Αφηρημένο

Η παθογένεση του παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) παραμένει ελάχιστα κατανοητή. S100 ασβέστιο πρωτεΐνη δέσμευσης Α6 (S100A6) έχει συσχετισθεί με PDAC? Ωστόσο, η επίδραση του S100A6 επί PDAC μετανάστευση και εισβολή δεν έχει ακόμη διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, τα κύτταρα Panc-1 επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο για να προκληθεί υπερέκφραση S100A6, και β-κατενίνη χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας ένα ειδικό RNA μικρή φουρκέτα (shRNA). Η επούλωση πληγών και προσδιορισμούς Transwell απέδειξαν ότι S100A6 προωθείται PDAC κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Επιπλέον, β-κατενίνης shRNA ανέστειλε τη μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων PDAC. Επιβεβαιώσαμε ότι S100A6 επάγει PDAC κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μέσω ενεργοποίησης του β-κατενίνης in vitro. Αξιολόγηση των mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αποκάλυψε ότι S100A6 επάγει αυξημένη έκφραση της β-κατενίνης, Ν-cadherin και βιμεντίνη, και μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης σε κύτταρα PDAC. β-κατενίνης shRNA μεταβάλλεται επίσης την έκφραση των επιθηλιακών-μεσεγχυματικών μετάβαση (ΕΜΤ)-σχετικές δείκτες σε κύτταρα PDAC. Συγκεκριμένα, η έκφραση της Ε-καδερίνης ήταν αυξημένη, ενώ η έκφραση του Ν-καδερίνης και βιμεντίνη μειώθηκε. Τέλος, αποδείξαμε ότι S100A6 μεταβάλλει την έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με δείκτες μέσω ενεργοποίησης β-κατενίνης. Εν κατακλείδι, S100A6 επάγει ΕΜΤ και προάγει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε ένα β-κατενίνης-εξαρτώμενο τρόπο. S100A6 μπορεί να αντιπροσωπεύουν ένα νέο πιθανό θεραπευτικό στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Chen X, Liu Χ, Lang Η Zhang S, Luo Υ, Zhang J (2015) S100 ασβέστιο-Binding Protein A6 Προωθεί επιθηλίου-μεσεγχύματος μετάβασης μέσω β-κατενίνης σε καρκίνο του παγκρέατος Γραμμή Cell. PLoS ONE 10 (3): e0121319. doi: 10.1371 /journal.pone.0121319

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Yue Wang, Εθνικό Ινστιτούτο για την Viral Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων, CDC, την Κίνα, την Κίνα

Ελήφθη: 10 Δεκεμβρίου, 2014? Αποδεκτές: 30 Ιανουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από την Βασική και Κλινική Ίδρυμα συνεργασίας του Κεφαλαίου Ιατρικό Πανεπιστήμιο No.13JL77 (Κίνα). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDAC) είναι ένα σοβαρό παγκόσμιο πρόβλημα υγείας. Είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτου στις Ηνωμένες Πολιτείες, με συνολική σχετική ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 6% [1]. Στην Κίνα, ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης των ασθενών PDAC είναι 7,8 μήνα, με 30,0% των ασθενών που υποβάλλονται σε θεραπευτική πρόθεση επιχειρήσεις, και μόνο το 9,8% των ασθενών που έλαβαν ολοκληρωμένη θεραπεία [2]. Παρά τις προόδους στη θεραπεία, PDAC παραμένει εξαιρετικά ανθεκτικό σε διαθέσιμα σήμερα ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία σχήματα [3]. Ένας συνεισφέρων στην κακή πρόγνωση είναι η περιορισμένη κατανόηση της παθογένεσης του καρκίνου του παγκρέατος. Επομένως, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για τη διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που σχετίζονται με την εμφάνιση, ανάπτυξη και μετάσταση του παρόντος θανατηφόρου ασθένειας.

S100A6 ανήκει στην οικογένεια S100, εκ των οποίων η έκφραση είναι συνδεδεμένη με ογκογένεση και τη μετάσταση [4] . Logsdon et al. [5] που χρησιμοποιούνται μικροσυστοιχίες στο προφίλ της γονιδιακής έκφρασης PDAC, προσδιορίζοντας ένα σύνολο 158 παγκρέατος γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων S100A6. Η ομάδα μας έχει εκτελεστεί προηγουμένως ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης S100A6 σε παγκρεατικά ιστούς, επιβεβαιώνοντας ότι η έκφραση S100A6 είναι αυξημένη σε δείγματα PDAC, σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς [6]. Ohuchida κ.ά.. [7] έδειξε ότι η έκφραση του S100A6 κυρίως περιορίζεται στους πυρήνες των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων, και τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης πυρηνικής S100A6 σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Ο ρόλος των S100A6 σε σχέση με σχηματισμό όγκου και τη μετάσταση, ωστόσο, ελάχιστα κατανοητή. Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι S100A6 εμπλέκεται στη ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης [8], η οποία οδηγεί στην υποβάθμιση των β-κατενίνης.

