Αφηρημένο

Ανθρώπινο γονίδιο μετάστασης που σχετίζονται με 1 (MTA1) είναι ιδιαίτερα συνδεδεμένες με τη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη? Ωστόσο, οι μοριακές λειτουργίες MTA1 που διευκολύνουν μετάσταση παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η αποσιώπηση του MTA1 με siRNA αποτελέσματα της θεραπείας στην προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης με την φωσφορυλίωση του ΑΚΤ (ρ-ΑΚΤ) και μειώνει την διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Δείχνουμε ότι MTA1 εκφράζεται σε πάνω από το 90% των ιστών καρκίνου του προστάτη, ιδιαίτερα μεταστατικό ιστό του καρκίνου του προστάτη, σε σύγκριση με μη έκφραση σε φυσιολογικό ιστό του προστάτη. RT-PCR ανάλυση και δοκιμασία κηλίδος Western έδειξε ότι η έκφραση MTA1 είναι σημαντικά υψηλότερη σε ιδιαίτερα μεταστατικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC-3M-1Ε8 (1Ε8) από ό, τι σε ανεπαρκώς κύτταρα μεταστατικού καρκίνου του προστάτη PC-3M-2Β4 (2Β4). Σίγαση της έκφρασης MTA1 με κατεργασία siRNA σε κύτταρα 1Ε8 αύξησε τα κυτταρικά κακοήθη χαρακτήρες, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής συγκολλητική ικανότητα, μείωσε την κυτταρική επεμβατική ικανότητα και άλλαξε την πολικότητα των κυτταρικών κυτταροσκελετού. κύτταρα 1Ε8 υπερεκφράζουν MTA1 είχε μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης, ενώ τα κύτταρα 1Ε8 σε επεξεργασία με siRNA MTA1 είχαν υψηλότερη έκφραση της Ε-καδερίνης. Η έκφραση του φωσφορυλιωμένου ΑΚΤ (ΑΚΤ-ρ) ή την αναστολή της ρ-ΑΚΤ με επεξεργασία βορτμαννίνη (100 ηΜ) μεταβάλλονται σημαντικά τη λειτουργία του MTA1 στη ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης. Μεταβολές στην έκφραση Ε-καδερίνης άλλαξε το ρόλο του ρ-ΑΚΤ στην κυτταρική κακοήθεις χαρακτήρες. Όλα αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι MTA1 παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη μέσω της οδού ρ-AKT /Ε-καδερίνης. Αυτή η μελέτη παρέχει επίσης μια νέα μηχανιστικό ρόλο για MTA1 στη ρύθμιση της μετάστασης του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Wang Η, Fan L, Wei J, Weng Υ, Zhou L, Shi Υ, et al. (2012) Akt Παρεμβαίνει Μετάσταση-Associated Gene 1 (MTA1) που ρυθμίζουν την έκφραση της E-cadherin και την προώθηση της εισβολής κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (12): e46888. doi: 10.1371 /journal.pone.0046888

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 30, 2012? Αποδεκτές: 6 Σεπ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5, Δεκεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30973184) (www.nsfc.gov.cn). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους και κακοήθεις είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις αμερικανικές άνδρες [1]. Η αποτυχία της θεραπείας παρουσιάζεται για τον καρκίνο του προστάτη συχνά οφείλονται σε λεμφαδένα και /ή μετάστασης μακρινό όργανο. Οι μοριακοί μηχανισμοί προστάτη μετάσταση και εισβολή καρκίνου δεν είναι καλά διευκρινιστεί. Αυξανόμενες ενδείξεις έδειξε ότι το ανθρώπινο γονίδιο μετάστασης που σχετίζονται με 1 (MTA1) είναι ένας βασικός παράγοντας στη μετάσταση όγκου [2]. Μια μελέτη που χρησιμοποίησε μια ορολογική ανάλυση της ανασυνδυασμένης βιβλιοθηκών έκφρασης cDNA (SEREX) βρήκαν ότι MTA1 ήταν προτίμηση εκφράζεται σε ένα πάνελ κακοήθεις ιστούς καρκινώματος του προστάτη σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να απαιτούνται MTA1 για μετάσταση καρκίνου του προστάτη [3] Μια άλλη μελέτη βρέθηκε ότι MTA1 επιλεκτικά υπερ-εκφράζεται σε μεταστατικό καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με κλινικά εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη και καλοήθη ιστό προστάτη [4]. Αυτές οι μελέτες έδειξαν ότι MTA1 μπορεί να παίξει ένα σημαντικό ρόλο στην μετάσταση του καρκίνου του προστάτη? Ωστόσο, ο ρόλος του μηχανιστική MTA1 στη διαδικασία της μετάστασης του καρκίνου του προστάτη είναι ακόμη πλήρως κατανοητό.

