Abstract

Four-έλικας DNA δευτερογενείς δομές G-τετραπλών έχουν πρόσφατα οπτικοποιούνται στους πυρήνες των ανθρωπίνων καλλιεργημένων κυττάρων. Εδώ, δείχνουμε ότι BG4, ένα G-τετραπλών-ειδικό αντίσωμα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη χρώση του DNA δομές G-τετραπλών σε ιστούς που λαμβάνονται από ασθενή με χρήση ανοσοϊστοχημείας. Παρατηρούμε ένα σημαντικά αυξημένο αριθμό G-τετραπλών-θετικών πυρήνων σε ανθρώπινους καρκίνους του ήπατος και του στομάχου σε σύγκριση με φόντο μη-νεοπλασματικό ιστό. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο σχηματισμός G-τετραπλών μπορούν να ανιχνευθούν και να μετρηθούν στο υλικό που λαμβάνονται από ασθενή και ότι τα αυξημένα σχηματισμό G-τετραπλών μπορεί να είναι ένα χαρακτηριστικό ορισμένων μορφών καρκίνου

Παράθεση:. Biffi G, Tannahill D, Miller J, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) Αυξημένα επίπεδα του G-Τετράκλινο Σχηματισμός στο ανθρώπινο στομάχι και το συκώτι καρκινικούς ιστούς. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10.1371 /journal.pone.0102711

Επιμέλεια: Mark Isalan, Imperial College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: May 28, 2014? Αποδεκτές: 23 Ιούνη 2014? Δημοσιεύθηκε: 17, Ιούλ 2014

Copyright: © 2014 Biffi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Cancer Research UK για την επιδότηση του προγράμματος (C9681 /A11961) και του πυρήνα θεσμικής χρηματοδότησης στο εργαστήριο Balasubramanian, και για μια διδακτορικής διατριβής για GB (https://www.cancerresearchuk.org). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη κανονικά G-τετραπλών DNA δευτερεύουσες δομές μπορούν να σχηματιστούν από γουανίνη πλούσιες ακολουθίες DNA του τύπου G

3 + N

L1 G

3 + N

L2 G

3 + N

L3 G

3+ (Ν = οποιαδήποτε βάση και L = βρόχος) και τέτοια μοτίβα αλληλουχίας είναι διαδεδομένες σε όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα [1], [2]. G-τετραπλά τέσσερις έλικας δομές που περιλαμβάνουν στοίβες των τετράδων που σχηματίζονται μέσω Hoogsteen σχηματισμού δεσμών υδρογόνου τεσσάρων γουανίνες συντονίζεται από μία κεντρική μονοσθενές κατιόν [3]. Ολιγονουκλεοτίδια διπλωμένο σε μια δομή τετραπλών G-

in vitro

έχουν υψηλή θερμοδυναμική σταθερότητα υπό σχεδόν φυσιολογικές συνθήκες, σε συμφωνία με το σχηματισμό τους στα κύτταρα [4]. Η προβλεπόμενη θέση των μοτίβων αλληλουχίας G-τετραπλών σε ρυθμιστικές περιοχές του γονιδιώματος, όπως υποκινητές και τελομερή, προτείνει ότι οι δομές G-τετραπλών μπορεί να έχουν σημαντικούς ρόλους στη λειτουργία γονιδίωμα [5] – [7]. Ένας αριθμός ελικασών που επιλύουν G-τετραπλά έχουν ταυτοποιηθεί και υπέθεσε να συμβάλουν στην κανονικές λειτουργίες του γονιδιώματος, όπως αντιγραφή, μεταγραφή και τη διατήρηση της σταθερότητας γονιδιώματος [8]. Η οπτικοποίηση του DNA δομές G-τετραπλών στα ανθρώπινα κύτταρα υποστήριξε την ύπαρξη του G-τετραπλά στο γονιδίωμα [9]. Σε αυτά τα πειράματα, ένας εξαιρετικά εκλεκτικός G-τετραπλών-ειδικό αντίσωμα (BG4) παρήχθη με εμφάνιση φάγου και που χρησιμοποιούνται για την οπτικοποίηση διακριτές εστίες δομές G-τετραπλών στους πυρήνες των γραμμών καλλιέργειας κυττάρων ανθρώπινου ιστού. Το αντίσωμα αυτό έδωσε την ευκαιρία για την ανίχνευση της κυτταρικής ρόλος του G-τετραπλά και επίσης πιθανή εμπλοκή τους στη νόσο.

έχουν δομές G-τετραπλών προταθεί ότι σχετίζεται με κυτταρικές λειτουργίες όπως αντιγραφή και μεταγραφή. Για παράδειγμα, η σταθεροποίηση G-τετραπλών από ένα μικρό μόριο μπορεί να καταστείλει τη μεταγραφή ορισμένων ογκογονιδίων και /ή προκαλεί βλάβη στο DNA σε τελομερή και ογκογονίδια οδηγούν στην αντιγραφή ελαττώματα και κυτταρικό θάνατο [10] – [17]. δομές G-τετραπλών μπορεί επίσης να συνδέεται με γονιδιώματος αστάθεια και έχουν μοτίβα αλληλουχίας G-τετραπλών βρέθηκε πλησίον σημεία διακοπής και θέσεων των σωματικών αριθμού αντιγράφων του DNA αλλαγές που παρατηρούνται σε διάφορες καρκίνους [18], [19]. Οι ελικάσες που επιλύουν G-τετραπλά επίσης βρέθηκαν εντοπισμένα σε θέσεις του γονιδιώματος αστάθειας [20] – [22], και ασθένειες όπως Bloom και σύνδρομα Werner, οι οποίες εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα γονιδιώματος αστάθεια και μια προδιάθεση για καρκίνο, έχει συμβάλλει μεταλλάξεις στο G -quadruplex-επίλυση ελικάσες [23].

