Αφηρημένο

ÈTK είναι μια κινάση της τυροσίνης μη-υποδοχέα, η οποία παρέχει ένα ισχυρό σήμα επιβίωσης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Src, ένα άλλο κινάσης τυροσίνης που διασταυρούμενη ενεργοποιεί με ETK, έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη. Εδώ, ανακαλύψαμε μια νέα τάξη αναστολέων ETK. Εντός αυτών των αναστολέων, CTA095 ταυτοποιήθηκε ως ένας ισχυρός ÈTK και Src διπλή αναστολέα. CTA095 βρέθηκε να επάγει autophagy καθώς και απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Επιπλέον, CTA095 ανέστειλε το σχηματισμό σωλήνων κυττάρων HUVEC και «επούλωση του τραύματος» ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει το ρόλο της στην αναστολή της αγγειογένεσης και της μετάστασης του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. Πιο ενδιαφέρον, CTA095 μπορούσε να ξεπεράσει Src αντίσταση αναστολέα σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Προκαλεί απόπτωση σε ανθεκτικό αναστολέα Src κυττάρων καρκίνου του προστάτη, πιθανόν μέσω ενός μηχανισμού του κάτω ρύθμιση Myc και BCL2. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι ταυτόχρονα στοχεύουν ÈTK και Src θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την υπερνίκηση της αντίστασης στα φάρμακα για τον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Guo W, Liu R, Bhardwaj G, Ma AH, Changou C, Yang JC, et al . (2013) CTA095, ένα μυθιστόρημα ÈTK και Src διπλός αναστολέας, επάγει την απόπτωση σε κύτταρα του προστάτη Καρκίνος και υπερνικά αντίσταση σε αναστολείς Src. PLoS ONE 8 (8): e70910. doi: 10.1371 /journal.pone.0070910

Επιμέλεια: Qiming Jane Wang του Πανεπιστημίου του Πίτσμπουργκ της Ιατρικής Σχολής, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Μάρ του 2013? Αποδεκτές: 25 Ιουν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Αυγ του 2013

Copyright: © 2013 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο ήταν εν μέρει υποστηρίζεται από C-Tag Bioscience Inc (Research επιχορήγηση προς RL)? ΝΙΗ χορηγεί DK52659 CA150197 (για HJK), και CA098116 (σε KSL)? και DOD Μεταδιδακτορικός Κατάρτισης Βραβείο PC080859 και Auburn Κοινοτικού Ταμείου Καρκίνου Κληροδότημα (σε WG). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. C-Tag Inc είναι μια εμπορική χρηματοδότη για το έργο αυτό, και οι δύο KSL και HJK είναι οι επιστημονικοί σύμβουλοι για το C-TAG Inc. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι ο καρκίνος διαγιγνώσκεται πιο συχνά και η δεύτερη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο των ανδρών στις ΗΠΑ [1]. Ενώ ο καρκίνος του προστάτη πρώιμη φάση (ΚΓΠ) μπορεί να ελεγχθεί αποτελεσματικά με ορμονοθεραπεία, μεταστατικό CaP παραμένει ανίατη. αναστολείς της τυροσινικής κινάσης (TKIs) είναι από τα πιο ελπιδοφόρα στοχευμένες θεραπείες? ακόμα δυνατότητες ως προστάτη θεραπευτικές του καρκίνου τους δεν έχουν υλοποιηθεί πλήρως και, μέχρι σήμερα, τα αποτελέσματα των κλινικών δοκιμών, χρησιμοποιώντας TKIs σαν απλούς παράγοντες ήταν γενικά μέτρια, ίσως λόγω πλεονασμού σε δέσμευση υποδοχέα και σηματοδότηση σε ενδοκυτταρική μεσολαβητές [2]. Οι περισσότερες από τις TKIs που έχουν αναπτυχθεί κατευθύνονται εναντίον κινάσες τυροσίνης υποδοχέα. ETK είναι μία κινάση τυροσίνης μη-υποδοχέα, η οποία είναι υπερ-εκφράζεται σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη και παρέχει ισχυρή λειτουργίες επιβίωσης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [3], [4]. ETK μεσολαβεί κρίσιμο ενεργοποίηση της STAT3 σε Cap γεγονός που υποδηλώνει ότι η λειτουργική διαταραχή του ETK μπορεί να μετριάσει πολλαπλά βασικά σήματα που εμπλέκονται στην ανάπτυξη της ΚΑΠ και την επιβίωση [5]. ETK ρυθμίζει επίσης την επιβίωση [6], η μετάσταση [7], αντοχή φαρμάκου [3], [8], η αγγειογένεση [9], και την απόπτωση [10]. Η υπερέκφραση του ETK επάγει προστάτη ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία σε ένα ποντίκι [11]. Πρόσφατες αναφορές δείχνουν ότι ETK παίζει σημαντικό ρόλο στην αυτο-ανανέωση και ογκογόνο δυναμικό του γλοιοβλαστώματος βλαστικών κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης Stat3 [12]. Ως εκ τούτου, η συστηματική αναστολή της ΕΤΚ μπορεί να προσφέρει συνεργιστικές επιδράσεις κατά του όγκου. Όπως ακόμη, δεν υπάρχει αποτελεσματική αναστολέας της κινάσης.

