Αφηρημένο

Ιστορικό

Περίπου το 60-80% των ασθενών με προχωρημένο κεφάλι και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα τραχήλου (HNSCC) πεθαίνουν μέσα σε πέντε χρόνια μετά τη διάγνωση. Η σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη ανακουφιστική θεραπεία για αυτούς τους ασθενείς. Για να αξιολογηθεί η προγνωστική αξία του αναστολέα φυλοσύνδετη απόπτωσης επίπεδο (ΧΙΑΡ) ως πιθανό βιοδείκτη σε αυτούς τους ασθενείς, διερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ της έκφρασης ΧΙΑΡ και απόκριση σισπλατίνη αυτών των ασθενών και την πρόγνωση τους.

Μεθοδολογία /Principal ευρήματα

Εξήντα ασθενείς με προχωρημένο HNSCC στρατολογήθηκαν σε αυτήν την μελέτη. Η έκφραση του ΧΙΑΡ εξετάστηκε τόσο πριν όσο και μετά τη χημειοθεραπεία και συσχετίστηκε με απόκριση σε χημειοθεραπεία, παράμετροι clinicopathology και κλινική έκβαση των ασθενών. Βρήκαμε ότι ΧΙΑΡ εκφράστηκε σε 17 (20,83%) από τα 60 δείγματα προηγμένων HNSCC και η έκφραση ήταν σημαντικά σχετίζονται με την αντίσταση cisplatin (Ρ = 0,036) και την κακή κλινική έκβαση (Ρ = 0,025). Σισπλατίνη βασίζεται προκαλείται από χημειοθεραπεία έκφραση ΧΙΑΡ σε αυτές τις μετα-χημειοθεραπεία δείγματα (P = 0,011), περαιτέρω σχετίζεται με φτωχότερη κλινική έκβαση (P = 0,029). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι μόνο η κατανάλωση αλκοόλ, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες και σε επίπεδο ΧΙΑΡ συσχετίστηκαν ανεξάρτητα με την πρόγνωση των ασθενών με προχωρημένο HNSCC. Την αναστολή της έκφρασης ΧΙΑΡ με siRNA σε ΧΙΑΡ κυττάρων υπερεκφράζεται HNSCC εντυπωσιακά αυξημένη ευαισθησία τους στη θεραπεία με σισπλατίνη σε σχεδόν μια διαφορά 3 φορές.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ΧΙΑΡ υπερέκφραση παίζει σημαντικό ρόλο στην η πορεία της νόσου και σισπλατίνη αντίσταση των προηγμένων HNSCC. ΧΙΑΡ είναι ένα πολύτιμο προγνωστικό της σισπλατίνης-απόκρισης και την πρόγνωση για ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Κάτω ρύθμιση των ΧΙΑΡ θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη συμπληρωματική θεραπεία για τους ασθενείς των προηγμένων HNSCC

Παράθεση:. Yang Χ-Η, Feng Ζ-Ε, Yan Μ, Hanada S, Ζούο Η, Yang C-Z, et al. (2012) ΧΙΑΡ είναι προγνωστικός της Cisplatin χημειοθεραπεία με βάση την ανταπόκριση και πρόγνωση για τους ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο κεφαλής και Τραχήλου. PLoS ONE 7 (3): e31601. doi: 10.1371 /journal.pone.0031601

Επιμέλεια: Torbjorn Ramqvist, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 1 του Σεπτεμβρίου του 2011? Αποδεκτές: 10, Ιανουαρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Μάρτη του 2012