Λαμβάνοντας υπόψη την πιθανή σχέση μεταξύ των δομών G-τετραπλών και την ανθρώπινη ασθένεια, είναι ένας σημαντικός στόχος για την αντιμετώπιση αν G-τετραπλά μπορούν να ανιχνευθούν εντός ανθρώπινους ιστούς. Συνεπώς ερευνήσαμε την ανίχνευση του DNA G-τετραπλά σε ασθενή που προέρχεται ιστούς και αν υπάρχουν διαφορές στα επίπεδα G-τετραπλών μεταξύ μη νεοπλασματικών και καρκινικούς ιστούς. Με τη χρήση του G-τετραπλών-ειδικό αντίσωμα, BG4, σε ανοσοϊστοχημεία με (FFPE) τμήματα ιστού microarray εγκλεισμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, έχουμε ανιχνεύεται διαδεδομένη DNA σχηματισμός G-τετραπλών στους πυρήνες των ανθρώπινων ιστών. Ποσοτικοποίηση των κυτταρικών πυρήνων BG4-θετικών αποκάλυψε πιο εκτεταμένες σχηματισμό δομών G-τετραπλών στο στομάχι και το συκώτι καρκίνων σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φόντο μη νεοπλασματικών ιστών. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επεξεργασία των δομών G-τετραπλών είναι κακή ρυθμίζεται σε ορισμένες ανθρώπινους καρκίνους.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Σας έθεσε ως στόχο να αποδείξει την παρουσία του G-τετραπλά στους πυρήνες των ανθρώπινων ιστούς και να διερευνηθεί αν υπάρχουν διαφορές είναι εύκολα εμφανείς σε καρκινικούς ιστούς που λαμβάνονται από ασθενή. Η προσέγγισή μας βασίστηκε στην ανίχνευση της πυρηνικής G-τετραπλά με ανοσοϊστοχημεία (IHC) με το G-τετραπλών-ειδικό αντίσωμα, BG4, επί μη νεοπλασματικών και καρκίνος μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs). Η ειδικότητα και εκλεκτικότητα των BG4 για τις δομές G-τετραπλών και η εφαρμογή των BG4 σε ανοσοφθορισμού (IF) μικροσκοπία σε ανθρώπινα κύτταρα έχουν περιγραφεί προηγουμένως [9]. Για να προσδιοριστεί η καταλληλότητα των BG4 για IHC, δοκιμάσαμε για πρώτη φορά αυτό το αντίσωμα σε ένα πρότυπο σύστημα χρησιμοποιώντας τμήματα από σφαιρίδια FFPE κυττάρων του MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού που είχαν προηγουμένως παρατηρηθεί να εμφανιστεί εστίες πυρηνική G-τετραπλών από IF μικροσκόπιο [9] . Όπως ανάκτηση επιτόπου, είτε θερμότητα μεσολάβηση (σε κιτρικό-based ρΗ 6,0 ή Τρις /EDTA που βασίζεται ρΗ 9.0 ρυθμιστικά διαλύματα) ή ενζυματικές (με πρωτεϊνάση Κ), απαιτείται συχνά να εκθέσει αντιγονικών θέσεων πριν δέσμευσης αντισώματος, συγκρίναμε αυτά τα τρία πρότυπο επίτοπο ανάκτηση προ-θεραπείες. Μετά την επώαση BG4, χρώση διεξήχθη με επώαση με ένα δευτερεύον αντίσωμα αντι-FLAG, το οποίο αναγνωρίζει ένα επίτοπο ετικέτα FLAG στο αντίσωμα BG4, ακολουθούμενη από Leica υπεροξειδάσης κοχλιαρίας ανίχνευση με βάση πολυμερές χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα χρώση Bond IHC. Μετά το πρωτόκολλο αυτό, έντονη πυρηνική χρώση παρατηρήθηκε με BG4 μόνο μετά την ανάκτηση επιτόπιου (εικόνα 1 Β και S1). Δεν παρατηρήθηκε χρώση εν απουσία προ-επεξεργασίας (Σχήμα 1Α) και τους ελέγχους που εκτελούνται υπό την απουσία του BG4 έδειξε ότι η ανάκτηση επιτόπου με ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού που βασίζεται έδωσε λιγότερο φόντο από ότι με Tris /EDTA (Σχήμα 1 C και S1), ενώ προ -Θεραπεία με πρωτεϊνάση Κ οδήγησε σε μη-ειδική πυρηνική χρώση ακόμη και εν απουσία του BG4 (Σχήμα S1). Επιπλέον, μετά την ανάκτηση επιτόπου με κιτρικό ή Τρις /EDTA ρυθμιστικά, θεραπεία ϋΝάσης Ι πριν από την BG4 χρώση οδήγησε σε ισχυρή μείωση των BG4 ένταση πυρηνικό σήματος (Σχήμα 1D και S1), επιβεβαιώνοντας περαιτέρω την ανίχνευση DNA G-τετραπλά. Το σήμα πυρηνικής BG4 φαίνεται στο IHC είναι συνεπής με την προηγούμενη ανίχνευση του BG4 εστιών στους πυρήνες των κυττάρων καλλιέργειας ιστού [9].