Wnt /β-κατενίνης μοίρα επιρροές κυτταρική σηματοδότηση, πολλαπλασιασμός, πολικότητα, και κυτταρικό θάνατο κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, καθώς και ομοιόσταση ιστού σε ενήλικες [9]. Η ανώμαλη ρύθμιση της οδού αυτής είναι ως εκ τούτου συνδέεται με μια ποικιλία ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου, της ίνωσης και νευροεκφυλισμό [10]. Το Wnt οδός αποτελείται από το Wnt πρωτεΐνη υποδοχέα συνδέτη και της κυτταρικής επιφάνειας, εκτός από κυτταροπλασματικά συστατικά και ένα ειδικό πυρηνικό μεταγραφικό σύμπλοκο [11]. Όταν η Wnt πρωτεΐνη συνδέτης δεσμεύεται με frizzled, έναν υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας, ο Wnt οδός ενεργοποιείται. Κυτταροπλασματικά β-κατενίνης στη συνέχεια εισέρχεται στον πυρήνα του κυττάρου, όπου διαμορφώνει τη μεταγραφή, επηρεάζοντας έτσι τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετάσταση του όγκου. Σε αυτή τη διαδικασία, β-κατενίνη είναι το κλειδί μόριο τελεστή [12]. Μία ποικιλία κυτταρικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των Wnt, μπορούν να επηρεάσουν την παραγωγή και τη συσσώρευση β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα. αλληλουχίας RNA των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος που κυκλοφορούν εμπλέκει Wnt και β-κατενίνης σε μετάσταση [13].

Υπάρχει ένας πλούτος της έρευνας σχετικά με τα χαρακτηριστικά των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων που σχετίζονται με την επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) [ ,,,0],14,15]. EMT αναφέρεται στη δια-επιθηλιακών κυττάρων σε μεσεγχυματικά κύτταρα κάτω από ορισμένες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, που συνοδεύεται από τη μορφολογία των κυττάρων και αλλαγές γονιδιακή έκφραση [16]. EMT εμφανίζεται σε μια ποικιλία διαδικασιών, όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη, την επούλωση των πληγών, ορισμένες χρόνιες ασθένειες, και μετάσταση πρώιμο στάδιο του όγκου. Κάτω ρύθμιση της E-cadherin, ένα επιθηλιακό δείκτη, είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της EMT. Η απώλεια της Ε-καδερίνης συνοδεύεται από την προς τα άνω ρύθμιση των δεικτών μεσεγχυματικών, όπως Ν-καντερίνης και βιμεντίνη. EMT είναι απαραίτητο για την πλειοψηφία των μεταστάσεων όγκων, συμπεριλαμβανομένων PDAC [17]. Το μονοπάτι /β-κατενίνης Wnt είναι ένα από τα σημαντικότερα μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στην επαγωγή EMT.

Στην έκθεση αυτή, μελετήθηκε η λειτουργία και σχετίζονται μηχανισμός S100A6 σε σχέση με EMT επαγωγή, αξιολογώντας την επιρροή της στις Panc-1 κύτταρο μετανάστευση και εισβολή.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική γραμμή

Η ανθρώπινη παγκρεατική καρκινική κυτταρική γραμμή, Panc-1, αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ΗΠΑ). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) (Invitrogen, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Invitrogen, USA), 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Invitrogen, USA) στους 37 ° C με 5% CO

2.

πλασμίδια και παρεμβολές RNA

Τα συμπληρωματικά DNA για την ανθρώπινη S100A6 και του αρνητικού μάρτυρα DNA εισήχθησαν σε πλασμιδιακό φορέα GV146 αγοράζονται από Genechem (Σανγκάη, Κίνα). Μία αλληλουχία στόχευσης shRNA β-κατενίνης (5′-ATCACTGAGCCTGCCATCTGTGCTCTTCG-3 ‘) και ένα αρνητικό ακολουθία ελέγχου συντέθηκαν και συνδέθηκαν εντός του φορέα pRFP-C-RS (ΟηΟεηε Technologies, USA). Τα πλασμίδια ενισχύθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση της αλληλουχίας μετά την κλωνοποίηση αποκάλυψε 100% ομολογία με δημοσιευμένες αλληλουχίες.

