Αφηρημένο

Ογκο-miR-182-5p έχει αναφερθεί ότι είναι υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης (BC), ωστόσο ιστούς μια λεπτομερής λειτουργική ανάλυση του miR-182-5p δεν έχει πραγματοποιηθεί στην BC. Ως εκ τούτου, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν: 1. Να προβεί σε λειτουργική ανάλυση του miR-182-5p στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, 2. εκτιμήσει τη χρησιμότητά του ως καρκινικός δείκτης, 3. τον εντοπισμό miR-182-5p γονιδίων-στόχων στην BC. Αρχικά βρήκαμε ότι miR-182-5p έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς και υψηλής miR-182-5p έκφραση συσχετίστηκε με μικρότερη συνολική επιβίωση σε ασθενείς. Π.Χ. Για τη μελέτη της λειτουργικής σημασίας του miR-182-5p, έχουμε υπερ-εκφράζεται miR-182-5p με miR-182-5p πρόδρομος και παρατήρησε ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή ικανότητες αυξήθηκαν στα κύτταρα. Π.Χ. Ωστόσο κυτταρική απόπτωση ανεστάλη με miR-182-5p. Εντοπίσαμε επίσης

Smad4

και

RECK

ως πιθανοί γονιδίων στόχων του miR-182-5p χρησιμοποιώντας διάφορους αλγόριθμους. δραστικότητα λουσιφεράσης 3’UTR αυτών των γονιδίων στόχων ήταν σημαντικά μειωμένη και η έκφραση πρωτεΐνης αυτών των γονιδίων στόχων ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε αναστολέα miR-182-5p καρκίνος της ουροδόχου κύστης επιμολυσμένα κύτταρα. MiR-182-5p αύξησε επίσης την έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης και ενώ Smad4 κατασταλεί η έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι miR-182-5p παίζει σημαντικό ρόλο ως ογκογονίδιο με χτυπήσει κάτω RECK και Smad4, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Wnt-βήτα-κατενίνης στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Citation.: Hirata Η, Ueno Κ, Shahryari V, Tanaka Υ, Tabatabai ZL, Hinoda Y, et al. (2012) τον ογκογόνο miRNA-182-5p Στόχοι Smad4 και RECK ανθρώπων καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 7 (11): e51056. doi: 10.1371 /journal.pone.0051056

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Σεπτεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 29 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 Νοεμβρίου, 2012

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων των Ηνωμένων Πολιτειών Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας μέσω της επιχορήγησης Αριθμός RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA επιχορηγήσεις κριτική Merit, και VA Έργου του Προγράμματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης (π.Χ.) είναι η τρίτη κυριότερη αιτία θανάτου μεταξύ των ουρολογικών όγκων και την πιο κοινή ιστολογικό τύπο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι ουροφόρων καρκίνωμα (UC), παλαιότερα γνωστή ως μεταβατικό καρκίνωμα (TCC) [1]. Περίπου το 75% των ασθενών είναι «μη επεμβατική μυών UC (PTA, pTis, ρΤ1) και έχουν ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μεταξύ 88-98% [2]. Η συνηθισμένη θεραπεία για αυτούς τους ασθενείς είναι ενδοσκοπική εκτομή [1], [3]. Οι ασθενείς με μυϊκή επεμβατική UC συνήθως αντιμετωπίζονται με ριζική κυστεκτομή ή χημειοθεραπεία ακτινοθεραπεία [1], [4]. Ωστόσο το ήμισυ των μυών επεμβατική ασθενείς UC αναπτύσσουν μετέπειτα μεταστατική νόσο μετά από την πρώτη επιθετική θεραπεία [1], [5]. Προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει αρκετούς υποψήφιους μοριακοί βιοδείκτες για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [6], [7]. Απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων

TP53

και

Rb

και

Ras

ογκογονίδιο ενεργοποίησης έχουν θεωρηθεί ως σημαντικοί βασικοί παράγοντες στην καρκινογένεση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [6].