A. Ανθρώπινα σβώλοι κυττάρων αδενοκαρκινώματος μαστού ΜΟΑ-ΜΒ-231 μονιμοποιήθηκαν, παραφίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για IHC χρησιμοποιώντας το G-τετραπλών-ειδικό αντίσωμα BG4. Δεν χρώση παρατηρείται εν απουσία ανάκτησης επιτόπου. Κλίμακα ράβδου αντιστοιχεί σε 20 μm. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη (μπλε). B. ισχυρή χρώση BG4 (καφέ) είναι εύκολα εμφανές στους πυρήνες των κυττάρων ακόλουθη ανάκτηση αντιγόνου με κιτρική-based ρυθμιστικό ρΗ 6.0. χρώση C. Δεν παρατηρείται εν απουσία του πρωτογενούς αντισώματος BG4. D. αριθ χρώση παρατηρείται μετά από αγωγή με ϋΝάση πριν από τη χρώση BG4. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι BG4 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση DNA G-τετραπλών με χρώση IHC.

Η

Αφού διαπιστώθηκε ένα πρωτόκολλο IHC για BG4, επιβεβαιώσαμε πρώτα ότι βιοψία μη νεοπλασματικά δείγματα ανθρώπινου ιστού θα μπορούσε να χρωματίζονται χρησιμοποιώντας BG4. Γενικά, παρατηρήσαμε ποικίλη χρώσης BG4 σε πολλούς ιστούς υποδηλώνοντας διαφορές στο σχηματισμό των G-τετραπλά μεταξύ ιστών και επίσης μεταξύ των κυττάρων εντός του ίδιου ιστού (Εικόνα S2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συνολική διαμόρφωση του DNA G-τετραπλά σε πολύπλοκες ανθρώπινους ιστούς μπορεί να αξιολογηθεί χρησιμοποιώντας BG4 σε IHC, επεκτείνοντας έτσι την οπτικοποίηση των δομών G-τετραπλών πέρα ​​IF μικροσκοπία σε κύτταρα καλλιέργειας ιστού. Σε μια προσωρινή έρευνα της χρώσης BG4 για καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φόντο μη-νεοπλασματικό ιστό, οι διαφορές στην ένταση ή τη διανομή χρώσης BG4 εμφανίστηκε κυρίως ασαφή (τα δεδομένα δεν φαίνονται), και σε πολλές περιπτώσεις αυστηρή ποσοτικοποίηση δεν ήταν δυνατή λόγω των σημαντικών διαφορών στη μορφολογία και παρουσία πολλαπλών τύπων κυττάρων σε κακοήθη έναντι μη νεοπλαστικό ιστό. Αντίθετα, για το συκώτι και το στομάχι, την προσωρινή εξέταση μας πρότεινε ότι οι ιστοί αυτοί ήταν εύκολο να προσδιοριστούν ποσοτικά λόγω σε μια πιο ομοιόμορφη εμφάνιση εντός και μεταξύ των μη νεοπλασματικών και καρκινικούς ιστούς. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται το λογισμικό ανάλυσης εικόνας Aperio Imagescope Nuclear (V9) για την ποσοτικοποίηση του ποσοστού των BG4-θετικών πυρήνων που υπάρχει στο TMAs. Μια ξεχωριστή ταξινομητής ανάλυση εικόνας αναπτύχθηκε για κάθε τύπο ιστού να προσδιορίσουμε με ακρίβεια και ξεχωριστό αγγίζοντας αντικείμενα, με τα κακοήθη και μη νεοπλαστικά δείγματα βαθμολογούνται χρησιμοποιώντας τις ίδιες παραμέτρους για την ακριβή σύγκριση. Εντυπωσιακά, σε εννέα περιπτώσεις για τις οποίες είχαμε διπλούν καρκίνο του ήπατος TMA πυρήνες με την αντίστοιχη συμφωνημένα φόντο μη νεοπλασματικά ιστό που λαμβάνεται από τον ίδιο ασθενή, παρατηρήσαμε μια πολύ μεγαλύτερο αριθμό BG4-θετικών πυρήνων στον καρκίνο (μέση 60,3 ± 5,4%) έναντι του μη νεοπλασματικά (μέση 18,3 ± 2,12%) πυρήνες ιστού (Σχήμα 2). Όταν εξετάστηκαν μεμονωμένα φαινοτύπους καρκίνου, βρήκαμε ότι και οι δύο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) και ενδοηπατικού χολαγγειοκαρκινώματος (ICC) έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη χρώση πυρηνική BG4 σε σύγκριση με μη-νεοπλασματικό ιστό (Σχήμα 2Α-D και G). Αν και HCC και ICC έχουν διαφορετική κυτταρική προέλευση, η ανάπτυξη από τα ηπατοκύτταρα ή χοληφόρα χοληφόρου πόρου αντίστοιχα, και οι δύο έδειξαν έναν μεγαλύτερο αριθμό και την ένταση των BG4-θετικών πυρήνων σε σύγκριση με το μη νεοπλασματικών ιστό του ήπατος. Επιπλέον, στις μεταστάσεις (που απομονώνεται από sites αδιαφοροποίητο μεγάλων κυττάρων καρκινώματος πνεύμονα) μια αύξηση στην χρώση BG4-θετικά Σημειώθηκε επίσης (Σχήμα 2Ε-G). Παρατηρήσαμε σαφείς διαφορές μεταξύ των μη νεοπλασματικών και του όγκου του ιστού για ένα αριθμό διαφορετικών περιπτώσεων ασθενών. Πράγματι, ένα ευρύτερο φάσμα ανάλυσης του καρκίνου και το υπόβαθρο μη-νεοπλασματικές πυρήνες ΤΜΑ συμπεριλαμβανομένων απαράμιλλη περιπτώσεις έδειξε και πάλι μια αύξηση στο BG4-θετικών πυρήνων σε όλη HCC, ICC και μεταστατικό καρκίνωμα (Εικόνα 3Α). Όταν όλες οι περιπτώσεις θεωρήθηκαν από κοινού, ένα περίπου 2.4 φορές αύξηση στον αριθμό των BG4-θετικών πυρήνων παρατηρήθηκε σε καρκίνο του ήπατος σε σύγκριση με μη-νεοπλασματικό ιστό. (Ρ & lt? 0.001, Εικόνα 3Β)