MTA1 ταυτοποιήθηκε αρχικά με διαφορική cDNA διαλογή χρησιμοποιώντας εξαιρετικά μεταστατικό καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές [5]. Το γονίδιο κωδικοποιεί μια MTA1 νέα πρωτεΐνη που περιέχει μια πλούσια σε προλίνη περιοχή (SH3 μοτίβο σύνδεσης), ένα υποθετικό μοτίβο δακτύλου ψευδαργύρου, ένα μοτίβο φερμουάρ λευκίνης και 5 αντίγραφα του μοτίβου SPXX δέσμευσης DNA [6]. Η πρωτεΐνη MTA1 έχει βρεθεί στο συγκρότημα νουκλεοσώματος αναδιαμόρφωσης αποακετυλάσης ιστόνης (NuRD), η οποία έχει αποδειχθεί να τροποποιήσουν ή να αναδιαμορφώνει χρωμοσώματα [7]. MTA1 αλληλεπιδρά φυσικά με αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC), η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην απακετυλίωση ιστόνης και την τροποποίηση του μεταγραφικού ελέγχου [8]. Ως ένα σημαντικό ρυθμιστή της κυτταρικής τύχης με έναν ρόλο στην ογκογένεση και την εξέλιξη πολλών κακοήθων όγκων, MTA1 έχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον [2].

(Α-Γ) Τυπικά αποτελέσματα για το πρότυπο χρώσης MTA1 προσδιορίζεται από την ανοσοϊστοχημεία φαίνονται στον φυσιολογικό ιστό του προστάτη (Α), εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη ιστό (Β), και μεταστατικό ιστό καρκίνου του προστάτη (C). Τα αποτελέσματα στο Β και Γ έδειξαν έκφραση MTA1 στις δύο πυρήνες και κυτταρόπλασμα. Η αρχική μεγέθυνση για το A-C είναι 200 ​​φορές και λεπτομερή με διευρυμένη άποψη είναι 400 φορές. (D) Μία ποσοτική RT-PCR ανάλυση των επιπέδων MTA1 RNA σε 2Β4 και 1Ε8 κύτταρα (κορυφή). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα 2Β4. (Ε) Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης MTA1 σε 2Β4 και 1Ε8 κύτταρα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα, και τα αποτελέσματα προσδιορίστηκαν ποσοτικά (επάνω). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα 2Β4. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Η