Src, ETK, και ΡΑΚ συνεργάτης με και δια-ενεργοποιούν το ένα το άλλο. Η αναστολή ενός μειώνει συχνά την δραστικότητα των άλλων. Οι τρεις αυτές οι κινάσες έχουν δειχθεί ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Ο αναστολέας Src, AZD0530, έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει μετάσταση καρκίνου του προστάτη οστών στα ζωικά μοντέλα. Ωστόσο, αυτός ο αναστολέας δεν έχει την δραστικότητα για να επάγει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Διπλή αναστολή της ΕΤΚ και Src θα μπορούσε όχι μόνο ξεπεραστεί το μειονέκτημα των αναστολέων Src, αλλά μπορεί επίσης να αυξήσει την αποτελεσματικότητα στην αναστολή της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

Autophagy είναι μια καταβολική διαδικασία που περιλαμβάνει την αποικοδόμηση των ιδίων συστατικών ενός κυττάρου μέσω της μηχανήματα λυσοσωματικής [13]. Πρόκειται για μια καλά οργανωμένη διαδικασία που βοηθά στη διατήρηση μιας ισορροπίας μεταξύ της σύνθεσης, την υποβάθμιση και την επακόλουθη ανακύκλωση των κυτταρικών προϊόντων [14]. Αυτοφαγία θα μπορούσε να συμβάλει τόσο στην κυτταρική επιβίωση και θανάτωση κυττάρων σε ένα πλαίσιο εξαρτώμενο τρόπο. ρυθμιστές αυτοφαγία έχουν πλέον αναδειχθεί ως σημαντικό ευαισθητοποιητές ή τροποποιητές της στοχευμένης θεραπείας [15], [16].

Εδώ, αναφέρουμε την αναγνώριση ενός νέου ÈTK και Src διπλός αναστολέας, CTA095, η οποία προκαλεί αυτοφαγία και την απόπτωση, όπως και οι συνέργειες με ρυθμιστές αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη αναφορά ενός διπλού αναστολέα ÈTK και Src με μια αίτηση ως αντικαρκινικού παράγοντα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Τα καθαρισμένα ETK , Btk, Mertk, Yes και Src κινάσες ελήφθησαν από την Millipore Inc (Dundee, UK). Ιωδιούχου προπιδίου (PI),

Ν

,

Ν

διισοπροπυλαιθυλαμίνη (ΟΙΕΑ),

Ν

,

Ν

-dimethylformimide (DMF), αιθανόλη, ακετονιτρίλιο (ACN), 1- (3-αμινοπροπυλ) πιπεριδίνη, το τριφθοροοξικό οξύ (ΤΡΑ), Pd /C, μυρμηκικό αμμώνιο και διμεθυλο σουλφοξείδιο (DMSO) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Saint Louis, ΜΟ). υδροχλωρικού μεθυλεστέρα L-φαινυλογλυκίνη αγοράστηκε από την Chem-Impex International Inc (Wood Dale, IL). Διβενζοφουραν-2-καρβοξαλδεϋδη αγοράστηκε από Oakwood Products, Inc (West Columbia, SC). Το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνη V-FITC ελήφθη από Abcam (Cambridge, ΜΑ). υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) από την Waters Corporation (Milford, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση και τον καθαρισμό των CTA095. LNCAP, CWR22Rv1, RWPE1, 293 και τα κύτταρα HUVEC ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA).