Υπόβαθρο μη νεοπλασματικών και ο καρκίνος του ήπατος ιστών χρωματίστηκαν με IHC χρησιμοποιώντας την G-τετραπλών ειδικό BG4 αντισώματος. A. Οι πυρήνες των μη νεοπλασματικά ηπατικού ιστού από έναν ασθενή ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα είναι ως επί το πλείστον BG4-αρνητικό, με αιματοξυλίνη αντιχρωματισμός (μπλε) εμφανής. Κλίμακα ράβδου αντιστοιχεί σε 50 μm. Σημειώστε ότι οι κυτταροπλασματικά κοκκία είναι μεταβλητά και πιθανόν να είναι αίμη-based αντικείμενα μερικές φορές παρατηρούνται στο ήπαρ IHC. B. νεοπλαστικός ιστός από τον ίδιο ασθενή σε Α δείχνει την εκτεταμένη παρουσία BG4-θετικών πυρήνων (καφέ). C. Οι πυρήνες των μη νεοπλασματικά ηπατικού ιστού για ενδοηπατική ασθενή χολαγγειοκαρκίνωμα είναι ως επί το πλείστον BG4-αρνητική. Δ νεοπλαστικός ιστός από τον ίδιο ασθενή σε C παρουσιάζει πολλές BG4-θετικών πυρήνων. E. Οι πυρήνες των μη νεοπλασματικά ηπατικού ιστού από ένα μεταστατικό αδιαφοροποίητο καρκίνωμα του πνεύμονος ασθενούς μεγάλων κυττάρων είναι κυρίως BG4-αρνητική. ΣΤ Μεταστατικό ήπατος ιστών που έχουν απομονωθεί από τον ίδιο ασθενή σε Ε δείχνει πολλές BG4-θετικών πυρήνων. G. Ποσοτικός προσδιορισμός του αριθμού των BG4-θετικών πυρήνων σε καρκίνο του ήπατος και της αντίστοιχης συμφωνημένα μη νεοπλασματικών ιστών από εννέα ασθενείς. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου (S.E.M.) που υπολογίζεται όταν διπλούν πυρήνες TMA ήταν διαθέσιμα. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι υπάρχει ένας μεγαλύτερος αριθμός δομών G-τετραπλών σε καρκίνο του ήπατος σε σύγκριση με φόντο μη νεοπλαστικό ιστό από το ίδιο άτομο.

Η

A. Η ποσοτικοποίηση του αριθμού των BG4-θετικών πυρήνων σε επιμέρους ιστούς του ήπατος συμπεριλαμβανομένου απαράμιλλη πυρήνες TMA. Μη-νεοπλασματικές ήπατος δείχνει λιγότερο BG4-θετικών πυρήνων σε σύγκριση με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα ή ενδοηπατική χολαγγειοκαρκίνωμα. Κάθε στήλη αντιστοιχεί σε ένα μόνο δείγμα ιστού και μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την S.E.M. υπολογίζεται όταν δείγματα εις διπλούν ιστού ήταν διαθέσιμα. B. Συνολική ποσοτικοποίηση του αριθμού των BG4-θετικών πυρήνων σε όλους τους μη-νεοπλασματικών και καρκίνο του ήπατος ιστούς. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την S.E.M. ** Ρ & lt? 0,001, η = 19 και 32 για τα μη νεοπλασματικών και καρκίνος πυρήνες, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τη γενικότητα των πιο εκτεταμένο σχηματισμό G-τετραπλών στα καρκίνων του ήπατος σε σύγκριση με μη-νεοπλασματικών ιστών.