η ενεργοποίηση της σηματοδότησης Wnt-βήτα-κατενίνης έχει επίσης μελετηθεί και αναφερθεί ότι συνδέεται με την εξέλιξη του καρκίνου και κακή πρόγνωση στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [8], [9]. Ο αυξητικός παράγοντας εξαλλαγής βήτα (ΤΟΡ-β) παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και παθογένεση πολλών ασθενειών και του καρκίνου [10]. Αποδεικτικά στοιχεία στιχομυθία μεταξύ ΤΟΡ-β και άλλα μονοπάτια σηματοδότησης περιλαμβανομένων σηματοδότηση Wnt έχουν αναφερθεί [10]. Smad4 είναι ένα κεντρικό συστατικό ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος του ΤΟΡ-β και οι πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι Smad4 συνεργάζεται με βήτα-κατενίνης σε αρκετές caners [11] – [14]

RECK είναι κρίσιμη καταστολέα μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs. ) και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση RECK είναι σημαντικά χαμηλότερη σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς urothelial [15] – [17]

μέχρι τώρα έχουν πολλά microRNAs έχουν ταυτοποιηθεί και αναφερθεί ότι είναι σημαντικό σε πολλές μορφές καρκίνου. [18]. Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs, περίπου 22 νουκλεοτίδια σε μήκος, που είναι ικανά να ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση τόσο η μεταγραφή και μετάφραση των επιπέδων [19]. MiRNAs προσδένονται στην 3’UTR του mRNA στόχου και να καταστέλλουν μετάφραση από mRNA σε πρωτεΐνη ή να επάγουν τη διάσπαση του mRNA και έτσι να ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων [20].

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι miR-182- 5P ήταν σημαντικά υψηλότερη στην κύστη καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς και ουροθηλιακά υψηλή έκφραση miR-182-5p συσχετίστηκε σημαντικά με μικρότερη συνολική επιβίωση. Μέχρι στιγμής δεν έχουν υπάρξει αναφορές σχετικά με τη λειτουργία των miR-182-5p στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Έτσι έχουμε επικεντρωθεί σε miR-182-5p, λειτουργικό αναλύσεων, εντοπίστηκαν πολλά γονίδια-στόχους του miR-182-5p χρησιμοποιώντας διάφορους αλγόριθμους και προσδιόρισε

Smad4

και

RECK

ως γονιδίων στόχων. Τέλος, έχουμε υπερ-εκφράζεται αυτά τα γονίδια-στόχους (

Smad4

και

RECK

) σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης για να εξετάσει το μηχανισμό του miR-182-5p λειτουργία.

Αποτελέσματα

miRNA-182-5p έκφραση είναι σημαντικά υψηλότερη σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης Οι ιστοί και τα συνδεδεμένα με μικρότερη συνολική επιβίωση

σύγκριση των επιπέδων έκφρασης miRNA-182-5p σε ιστούς του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (n = 18) και κανονική ουροφόρων ιστών (n = 6) με πραγματικού χρόνου PCR. Το miR-182-5p έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Σχήμα 1Α). Ερευνήσαμε τη σύνδεση των miR-182-5p και αρκετές κλινικές παραμέτρους, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1-Β και παρατηρήθηκε ότι η υψηλή έκφραση miR-182-5p συσχετίστηκε σημαντικά με μικρότερη συνολική επιβίωση.

A. miR-182-5p έκφραση σε κλινικά δείγματα και κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης, Β Συλλόγου miR-182-5p με κλινική-παθολογική παραμέτρους, Γ Kaplan Meier για τη συνολική επιβίωση.

Η

Όσον αφορά αρκετές άλλες κλινικές παραμέτρους, δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική σχέση. Χωρίσαμε τις ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης 18 σε δύο κατηγορίες με βάση τη μέση τιμή και οικόπεδα Kaplan Meier έδειξε ότι η συνολική επιβίωση ήταν μικρότερη σε υψηλή miR-182-5p εκφράζουν ομάδα (p value = 0,0349, δοκιμασία log-rank) (Σχήμα 1 C).

miRNA-182-5p έκφραση είναι σημαντικά αυξημένη σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης γραμμές κυττάρων

σύγκριση miR-182-5p έκφραση σε αρκετές καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές και η έκφρασή της σε Τ24 και UM -UC-3 κυττάρων ήταν στην περιοχή από ότι σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Έτσι χρησιμοποιήσαμε αυτές τις κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης δύο για περαιτέρω πειράματα σε αυτή τη μελέτη (Εικόνα 1Α).