παροδική επιμόλυνση και δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών

Το πλασμίδιο υπερέκφραση S100A6 και το πλασμίδιο ελέγχου επιμολύνθηκαν σε Panc-1 κύτταρα χρησιμοποιώντας αισιό- ΜΕΜ μέσο μειωμένου ορού (Invitrogen, USA) και Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

β-κατενίνης shRNA και ελέγχου shRNA διαμολύνθηκαν σε κύτταρα Panc-1 όπως αναφέρεται παραπάνω. Μετά από παροδική επιμόλυνση, επιλεγμένα Panc-1 κύτταρα χρησιμοποιώντας 1,0 μg /mL πουρομυκίνη, και διατηρήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης συμπληρωμένο με 1.0 μg /mL πουρομυκίνη. Κλωνικοί πληθυσμοί κυττάρων απομονώθηκαν με μεταφορά ενιαία συσσωματώματα κυττάρων σε ατομικά φρεάτια μιας πλάκας έξι φρεατίων. Τα κύτταρα στη συνέχεια διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2.

Στη συνέχεια, S100A6 υπερέκφραση και ελέγχου πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε β-κατενίνης knockdown σταθερές κυτταρικές σειρές, όπως αναφέρεται ανωτέρω.

επούλωση πληγών Δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων και επιμολύνθηκαν με την υπερέκφραση ή τον έλεγχο πλασμιδίου S100A6, και β-κατενίνη shRNA ή ελέγχου shRNA. Μετά από 36 ώρες, πλήρες μέσο αντικαταστάθηκε με FBS-DMEM χωρίς, και μετά από περαιτέρω 6 ώρες, οι κυτταρικές μονοστοιβάδες τραυματίστηκαν με ένα αποστειρωμένο πλαστικό άκρο 200 μL. Οι καλλιέργειες στη συνέχεια διατηρούνται σε FBS-DMEM χωρίς, και παρατηρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν περιοχές τραύματος χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο σε 0, 24 και 48 ώρες μετά τον τραυματισμό. Το πλάτος του τραύματος μετρήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Image J. Οι επουλωτικές των πληγών ποσοστό εκτιμήθηκε ως εξής:

Transwell Δοκιμασία

Transwell θαλάμους (Corning, USA) με ένα πόρου 8-μm χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της μετανάστευσης σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά την επιμόλυνση, έναν όγκο 200 μι κυττάρων, σε πυκνότητα 1 × 10

5 /mL σε FBS-DMEM χωρίς, σπάρθηκε στα ανώτερα θαλάμους. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με DMEM που περιείχε 10% FBS ως διεγερτικός παράγοντας. Οι θάλαμοι επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή ιστοκαλλιέργειας στους 37 ° C, 5% CO

2 ατμόσφαιρα, για 8 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 95% αιθανόλη για 20 λεπτά, χρωματισμένο με κρυσταλλικό ιώδες επί 30 λεπτά, και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο με ένα 40 × στόχο.

Για να αξιολογηθεί κύτταρο εισβολή, Biocoat Matrigel (BD Biosciences) (300 μg /mL, 100 μL ανά θάλαμο) εφαρμόστηκε στους άνω θαλάμους ένθετο 5 ώρες πριν να ακολουθηθεί η διαδικασία για την δοκιμασία της μετανάστευσης που περιγράφεται παραπάνω.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA από Panc -1 κύτταρα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA). Ολικό RNA χρησιμοποιήθηκε σαν εκμαγείο για να συνθέσει cDNA, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, USA). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν 7500 PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems, USA), με ένα μείγμα αντίδρασης αποτελούμενο από 5-μι 2 χ SYBR Green Master Mix, 1-μί πρότυπο, 0,4-μι πρόσθιο εκκινητή, 0,4, μι αντίστροφο εκκινητή και 3,2-μί RNA χωρίς νερό. Οι συνθήκες κυκλοποίησης ήταν 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95˚C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. επίπεδα γονιδιακής έκφρασης κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με εκείνη του GAPDH. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Σχετικά επίπεδα mRNA παρουσιάστηκαν ως 2

-ΔΔCt [18]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται είναι λεπτομερώς στον Πίνακα 1.

Η

Δυτική Blotting

Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Solarbio, Πεκίνο, Κίνα) συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης PMSF (Solarbio , Πεκίνο, Κίνα). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των δειγμάτων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ πρωτεΐνη ποσοτικοποίησης (keygen Biotech, Nanjing, Κίνα). Δείγματα (40-100 μα) υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 2 ώρες σε 5% άπαχο ξηρό γάλα. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: αντι-β-κατενίνης (Cell Signaling Technology 8480, USA), αντι-Ε καδερίνης (Abcam ab1416, USA), αντι-Ν καντερίνης (Abcam ab19348, USA), αντι-βιμεντίνη ( Abcam ab8069, USA) και αντι-β-ακτίνης (Cell Signaling Technology 8457, USA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με τα αντίστοιχα φθορίζοντα δευτερεύοντα αντισώματα (Οδύσσεια). Western κηλίδες ποσοτικά με τη χρήση Οδύσσεια υπέρυθρη απεικόνιση. τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με εκείνο του β-ακτίνης.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκε ανεξάρτητα τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD (τυπική απόκλιση). Μαθητή

t-test

χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο λογισμικού SPSS 17.0 και τα στοιχεία παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 5. Για όλες τις δοκιμές, σ & lt? 0,05 θεωρήθηκε ότι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα.