σύνθεση ενός δοχείου από CTA095

Η συνθετική προσέγγιση του CTA095, 2-(dibenzo[

b

,

d

]furan-2-yl)-7-phenyl-1-(3-(piperidin-1-yl)propyl)-1

H

-imidazo[4,5-

g

]quinoxalin-6(5

H

)-one, είναι παρόμοιο με την προσέγγιση που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [17]. Εν συντομία, ένα διάλυμα υδροχλωρικής L-φαινυλογλυκίνη μεθυλεστέρας (201,7 mg, 1,0 mmol) και DIEA (383.2 μί, 2.2 mmol) σε DMF (1.5 ml) προστέθηκε στάγδην υπό έντονη ανάδευση σε ένα διάλυμα από 1,5-διφθορο- 2,4-δινιτροβενζόλιο (204,0 mg, 1,0 mmol) σε DMF (0.5 ml). Το διάλυμα της αντίδρασης αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά. Αυτό ακολουθήθηκε από την προσθήκη ενός διαλύματος από 1- (3-αμινοπροπυλ) πιπεριδίνη (159 μΙ, 1,0 mmol) και DIEA (174.2 μί, 1.0 mmol) σε DMF (1 ml). Το προκύπτον μίγμα αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου όλη τη νύκτα. Αιθανόλη (20 ml), Pd /C (10%, 200 mg), και μυρμηκικό αμμώνιο (1.50 g, 23.8 mmol) προστέθηκαν στο διάλυμα. Το διάλυμα θερμάνθηκε σε αναρροή για 3 ώρες και στη συνέχεια ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου. Το Pd /C απομακρύνθηκε με διήθηση και το διήθημα συμπυκνώθηκε με περιστροφικό εξατμιστή. Διβενζοφουραν-2-καρβοξαλδεϋδη (196.2 mg, 1.0 mmol) σε DMF προστέθηκε στο διάλυμα. Το προκύπτον διάλυμα αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ημέρα. Το διάλυμα DMF χύθηκε σε 40 mL πάγου. Το ίζημα συλλέχθηκε με διήθηση και πλύθηκε με νερό, ακολουθούμενο από καθαρισμό με RP-HPLC. Το κλάσμα συλλέχθηκε και λυοφιλοποιήθηκε για να δώσει μια κίτρινη σκόνη ως τελικό προϊόν (Σχήμα S1). Η ομοιογένεια της ενώσεως ελέγχθηκε με αναλυτική RP-HPLC. Η καθαρότητα προσδιορίστηκε να είναι Περιοχή άρθρωσης. αναπαράσταση (Β) γελοιογραφία δείχνει προβλεπόμενες αλληλεπιδράσεις των CTA095 με τον gatekeeper Thr489, DFG (554-556) μοτίβο, και Cys496. CTA095 δεσμευτική σταθεροποιεί Phe555 στο «έξω» διαμόρφωση, και επηρεάζει την ενεργή κατάσταση σχηματισμό γέφυρας άλατος μεταξύ Lys445 και Glu460. Μπλε: Helix C? Κόκκινο: Ενεργοποίηση Loop? Πράσινο: μοτίβο DFG (554-556)? Κυανό: Γλυκίνη πλούσια σε βρόχο? Πορτοκάλι; Περιοχή άρθρωσης. Τα σχήματα παρήχθησαν χρησιμοποιώντας PyMol.