Επίδραση των microRNA-182-5p Υπερ-έκφραση για την Κυτταρική Βιωσιμότητα και Μετανάστευσης σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης Γραμμές κυττάρων

Για να επιβεβαιώσετε τη λειτουργία των miR-182-5p, εμείς επιμολυσμένα miR-182-5p πρόδρομο σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης (T24 και UM-UC-3). Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση του miR-NC ή miR-182-5p πρόδρομος σε καρκινικά κύτταρα κύστης, το επίπεδο miR-182-5p έκφραση πιστοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR (fold αλλαγή? 4545, 5920, αντίστοιχα σχήμα 2-Α). . Στη συνέχεια, έγιναν αρκετές λειτουργικές αναλύσεις. Παρατηρήσαμε σημαντικά αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχ. 2-Β), εισβολή (Σχ. 2-C) και τη μετανάστευση (Σχ. 2-Α) στον miRNA 182-5p επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με miR-NC επιμολυσμένων κυττάρων. Επιπλέον, miR-182-5p μειώθηκε σημαντικά κυτταρικής απόπτωσης (Σχ. 2-Ε).

Δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Τ24 και UM-UC-3) διαμολύνθηκαν παροδικά είτε με miR-182-5p πρόδρομο ή τον έλεγχο (miR-NC). A. Σχετική miR-182-5p έκφραση, Β κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας, δοκιμασία C. Invasion, D. επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίας (24 ώρες), Ε Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης σε miR-NC ή miR-182-5p επιμολυσμένα π.Χ. κύτταρα.

Η

3’UTR-λουσιφεράσης-Δοκιμασία και στόχος Protein Expression στο miR-182-5p Οι επιμολύνσεις

RECK mRNA έχει ένα, ενώ Smad4 έχει δύο πιθανές δωρεάν σημείου σύνδεσης με ΜΙΚ 182-5p μέσα σε 3 ‘UTR του (Σχ. 3-Α). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς λουσιφεράσης 3’UTR και βρήκαν ότι οι σχετικές δραστηριότητες λουσιφεράσης με αυτές τις θέσεις μειώθηκαν σημαντικά σε miR-182-5p επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα κύστης (Τ24, UM-UC-3) (Σχ. 3-Β ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι RECK και Smad4 mRNAs είναι πιθανά γονίδια στόχους του miR-182-5p. Western ανάλυση επιβεβαίωσε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης RECK και Smad4 ήταν σημαντικά αυξημένη σε miR-182-5p αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3-C).

A. RECK και Smad4 3’ΙΙΤΡ θέσης και συμπληρωματικές miR-182-5p ακολουθίες. δοκιμασία Β 3’ΙΙΤΡ λουσιφεράσης (miR-NC και miR-182-5p πρόδρομος), Γ RECK, Smad4 και βήτα-τουμπουλίνης έκφραση της πρωτεΐνης του αναστολέα miR-NC ή miR-182-5p αναστολέας επιμολυσμένα κύτταρα καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Τ24, UM-UC-3).

η

Επιπτώσεις της Υπερ-έκφραση της RECK και Smad4 για καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυττάρων (T24) λειτουργία

για να δούμε την λειτουργία του RECK και Smad4, εμείς υπερεκφράζεται RECK και Smad4 σε κύτταρα Τ24 η οποία επιβεβαιώθηκε με μέτρηση mRNA (Σχ. 4-Α) και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης (Σχ. 4-Β). Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε αρκετές λειτουργικές αναλύσεις. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, η βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχ. 4-C), εισβολή (Εικ. 4-D) και της μετανάστευσης (Εικ. 4-Ε) ήταν σημαντικά αναστέλλεται RECK και Smad4 επιμολυσμένα Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4-F, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά σε RECK ή Smad4 επιμολυσμένων κυττάρων.