Αποτελέσματα

S100A6 προωθεί PDAC μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή in vitro

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον S100A6 προωθεί PDAC μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή, Panc-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα S100A6 υπερέκφραση πλασμίδιο ή ένα πλασμίδιο ελέγχου. Real-time RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να επαληθεύσει ότι το πλασμίδιο υπερέκφραση S100A6 αύξησε τα επίπεδα του mRNA του S100A6 σε κύτταρα Panc-1. Εμείς ανίχνευσε μια σημαντική αύξηση στο επίπεδο του mRNA σε S100A6 S100A6 υπερεκφράζουν κύτταρα, συγκριτικά με κύτταρα ελέγχου (ρ & lt? 0.001) (. S1 Εικ). Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την επίδραση της έκφρασης στην κυτταρική S100A6 εισβολή in vitro. Μία δοκιμασία για επούλωση της πληγής απεκάλυψε μία σημαντική αύξηση στην επούλωση τραύματος συντελεστή S100A6 υπερεκφράζουν κύτταρα, σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου, στις 24 και 48 ώρες (ρ = 0,006 και ρ & lt? 0.001, αντίστοιχα) (Εικ. 1Α και 1Β). Μία δοκιμασία transwell έδειξαν επίσης αυξημένη μετανάστευση και εισβολή σε S100A6 κύτταρα που υπερεκφράζουν (ρ = 0.04 για την δοκιμασία μετανάστευσης, ρ = 0,006 για τη δοκιμασία εισβολής) (Σχ. 1C και 1D). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι S100A6 προωθεί την εισβολή των κυττάρων PDAC.

(Α) Ο προσδιορισμός επούλωση της πληγής, κύτταρα που υπερεκφράζουν S100A6 (αριστερά), κύτταρα ελέγχου (δεξιά). (Β) Το ποσοστό επούλωση της πληγής ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα που υπερεκφράζουν S100A6, σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, στις 24 και 48 ώρες. (Γ) Transwell δοκιμασία, «Ι» αντιπροσωπεύει S100A6 υπερέκφραση στη δοκιμασία μετανάστευσης? «II» αντιπροσωπεύει την ομάδα ελέγχου στην δοκιμασία μετανάστευσης? «III» αντιπροσωπεύει S100A6 υπερέκφραση στη δοκιμασία εισβολής? «IV» αντιπροσωπεύει την ομάδα ελέγχου στην δοκιμασία εισβολής. (D) αντιπροσωπευτικό στατιστικό διάγραμμα για τη δοκιμασία transwell, που δείχνει μια σημαντική αύξηση στη μετανάστευση (Ι) και εισβολή (II) με S100A6 υπερεκφράζουν κύτταρα, σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0.01.

Η

S100A6 μεταβάλλει την έκφραση της β-κατενίνης και EMT που σχετίζονται με δείκτες στα κύτταρα PDAC

Κατά τη διερεύνηση των πιθανών κατάντη μεσολαβητών της S100A6 υπεύθυνη για την προώθηση της μετανάστευσης PDAC κυττάρων και εισβολής , παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση του S100A6 οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων του mRNA β-κατενίνης σε Panc-1 κύτταρα (p = 0,006) (Σχ. 2Α). Δεδομένου ότι EMT παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία εισβολής-μετάσταση, προχωρήσαμε να εκτιμηθεί η έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με δείκτες. Η έκφραση της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης μειώθηκε στο επίπεδο του mRNA, ενώ η έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών Ν-καντερίνης και βιμεντίνης αυξήθηκε (ρ & lt? 0.001, ρ = 0.002 και ρ & lt? 0.001, αντιστοίχως) (Σχ. 2Β). Εξετάσαμε επίσης τα επίπεδα πρωτεΐνης του β-κατενίνης και τους δείκτες EMT χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western, και επιβεβαίωσε ότι η υπερέκφραση του S100A6 αύξησε την έκφραση του β-κατενίνης (p = 0,024) (Σχ. 2C και 2D), μειωμένη εκείνη του Ε-καδερίνης , και αύξησε την έκφραση του Ν-καδερίνης και βιμεντίνης (ρ = 0,009, ρ = 0,026, ρ = 0,044, αντίστοιχα) (Σχ. 2Ε και 2F). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι S100A6 ανυψώνει τα επίπεδα β-κατενίνης και αλλοιώνει την έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με δείκτες σε κύτταρα PDAC.