Η

Σε αντίθεση με δεσμευτικό ETK-CTA095, Src κινάσης παρουσιάζει δέσμευση με CTA095 στο θύλακα δραστικής θέσης που σχηματίζεται από το Ν-λοβού, C-λοβού και του βρόχου ενεργοποίησης. CTA095 σε σταθερή θέση της καλύπτει τα υπολείμματα Asp404 και Αδη 391, το οποίο είναι τόσο σημαντικό για Mg

2+ και δεσμευτική ΑΤΡ. CTA095 επίσης αλληλεπιδρά υποθετικώς με το λειτουργικά σημαντικό υπόλειμμα Tyr416, που είναι μέρος της περιοχής βρόχο ενεργοποίησης (Σχήμα S4). Συνολικά, πιστεύουμε ότι η πρόσδεση εμποδίζει CTA095 η ΑΤΡ τσέπη σε Src κινάσης, και αναστέλλει τη σύνδεση του ΑΤΡ σε ETK επάγοντας αλλαγές διαμόρφωσης μέσω του πίσω-τσέπη.

CTA095 αναστέλλει την φωσφορυλίωση του ETK, Src και κατάντη σήματα Stat3 και Akt σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Η ανασταλτική δραστικότητα των CTA095 έναντι φωσφορυλίωσης ETK σε ανέπαφα κύτταρα εξετάστηκε με στύπωση Western. ETK, καθώς και Src φωσφορυλίωση σε PC3-ETK (κύτταρα PC3 σταθερά επιμολυσμένα με ETK), τα κύτταρα αναστέλλεται σημαντικά σε 5 μΜ και 10 μΜ. Η αναστολή Src είναι πιθανό να οδηγήσει τόσο από την άμεση αναστολή από CTA095, καθώς και η μειωμένη δραστηριότητα ETK, το οποίο ενεργοποιεί την Src. Μια επιλεκτική στόχος για ETK και Src είναι STAT3, των οποίων η φωσφορυλίωση αναστέλλεται επίσης από CTA095. Akt είναι ένας άλλος σημαντικός καθοδικός τελεστής του ETK, και η φωσφορυλίωση του ανεστάλη από CTA095 (Σχήμα 4).

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκα 10 mm έως 50% συρροή και κατεργάζεται με CTA095. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες. pEtk, ETK, pSrc, Src, pStat3, Stat3, pAkt και τα επίπεδα Akt μετρήθηκαν με τη χρήση των αντίστοιχων αντισωμάτων με κηλίδα Western. Ένα από τα τρία παρόμοια πειράματα που απεικονίζονται.

Η

CTA095 αναστέλλει κατά προτίμηση την ανάπτυξη των κακοήθων κυττάρων του προστάτη

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της CTA095 επί του πολλαπλασιασμού, ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων LNCAP, CWR22Rv1 , PC3 και το φυσιολογικό κύτταρο προστάτη RWPE1 επωάστηκαν με CTA095 και ο πολλαπλασιασμός τους μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. CTA095 ήταν αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη (LNCAP, CWR22Rv1 και PC3), ενώ η αθανατοποιημένη φυσιολογικό κύτταρο προστάτη RWPE1 ήταν πιο ανθεκτικά στην CTA095 (Σχήμα 5), πιθανόν λόγω της «εθισμός» στο σήμα ETK από τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη , όπως φαίνεται προηγουμένως [11].

τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων όλη τη νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CTA095 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία μετά από 72 ώρες. τελείες, σημαίνει? μπαρ, τυπική απόκλιση, n = 3.

Η

CTA095 προκαλεί αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Προηγουμένως δείξαμε ότι ο αναστολέας AZD0530 Src προκαλεί αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, η οποία συμβάλλει στην απόπτωση αντίσταση και μειώνει την αποτελεσματικότητα του αναστολέα Src [16]. Για να προσδιορίσετε αν CTA095 μπορεί να προκαλέσει την αυτοφαγία, PC3 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με GFP-LC3 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CTA095, τότε εξετάζεται στο μικροσκόπιο φθορισμού. Μετά από 24 ώρες αγωγή με CTA095, αυτά τα κύτταρα έδωσε εκτεταμένη διακριτές «puncta» autophagosome μορφολογία, ενώ η αγωγή όχημα δεν είχε (Σχήμα 6Α). Η ικανότητα των CTA095 να προκαλέσει αυτοφαγία στα κύτταρα PC3 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την μετατροπή της ενδογενούς LC3-Ι LC3-II μορφές (Εικόνα 6Β). Έτσι, όπως και τον αναστολέα της κινάσης της τυροσίνης Src, η αναστολή της ΕΤΚ επάγει επίσης αυτοφαγία.