Α Σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση είτε pCMV6-κενό, pCMV6-RECK ή pCMV6-Smad4 σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα (Τ24), τα επίπεδα έκφρασης RECK και Smad4 ελέγχθηκε από το πραγματικό χρόνο RT-PCR (fold αλλαγή? 24744, 8563, αντίστοιχα) και ανάλυση Western (Β) δοκιμασία Γ βιωσιμότητα των κυττάρων, δοκιμασία Δ εισβολή, Ε Πληγή δοκιμασία επούλωσης, F. ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης σε κενό, RECK και Smad4 επιμολυσμένα κύτταρα Τ24. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± S.D. από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. Γ έκφρασης β-κατενίνης στον πυρηνικό κλάσμα, CREB χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Η

Επίδραση του miR-182-5p και Smad4 σε βήτα-κατενίνης έκφραση στο πυρηνικό κλάσμα

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4-G, η έκφραση β-κατενίνης στον πυρηνικό κλάσμα ήταν σημαντικά αυξημένη σε miR-182-5p επιμολυσμένα κύτταρα Τ24. Σε αντίθεση, η έκφραση β-κατενίνης στον πυρηνικό κλάσμα μειώθηκε σημαντικά σε Smad4 επιμολυσμένα κύτταρα Τ24.

Συζήτηση

Μια σειρά έχουν ταυτοποιηθεί ως καταστολέας των όγκων ή ογκογονίδια microRNAs με βάση το επίπεδο έκφρασής τους σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης ή /και λειτουργική ανάλυση. Ωστόσο, πολλές μελέτες miRNA έχουν επικεντρωθεί στην miRNAs ογκοκατασταλτικό συμπεριλαμβανομένων των miR-125b, -133a, -143, -145, -200 οικογένεια (200α, 200b, 200c, 141, 429), -203, -205, -218, – 449Α, -493 και -517a [21] – [29]. Δύο miRNAs (MIR-21 και miR-129) έχουν ταυτοποιηθεί και επιβεβαιώθηκε ως ογκογονίδια στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [30], [31].

MiR-182-5p έχει επίσης αναφερθεί να είναι ένα ογκογονίδιο σε αρκετές καρκίνους [32] – [37]. Παρόμοια με τα αποτελέσματά μας, μια έκθεση διαπίστωσε ότι miR-182-5p έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη στην κύστη καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με την κανονική ουροθήλιο, ωστόσο λειτουργική ανάλυση δεν πραγματοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη [38]. Έτσι, ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ miR-182-5p έκφρασης και κλινικές παραμέτρους περιλαμβανομένης της παθολογικής στάδια και τις εκβάσεις των ασθενών και διαπίστωσε ότι miR-182-5p έκφραση συσχετίστηκε με μικρότερη συνολική επιβίωση μετά τη λειτουργία σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-182-5p μπορεί να είναι ένα νέο και χρήσιμο διαγνωστικό βιοδείκτη για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Ο επόμενος στόχος μας ήταν να διαπιστωθεί αν miR-182-5p λειτουργεί ως ογκογονίδιο καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Από τρία κύστη καρκινικές κυτταρικές σειρές (Τ24, UM-UC-3, J82), η έκφραση του miR-182-5p σε δύο κυτταρικές σειρές (T24 και UM-UC-3) ήταν στην περιοχή της έκφρασης που παρατηρείται στην κύστη καρκινικούς ιστούς . Έτσι χρησιμοποιήσαμε αυτές τις κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης δύο (Τ24 και UM-UC-3) για πειράματα λειτουργική ανάλυση. Βρήκαμε ότι η υπερ-έκφραση του miR-182-5p σημαντικά προωθείται καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρική βιωσιμότητα, τη μετανάστευση και την εισβολή και ανέστειλε την απόπτωση. Χρησιμοποιήσαμε αρκετές αλγόριθμους για να αναζητήσουν πιθανούς miR-182-5p γονιδίων στόχων, δεδομένου microRNAs ασκούν τη δράση τους με τη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Εντοπίσαμε RECK και Smad4 ως πιθανοί γονιδίων στόχων με δοκιμασία λουσιφεράσης 3’UTR και αναλύσεις Western.