Για τα επιθηλιακά κύτταρα να εξελιχθούν σε καρκινικά κύτταρα, πρέπει να λάβει χώρα η μετάβαση επιθηλιακά μεσεγχυματικά (ΕΜΤ) [9]. Η ΕΜΤ οδηγεί επιθηλιακών κυτταρικών στιβάδων για να χάσουν πολικότητα και κυττάρου-κυττάρου επαφές και ενεργοποιεί την αναδιαμόρφωση της κυτταρικής κυτταροσκελετού [10], [11]. E-cadherin θεωρείται ως κύριος δείκτης για την εμφάνιση της EMT [12]. E-cadherin παίζει σημαντικούς ρόλους σε κακοήθη φαινότυπο, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής προσκόλλησης, κυτταρική διαφοροποίηση, και τη δομή των κυττάρων. Η αυξητική ρύθμιση της Ε-καδερίνης έχει εμπλακεί στην απενεργοποίηση του ΕΜΤ [13], [14]. Ως εκ τούτου, η Ε-καντερίνη έχει προταθεί να χρησιμεύσει ως ένα ισχυρό καταστολέας όγκων στην ανάπτυξη του καρκίνου [14], [15]. Απακετυλίωση ιστόνης ή /και η υπερμεθυλίωση των CpG νησίδες σε Ε-καδερίνης έχουν δειχθεί ότι είναι οι κύριοι μηχανισμοί για Ε-καδερίνης σίγηση σε όγκους [15], [16], [17]. MTA1 έχει δειχθεί ότι έχει ένα ρόλο στην απακετυλίωση ιστόνης, την αλλοίωση της δομής της χρωματίνης και μεταγραφικού ελέγχου [18], [19]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι MTA1 μπορεί ενδεχομένως ρυθμίζει Ε-καδερίνης. Επιπλέον, MTA1 έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν φαινοτύπους ΕΜΤ [20], [21]. Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι η έκφραση Ε-καδερίνης ρυθμίζεται αυξητικά σε μελάνωμα και καρκίνο του τραχήλου κύτταρα επεξεργασμένα με MTA1 siRNA [22]. Ωστόσο, αυτές οι μελέτες δεν επικεντρώνονται στο μηχανισμό που ρυθμίζει τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση Ε-cadherin από MTA1. Η φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /ΑΚΤ οδός πιστεύεται ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένης της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη [23], [24]. MTA1 έχει βρεθεί ότι ρυθμίζει την έκφραση ΑΚΤ [25]. Για να αλλάξετε το κακοήθη φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων, η οδός MTA1 /ΑΚΤ μπορεί να ενεργοποιεί τα γονίδια και ανταγωνίζονται τα γονίδια που καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και /ή των κυττάρων της μετάστασης. Πρόσφατα, η οδός ΡΙ3Κ /ΑΚΤ έχει δειχθεί ότι είναι ένας κεντρικός ρυθμιστής της ΕΜΤ [26], [27]. E-cadherin είναι επίσης ένας βασικός ρυθμιστής της ΕΜΤ και ένας αναστολέας της ανάπτυξης του καρκίνου που μπορεί να ρυθμίζεται από την οδό ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [28]. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι MTA1 αλλάζει τον κακοήθη φαινότυπο των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη και ρυθμίζει την έκφραση Ε-καδερίνης με εξαρτώμενο από φωσφορυλίωση μηχανισμός ΑΚΤ. Αυτή η προκλινική μελέτη παρέχει μια καλύτερη κατανόηση των ρόλων των MTA1 και αποτελεί τη βάση για την περαιτέρω κλινική μελέτη MTA1 ως γονίδιο-στόχο.

(Α) Η θεραπεία με MTA1 siRNA μειωμένη έκφραση MTA1 αποτελεσματικά και ενισχυμένη έκφραση Ε-καδερίνης . Τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western και ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη. Η ποσοτικοποίηση των εντάσεων ζώνης δείχνεται (επάνω). Ο αστερίσκος (*) ή διαμάντι (◊) δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) στα επίπεδα MTA1 ή Ε-καδερίνης, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο κύτταρα και τα αρνητικά-κύτταρα ελέγχου siRNA επιμολυσμένα, η = 3. (Β) το ποσοστό συγκολλητικό ποσοτικοποιήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ, και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται. Η ικανότητα των κυττάρων να προσκολλώνται σε μια στερεή επιφάνεια ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω στα κύτταρα που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με MTA1 siRNA. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο κύτταρα και αρνητικού ελέγχου κύτταρα siRNA επιμολυσμένα. (C, D, και Ε) Χρησιμοποιώντας ένα Matrigel

TM-επικαλυμμένο σύστημα Transwell, η επεμβατική ικανότητα των κυττάρων σε επεξεργασία MTA1 siRNA ελέγχθηκε. Η ποσοτικοποίηση του αριθμού των μεταστατικών κυττάρων από τον πυθμένα των ένθετων transwell δείχνεται στο κάτω πάνελ. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο κύτταρα και αρνητικού ελέγχου κύτταρα siRNA επιμολυσμένα. (F, G, και Η) Οι αλλαγές στη δομή κυτταροσκελετού ανιχνεύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία: Red χρώση αντιπροσωπεύει α-τουμπουλίνης. Μπλε χρώση αντιπροσωπεύει τους πυρήνες. Τα «πόδια» είχαν μειωθεί, και η πόλωση αποδυναμώθηκε σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με MTA1 siRNA. Αυτές οι αλλαγές δείχνουν μια μειωμένη ικανότητα να κινείται (400 φορές). Ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα για όλα τα δεδομένα.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και βαφές