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων σε 50% συρροή και κατεργάζεται με CTA095. Autophagy οπτικοποιήθηκε με GFP-LC3 «puncta» (Α) και ανοσοαποτύπωμα των ισομορφών ενδογενής LC3 (Β). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν 24 ώρες μετά την αγωγή.

Η

CTA095 διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα προστάτη

Για να καθοριστεί εάν η αναστολή αύξησης που προκαλείται από CTA095 σε κύτταρα PC3 οφειλόταν σε απόπτωση, τη ροή κυτταρομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε. Μετά τη θεραπεία με CTA095 για 24 ώρες, μια εξαρτώμενη από την δόση συσσώρευση ενός «υπο-G1» κλάσμα παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας χρώση ΡΙ (Σχήμα 7Α). Τα δεδομένα βασίζονται σε αντιδραστικότητα αννεξίνης-ν έδειξε επίσης μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση της απόπτωσης των κυττάρων PC3 μετά από θεραπεία με CTA095 (Σχήμα 7Β). Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι η θεραπεία των PC3 κυττάρων με CTA095 είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη ενεργοποίηση δόση caspase3 /7 (Σχήμα 7C) και κασπάσης 9 (Σχήμα 7D). Έτσι, σε αντίθεση με τον αναστολέα AZD05350 Src, αυτός ο αναστολέας ETK επάγει ένα σημαντικό επίπεδο απόπτωσης, παρά διέγερση της οδού αυτοφαγία. Ακόμη πιο ενδιαφέρον, κύτταρα 293 (ETK αρνητικό) είναι ανθεκτικά για να επάγει απόπτωση με CTA095, υποδεικνύοντας την ειδικότητα αυτής της ένωσης να ETK (Εικόνα S5). Όπως θα συζητηθεί αργότερα, ÈTK ελέγχει άμεσα το μονοπάτι επιβίωσης, η απουσία των οποίων προφανώς μπορεί να παρακάμψει την προστατευτική δράση της αυτοφαγία. Ως αποτέλεσμα, CTA095 επαγόμενη απόπτωση μπορεί να ενισχυθεί περαιτέρω από έναν αποκλεισμό autophagy (βλέπε παρακάτω).

κύτταρα PC3 σπάρθηκαν σε 10

6 κύτταρα /ml (2 ml) σε ένα 6-φρεατίων όλη τη νύκτα και στη συνέχεια κατεργάζεται με CTA095 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. σύλληψη κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ΡΙ βαφή (Α). Η απόπτωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης ΡΙΤΟ απόπτωσης Annexin-V (Β). Η ενεργοποίηση της κασπάσης 9 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας στύπωμα Western (D). Για δραστικότητα κασπάσης 3/7, τα κύτταρα PC3 σπάρθηκαν στα 5000 κύτταρα /φρεάτιο πλάκας καλά σε 96 επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CTA095 στους 0-10 μΜ για 24 ώρες. Caspase-3/7 Δραστηριότητα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το ομογενές Caspase-3/7 κιτ προσδιορισμού Αρο-ΕΝΑ (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, τυπική απόκλιση, n = 3. 5 μΜ και 10 μΜ είναι σημαντικά διαφορετική από το 0 μΜ (*, p & lt? 0.05, μονόδρομη ANOVA με δοκιμή Tukey για ζευγάρι σοφή σύγκριση)

Η

CTA095. αναστέλλει HUVEC σχηματισμός σωλήνα κυττάρου και μετανάστευση κυττάρων καρκίνου του προστάτη