ΜΜΡ παίζει σημαντικό ρόλο στην εισβολή καρκίνου και μετάσταση και ΜΜΡ-2 ανύψωση στην κύστη καρκινικούς ιστούς έχει αναφερθεί ότι συσχετίζεται με το στάδιο του όγκου και κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [39], [40]. RECK είναι ένα κρίσιμο ΜΜΡ-2 καταστολέα και έκφραση RECK είχε προηγουμένως αναφερθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με την κανονική ουροθήλιο [16], [17]. Επιπλέον, μεθυλίωση του DNA έχει ταυτοποιηθεί ως ένας μηχανισμός RECK σίγηση [41]. Πρόσφατα miR-21 ταυτοποιήθηκε ως ρυθμιστής του

RECK

γονιδιακής έκφρασης σε διάφορες καρκίνους [42], αλλά μέχρι σήμερα δεν έχει υπάρξει έκθεση παρουσιάζει άμεση ρύθμιση των RECK από miR-182-5p.

Ερευνήσαμε επίσης τη λειτουργία των RECK από πάνω του την έκφραση σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρική σειρά (Τ24). Όπως φαίνεται, RECK ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή ικανότητες σε καρκινικά κύτταρα της κύστης και ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε κατά RECK διαμόλυνση.

Smad4 είναι ένα σημαντικό συστατικό μεταγωγής σήματος του ΤΟΡ-β και οι πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι Smad4 λειτουργίες συνεργαζόμενη με βήτα-κατενίνης σε διάφορες μορφές καρκίνου.

Wnt-βήτα κατενίνης σηματοδότησης είναι ζωτικής σημασίας για την εμβρυογένεση και ογκογένεσης [43]. Σε καρκινικά κύτταρα, η οδός Wnt συνήθως ενεργοποιείται προκαλώντας μη φωσφορυλιωμένη β-κατενίνης να συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα και κινείται προς τον πυρήνα, όπου συνδέεται με TCF /LEF και μεταγραφικά ρυθμίζει Wnt γονίδια στόχους προώθηση ογκογένεση [43]. Στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, απορρυθμισμένη σηματοδότηση Wnt-βήτα-κατενίνης παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη και τη μετάσταση. Έτσι κοιτάξαμε να δούμε αν η έκφραση βήτα-κατενίνης μεταβλήθηκε είτε miRNA-182 ή Smad4 επιμόλυνση. Όπως παρατηρήσαμε, miR-182-5p αυξημένη έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης, ενώ Smad4 μειωμένη έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης. Σε ό, τι γνωρίζουμε, δεν υπήρξαν αναφορές για miR-182 και σηματοδότηση Wnt-βήτα-κατενίνης και τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ογκο-miR-182-5p μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της Wnt-β-κατενίνης που σχετίζονται με τα γονίδια.

Στη μελέτη μας, Smad4 υπερέκφραση μείωση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης, τη μετανάστευση και την ικανότητα εισβολής. Η απόπτωση ήταν επίσης αυξημένη με Smad4 υπερέκφραση σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Δεδομένου ότι η απώλεια του Smad4 έχει αναφερθεί ότι παίζει ένα ρόλο συνάφεια στην έναρξη πλακωδών κυττάρων καρκινώματα του δέρματος, ανώτερη πεπτική οδό, καθώς και αδενοκαρκίνωμα του γαστρεντερικού σωλήνα [44], τα αποτελέσματά μας μπορεί να υποδεικνύει ότι Smad4 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Από τη στιγμή που επικεντρώνεται μόνο στην Smad4 στον καταρράκτη Wnt σηματοδότησης, είναι πιθανό ότι άλλα γονίδια μπορεί να είναι άμεσα ή έμμεσα ρυθμίζονται από miR-182-5p. Επιπλέον πειράματα θα χρειαστούν για να διαλευκανθεί ο ακριβής ρόλος του miR-182-5p στη σηματοδότηση Wnt-βήτα κατενίνης. Στο σύνολό τους, η μελέτη αυτή δείχνει ότι το miR-182-5p ασκεί ογκογόνο επιδράσεις της στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα από τα κάτω ρύθμιση RECK και Smad4.