(Α) Η υπερέκφραση του S100A6 οδήγησε σε σημαντική αύξηση του επιπέδου του mRNA β-κατενίνης σε κύτταρα Panc-1. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR αποκάλυψε ότι S100A6 υπερέκφραση οδήγησε σε μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης, και αυξημένη έκφραση του Ν-καδερίνης και βιμεντίνη. (C) Κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι S100A6 αυξητικά β-κατενίνης στο επίπεδο πρωτεΐνης. (D) αντιπροσωπευτικό στατιστικό διάγραμμα που δείχνει τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης β-κατενίνης, σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Ε) κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι S100A6 υπερέκφραση οδήγησε σε τροποποιημένη έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με δείκτες. Συγκεκριμένα, η έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης μειώθηκε, ενώ η έκφραση του Ν-καδερίνης και βιμεντίνη αυξήθηκε. (F) Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του Ε-καδερίνης, Ν-cadherin και βιμεντίνης διέφεραν σημαντικά μεταξύ του S100A6 υπερεκφράζουν κατάσταση και τον έλεγχο. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001.

Η

β-κατενίνης shRNA αλλαγμένη τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων PDAC in vitro

Για να διερευνήσει την επίδραση της β-κατενίνης για τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων PDAC, χρησιμοποιήσαμε β- κατενίνης shRNA για να δημιουργήσει ένα σταθερό β-κατενίνης knockdown κυτταρική γραμμή Panc-1. Panc-1 κύτταρα επιμολυσμένα με μη στόχους shRNA χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Knockdown του β-κατενίνης επιβεβαιώθηκε με PCR πραγματικού χρόνου και κηλίδωση Western (ρ & lt? 0.001 και ρ = 0.001, αντίστοιχα) (. S2 Εικ). Μία δοκιμασία δοκιμασίας και transwell επούλωση πληγών διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί η επίδραση της β-κατενίνης για τη μετανάστευση και εισβολή. Η δοκιμασία επούλωση της πληγής έδειξαν ότι knockdown του β-κατενίνης ανέστειλαν σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων PDAC σε σύγκριση με την κατάσταση ελέγχου και στα δύο 24 και 48 ώρες (ρ = 0,013 και ρ = 0,002, αντίστοιχα) (Σχ. 3Α και 3Β). Η δοκιμασία transwell αποκάλυψε μειωμένη μετανάστευση και εισβολή στα κύτταρα knockdown β-κατενίνης, σε σύγκριση με τον μάρτυρα (ρ = 0,009 για τη δοκιμασία της μετανάστευσης, p = 0,015 για τη δοκιμασία εισβολής) (Σχ. 3C και 3D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αναστολή της β-κατενίνης μειώνει τη μετανάστευση και εισβολή κυττάρων PDAC in vitro.

(Α) Ο προσδιορισμός επούλωση της πληγής απεκάλυψε μία σημαντική μείωση στην μετανάστευση στην β-κατενίνης ομάδα shRNA (αριστερά) , σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (δεξιά). (Β) Το ποσοστό επούλωση της πληγής ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε S100A6-εκφράζοντα κύτταρα, σε σύγκριση με τον μάρτυρα, στις 24 και 48 ώρες. (Γ) Η δοκιμασία transwell έδειξε ότι β-κατενίνης shRNA μείωσε δραματικά τον αριθμό των μεταναστεύουν και εισβάλλουν κυττάρων (χ 40). «Ι» αντιπροσωπεύει β-κατενίνης shRNA στη δοκιμασία μετανάστευσης? «II» αντιπροσωπεύει την ομάδα ελέγχου στην δοκιμασία μετανάστευσης? «III» αντιπροσωπεύει β-κατενίνης shRNA στην δοκιμασία εισβολής? «IV» αντιπροσωπεύει την ομάδα ελέγχου στην δοκιμασία εισβολής. (D) αντιπροσωπευτικό στατιστικό διάγραμμα για τη δοκιμασία transwell, που δείχνει μια σημαντική μείωση της μετανάστευσης (Ι) και εισβολή (II) στην β-κατενίνης ομάδα shRNA, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0.01.

Η

β-κατενίνης shRNA αλλοιώνει την έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με δείκτες σε κύτταρα in vitro PDAC

Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον β-κατενίνης εμπλέκεται στη EMT, εκτιμήσαμε την έκφραση του ΕΜΤ σχετίζονται δείκτες σε επίπεδο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε β-κατενίνης knockdown κυττάρων Panc-1. Knockdown του β-κατενίνης είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένα επίπεδα E καντερίνης-mRNA, και μειωμένα επίπεδα Ν-καδερίνης και του mRNA βιμεντίνης (p = 0.002, ρ & lt? 0.001 και ρ & lt? 0.001, αντίστοιχα) (Εικ. 4Α). Western blotting αποτελέσματα όσον αφορά την έκφραση της πρωτεΐνης ήταν σύμφωνα με την σε πραγματικό χρόνο δεδομένα RT-PCR. Συγκεκριμένα, η έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης ήταν αυξημένη, ενώ η έκφραση του Ν-καδερίνης και βιμεντίνης μειώθηκε (ρ = 0,004, ρ = 0,007 και ρ = 0,017, αντίστοιχα), σε κύτταρα β-κατενίνης knockdown Panc-1 (Εικ . 4Β και 4C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το επίπεδο έκφρασης β-κατενίνης συσχετίζεται με την έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με δείκτες σε PDAC κύτταρα.