Η

Παρόμοια με την αύξηση του G-τετραπλών συχνότητα σε καρκινικό ιστό ήπατος, μεγαλύτερο από 3 φορές σε αύξηση του αριθμού των BG4-θετικών πυρήνων παρατηρήθηκε σε αδενοκαρκίνωμα του στομάχου και καρκίνωμα σφραγιστικό δαχτυλίδι σύγκριση με φόντο μη νεοπλασματικά ιστό που λαμβάνεται από το ίδιο άτομο (Σχήμα 4). Μια ευρυτέρων ανάλυση του καρκίνου του στομάχου και μη νεοπλασματικών ιστών, συμπεριλαμβανομένων χωρίς ταίρι περιπτώσεις επιβεβαίωσε την αύξηση του αριθμού των BG4-θετικών πυρήνων εμφανίζονται σε καρκίνο του στομάχου σε σύγκριση με μη νεοπλασματικά ιστού (Σχήμα 5). Πράγματι, σε μεμονωμένες καρκίνο του στομάχου υπο-τύπους, αδενοκαρκινώματα (προερχόμενο από αδενικό επιθήλιο), καρκινώματα σφραγιστικό δαχτυλίδι κυττάρων (αδενοκαρκινώματα που χαρακτηρίζεται από βλεννίνη εναπόθεση) και στρωματικών όγκων του γαστρεντερικού (GIST, KIT εκφράζουν σαρκώματα των μεσεγχυματικών προέλευσης), όλα έδειξαν μεγαλύτερο αριθμό BG4-θετικών πυρήνων σε σύγκριση με μη-νεοπλασματικό ιστό στομάχου (Σχήμα 5Α). Όταν όλες οι περιπτώσεις θεωρήθηκαν από κοινού, ~3.1 φορές περισσότερο BG4-θετικών πυρήνων βρέθηκαν στον καρκίνο έναντι μη νεοπλασματικά ιστούς (Σχήμα 5Β, Ρ & lt? 0.001). Είναι αξιοσημείωτο ότι αρκετές όγκου του στομάχου υπο-τύπους, οι οποίοι έχουν διαφορετικές αιτιολογίες και την εξέλιξη, όλα χαρακτηρίζονται από αύξηση στην χρώση BG4. Αυτά τα αποτελέσματα είναι, επομένως, εξαιρετικά υποδηλώνουν μια γενική σχέση μεταξύ της αυξημένης παρουσίας των δομών G-τετραπλών και την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου.

αδενοκαρκινώματος στομάχου και του καρκινώματος σφραγίδα κυττάρων δαχτυλίδι και συμφωνημένα φόντο μη νεοπλασματικών ιστών που λαμβάνονται από τον ίδιο ασθενή ήταν βάφονται με το G-τετραπλών ειδικό BG4 αντισώματος από την IHC. A. Οι πυρήνες των μη νεοπλασματικών ιστών στομάχου από γαστρικό αδενοκαρκίνωμα ασθενούς είναι ως επί το πλείστον BG4-αρνητικό, με αιματοξυλίνη αντιχρωματισμός (μπλε) άμεσα εμφανής. Κλίμακα ράβδου αντιστοιχεί σε 50 μm. B. Αδενοκαρκίνωμα ιστός από τον ίδιο ασθενή σε Α δείχνει εκτεταμένη αριθμοί BG4-θετικών πυρήνων (καφέ). C. Οι πυρήνες των μη νεοπλασματικών ιστών στομάχου από ασθενή καρκίνωμα σφραγιστικό δαχτυλίδι είναι κυρίως BG4-αρνητική. Δ Signet ιστός καρκινώματος δακτύλιος από τον ίδιο ασθενή σε C παρουσιάζει πολλές BG4-θετικών πυρήνων. Ε Ποσοτικοποίηση του αριθμού των BG4-θετικών πυρήνων στα συμφωνημένα καρκίνος του στομάχου και του φόντου μη νεοπλασματικών ιστών από δύο διαφορετικούς ασθενείς. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την S.E.M. υπολογίζεται όταν διπλούν πυρήνες TMA ήταν διαθέσιμα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι υπάρχουν περισσότερες δομές G-τετραπλών στους πυρήνες των ιστών καρκίνου του στομάχου από ότι σε μη-νεοπλασματικό ιστό από το ίδιο άτομο.

Η

Επιβεβαίωση της αυξημένης παρουσίας BG4-θετικών πυρήνων σε ένα φάσμα του στομάχου καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φόντο μη νεοπλασματικών ιστών, συμπεριλαμβανομένων απαράμιλλη περιπτώσεις. A. Οι πυρήνες των μη νεοπλασματικών ιστών στομάχου είναι σε μεγάλο βαθμό BG4-αρνητικό. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη (μπλε). Κλίμακα ράβδου αντιστοιχεί σε 50 μm. Β γαστρικού αδενοκαρκινώματος ιστού δείχνει την εκτεταμένη παρουσία BG4-θετικών πυρήνων (καφέ). καρκίνωμα του δακτυλίου Γ Signet παρουσιάζει πολλές BG4-θετικών πυρήνων. Δ γαστρεντερικού στρωματικών όγκων (GIST) είναι σε μεγάλο βαθμό BG4 θετικά (για την έρευνα του καρκίνου του στομάχου μόνο απαράμιλλη ιστούς GIST ήταν διαθέσιμα). Ε ποσοτικοποίηση του αριθμού των BG4-θετικών πυρήνων σε επιμέρους ιστούς στομάχι συμπεριλαμβανομένων απαράμιλλη πυρήνες TMA. Μη νεοπλασματικό ιστό του στομάχου δείχνει λιγότερο BG4-θετικών πυρήνων σε σύγκριση με το αδενοκαρκίνωμα, το καρκίνωμα σφραγιστικό δαχτυλίδι ή GIST. Κάθε στήλη αντιστοιχεί σε ένα μόνο δείγμα ιστού και μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την S.E.M. υπολογίζεται όταν δείγματα εις διπλούν ιστού ήταν διαθέσιμα. ΣΤ Συνολική ποσοτικοποίηση του αριθμού των BG4-θετικών πυρήνων σε όλους τους μη-νεοπλασματικών και το στομάχι του ήπατος ιστούς. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την S.E.M. ** Ρ & lt? 0,001, η = 10 και 34 για τα μη νεοπλασματικών και καρκίνος πυρήνες, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τη γενικότητα των πιο εκτεταμένη σχηματισμό G-τετραπλών στους καρκίνους του στομάχου σε σύγκριση με μη-νεοπλασματικών ιστών.