Αυτή είναι η πρώτη έκθεση που τεκμηριώνει, επίσης, ότι το miR-182-5p έκφραση είναι σημαντικά αυξημένη σε κύστη καρκινικούς ιστούς όπου λειτουργεί ως ένα ογκογονίδιο με αναστολή της έκφρασης RECK και Smad4 και μπορεί να είναι δυνητικά χρήσιμο ως προγνωστικός βιοδείκτη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι το miR-182-5p μπορεί να έχει θεραπευτικές δυνατότητες για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

φορμόλη-σταθερό, παραφινώδη ενσωματωμένα δείγματα καρκίνου (FFPE) της ουροδόχου κύστης ελήφθησαν από τους Σαν Φρανσίσκο Υποθέσεων Βετεράνων (VA) Ιατρικό Κέντρο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή UCSF για τα Ανθρώπινα Ερευνών (αριθμός έγκρισης: H9058-35751-01).

Κλινικά δείγματα

Ένα σύνολο από 18 άνδρες ασθενείς με παθολογικά επιβεβαίωσε τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης είχαν εγγραφεί στη μελέτη αυτή (Veterans Affairs Medical Center στο Σαν Φρανσίσκο)

Cell Culture

τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης (J82? αριθμός ATCC:. ΗΤΒ-1, Τ24? αριθμός ATCC: ΗΤΒ-4, UM-UC-3? αριθμός ATCC: CRL-1749) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Οι γραμμές J82 και UM-UC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ Eagle με BSS του Earle συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Η κυτταρική σειρά Τ24 καλλιεργήθηκε σε μέσο McCoy 5Α με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό.

RNA και πρωτεΐνης Εκχύλιση

RNA (microRNA και το συνολικό RNA) εκχυλίστηκε από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης και μη-καρκινικές φυσιολογικούς ιστούς ουροδόχου κύστης (urothelial κύτταρα) χρησιμοποιώντας κιτ miRNeasy FFPE (Qiagen) μετά λέιζερ μικρο-ανατομή βασίζονται σε παθολόγους κριτικές. Ολικό RNA εκχυλίστηκε επίσης από καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ένα κιτ miRNeasy mini (QIAGEN). Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Thermo Scientific, Rockford, IL) που περιείχε αναστολείς πρωτεάσης (Sigma, St. Louis, ΜΟ). Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας ένα BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Thermo Scientific, Rockford, IL). Το Αντιδραστήριο Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Εκχύλιση ΝΕ-PER χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση κλάσματα πυρηνικής και κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης από καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL).

microRNA Επιμόλυνσης (προ-miR Προδρόμου και miR αναστολέα)

προδρόμους προ-miR ™ miRNA [αρνητικό έλεγχο (mIR-NC) ή HSA-miR-182-5p, Ambion] επιμολύνθηκαν παροδικά σε καρκινικά κύτταρα κύστης με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Anti-miR ™ miRNA αναστολέα [αρνητικού ελέγχου (εισπνοή-NC) ή αναστολέα miR-182-5p (miR-182 αναστολέα), Ambion] επιμολύνθηκαν παροδικά σε καρκινικά κύτταρα κύστης από siPORT NeoFX η επιμόλυνση Agent (Ambion) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 48 ώρες μέχρι την αξιολόγηση.

Βιωσιμότητας Κυττάρων, Cell Invasion, Επούλωση Δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε 3 ημέρες μετά τη διαμόλυνση με MTS (CellTiter 96 Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού υδατικό One Λύση κυττάρων, Promega). Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± S.D. 6 ανεξάρτητα πειράματα. προσδιορισμοί κυττάρων εισβολή πραγματοποιήθηκαν με το κιτ προσδιορισμό κυτταρικής εισβολής CytoSelect 24 φρεατίων (Cell BioLab, San Diego, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας χωρίς FBS και τοποθετήθηκαν στον ανώτερο θάλαμο εις τριπλούν. Μετά από 48 ώρες επώασης στους 37