(Α) β-κατενίνης shRNA οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων του E-cadherin mRNA, και μία σημαντική μείωση στα επίπεδα του Ν-καντερίνης και mRNA βιμεντίνη. (Β) Κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι β-κατενίνης shRNA οδήγησε σε απορυθμίζεται πρωτεΐνη έκφραση της Ε-καδερίνης και ρυθμίζεται προς τα κάτω έκφραση πρωτεΐνης Ν-καδερίνης και βιμεντίνη. (Γ) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης, Ν-cadherin και βιμεντίνης ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ του β-κατενίνης ομάδα shRNA και της ομάδας ελέγχου. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001.

Η

S100A6 προωθεί PDAC μετανάστευση των κυττάρων και εισβολής μέσω ενεργοποίησης β-κατενίνης in vitro

Για να διερευνήσουν κατά πόσον S100A6 προωθεί PDAC μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή μέσω της ρύθμισης της β-κατενίνης, εμείς επιμολυσμένα σταθερή β-κατενίνης-νοκ ντάουν κύτταρα Panc-1 με ένα πλασμίδιο υπερέκφραση S100A6. Εκτιμήσαμε έκφραση β-κατενίνης χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR και στυπώματος Western αναλύσεις. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης μεταξύ των δύο ομάδων (ρ = 0,354 και ρ = 0,765, αντίστοιχα) (S3 Εικ.). Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η β-κατενίνης ήταν πράγματι σταθερά χτυπηθεί κάτω, και ότι η έκφραση της δεν επηρεάστηκε από S100A6 υπερέκφραση. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε την επούλωση πληγών και transwell δοκιμασίες για να αξιολογηθεί η μετανάστευση και εισβολή αυτών των κυττάρων. Η δοκιμασία επούλωση της πληγής έδειξαν ότι η μετανάστευση δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο ομάδων, σε 24 ή 48 ώρες (ρ = 0,983 και ρ = 0,875, αντίστοιχα) (Εικ. 5Α και 5Β). Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας transwell ήταν συνεπή με τη δοκιμασία επούλωση της πληγής, χωρίς σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων είτε για τη μετανάστευση ή την εισβολή (p = 0,803 για τη δοκιμασία της μετανάστευσης, p = 0,659 για τη δοκιμασία εισβολής) (Σχ. 5C και 5D ). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι S100A6 δεν έχει καμία επίδραση για τη μετανάστευση και εισβολή σε σταθερές β-κατενίνης knockdown κυττάρων PDAC. Αυτό υποδηλώνει ότι S100A6 προάγει PDAC κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μέσω ενεργοποίησης β-κατενίνης in vitro.

(Α) Ο προσδιορισμός επούλωση της πληγής δεν αποκάλυψε καμία αλλαγή στη μετανάστευση των κυττάρων β-κατενίνης shRNA υπερεκφράζουν S100A6 (αριστερά) σε σύγκριση με την ομάδα β-κατενίνης shRNA ελέγχου (δεξιά). (Β) Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο ποσοστό επούλωση της πληγής μεταξύ των δύο ομάδων. (Γ) Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα αποτελέσματα της δοκιμασίας Transwell μεταξύ των δύο ομάδων, όσον αφορά τόσο τη μετανάστευση και την εισβολή (× 40). «Ι» αντιπροσωπεύει β-κατενίνης-shRNA + S100A6 υπερέκφραση στη δοκιμασία μετανάστευσης? «II» παριστά β-κατενίνης shRNA + S100A6 ελέγχου στην δοκιμασία μετανάστευσης? «III» αντιπροσωπεύει β-κατενίνης shRNA + S100A6 υπερέκφραση στον προσδιορισμό εισβολής? «IV» αντιπροσωπεύει β-κατενίνης shRNA + S100A6 ελέγχου στη δοκιμασία εισβολής. (Δ) Εκπρόσωπος στατιστική γράφημα για τη δοκιμασία φρεατίων, που δείχνει καμία σημαντική διαφορά στην μετανάστευση (Ι) ή εισβολής (II) δοκιμασίες μεταξύ των δύο ομάδων.