Copyright: © 2012 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Project του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 30772433), του έργου της Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (Grant Νο 07QA14038), και στη Σαγκάη κορυφαία ακαδημαϊκά Πειθαρχία Έργου (Σχέδιο Νο S30206). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου (HNSCC) είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου παγκοσμίως και είναι η πιο κοινή νεόπλασμα στην κεντρική Ασία [1]. Αν και σε πρώιμα στάδια HNSCC έχουν υψηλά ποσοστά ίασης, έως και 50% των ασθενών με προχωρημένο παρούσας [2] ασθένεια. Μεταξύ αυτών ασθενείς με προχωρημένο στάδιο HNSCC, 60-80% θα πεθάνουν μέσα σε 5 χρόνια μετά τη διάγνωση [3]. Επί του παρόντος, η σισπλατίνη-based χημειοθεραπείας είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη ανακουφιστική θεραπεία για αυτούς τους ασθενείς. Ωστόσο, στην κλινική μόνο ένας περιορισμένος αριθμός ασθενών ωφελούνται από σισπλατίνη χημειοθεραπεία βασισμένη σε? άλλους ασθενείς είναι ανθεκτικοί σε αυτή τη θεραπεία και κάποιοι θα πεθάνουν εξαιτίας της τοξικότητας σχετιζόμενης με τη θεραπεία [4]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να ψάξουν για προγνωστικούς παράγοντες ή δυνητικούς βιοδείκτες που μπορεί να συμβάλει στον εντοπισμό των ασθενών που μπορούν να επωφεληθούν από σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση.

Οι αναστολείς των πρωτεϊνών απόπτωσης (ΙΑΡ) αντιπροσωπεύουν ένα σύνολο ισχυρών ενδογενείς ρυθμιστές της απόπτωσης σε κύτταρα θηλαστικών, το οποίο αποτελείται από οκτώ μέλη: ΧΙΑΡ, cIAP1, cIAP2, survivin, NIAP, Bruce, ML-ΙΑΡ και ILP-2 [5]. Αυτές οι πρωτεΐνες μεσολαβούν πολλαπλές βιολογικές λειτουργίες που περιλαμβάνουν σύνδεση και την αναστολή κασπάσες, ρυθμίζοντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, και ρυθμίζοντας μεταγωγής σήματος με τη μεσολάβηση υποδοχέων [6]. Μεταξύ αυτών, το Χ-συνδεδεμένο αναστολέας της απόπτωσης (ΧΙΑΡ) είναι ένα από τα πιο ισχυρός αναστολέας της κασπασών και την απόπτωση. ΧΙΑΡ μπορεί να δεσμεύει άμεσα και αναστέλλουν τόσο ο εκκινητής και τελεστή κασπάσες και αναστέλλουν τόσο μιτοχονδριακή-εξαρτώμενη και-ανεξάρτητο αποπτωτικών οδών [7], [8], [9]. Πρόσφατα ευρήματα έδειξαν

in vitro

, ΧΙΑΡ μπορεί να προκαλέσει αντίσταση μεταξύ των κυττάρων του όγκου όταν εκτεθούν σε μια ποικιλία αποπτωτικών ερεθισμάτων, συμπεριλαμβανομένης της χημειοθεραπείας [10], [11]. Ωστόσο, δεν είναι γνωστό εάν το επίπεδο έκφρασης ΧΙΑΡ θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη της απόκρισης σισπλατίνης προηγμένων HNSCC. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να διερευνηθεί η έκφραση του ΧΙΑΡ σε προχωρημένο HNSCC και η σχέση της με την απάντηση σισπλατίνη και την πρόγνωση των ασθενών αυτών.

Αποτελέσματα

επίπεδο έκφρασης ΧΙΑΡ συνδέεται με κακή κλινική έκβαση των ασθενών με προχωρημένο HNSCC

ΧΙΑΡ ήταν εντοπισμένη κυρίως στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 1), με εξαιρετικά μεταβλητή θετικό ποσοστό από 1% -85%. χρώση πυρήνα παρατηρήθηκε περιστασιακά σε ορισμένες μετα-χημειοθεραπεία δείγματα. Οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι εξέφρασαν υψηλά επίπεδα ΧΙΑΡ είχε γενικά χειρότερη πρόγνωση από εκείνους τους ασθενείς των οποίων οι όγκοι εκφράζονται χαμηλά επίπεδα των ΧΙΑΡ σε καρκινικό ιστό προ-χημειοθεραπείας (συνολική επιβίωση

