα μειώθηκαν ξεχωριστά με 100 μΜ NFA και 50 μΜ T16Ainh-A01.

Η

μέσα-έξω πειράματα τοπικής λαβίδος των κυττάρων SW620 εκδηλώνεται ότι η τρέχουσα μεμβράνη εξαρτιόταν από το ασβέστιο και την τάση , το οποίο είναι τυπικά χαρακτηριστικά του ενδογενούς CaCCs (Σχ. 3C-F). Επιπλέον, τα ρεύματα ανιχνεύονται έντονα αναστέλλεται από το Cl

– αποκλειστή διαύλων νιφλουμικό οξύ (NFA) (Σχ 3G.) Και το TMEM16A-ειδικά αναστολέας T16Ainh-A01 (Σχήμα 3Η).

. πρόσθεσε επίσης TEME16A συγκεκριμένο αναστολέα T16Ainh-A01 προς SW620 κύτταρα και κύτταρα SW480 χωριστά, και παρατηρήθηκαν αλλαγή ανάπτυξη αυτών των κυττάρων μετά από 24 ώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι T16Ainh-A01 θα μπορούσε να μειώσει ειδικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW620 αλλά όχι SW480 κύτταρα (Σχ. 4).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις T16Ainh-A01 για 24 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (n = 3).

Η

Νοκ ντάουν της TMEM16A ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW620

Για να αποκαλύψει τις λειτουργίες της TMEM16A στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, εμείς επιμολυσμένα δύο ακολουθίες TMEM16A shRNA (# 1 και 2 #) στα κύτταρα SW620 για να φιμώσουν την έκφραση της TMEM16A. Αποτελέσματα κηλίδα Western έδειξαν ότι TMEM16A shRNA # 1 προκάλεσε μείωση 63,4% στην έκφραση της πρωτεΐνης TMEM16A και TMEM16A shRNA # 2 προκάλεσε 71,7% μείωση, σε σύγκριση με τον έλεγχο shRNA. TMEM16A knockdown οδήγησε σε σημαντική μεταβολή σε ρεύματα χλωριούχο ασβέστιο ενεργοποιούμενη ολικού κυττάρου και την πυκνότητα immunofluorescene (Εικ. 5).

Α, ανάλυση κηλίδος Western της πρωτεϊνικής έκφρασης σε κύτταρα TMEM16A SW620 που επιμολύνθηκαν με shRNA # 1 και # 2. Β, Ο ραβδόγραμμα συνοψίζει το σχετικό επίπεδο έκφρασης TMEM16A πρωτεΐνης από τον πίνακα Α Έκφραση TEMEM16A πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε με το επίπεδο έκφρασης του β-ακτίνης (n = 3). C, Αντιπροσωπευτικά εικόνες immunofluence των κυττάρων SW620 εμφανίζονται μετά TMEM16A είναι νοκ ντάουν από shRNA # 1 και # 2 shRNA, σε σύγκριση με τον έλεγχο shRNA (200 ×). Δ, Η ραβδόγραμμα συνοψίζει τα ρεύματα αιχμής που καταγράφονται στα 100 τάσης mV σε SW620 κύτταρα μετά από TMEM16A χτυπήθηκε κάτω, σε σύγκριση με τον έλεγχο shRNA. ** P & lt? 0,01. Όλα τα δεδομένα δείχνονται ως μέση τιμή ± SD. Ε, ολόκληρων κυττάρων ρεύματα καταγράφηκαν από κύτταρα SW620 επιμολυσμένα με έλεγχο shRNA, shRNA # 1 και # 2 σε δυναμικό διατήρησης 0 mV ακολουθούμενο από πάλλεται τάσεις μεταξύ ± 100 mV σε βήματα των 20 mV.

Η

για να διερευνηθούν οι επιδράσεις του TMEM16A επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων SW620, χρησιμοποιήσαμε δύο αλληλουχίες shRNA να παρεμβαίνει την έκφραση του TMEM16A. ανάλυση ΜΤΤ έδειξε ότι TMEM16A knockdown κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με τον έλεγχο shRNA εκφράζουν SW620 κύτταρα

in vitro

(Εικ. 6).

Α, η ανάπτυξη των SW620 κύτταρα ανεστάλη με TMEM16A shRNA # 1 και # 2 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Μέση ± SD? η = 3? * Ρ & lt? 0,05). Β, Εκπρόσωπος ανοσοκηλιδώσεις επιβεβαιώνοντας νοκ ντάουν της TMEM16A. Ctrl, τον έλεγχο.