ETK εκφράζεται έντονα στα ενδοθηλιακά κύτταρα και φαίνεται ότι εμπλέκονται στην αγγειογένεση [31]. Για να διερευνηθεί η ικανότητα του CTA095 να αναστέλλει την αγγειογένεση, εξετάστηκε σχηματισμός αγγειακού σωλήνα ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC μετά από θεραπεία με CTA095. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο σχηματισμός σωλήνων κυττάρων HUVEC διακόπηκε από CTA095 (Σχήμα 8Α). «Επούλωση του τραύματος» Για να διερευνηθεί η ικανότητα του να αναστέλλει CTA095 κυτταρική μετανάστευση, των κυττάρων PC3 μετρήθηκε μετά από θεραπεία με CTA095. «Επούλωση του τραύματος» Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8Β, των κυττάρων PC3 ανεστάλη σημαντικά από CTA095 μετά από 48 ώρες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι CTA095 έχει την ικανότητα όχι μόνο να καταστέλλουν ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, αλλά επίσης για τη μείωση της αγγειογένεσης.

Αναστολή του σχηματισμού αγγειακών σωλήνα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC (Α) και η αναστολή της μετανάστευσης (επούλωση τραυμάτων) του PC3 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Β) με CTA095. (Α) Κύτταρα HUVEC σπόρο mitrogel και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CTA095 (0 και 5 μΜ) για 6 ώρες. σχηματισμός Αγγειακή σωλήνας έγινε ορατή χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο. (Β) κύτταρα PC3 αναπτύχθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων σε 60% συρροή. Στη συνέχεια, τραύματα έγιναν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CTA095 (0 και 5 μΜ). Η μετανάστευση κυττάρων (επούλωση πληγών) οπτικοποιήθηκε υπό μικροσκόπιο στους χρόνους που υποδεικνύονται.

Η

CTA095 στο ένα χημειο-ευαισθητοποιητής

αρχικές μελέτες μας έδειξαν ότι CTA095 έχει καλή κυτταροτοξικότητα προς ένα πάνελ προστάτη τα καρκινικά κύτταρα. Για να εξεταστεί εάν ETK και Src διπλός αναστολέας λειτουργεί αποτελεσματικά ως ευαισθητοποιητής χημειο, PC3 κύτταρα συν-θεραπεία με CTA095 και πακλιταξέλη (ΡΤΧ) (2ng /ml), ή η χλωροκίνη αναστολέα αυτοφαγία (CQ) (10 μΜ). Η αναστολή της ανάπτυξης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ μετά από 72 ώρες. Είναι ενδιαφέρον, συνεργική δράση των CTA095 με ΡΤΧ ή CQ σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη παρατηρήθηκε (Σχήμα 9). Αυτό υποδηλώνει ότι CTA095 είναι ένα χημειο ευαισθητοποιητής, και το κλείδωμα των autophagy από CQ προάγει προκαλούμενη CTA095 κυτταρικό θάνατο.

Αναστολή ανάπτυξης CTA095 και σε συνδυασμό με 10 μΜ χλωροκίνη (CQ), ή 2 ng /ml paclitaxel (ΡΤΧ ) να PC3 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων όλη τη νύκτα και προκατεργάστηκαν με τις αντίστοιχες συν-θεραπείες για 1 ώρα, έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2,5 μΜ CTA095. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία μετά από 72 ώρες. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, τυπική απόκλιση, n = 3.

Η

CTA095nano αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων PC3 ξενομοσχευμάτων in vivo

Με δεδομένη την

in vitro

δραστηριότητα CTA095 εναντίον καρκινικών κυττάρων του προστάτη, είναι σημαντικό για την επικύρωση των αποτελεσμάτων αυτών

in vivo

. Από CTA095 είναι άκρως αδιάλυτη στο νερό, διατυπώσαμε CTA095 σε μικκύλια nano. Αυτό μικυλλίου αναπτύχθηκε στο εργαστήριο μας και έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για τη διαμόρφωση υδρόφοβων φαρμάκων όπως είναι η πακλιταξέλη και βινκριστίνη [32], [33]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 10, CTA095nano εμπόδισε σημαντικά την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος όγκου PC3 στα 10 mg /kg (δύο φορές την εβδομάδα, ενδο-φλεβικής ένεση) χωρίς σημαντική τοξικότητα.

(CAT095 μορφοποιηθούν σε νανο-μικκύλια.) 2 × 10 Στήλες, σημαίνει? Στήλες, σημαίνει? Στήλες, σημαίνει?