P

= 0,025, δοκιμασία log Rank, Σχήμα 2). ρυθμό έκφρασης ΧΙΑΡ δεν συσχετιζόταν με το στάδιο ΤΝΜ, παθολογική βαθμό, το κάπνισμα και την ιστορία αλκοόλ από αυτούς τους ασθενείς με προχωρημένο HNSCC (Πίνακας 1). Στην πολυμεταβλητή ανάλυση, μετάσταση λεμφαδένα, η κατανάλωση αλκοόλ και την έκφραση ΧΙΑΡ (προ-χημειοθεραπείας) ήταν ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για την πρόγνωση των ασθενών (Πίνακας 2)

Α:. Αρνητικός έλεγχος με PBS αντί του πρώτου αντισώματος? Β: Η χαμηλή έκφραση του ΧΙΑΡ (το ποσοστό των θετικών ποσοστό & lt? 25%)? C:. Υψηλή έκφραση του ΧΙΑΡ (το ποσοστό του θετικού ρυθμού & gt? 25%)

Η

Α: Συνολικό ποσοστό επιβίωσης από ΧΙΑΡ βαθμολογίες. Οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του ΧΙΑΡ είχε γενικά χειρότερη πρόγνωση από εκείνους τους ασθενείς των οποίων οι όγκοι εκφράζονται χαμηλά επίπεδα ΧΙΑΡ σε προ-καρκινικό ιστό χημειοθεραπεία? Β: Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης από chemoresponse. Οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι είχαν αποκρίνεται σε χημειοθεραπεία είχαν γενικά καλύτερη πρόγνωση από εκείνους τους ασθενείς των οποίων ο όγκος ήταν ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία? C: ΧΙΑΡ αποτελέσματα της μετα-χημειοθεραπεία δείγματα. επίπεδα ΧΙΑΡ στην μετα-χημειοθεραπεία δείγματα ήταν επίσης σημαντικά που σχετίζονται με τις ασθενή συνολικά ποσοστά επιβίωσης.

Η

Η

επίπεδο έκφρασης ΧΙΑΡ συνδέθηκε με την απάντηση χημειοθεραπεία των ασθενών με προχωρημένο HNSCC

Όλοι αυτοί οι ασθενείς με προχωρημένο HNSCC είχε τελειώσει έναν κύκλο χημειοθεραπείας. Μεταξύ αυτών, 34 περιπτώσεις ήταν πλήρης απόκριση (CR) και μερική ανταπόκριση (PR) στη χημειοθεραπεία και 26 περιπτώσεις ήταν προοδευτική ασθένεια (PD) και σταθερή νόσος (SD). Οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του ΧΙΑΡ ήταν σημαντικά πιο ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία σισπλατίνη και γενικά είχαν φτωχότερες αποκρίσεις σε χημειοθεραπεία (

P

= 0,005, Πίνακας 1). επίπεδα έκφρασης ΧΙΑΡ ήταν πολύ αυξημένη σε μετα-χημειοθεραπεία ιστούς HNSCC σύγκριση με τα δείγματα προ-χημειοθεραπείας (

P

= 0,011, Πίνακας 3). επίπεδα ΧΙΑΡ σε μετα-χημειοθεραπεία δείγματα ήταν επίσης σημαντικά που σχετίζονται με τα συνολικά ποσοστά επιβίωσης αυτών των ασθενών (

P

= 0.029) (Σχήμα 2), αν και στην πολυπαραγοντική ανάλυση, δεν ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας που σχετίζονται με τους ασθενείς «εκβάσεις.