Η

καταστολή της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων SW620 από φίμωση ενδογενή TMEM16A

Για να παρατηρήσουμε περαιτέρω τα αποτελέσματα της TMEM16A στην κυτταρική κινητικότητα, πραγματοποιήσαμε επούλωση της πληγής δοκιμασίες μετά την φίμωση ενδογενή TMEM16A. εικόνες επούλωση πληγών απέδειξε ότι το κλείσιμο των πληγών των κυττάρων TMEM16A shRNA # 1 και # 2 ήταν βραδύτερη από ό, τι στον έλεγχο shRNA επεξεργασμένα κύτταρα μετά από ξύσιμο των κυττάρων (Εικ. 7). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι η απορρύθμιση του TMEM16A καθυστέρησε την θεραπεία του τραύματος σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Α, μετανάστευση κυττάρων SW620 εκτιμήθηκε με δοκιμασία επούλωση της πληγής υπό την παρουσία TMEM16A shRNA # 1 και # 2 shRNA, σε σύγκριση με ελέγχου shRNA. Αντιπροσωπευτικές εικόνες κλεισίματος τραύματος ελήφθησαν σε 0 ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες μετά τον τραυματισμό κάτω από 100 × μεγέθυνση. Β, Ιστογράμματα πίνακα Α απεικονίζεται. Οι τιμές είναι οι μέσες ± SD? n = 3? ** P & lt? 0,01. Ctrl, τον έλεγχο.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε τους ρόλους της TMEM16A στην μετάσταση στα κύτταρα SW620. Transwell μετανάστευση και δοκιμασίες εισβολής των κυττάρων knockdown TMEM16A διεξήχθησαν. Στη δοκιμασία μετανάστευσης transwell, οι αριθμοί των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με TMEM16A shRNA που διείσδυσε στη μεμβράνη σε μεγάλο βαθμό μειωμένη σε σύγκριση με κύτταρα SW620 επιμολυσμένα με τον αρνητικό μάρτυρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι SW620 κύτταρα επιμολυσμένα με TMEM16A shRNA # 1 και # 2 παρουσίασαν σημαντική εξασθένηση των μεταναστευτικών ικανότητα. Ομοίως, το αντίστοιχο ρόλο της TMEM16A shRNA # 1 και # 2 για επεμβατική ικανότητα παρατηρήθηκε επίσης σε μια παράλληλη επεμβατική δοκιμασία (Εικ. 8).

Α, Μετανάστευση (χωρίς Matrigel) και εισβολή (με Matrigel) της τα κύτταρα SW620 καταστέλλονται σημαντικά με knockdown του TMEM16A σύγκριση με την ομάδα ελέγχου μέσω επικοινωνούντα δοκιμασίες διείσδυσης. Μη-κύτταρα που μετανάστευσαν ξύνεται με μια μπατονέτα. Τα κύτταρα που διείσδυσαν τα φίλτρα transwell βάφτηκαν με Coomassie blue. Αντιπροσωπευτικά εικόνες. Β και C, Ιστογράμματα πίνακα Α δείχνονται. Οι τιμές είναι οι μέσες ± SD? n = 3? ** P & lt? 0,01. Ctrl, τον έλεγχο.

Η

Η εξάντληση των TMEM16A ανέστειλε την ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ σηματοδότησης

Για την διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους TMEM16A επηρεάζει την ανθρώπινη ανάπτυξη CRC και μετάσταση, διερευνήσαμε τη συσχέτιση των TMEM16A με κυκλίνη D1 και ΜΑΡΚ μονοπατιού σηματοδότησης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 9, νοκ ντάουν της TMEM16A ελάττωσε σημαντικά την έκφραση της κυκλίνης D1 και φωσφορυλίωση των ΜΕΚ και ERK1 /2, ενώ δεν επηρέασε τη συνολική ΜΕΚ ή τα επίπεδα ERK1 /2 έκφραση.

Αποτελέσματα κηλίδας Western δείχνουν αναστολή της TMEM16A οδήγησε σε μείωση της φωσφο-ΜΕΚ, φωσφο-ERK1 /2 και κυκλίνης D1. Ctrl, τον έλεγχο.