Η

Στο ήπαρ και το στομάχι TMAs, μερικοί πυρήνες καρκινικού ιστού έδειξε μικρή ή καθόλου ποσοτικά χρώση BG4 , αντανακλώντας ίσως ένα ζήτημα σταθερότητας επιτόπου κατά τη διάρκεια χειρουργικών συλλογή βιοψία ή εναλλακτικά δείχνουν προς μια πραγματική μεταβλητότητα στο σχηματισμό G-τετραπλών σε αυτούς συγκεκριμένους ιστούς. Είναι, ωστόσο, να σημειωθεί ότι σε καμία περίπτωση δεν ήταν καθόλου μη-νεοπλασματικές ήπαρ ή το στομάχι ιστού εκτενώς BG4 θετικά. Αυτή η τελευταία παρατήρηση επιβεβαιώνει περαιτέρω ότι η αύξηση του αριθμού των BG4-θετικών κυττάρων φαίνεται στους πυρήνες του καρκίνου TMA αντικατοπτρίζει μια πραγματική διαφορά στην G-τετραπλών παρουσία μεταξύ των μη νεοπλασματικών και κακοήθεις καταστάσεις. Ανάλυση χρώσης G-τετραπλών σε άλλους καρκίνους μπορεί επομένως να είναι δυνατή και η προκαταρκτική ανάλυσή μας του παγκρέατος ιστού δείχνει ότι, ενώ χρώση BG4 σε μη νεοπλασματικά πάγκρεας είναι ευρέως διαδεδομένη, υπάρχει ένα ~1.6-πλάσια αύξηση του BG4 πυρηνική χρώση σε ιστούς αδενοκαρκινώματος ( Ρ & lt?. 0.01, Σχήμα S3)

Συνολικά, τα αποτελέσματα μας αποδεικνύουν ότι η G-τετραπλά μπορεί να γίνει ορατή με IHC σε μη νεοπλασματικά και καρκίνος ανθρώπινους ιστούς επεκτείνουν προηγούμενα ευρήματα μας που αποκάλυψε την παρουσία δομών G-τετραπλών σε οι πυρήνες των κυτταρικής καλλιέργειας γραμμών [9]. Είναι αξιοσημείωτο ότι παρατηρήθηκε μια αύξηση του αριθμού των G-τετραπλών-θετικών κυττάρων για ορισμένους καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με μη-νεοπλασματικές περιπτώσεις. Τα στοιχεία που παρουσιάζουμε δεν κάνουμε στον εαυτό τους να εξηγήσει γιατί περισσότερο G-τετραπλά είναι εμφανής στις περιπτώσεις του στομάχου και του ήπατος καρκίνους. Ωστόσο, υπάρχουν πολλά στοιχεία στη βιβλιογραφία που υποδεικνύουν πιθανή συσχέτιση ή αιτιολογικός σύνδεσμος μεταξύ του G-τετραπλά και μηχανισμούς που συμβάλλουν στην ανάπτυξη ή την πρόοδο του καρκίνου. Για παράδειγμα, οι δομές G-τετραπλών, αν δεν επιλυθεί κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA, μπορεί να αντιπροσωπεύουν εύθραυστο ιστοσελίδες που προωθούν γονιδιώματος αστάθεια, η οποία είναι ένα πολύ γνωστό σήμα κατατεθέν του καρκίνου [24]. Πράγματι, οι G-τετραπλών μοτίβα αλληλουχία που βρίσκεται στο DNA σημεία παύσης που οδηγούν σε μετατοπίσεις εντός του γονιδίου BCL2 σε λεμφώματα και εντός του γονιδίου ΗΟΧ11 σε Τ-κυττάρων λευχαιμίας [25], [26]. Υπολογιστική αναλύσεις πρότειναν επίσης δυνατόν οι ενώσεις G-τετραπλά και σημείο διακοπής περιοχές σε διάφορους καρκίνους [19].

Υποθέτουμε ότι μια αύξηση στην γονιδιωματική G-τετραπλά στον καρκίνο μπορεί να προκύψει από μεταλλάξεις στα ένζυμα που επεξεργάζονται G-τετραπλά ή /και της γονιδιωματικής αστάθειας σε θέσεις G-τετραπλών. Για παράδειγμα, αναιμία Fanconi, Bloom και του Werner σύνδρομα, όλες γονιδίωμα οθόνη αστάθεια με μια προδιάθεση για καρκίνο [27] – [29] και προκύπτουν από μεταλλάξεις σε ένζυμα ελικάσης DNA που έχουν δραστικότητα-τετραπλών-επίλυση G [30] – [32] . Πρόσφατες μελέτες γονιδιώματος σε επίπεδο τόνισαν επίσης την αναγνώριση των ακολουθιών G-τετραπλών με πρόσθετα επίλυση ελικάσες όπως ATRX, PIF1 και XPB /D [20] – [22]. Επιπλέον, PIF1 έχει προταθεί για να καταστείλει γενωμική αστάθεια στο G-τετραπλά [22], ενώ η απώλεια ATRX συνδέεται με χρωμοσωμική αστάθεια σε νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος [33], και XPD μεταλλάξεις διαταράσσουν νουκλεοτιδίων εκτομής επιδιόρθωσης του DNA που οδηγεί σε καρκίνο επιρρεπείς ασθένειες όπως όπως pigmentosum ξηροδερμίας [34].