o C (5% CO2), τα κύτταρα μεταναστεύουν μέσω της μεμβράνης βάφτηκαν. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως εισβάλει κύτταρα ποσοτικοποιούνται σε OD 560nm. Η διαδικασία επούλωσης του τραύματος αρχίζει με αναδιαμόρφωση μήτρας ιστού, τη μετανάστευση, και η ενδεχόμενη κλείσιμο της περιοχής του τραύματος. Ως εκ τούτου, αυτή η δοκιμασία χρησιμοποιείται συχνά για την αξιολόγηση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων. Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασία πραγματοποιήθηκε με το CytoSelect 24 φρεατίων επούλωσης τραυμάτων κιτ δοκιμασίας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να δημιουργηθεί ένα πεδίο πληγή, επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν μέχρι να σχηματιστεί μια μονοστοιβάδα γύρω από το ένθετο. Μετά την απομάκρυνση του ενθέτου, ένα πεδίο ανοιχτό τραύμα 0,9 πιπί που παράγονται και τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν από κάθε πλευρά του κενού. Το κλείσιμο της πληγής παρακολουθείται και το ποσοστό κλεισίματος μετρήθηκε. [Ποσοστό κλεισίματος Ποσοστό (%) = εμβαδόν μετανάστευσαν κυτταρικής επιφάνειας /συνολικής επιφάνειας x100)].

Η απόπτωση Αναλύσεις

Τα κύτταρα (48 ώρες μετά την επιμόλυνση) πλύθηκαν δύο φορές με 1 xPBS και επεξεργασία με θρυψίνη. Μετά την αδρανοποίηση της θρυψίνης σε πλήρες μέσο, ​​τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο 1χ ρυθμιστικό διάλυμα (70 μΙ) δέσμευσης. διάλυμα Annexin V-FITC (10 μΐ) και βαφή βιωσιμότητας 7-AAD (20 μΐ) προστέθηκαν σε 70 μΙ των κυτταρικών εναιωρημάτων. Μετά από επώαση για 15 λεπτά στο σκοτάδι, 400 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης 1χ παγωμένο προστέθηκε. Η αποπτωτική κατανομή των κυττάρων σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας FACS (Cell Lab QUANTA SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± S.D. από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Κατασκευή πλασμιδίου και 3’UTR-λουσιφεράσης Δοκιμασία

Εμείς κατασκευαστεί μεμονωμένα πλασμίδια για κάθε θέση πρόσδεσης στην 3’UTR του mRNA από τους πιθανούς γονιδίων στόχων με βάση microRNA.org πληροφορίες. Στη συνέχεια, επιβεβαίωσε σύνδεση με τα γονίδια-στόχους mRNA 3’ΙΙΤΡ με δοκιμασία λουσιφεράσης με miR-182-5p πρόδρομος miR-182-5p. PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target φορέας έκφρασης χρησιμοποιείται για την εκτέλεση ανάλυσης 3’UTR λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA). Οι αλληλουχίες εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για το πλασμίδιο ένθετα φαίνονται στον Πίνακα 1. Σε ένα συνολικό όγκο 20 μΐ, 5 μΐ έκαστο 100 μΜ πρόσθιου εκκινητή και αντίστροφο εκκινητή, 2 μΐ 10Χ ρυθμιστικού ανόπτησης (100 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 1 Μ NaCl, 10 mM EDTA) και 8 μΙ ύδατος προστέθηκαν σε 200 μΙ PCR σωληνάριο και επωάζονται στους 95 ° C για 5 λεπτά και στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Τα ολιγονουκλεοτίδια συνδέθηκαν εντός του

Pme

I-

Xba Ι θέση

της Έκφρασης pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target φορέα. Αποικία άμεση PCR εκτελέστηκε για αναγνώριση ενθέτου χρησιμοποιώντας REDTaq (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για PCR είχαν ως εξής: εμπρόσθιος εναρκτήρας, 5′-cgtgctggaacacggtaaaa-3 ‘? αντίστροφο εκκινητή, 5’-gcagccaactcagcttcctt-3 ‘. παράμετροι της PCR για το ποδήλατο ήταν ως ακολούθως: 94 ° C για 3 λεπτά, 30 κύκλοι PCR στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 10 λεπτά και 4 ° C για 10 λεπτά. Το PCR προϊόν υπέστη πέψη με NotI (Takara /Fisher Scientific,

Pittsburgh

,

PA, USA

). Τα μεγέθη των φορέων που περιέχουν ένθετα ήταν περίπου 200 bp και 100 bp με ηλεκτροφόρηση, δεδομένου ότι η αλληλουχία αναγνώρισης NotI ενσωματώθηκε εκκινητών. Για miR-182-5p πρόδρομος επιμόλυνση, της ουροδόχου κύστης καρκινικά κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με miR-NC και pmirGLO ή miR-182-5p και pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Φορείς Έκφρασης χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Η δραστικότητα λουσιφεράσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το Σύστημα Dual-Luciferase® Reporter Assay (Promega) (48 ώρες μετά την επιμόλυνση τους).