η

η αναστολή ΧΙΑΡ έκφραση ευαισθητοποιημένων HNSCC κυτταρικές σειρές με τη θεραπεία με σισπλατίνη

για να διερευνηθεί η περιστασιακή σχέση της έκφρασης ΧΙΑΡ και την ανταπόκριση του φαρμάκου των ασθενών, χρησιμοποιήσαμε siRNA για την αναστολή της έκφρασης ΧΙΑΡ στην HNSCC κυτταρική σειρά CAL27 και WSU-HN13. Τρεις siRNAs σχεδιάστηκαν για να αναστέλλουν την έκφραση του ΧΙΑΡ σε κύτταρα CAL27 και WSU-HN13, και μεταξύ αυτών, ομάδα αγωγής siRNA1 ελήφθη μείωση near70% της έκφρασης ΧΙΑΡ mRNA σε δύο κύτταρα (Σχήμα 3). Σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου, η σισπλατίνη τιμή IC50 στην ομάδα siRNA1 μειώθηκε από 0,51 μg /ml έως 0,20 μg /ml (

P

= 0.05, Σχήμα 4) σε CAL27 και από 4,32 έως 1,82 μg /ml σε WSU -HN13.

αποτελεσματικότητα Αναστολή της siRNA-1, siRNA-2 και siRNA-3 για την έκφραση του ΧΙΑΡ mRNA εξετάστηκε σε CAL27 κύτταρο (άνω) και WSU-HN13 κυττάρων (Κάτω) με πραγματικού χρόνου PCR . ομάδα θεραπείας ΧΙΑΡ siRNA1 που λαμβάνονται κοντά σε μείωση κατά 70% της έκφρασης ΧΙΑΡ mRNA σε δύο κύτταρα.

Η

ΧΙΑΡ siRNA-1 ανέστειλε αποτελεσματικά την έκφραση της πρωτεΐνης ΧΙΑΡ τόσο CAL27 και τα κύτταρα WSU-HN13 (Άνω) και μειωμένη η τιμή σισπλατίνη IC50 από 0,51 μg /ml έως 0,20 μg /ml σε CAL27 και 4,32 έως 1,82 μg /ml σε WSU-HN13 (Κάτω).

η

Συζήτηση

σισπλατίνη– με βάση εισαγωγική χημειοθεραπεία, χειρουργική επέμβαση και ακτινοθεραπεία που χρησιμοποιείται πρέπει να θεωρηθεί ως τυπικό σύστημα για ασθενείς με προχωρημένο HNSCC σε υψηλού κινδύνου? Ωστόσο, τα θεραπευτικά αποτελέσματα της θεραπείας παραμένουν εισαγωγική ασαφή οφείλεται σε πολλούς τυχαιοποιημένες μελέτες παραλείποντας να δείξει ένα πλεονέκτημα επιβίωσης με τη χρήση της εισαγωγική χημειοθεραπεία [12], [13]. Αν και αδιάκριτη χορήγηση εισαγωγική διευθύνσεις χημειοθεραπεία κανένα όφελος για την έκβαση των ασθενών (ποσοστό πενταετούς επιβίωσης ήταν 38,33% στη μελέτη μας), βρήκαμε αυτούς τους ασθενείς που πέτυχαν κλινική ανταπόκριση είχε μια πιο ευνοϊκή πρόγνωση (p = 0,001, δοκιμασία log-rank ), το οποίο είναι σύμφωνο με ορισμένες προηγούμενες εκθέσεις [12], [13]. Από αυτή την άποψη, την αξιολόγηση πώς να επιλέξετε την επιλεκτική ασθενών που θα επωφεληθούν θετικά από την εισαγωγική χημειοθεραπεία ήταν ο αποφασιστικός παράγοντας για την επιτυχή θεραπεία [4].