Η

Η εξάντληση των TMEM16A προκάλεσε καθυστέρηση του κυτταρικού κύκλου πομπή

Εμείς μετριέται περαιτέρω την κατανομή του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής για να ερευνήσει την πιθανή μηχανισμό TMEM16A στη ρύθμιση CRC κυττάρων πολλαπλασιασμός. Όπως δεικνύει η Εικ. 10 έδειξαν, μια αύξηση του αριθμού των κυττάρων στο G0 /G1 φάση και μείωση του αριθμού των κυττάρων στο G2 /M φάση παρατηρήθηκε μετά από ενδογενείς TMEM16A χτυπήθηκε κάτω. Το ποσοστό των κυττάρων G1 φάσης σε # 1 κύτταρα TMEM16A-shRNA (50,3% ± 1,83) και # 2 κύτταρα TMEM16A-shRNA (51.8 ± 1.13) ήταν σημαντικά υψηλότερα από ό, τι στα κύτταρα ελέγχου (33,95 ± 2,05) (Ρ & lt? 0,01). Αυτά τα αποτελέσματα επαλήθευσε ότι TMEM16A knockdown οδήγησε στην επιβράδυνση της προόδου του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα SW620 συλλαμβάνοντας κύτταρα στο Go /G1 φάση, η οποία προκάλεσε την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων TMEM16A shRNA.

Α, Β και C, κυτταρομετρίας ροής ανάλυση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων SW620 επιμολυσμένα με έλεγχο shRNA, TMEM16A shRNA # 1 και # 2, αντίστοιχα, για 72 ώρες. D, Bar γραφικές παραστάσεις που δείχνουν την σχετική εκατοστιαία αναλογία των κυττάρων σε υποδεικνυόμενες φάσεις του κυτταρικού κύκλου μετά knockdown του TMEM16A. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD? n = 3? * P & lt?.. 0.05

Η

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εξάντληση των TMEM16A κατέστειλε την ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ μονοπατιού και καθυστερημένη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σηματοδότησης

Συζήτηση

πρωτεΐνες TMEM16A βρέθηκαν πρόσφατα να σχηματίσουν Ca

2 + -ενεργοποιημένου Cl

– κανάλια που παροδικά ενεργοποιούνται από το ενδοκυτταρικό ασβέστιο [15], [16], [26], [35]. Τα κανάλια αυτά παίζουν ένα σημαντικό ρόλο σε επιθηλιακά Cl

– έκκριση, συστολή λείου μυός και την μεταγωγή σήματος οσφρητικό [17], [36], [37], [38], [39]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι TMEM16A είναι συχνά υπερεκφράζεται σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του SCCHN, καρκίνο του οισοφάγου και των γαστρεντερικών στρωματικών όγκων (GIST) [28], [36], [40]. Ωστόσο, η έκφραση του TMEM16A σε CRC παραμένει ασαφής.

Το εύρημά μας παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι TMEM16A ενισχύεται και εκφράζεται έντονα σε SW620, HCT116 και LS174T κύτταρα αλλά όχι σε HCT8 και τα κύτταρα SW480. Βρήκαμε ότι η πρωτεΐνη TMEM16A ήταν περίπου 110 kD και που βρίσκεται στην κυτταρική μεμβράνη και το πλάσμα του SW620, HCT116 και τα κύτταρα LS174T, η οποία είναι συνεπής με προηγούμενες αναφορές [39], [41]. Colon καρκινική κυτταρική γραμμή SW480 προέρχεται από πρωτογενή αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου από ένα 50-year-old άνδρα ασθενή, και SW620 κυττάρων που προέρχονται από ένα μεταστατικό μεσεντερικά λεμφαδένα του ίδιου ασθενούς. Έτσι SW620 κύτταρα έχουν υψηλό δυναμικό μετάστασης σε σύγκριση με SW480 κύτταρα [42]. LS174T και HCT116 έχουν υψηλότερο δυναμικό μετάστασης από HCT8 κύτταρα [43], [44], [45]. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τα άνω ρύθμιση του TMEM16A συσχετίστηκε με αυξημένη δυνατότητα μετάστασης σε πέντε κυτταρικές γραμμές CRC. Είμαστε εικάζουν ότι μεταβολή της έκφρασης TMEM16A συνδέθηκε με την εξαγορά της πιο επιθετική ακίνητα σε κυτταρικές σειρές CRC, η οποία προκαλεί όγκους να γίνει μεταστατική. Σχέση ανάμεσα στην έκφραση TMEM16A και την εξέλιξη της CRC όγκου θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω σε περισσότερες κυτταρικές σειρές CRC και σε μια άλλη μελέτη κλινική.

Λόγω ισογονιδιακές χαρακτηριστικό τους, κυτταρικές σειρές SW480 και SW620 να χρησιμεύσει ως ένα πολύτιμο μοντέλο για τη μελέτη της γενετικής εναλλαγές σε καρκίνο του παχέος εντέρου μεταστατική εξέλιξη [46]. Ως εκ τούτου, έχουμε επιλέξει αυτό το ζευγάρι μοντέλου κυττάρων για μεταγενέστερη μελέτη.