Η

Η υπερέκφραση πλασμίδιο γονιδίων στόχων (RECK, Smad4) και Λειτουργική Αναλύσεις

προκειμένου να κατασκευαστεί το γονίδιο-στόχο (RECK, Smad4) πάνω από πλασμίδια που εκφράζουν τα γονίδια ενισχύθηκαν με ολικό RNA από ανθρώπινο νεφρό ενηλίκου κανονική ιστούς (κατάλογος #: R1234142-50, Biochain Institute, Newark, CA) και RWPE-1 με αλυσιδωτή αντίδραση μεταγραφής-πολυμεράσης (RT-PCR). Οι αλληλουχίες των εκκινητών για την κλωνοποίηση φαίνεται στον Πίνακα 1. προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης κλωνοποιήθηκαν στον pTargeT θηλαστικών Φορέα Έκφρασης System (Promega, Madison, WI). Στη συνέχεια pCMV6-RECK ή pCMV6-Smad4 ελήφθη με υποκλωνοποίηση ενός θραύσματος NheI-XhoI από pTargeT-RECK /Smad4 στη θέση Nhel-Xhol του pCMV6-Έναρξη διάνυσμα.

Αρχικά επιμολυσμένα pCMV6-κενό και pCMV6- RECK ή -Smad4 εντός της ουροδόχου κύστης καρκινικά κύτταρα και RNA και πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν. Η υπερέκφραση του RECK ή Smad4 επιβεβαιώθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR και ανάλυση Western Blot και λειτουργικές αναλύσεις διεξήχθησαν.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ήταν πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με ένα Applied Biosystems Prism 7500 Fast Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας TaqMan καθολικής PCR μάστερ μιξ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Οι ανιχνευτές και εκκινητές TaqMan αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. Ανθρώπινη GAPDH και RNU48 χρησιμοποιήθηκαν ως ένα ενδογενές ελέγχου. Τα επίπεδα έκφρασης του RNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το 7500 γρήγορο σύστημα SDS έκδοση λογισμικού 1.3.1 (Applied Biosystems).

Ανάλυση Western

Σύνολο κύτταρο πρωτεΐνη (15-20 μg) χρησιμοποιήθηκε για κηλίδωση Western . Τα δείγματα αναλύθηκαν σε 4-20% Precise Gels Πρωτεΐνη (Thermo Scientific, Rockford, IL) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). Οι μεμβράνες εμβαπτίζονται σε 0,3% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBS που περιέχει 0.1% Tween 20 για 1 ώρα και ανιχνεύτηκαν για όλη τη νύχτα στους 4 4 ° C με πρωτογενές πολυκλωνικό και μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι Smad4 (# 9515), RECK (# 3433), β-κατενίνης ( # 9562), CREB (# 9197) και βήτα-τουμπουλίνης (# 2128) από την Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ. Οι κηλίδες πλύθηκαν σε TBS που περιέχει 0.1% Tween20 και σημάνθηκαν με υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης δευτερεύον αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού αντίσωμα (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ). Οι πρωτεΐνες ενισχύεται με χημειοφωταύγεια (Amersham ECL συν το σύστημα Western Blotting ανίχνευσης, Fairfield, CT) για οπτικοποίηση. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης εκφράστηκαν σε σχέση με τα επίπεδα β-τουμπουλίνης ή CREB

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση StatView. (Έκδοση 5? SAS Institute Inc., NC). Ένα

σ

-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Δρ Ρότζερ Erickson για την υποστήριξη και τη βοήθειά του με την προετοιμασία του χειρογράφου. .