φαίνεται ότι το συκώτι και το στομάχι καρκίνοι είναι πολύ ετερογενείς και δεν χαρακτηρίζονται από μια κοινή γενετική υπογραφή ή μια άκρως εκπροσωπείται μετάλλαξη οδήγησης που μπορεί απλά να εξηγήσει την παρατηρούμενη αύξηση στις δομές G-τετραπλών . Ενώ πολλές καρκίνων του ήπατος που σχετίζεται με λοίμωξη ηπατίτιδας Β ή C, η παθολογική πληροφορίες που λαμβάνονται με τον TMAs δείχνει ότι δεν υπάρχει συσχέτιση με χρώση BG4. Ως μέρος των μελλοντικών εργασιών, θα έχει αξία για την ανάλυση μη νεοπλασματικών και κακοήθη δείγματα όγκων για τις περιπτώσεις όπου αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος έχει χρησιμοποιηθεί για τη διαλεύκανση της γενετικό υπόβαθρο του όγκου /ζεύγη μη νεοπλασματικών, προκειμένου να καθοριστεί η σχέση μεταξύ γονότυπου και G-τετραπλών σχηματισμό στον καρκίνο.

Εν κατακλείδι, αναφέρουμε τη χρήση του G-τετραπλών-ειδικό αντίσωμα, BG4, στο IHC πειράματα χρώση της ανθρώπινης μη-νεοπλασματικές και καρκινικούς ιστούς. Αυτή η μελέτη μας επέτρεψε να προσδιορίσει μια σημαντικά υψηλότερη παρουσία DNA δομές G-τετραπλών στους πυρήνες του στομάχου και καρκίνο του ήπατος κυττάρων σε σύγκριση με τα αντίστοιχα μη νεοπλασματικών ιστών. Υποθέτουμε ότι αυτές οι διαφορές θα μπορούσαν να εξαρτώνται από μεταβολές των κυτταρικών διαδικασιών που ρυθμίζουν σταθερότητα γονιδιώματος ή αλλαγές στην κατάσταση της χρωματίνης σε θέσεις G-τετραπλών σε καρκινικούς ιστούς. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την πιθανότητα ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να παρέχει ένα παράθυρο της επιλεκτικότητας που θα καθιστούν πιο ευαίσθητα από μη νεοπλασματικά κύτταρα προς ένα μικρό μόριο G-τετραπλών στόχευση στρατηγική.

Υλικά και Μέθοδοι

Σταθεροποίηση, ενσωμάτωση, τομή και κηλίδωση των σφαιριδίων κυττάρου έγιναν από τον πυρήνα υπηρεσία ιστοπαθολογία στο Cancer Research UK Cambridge Institute. Ανοσοϊστοχημεία (IHC) διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους σε ένα αυτοματοποιημένο πλατφόρμα Leica Bond με μικρές παραλλαγές. Εν συντομία, ιστοί σταθεροποιήθηκαν για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (RT) σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας έναν επεξεργαστή Leica ASP300 ιστού με de-ενυδάτωση μέσω διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης, εκκαθάρισης σε ξυλόλιο και διήθηση με λειωμένο κερί παραφίνης. Η ενσωμάτωση εκτελέστηκε σε ένα σταθμό Leica EG1160 Ενσωμάτωση και τομές κόπηκαν στα 3 μm με μικροτόμο, επιπλέει σε ένα λουτρό νερού ορίζεται σε ~45-50 ° C μέχρι να μαλακώσει και επίπεδη, πριν από τη συλλογή πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα και ξήρανση στους 60 ° C για 1 ώρα. De-αποτρίχωση και την εκ νέου ενυδάτωση πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός αυτοματοποιημένου ST5020 Multistainer Leica. κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου μαστού MDA-MB-231 ελήφθησαν από την ATCC Πρότυπα LGC. Για σφαιρίδια κυττάρων MDA-MB-231, ανάκτηση επίτοπο διεξήχθη στους 100 ° C για 20 λεπτά με διάλυμα ανάκτηση Bond επιτόπιο 1 (κιτρικό-based ρυθμιστικό ρΗ 6,0) ή Bond διάλυμα ανάκτησης επιτόπου 2 (Tris /EDTA που βασίζεται ρυθμιστικό ρΗ 9.0) ή στους 37 ° C για 10 λεπτά με το κιτ προ-θεραπεία ένζυμο Bond (100 μg /ml πρωτεϊνάσης Κ σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα, επιφανειοδραστικό και 0,35% ProClin 950) για να βρει το καλύτερο κατάσταση. Που διατίθεται στο εμπόριο μικροσυστοιχίες ανθρώπινου ιστού με τις κατάλληλες ηθικές έγκριση στη χώρα καταγωγής αγοράστηκαν από την Insight Bio UK (για συστοιχίες των ΗΠΑ Biomax Inc.) και BioCat, η Γερμανία ή η Stretton Επιστημονική, UK (για Accumax, συστοιχίες Isu Abxis). Επιτόπου ανάκτηση διεξήχθη στους 100 ° C για 20 λεπτά με διάλυμα κιτρικού οξέος. χρώση BG4 διεξήχθη σε RT σε ένα αυτοματοποιημένο όργανο Leica Bond με ένα κιτ πολυμερές κουνελιού (Leica) μετά από επώαση 15 λεπτών με BG4 και 8 λεπτά επώαση με αντι-FLAG πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Cell Signaling Technology). Τα πλακίδια στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν για 5 λεπτά με 0,02% αιματοξυλίνη για την οπτικοποίηση των κυτταρικών πυρήνων. De-ενυδάτωση και εκκαθάρισης έγιναν σε ένα αυτοματοποιημένο Multistainer Leica ST5020, και τοποθέτηση έγινε σε ένα αυτοματοποιημένο γυαλί coverslipper Leica CV5030. Διαφάνειες σαρώθηκαν με ένα σύστημα σάρωσης διαφανειών Aperio XT120 (Leica) και οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Aperio Imagescope Πυρηνική v9. Οι στατιστικές αναλύσεις και τιμές Ρ υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student. γραφήματα συχνότητα διανομής χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad Software).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. χρώση