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε μια ισχυρή σχέση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης ΧΙΑΡ και η κλινική ανταπόκριση και την πρόγνωση των ασθενών με προχωρημένο HNSCC. χαμηλή έκφραση ΧΙΑΡ ήταν συσχετίζεται στενά με την απάντηση χημειοθεραπεία και ευνοϊκή πρόγνωση, ενώ η υψηλή έκφραση ΧΙΑΡ μπορεί να προβλέψει την αποτυχία χημειοθεραπείας και κακή έκβαση. Τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές που δείχνουν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του ΧΙΑΡ ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα σε θεραπευτικά φάρμακα στον καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του προστάτη, καρκίνο των ωοθηκών και τον καρκίνο του παγκρέατος [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19], [20]. Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι η σισπλατίνη-based από χημειοθεραπεία σε μεγάλο βαθμό την έκφραση του ΧΙΑΡ σε προχωρημένο HNSCC. Το υψηλότερο επίπεδο ΧΙΑΡ στην μετα-χημειοθεραπεία δείγματα που συνδέεται επίσης με χειρότερη πρόγνωση των ασθενών. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση του ΧΙΑΡ αποτελεί πρωταρχική αιτία της αποτυχίας της θεραπείας και προκαλούμενη από χημειοθεραπεία έκφραση ΧΙΑΡ οδήγησε σε κακή πρόγνωση αυτών των ασθενών ανθεκτικών στα φάρμακα. αρνητικούς ασθενείς προ-επιλεγμένο ΧΙΑΡ μπορούν να επωφεληθούν από σισπλατίνη βασίζεται εισαγωγική θεραπεία.

in vitro

δεδομένων μας πρότεινε περαιτέρω μια δυνητική αξία της αναστολής της έκφρασης ΧΙΑΡ να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι σε αντίθεση με τις περισσότερες μελέτες, παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ της κατανάλωσης αλκοόλ και η συνολική επιβίωση των ασθενών με προχωρημένο HNSCC σε αυτή τη μελέτη. Ενδιαφέρουσες, ένα παρόμοιο αποτέλεσμα έχει δημοσιευθεί πρόσφατα, η οποία πρότεινε τις διαφορές των δεδομένων μας και την πολιτιστική παράδοση θα μπορούσε να προκληθεί από διάφορες συνήθειες κατανάλωσης οινοπνεύματος: οι ασθενείς με προχωρημένο HNSCC από την Κίνα συχνά έπιναν λικέρ με πολύ υψηλή συγκέντρωση αλκοόλ (συνήθως & gt? 50%) , ενώ οι Δυτικοί συνήθως καταναλώνουν ποτά με πολύ χαμηλότερη συγκέντρωση του οινοπνεύματος. Τέτοιες υψηλές συγκεντρώσεις αλκοόλ μπορεί να τονώσει στοματικό βλεννογόνο και να καταστρέψει την ισορροπία βακτηρίων, που επηρεάζουν την πορεία της νόσου των προηγμένων HNSCCC [21]. Δεν μπορούμε να αποκλείσουμε τις δυνατότητες του περιορισμένου μεγέθους του δείγματος ή /και άλλους παράγοντες που μπορεί να συνέβαλαν σε αυτή την παρατήρηση.

Αυτή η μελέτη ήταν μια αναδρομική μελέτη ασθενών-μαρτύρων και είχε κάποιους περιορισμούς. Στην παρούσα μελέτη, εμείς επιλέξαμε IHC να αξιολογήσει την έκφραση ΧΙΑΡ αντί κάποιων ποσοτικών μεθόδων πρωτογενούς λόγω της μη διαθεσιμότητας των νωπών βιοψία ιστών. Παρά το γεγονός ότι IHC είναι μια ημι-ποσοτική μέθοδος, είναι τώρα η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη, απλούστερη και πιο αποδοτικός πρωτόκολλο στην κλινική εργασία [22]. Επίσης, το ποσοστό της έκφρασης υψηλής ΧΙΑΡ στα προ-χημειοθεραπεία δείγματα ήταν μόλις 20,83%, ενώ το ποσοστό ανταπόκρισης χημειοθεραπεία (CR + PR) των ασθενών ήταν 43.34%. Είναι περισσότερο από πιθανό ότι πολλοί παράγοντες μπορούν να συμβάλλουν στη συνολική απόκριση των ναρκωτικών στην προηγμένη HNSCC? έκφραση ΧΙΑΡ μπορεί να είναι μόνο ένας από τους πολλούς παράγοντες που εμπλέκονται.