Η

S100A6 προωθεί EMT μέσω της ενεργοποίησης της β-κατενίνης

για να ερευνηθεί η δυνατότητα μηχανιστική σχέση μεταξύ S100A6 και β-κατενίνης σε σχέση με EMT σε καρκίνο του παγκρέατος, επιμολύναμε σταθερά β-κατενίνης knockdown κυττάρων Panc-1 με ένα S100A6 υπερέκφραση πλασμίδιο ή ένα πλασμίδιο ελέγχου, και αξιολογήθηκαν η έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με δείκτες. Real-time RT-PCR κατέδειξαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα mRNA του Ε-καδερίνης, Ν-cadherin και βιμεντίνης μεταξύ των δύο ομάδων (ρ = 0,227, ρ = 0,228 και ρ = 0,067, αντίστοιχα) (Σχ. 6Α). Επιβεβαιώσαμε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης, Ν-cadherin και βιμεντίνη επίσης δεν διέφερε μεταξύ των δύο ομάδων (ρ = 0,267, ρ = 0,638 και ρ = 0,940, αντίστοιχα) (Σχ. 6Β και 6C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι S100A6 δεν έχει καμία επίδραση επί ΕΜΤ σχετίζονται δεικτών σε σταθερή PDAC κύτταρα β-κατενίνης knockdown, υποδεικνύοντας ότι S100A6 μεταβάλλει την έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με δείκτες μέσω ενεργοποίησης β-κατενίνης.

(Α) Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με δείκτες μεταξύ κυττάρων β-κατενίνης shRNA υπερεκφράζουν S100A6 και κύτταρα ελέγχου β-κατενίνης shRNA. (Β) Κηλίδωση Western αποκάλυψε παρόμοιες αλλαγές στην έκφραση του ΕΜΤ σχετίζονται δείκτες στις δύο ομάδες. (Γ) Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων σε σχέση με την έκφραση της E-cadherin, N-cadherin και πρωτεΐνες vimentin.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, απέδειξαν ότι S100A6 υπερέκφραση προωθεί, και β-κατενίνη shRNA αναστέλλει, PDAC κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Διαπιστώσαμε ότι S100A6 προάγει PDAC κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μέσω ενεργοποίησης β-κατενίνης in vitro. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι η έκφραση S100A6 συσχετίζεται με εκείνη του β-κατενίνης και ότι η έκφραση του EMT σχετίζονται δεικτών σε PDAC κύτταρα τροποποιείται τόσο S100A6 υπερέκφραση και β-κατενίνης knockdown.

S100A6 αναφέρεται ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ένας αριθμός καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του δέρματος, του στομάχου, του πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος και άλλων επιθηλιακών καρκίνων [19]. Έχει αναφερθεί ότι η αυξημένη έκφραση του S100A6 μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετανάστευση σε ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [20]. Επιπλέον, τα επίπεδα του ορού S100A6 μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πιθανή προγνωστική βιοδείκτη σε γαστρικό καρκίνο, και η αναστολή της S100A6 μειώνει το μεταστατικό δυναμικό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων [21]. Σε παγκρεατικό καρκινογένεση, έχουν δοκιμασίες ανοσοϊστοχημείας έχουν χρησιμοποιηθεί για να αποδείξει ότι τα κύτταρα PanIN 1α δεν εκφράζουν S100A6, και ότι η αναλογία των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων αυξάνει αναλογικά με το βαθμό PanIN, με επίπεδα S100A6 mRNA αυξάνοντας επίσης με σταδιακό τρόπο [22,23] .

ένα ευρύ φάσμα πειραματικών μοντέλων είναι ενδεικτικά ενός σημαντικού ρόλου για την β-κατενίνης σε παγκρεατικά μετάσταση του καρκίνου [24]. Nowotny et al. [25,26] πρότεινε ότι S100A6 μπορεί να έχουν επίδραση στην πρωτεΐνη calcyclin δέσμευσης (CacyBP) /Siah-1 αλληλεπιδρά πρωτεΐνη (SIP) και κατασταλτικά του αλληλόμορφου G2 της Skp1 (Sgt1). CacyBP /SIP ταυτοποιήθηκε ως μία πρωτεΐνη S100A6 πρόσδεσης που εμπλέκεται στην ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του β-κατενίνης [27]. Η ακολουθία των Sgt1 μοιράζεται 20% ταυτότητα με εκείνη της CacyBP /SIP. Επιπλέον, Sgt1 και CacyBP /SIP βρέθηκαν να δεσμεύσει Skp1 και ενεργοποιούν πρωτεΐνες Skp1p-cullin-F-box (ΕΕΤ) ουβικιτίνης λιγάση. Αυτή η λιγάση περιγράφεται σε κύτταρα θηλαστικών ως σύμπλεγμα που ρυθμίζει την ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του φωσφορυλιωμένη β-κατενίνης [28]. Μια άλλη μελέτη [29], επιβεβαίωσε ότι CacyBP /SIP δεν ανιχνεύεται σε φυσιολογικούς ιστούς του παγκρέατος, αλλά ανιχνεύεται σε καρκίνο του παγκρέατος. Ως εκ τούτου, εικάζουν ότι S100A6 επηρεάζει την υποβάθμιση της β-κατενίνης μέσω παρέχοντας υπεράσπιση της BP /SIP και Sgt1 σε PDAC. Σε αυτή τη μελέτη, S100A6 επαγόμενη έκφραση β-κατενίνης τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. Επιπλέον, τόσο η δοκιμασία επούλωση της πληγής και μια δοκιμασία φρεατίων έδειξαν ότι S100A6 υπερέκφραση προωθεί τη μετανάστευση PDAC κυττάρων και εισβολή.