Οι ηλεκτροφυσιολογικές αποδείξεις επικυρωθεί που λειτουργεί TMEM16A όπως CaCCs στα κύτταρα SW620. Πρώτον, η τρέχουσα εξαρτάται από την συγκέντρωση του ιόντος ασβεστίου στο κυτταρόπλασμα και την τάση (Σχ. 3C-F). Επιπλέον, τόσο το χλωριούχο αναστολέας διαύλου NFA και TMEM16A-ειδικός αναστολέας Τ16Α

ΙΝΗ-A01 [47] μπορεί να καταστείλει αποτελεσματικά τα ρεύματα καταγράφηκαν από ένα μπάλωμα SW620 κυττάρων (Σχ. 3G, Η). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι μετά από ένα επίθεμα κύτταρο αποκόπηκε, η τρέχουσα CACC μειώθηκε γρήγορα στην πρώτη και στη συνέχεια έγινε σχετικά σταθερή (Σχ. 3C, D). Αυτό το φαινόμενο κατέδειξε ότι άλλες πρωτεΐνες, όπως καλμοδουλίνη ή εξαρτώμενη από καλμοδουλίνη κινάση, μπορεί να εμπλέκεται στην ρύθμιση της TMEM16A CaCCs σε κύτταρα SW620.

Υπάρχουν ενδείξεις ότι τα κανάλια χλωριούχο συμβάλλουν στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου [48] , [49], [50], [51]. TMEM16A CaCCs έχουν αναφερθεί πρόσφατα για την προώθηση της ανάπτυξης και της μετάστασης σε HNSCC, καρκίνο του προστάτη και του καρκίνου του μαστού [27], [30], [31]. Συνεπής με αυτά τα ευρήματα, βρήκαμε ότι TMEM16A knockdown είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή του πολλαπλασιασμού, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων SW620. Τα στοιχεία μας παρέχουν αποδείξεις ότι TMEM16A πιθανόν συμβάλλει στην ογκογένεση και τη μετάσταση στον τομέα της υψηλής μεταστατικό δυναμικό CRC. Μικρές μοριακή αναστολείς που μπορούν να μειώσουν την έκφραση των TMEM16A μπορεί να χρησιμεύσει ως νέα θεραπευτικά φάρμακα για το μεταστατικό CRC.

Μέχρι σήμερα, ο μηχανισμός με τον οποίο TMEM16A επηρεάζει τον καρκίνο του παχέος εντέρου παρέμεινε σχετικά ανεξερεύνητη. Πολυάριθμες μελέτες έδειξαν ότι η οδός ΕΚΚ δεν ελέγχει μόνο τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση, αλλά επηρεάζει επίσης τη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων, εισβολή και την εξέλιξη [52], [53], [54]. Πρόσφατες μελέτες ανέφεραν ότι TMEM16A προωθεί HNSCC ογκογένεσης και πρόοδο του καρκίνου ενεργοποιώντας ΜΑΡΚ μονοπάτι σηματοδότησης [30]. Ως εκ τούτου, επικεντρωθήκαμε στη μελέτη της σχέσης μεταξύ TMEM16A και ΜΕΚ-ERK1 /2 μονοπατιού στο CRC. Αλλαγές σε αυτό το μονοπάτι ερευνήθηκαν μετά την έκφραση TMEM16A αναστάλθηκε χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι knockdown του TMEM16A ανέστειλε σημαντικά την ενεργοποίηση της ΜΕΚ και ERK1 /2. Με βάση αυτό το αποτέλεσμα, ερευνήσαμε περαιτέρω την έκφραση της κυκλίνης D1, μια ρυθμιστική πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου που σχετίζεται με την έκφραση pERK1 /2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση της κυκλίνης D1 συνδέεται θετικά με pERK1 /2 και TMEM16A έκφρασης. Επιπλέον, κυτταρομετρία ροής (FCM) προσδιορισμοί έδειξαν ότι η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου από G1 σε S φάση ανεστάλη, η οποία ήταν σύμφωνη με την απορρύθμιση της έκφρασης κυκλίνης D1 μετά TMEM16A είχε εξαντληθεί. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν μια πιθανή εξήγηση για την παρατηρούμενη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τη μετανάστευση και εισβολή του CRC όταν TMEM16A καταστάλθηκε και έδειξε ότι TMEM16A συμβάλλει στην ανάπτυξη και μετάσταση του CRC πιθανώς ρυθμίζοντας την οδό ΜΑΡΚ.

Εν κατακλείδι , δείξαμε ότι η έκφραση του TMEM16A σχετίζεται με μεταστατικό δυναμικό των κυτταρικών σειρών CRC.