Τα ευρήματα από την παρούσα μελέτη έχουν δυνητικά σημαντικές κλινικές επιπτώσεις. Πρώτον, η μελέτη μας έδειξε για πρώτη φορά ότι η έκφραση του ΧΙΑΡ σχετίζεται με απόκριση χημειοθεραπεία και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για την πρόβλεψη κλινικές εκβάσεις των ασθενών με προχωρημένο HNSCC, ιδίως σε εκείνους που είχαν σισπλατίνη βασίζεται χημειοθεραπευτική θεραπεία. Δεύτερον, η έκφραση ΧΙΑΡ μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για να επιλέξετε ασθενείς που έχουν τις μεγαλύτερες πιθανότητες να επωφεληθούν από σισπλατίνη βασίζεται εισαγωγική χημειοθεραπεία. Τέλος, η αιτιώδης σχέση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης ΧΙΑΡ και την ανταπόκριση χημειοθεραπεία δείχνουν ότι κάτω ρύθμιση των ΧΙΑΡ θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη επικουρική θεραπεία για ασθενείς με προχωρημένο HNSCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Νοσοκομείου Ένατη Λαϊκής, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine και διεξάγεται σύμφωνα με τις συστάσεις της Διακήρυξης του Ελσίνκι. Δεν επιγνώσει συναίνεση (γραπτή ή προφορική) λήφθηκε για τη χρήση των δειγμάτων αναδρομική ιστών από τους ασθενείς στο πλαίσιο αυτής της μελέτης, πολλοί από τους οποίους είχαν αποβιώσει, δεδομένου ότι η Επιτροπή Δεοντολογίας, ο οποίος παραιτήθηκε από την ανάγκη για συναίνεση, δεν έκρινε αναγκαίο. Όλα τα δείγματα ήταν ανώνυμα.

Cell Culture

Ανθρώπινο HNSCC κυτταρική γραμμή CAL27, η οποία ήταν ανθεκτική σε θεραπεία με σισπλατίνη, ελήφθη από την Αμερικανική Συλλογή Κυττάρων Ιστών (Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1% γλουταμίνη και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. κυτταρική γραμμή WSU-HN13 [23] ήταν προικισμένος από το University of Maryland Οδοντιατρική Σχολή (Baltimore, MD, USA) και επίσης καλλιεργήθηκαν σε DMEM (Gibco, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1% γλουταμίνη, και 1 % πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη

ασθενείς και όγκου δείγματα

Εξήντα ασθενείς με προχωρημένο HNSCC. (κλινικό στάδιο ΙΙΙ /Iva?.. UICC /AJCC 7 ed, 2010) είχαν προσληφθεί σε αυτή τη μελέτη. Όλοι οι ασθενείς έχουν αποδεχθεί σισπλατίνη βασίζεται εισαγωγική χημειοθεραπεία ακολουθούμενη από ριζική εκτομή του όγκου μέσα σε δύο έως τρεις εβδομάδες από την ολοκλήρωση της χημειοθεραπείας στο Τμήμα Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής, Ένατη Λαϊκής νοσοκομείο, Shanghai Jiao Tong University από τον Ιανουάριο 1999 έως τον Δεκέμβριο του 2004.