Σε πολλά μοντέλα, συμπεριλαμβανομένων των μαστικών γραμμές επιθηλιακών κυττάρων και καρκίνωμα, η οδός /β-κατενίνης Wnt πιστεύεται να προκαλέσει EMT. β-κατενίνης είναι συνήθως συνδεδεμένο με E-cadherin, η οποία είναι σημαντική για κυττάρου-κυττάρου και τις συνδέσεις του κυτταροσκελετού καντερίνης. Επιπλέον, η μεταφορά β-κατενίνης στον πυρήνα μπορεί να προωθήσει την έκφραση των συγγενικών ΕΜΤ γονιδίων [30]. Ορισμένες μελέτες [31-34] επιβεβαίωσαν ότι ορισμένοι παράγοντες μπορεί να ελέγξει τα επιθηλιακά πλαστικότητα και να μεταβάλλουν τη μετάσταση μέσω β-κατενίνης εξαρτώμενη ρύθμιση σε PDAC, ορθοκολικό καρκίνο, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και ο καρκίνος του μαστού. Η μελέτη μας έδειξε επίσης ότι η β-κατενίνης νοκ ντάουν μπορεί να προκαλέσει ρύθμιση προς τα άνω της E-cadherin και προς τα κάτω ρύθμιση του Ν-cadherin και βιμεντίνης.

Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι S100A4, ένα μέλος της οικογένειας των S100, θα μπορούσε να είναι ένας βασικός παράγοντας στην προώθηση της διαδικασίας EMT στην PDAC [35]. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τις σχέσεις μεταξύ S100A6, β-κατενίνης, ΕΜΤ και εισβολή κυττάρων PDAC. Επιβεβαιώσαμε ότι S100A6 ενδέχεται να προκαλέσουν ΕΜΤ σε μια β-κατενίνης εξαρτώμενο τρόπο, αποδεικνύοντας ότι S100A6 μπορεί να προωθήσει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μέσω β-κατενίνης in vitro. Ο ακριβής ρόλος της οικογένειας S100 και σχετίζονται πρωτεΐνες σε σχέση με τον καρκίνο του παγκρέατος είναι ένα σημαντικό θέμα που χρήζει περαιτέρω μελέτης.

Συμπέρασμα

S100A6 μπορεί να προκαλέσει EMT και να προωθήσει τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή σε ένα β κατενίνης-εξαρτώμενο τρόπο. S100A6 μπορεί να αντιπροσωπεύουν ένα νέο πιθανό θεραπευτικό στόχο για PDAC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Η επιμόλυνση με την υπερέκφραση S100A6 ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση του επιπέδου S100A6 mRNA

*** ρ & lt.? 0.001

doi:. 10.1371 /journal.pone.0121319.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. β-κατενίνης χτυπήθηκε επιτυχώς σε κύτταρα PDAC.

(Α) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR αποκάλυψε μια σημαντική μείωση στο επίπεδο του mRNA β-κατενίνης σε β-κατενίνης shRNA κύτταρα Panc-1. (Β) Κηλίδωση Western αποκάλυψε μια σημαντική μείωση στην πρωτεΐνη β-κατενίνης στην β-κατενίνης ομάδα shRNA, σε σχέση με τον έλεγχο. (Γ) Το επίπεδο της πρωτεΐνης β-κατενίνης ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο ομάδων. ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001

doi:. 10.1371 /journal.pone.0121319.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ. β-κατενίνης έκφραση δεν ρυθμίζεται αυξητικά με S100A6 σε σταθερά κύτταρα β-κατενίνης knockdown.

(Α) Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα β-κατενίνης mRNA μεταξύ σταθερών κυττάρων β-κατενίνης knockdown υπερεκφράζουν S100A6 και σταθερή η β-κατενίνη knockdown κυττάρων που εκφράζουν το πλασμίδιο ελέγχου. (Β) Κηλίδωση Western αποκάλυψε παρόμοιες αλλαγές στην β-κατενίνης μεταξύ των δύο ομάδων. (Γ) Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των επιπέδων της πρωτεΐνης β-κατενίνης μεταξύ των δύο ομάδων.

Η αγγλική σε αυτό το έγγραφο έχει ελεγχθεί από τουλάχιστον δύο επαγγελματίες συντάκτες, δύο φυσικούς ομιλητές της αγγλικής γλώσσας. Για πιστοποιητικό, παρακαλούμε see:https://www.textcheck.com/certificate/GZTsUk

doi:10.1371/journal.pone.0121319.s003

(TIF)