BG4 επί εμπεδωθεί με παραφίνη σφαιρίδια κυττάρων MDA-MB-231. MDA-MB-231 σφαιρίδια καρκινικού κυττάρου μαστού A. Ανθρώπινη μονιμοποιήθηκαν, εγκλεισμένα σε παραφίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για IHC χρησιμοποιώντας το G-τετραπλών-ειδικό αντίσωμα BG4. Ισχυρή χρώση BG4 (καφέ) είναι εμφανής σε πυρήνες κυττάρων ακόλουθη ανάκτηση επιτόπου με τρις ​​/EDTA που βασίζεται ρυθμιστικό ρΗ 9.0. Κλίμακα ράβδου αντιστοιχεί σε 20 μm. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη (μπλε). B. ισχυρή χρώση BG4 (καφέ) είναι εμφανής σε πυρήνες κυττάρων ακόλουθη ανάκτηση επιτόπου με πρωτεϊνάση Κ C. Δεν πυρηνική χρώση παρατηρείται απουσία του αντισώματος BG4 μετά ανάκτηση Tris /EDTA επίτοπο. D. αριθ πυρηνική χρώση παρατηρείται μετά από αγωγή με ϋΝάση πριν από τη χρώση BG4 μετά ανάκτηση επιτόπου με EDTA. Ε υψηλά επίπεδα μη ειδικής χρώσης απουσία BG4 μετά την ανάκτηση επιτόπου με πρωτεϊνάση Κ

doi: 10.1371 /journal.pone.0102711.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

μη-νεοπλασματικές ανθρώπινους ιστούς δείχνουν χρώση μεταβλητή BG4. Μη νεοπλασματικές ιστοί χρωματίσθηκαν με IHC χρησιμοποιώντας το G-τετραπλών-ειδικό αντίσωμα BG4. Α BG4 χρώση (καφέ) στο νεφρό φλοιό δείχνει ένα φάσμα εντάσεων πυρηνική χρώση σε σπειράματα και συναφείς κατασκευές. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη (μπλε). Κλίμακα ράβδου αντιστοιχεί σε 50 μm Β ασθενώς θετική χρώση BG4 φαίνεται στις σωληναρίου συλλογής πυρήνων του νεφρού μυελό. Γ δέρματος παρουσιάζει μια σειρά από BG4 εντάσεις στην επιδερμίδα με θετικά και αρνητικά πυρήνων διάσπαρτα σε όλη, ενώ το χόριο είναι ως επί το πλείστον θετικές. Δ περισσότεροι πυρήνες στο παχύ έντερο είναι BG4 θετικά. E. Σε μήτρας σώματος, η στρωματοποιημένη πλακώδες επιθήλιο είναι σε μεγάλο βαθμό BG4-αρνητικό, ενώ θετική χρώση φαίνεται πιο επιφανειακά. F. Κατά τη διάρκεια των λοβών του πόρου του μαστού, και οι δύο μυοεπιθηλιακά και αυλού κύτταρα δείχνουν τη γενική ισχυρή χρώση BG4 με μόνο περιστασιακή αρνητικά κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Αυξημένα παρουσία δομών G-τετραπλών σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του παγκρέατος. Μη νεοπλασματικές και του καρκίνου του παγκρέατος ιστοί χρωματίσθηκαν με IHC χρησιμοποιώντας το G-τετραπλών-ειδικό αντίσωμα BG4, και ο αριθμός των BG4-θετικών πυρήνων βαθμολογήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Aperio Imagescope. A. Οι πυρήνες των μη νεοπλασματικών παγκρέατος ιστού δείχνουν μέτρια χρώση BG4 (καφέ) με πολλά μη χρωματισμένα πυρήνες παρόν επίσης. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη (μπλε). Κλίμακα ράβδου αντιστοιχεί σε 50 μm. Β BG4 χρώση σε παγκρεατικό ιστό αδενοκαρκινώματος είναι πιο εκτεταμένη με μεγαλύτερη ένταση. C. Συνολικά ποσοτικοποίηση του αριθμού των BG4-θετικών πυρήνων σε όλες τις μη νεοπλασματικές και παγκρεατικών καρκινικούς ιστούς. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την S.E.M. * P & lt? 0.01, n = 6 και 12 για τα μη-νεοπλασματικές και τον καρκίνο πυρήνες, αντίστοιχα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s003

(ΔΕΘ)