Η κλινική ανταπόκριση της χημειοθεραπείας εκτιμήθηκε όχι λιγότερο από 2 εβδομάδες μετά ασθενείς ολοκλήρωσαν τη χημειοθεραπεία σύμφωνα με τα κριτήρια ανταπόκρισης αξιολόγησης σε συμπαγείς όγκους (RECIST) [24]. Μια CR ορίστηκε ως η πλήρης εξαφάνιση όλων των μετρήσιμων αλλοιώσεων, χωρίς την εμφάνιση οποιωνδήποτε νέων βλαβών. Μια PR ορίστηκε ως μείωση της δυσδιάστατα μετρήσιμων αλλοιώσεων κατά τουλάχιστον 50 τοις εκατό του αθροίσματος των προϊόντων των μεγαλύτερων κάθετων διαμέτρων τους και την απουσία εξέλιξης σε άλλες βλάβες, χωρίς την εμφάνιση οποιωνδήποτε νέων βλαβών. SD [9] ορίστηκε ως μια μείωση στον όγκο του όγκου μικρότερο από 50 τοις εκατό ή σε αύξηση του όγκου ενός ή περισσοτέρων μετρούμενων βλαβών από λιγότερο από 25 τοις εκατό, χωρίς την εμφάνιση οποιωνδήποτε νέων βλαβών. PD ορίστηκε ως αύξηση του μεγέθους τουλάχιστον μιας δυσδιάστατα μετρήσιμα αλλοίωση κατά τουλάχιστον 25 τοις εκατό και η εμφάνιση νέων βλαβών. κλινικοπαθολογικοί πληροφορίες των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το πρότυπο θεραπευτική επιχειρήσεις με αρνητικό περιθώριο εκτομή. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία εντός δύο-έξι εβδομάδων από την ολοκλήρωση της χειρουργικής επέμβασης. Συνολική δόση για πρωτογενή περιοχή του όγκου και του τραχήλου της θετικούς λεμφαδένες ήταν 6000cGy και για την πρωτογενή όγκο και το λαιμό των αρνητικών κόμβων ήταν 5000 cGy.

Η

Western Blot Ανάλυση

Η συνολική πρωτεΐνη σε λύση σε 2 × ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 125 mM Tris-HCl (ρΗ 6.8), 5% β /ο SDS, και 24,75% γλυκερίνη. 40 μg πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας 12% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF. Μετά από ολονύκτια επώαση με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου ΧΙΑΡ (BD, ΗΠΑ) σε αραίωση 1:4000 και από μία ώρα επώαση με δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού κατσίκας IRDye 800CW (LI-COR, USA), το σήμα σαρώθηκε και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας την Οδύσσεια Infrared System απεικόνισης (LI-COR Βιοεπιστημών, USA). β-ακτίνης (Sigma-Aldrich, USA) χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Real-time PCR

Το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA). 1 μα ολικού RNA που μεταγράφεται wasreverse σε cDNA χρησιμοποιώντας ολιγο-άΤ εκκινητή και PrimeScript II ΚΤ-άση (Takara, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με Thermal Cycler Dice σύστημα πραγματικού χρόνου (Takara, Ιαπωνία). Οι εκκινητές για PCR σχεδιάστηκαν με λογισμικό Primer Express® 3.0 (Applied Biosystem, USA). Οι αλληλουχίες εκκινητών του ΧΙΑΡ ήταν: 5′-CCGGCTGTCCTGGCGCGAAA-3 ‘και 5′-GCTCGTGCCAGTGTTGATGCTGA-3’. Οι αλληλουχίες εκκινητή του β-ακτίνης ήταν: 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3 ‘και 5′-GGGCCGGACTCGTCATACT-3′, και οι αλληλουχίες εκκινητή του GAPDH ήταν: 5’- AATTGAGCCCGCAGCCTCCC -3 ‘και 5′-ACCAGGCGCCCAATACGACC-3’. Όλα τα εναύσματα διαχωρίζονται από τουλάχιστον ένα ιντρόνιο στο αντίστοιχο γονιδιωματικό DNA. ανάλυση καμπύλης διαστάσεως συμπεριλήφθηκε σε όλες τις αντιδράσεις για τον αποκλεισμό μη-ειδική ενίσχυση. Η σχετική ποσότητα του επιπέδου ΧΙΑΡ mRNA υπολογίστηκε με βάση τις πρότυπες μεθόδους ΔΔCT [25]. Τόσο η β-ακτίνη και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος.

siRNA Νοκ ντάουν

Τρεις αντι-ΧΙΑΡ siRNAs κάθε στόχο τις δύο παραλλαγές ματίσματος των ΧΙΑΡ και ένα αρνητικό έλεγχο FAM σημασμένο siRNA (μη αλληλουχίας στόχου), συντέθηκαν από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). Οι ακολουθίες ήταν: siRNA1: GGUCAGUACAAAGUUGAAATT, siRNA2: GCAGGUUGUAGAUAUAUCATT, siRNA3: CCGGAAUCUUAAUAUUCGATT και αρνητικός μάρτυρας: AAUUCUCCGAACGUGUCACGU. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Ανοσοϊστοχημεία

πριν και μετά τη χημειοθεραπεία μπλοκ παραφίνης εκπρόσωπος ιστού κόπηκαν σε τομές 5 μm για πρότυπο ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC ). Μετά ανάκτηση αντιγόνου θερμότητα που προκαλείται σε ρυθμιστικό κιτρικού οξέος (ρΗ 7.0) για 20 λεπτά και το κλείδωμα σε 5% ορό κατσίκας για 30 λεπτά, τα πλακίδια επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρωπίνου ΧΙΑΡ (BD, ΗΠΑ) σε αραίωση 1: 100 στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Η παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Το συνδεδεμένο αντίσωμα ανιχνεύθηκε με ένα Super Sensitive Σύστημα Ανίχνευσης IHC (BioGenex, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι τομές έγιναν ορατά με (, USA Sigma) διάλυμα διαμινοβενζιδίνης τετραϋδροχλωρική και αντιθέτως με αιματοξυλίνη Harris. Το αποτέλεσμα χρώση προσδιορίστηκε με μέτρηση 1000 κυττάρων όγκου σε τρία 100 × πεδία μεγέθυνση από δύο ανεξάρτητους παθολόγους και διαβαθμισμένων περαιτέρω ως χαμηλή έκφραση (το ποσοστό του θετικού ρυθμού & lt? 25%) και υψηλή έκφραση (το ποσοστό του θετικού ρυθμού ≥25%) .

Drug ευαισθησία της δοκιμασίας

τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 4 Χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν περαιτέρω για 24 ώρες. 6 ώρες μετά την επιμόλυνση με αρνητικό μάρτυρα ή siRNA, το μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο containingone σειριακών αραιώσεων DDP για άλλες 72 ώρες, συμπεριλαμβανομένου ενός αρνητικού ελέγχου χωρίς DDP. Στη συνέχεια, 20 μΙ αποστειρωμένου χρωστικής ΜΤΤ (3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -2,5-δι-φαινυλτετραζόλιο, 5 mg διαλυμένα σε 1 ml ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο? Sigma, USA) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας σε μια τελική συγκέντρωση 0.5 mg /ml και επωάζονται στους 37 ° C για 4 ώρες. Στη συνέχεια, οι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν με 150 μΙ διμεθυλοσουλφοξείδιο για 10 λεπτά. Φασματομετρίας απορρόφηση στα 490 nm μετρήθηκε με αναγνώστη μικροπλάκας. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

Στατιστική Ανάλυση

Το πακέτο λογισμικού SPSS 17.0 χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Συχνότητες σε σύγκριση με το ακριβές τεστ του Fisher, × 2 δοκιμή έκτακτης ανάγκης, ή μη-παραμετρικές δοκιμασίες ανάλογα με την περίπτωση. Έχουμε κατ ‘εκτίμηση καμπύλες επιβίωση και ο χρόνος μέχρι την πρόοδο, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν τους χρησιμοποιώντας ένα διπλής όψης δοκιμασία log-rank. Πολλαπλές λογιστικών παλινδρομήσεων που χρησιμοποίησε ένα μοντέλο Cox αναλογικού κινδύνου χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί εάν τα μοριακά χαρακτηριστικά των όγκων προέβλεψε ανεξάρτητα επιβίωση σε ομάδα μας από ασθενείς με προχωρημένο HNSCC. P & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

.