Όλα τα αντιδραστήρια σε αυτή τη μελέτη ήταν αναλυτικού βαθμού και είναι εμπορικά διαθέσιμα. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη αγοράστηκαν από τις ακόλουθες εταιρείες: το αντίσωμα MTA1 ήταν από την Santa Cruz Biotech, Η.Π.Α.? το αντίσωμα Ε-καδερίνης ήταν από Epitomics Inc, USA? η α-τουμπουλίνης και β-ακτίνης αντισώματα ήταν από την Sigma, Γερμανία, και η ρ-ΑΚΤ (Ser473) αντίσωμα ήταν από τη Cell Signaling Technology, USA. Τα IgGs αλκαλική φωσφατάση συζευγμένη με αντι-κουνελιού, αντι-ποντικού ή αντι-κατσίκας επίσης αγοράστηκαν από την Sigma. Οι FITC- και Cy3-συζευγμένο IgGs αγοράσθηκαν από το εργαστήριο PTG, ΗΠΑ. ΫΑΡΙ (4, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη διυδροχλωρίδιο, (2 μg /ml μεθανόλης)) αγοράστηκε από Taufkirchen, Γερμανία. Η βορτμαννίνη αγοράστηκε επίσης από τη Sigma.

(Α) Western blotting αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με MTA1 siRNA αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης μετά από 48 ώρες. Ο αστερίσκος (*) ή διαμάντι (◊) δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) στα επίπεδα MTA1 ή Ε-καδερίνης, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα siRNA επιμολυσμένα αρνητικού μάρτυρα. (Β) Ένα ανάλυση κηλίδωσης Western κατέδειξε επίσης ότι παροδική επιμόλυνση με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιούσε πλήρους μήκους MTA1 μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης μετά από 48 ώρες. Ο αστερίσκος (*) ή διαμάντι (◊) δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) στα επίπεδα MTA1 ή Ε-καδερίνης, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα. Οι αλλαγές ποσοτικοποιήθηκαν (κορυφή). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Η

Δείγματα ιστών και κυτταρικών σειρών

Τα δείγματα ιστών φυσιολογικού προστάτη, εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη ελήφθησαν από το Τμήμα Παθολογίας της Tongji Νοσοκομείο, το οποίο συνδέεται με την Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας. Όλα τα μεταστατικού ιστών καρκίνου του προστάτη ελήφθησαν από ασθενείς που είχαν τεκμηριωμένη μεταστατική νόσο και υποβλήθηκε σε μια διουρηθρική εκτομή του προστάτη (TURP) να απαλλάξει ένα ουρική απόφραξη (απομακρυσμένη μετάσταση και θετικό σπινθηρογράφημα οστών, Μ1 σε όγκο κόμβο-μετάσταση TNM στάσης) . Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας στην έρευνα (REC) στο Tongji Νοσοκομείο της Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας, σύμφωνα με την αρχή του Ελσίνκι Δήλωση II. Όλες οι γραπτές ενημέρωσε τα έγγραφα συγκατάθεση από κάθε συμμετέχοντα ελήφθησαν κατά τη φάση της εγγραφής. Η κακώς μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα του προστάτη ανθρώπινη κυτταρική σειρά PC-3M-2Β4 (2Β4) και το εξαιρετικά μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου προστάτη PC-3M-1Ε8 κυτταρική γραμμή (1Ε8) αγοράστηκαν από τον καθηγητή Zhengjie (Πανεπιστήμιο του Πεκίνου, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco-BRL, Η.Π.Α.) με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (Si Jiqing, Hangzhou, Κίνα).

(Α) ανάλυση κηλίδωσης Western έδειξε ότι θεραπεία με MTA1 siRNA θα μπορούσε να αναστείλει την φωσφορυλίωση της ΑΚΤ μετά από μια θεραπεία siRNA 48 ώρες. Ο αστερίσκος (*) και με διαμάντια (◊) δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) στα επίπεδα MTA1 και Ε-καδερίνης, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα siRNA επιμολυσμένα αρνητικού μάρτυρα. (Β) Τα κύτταρα επωάστηκαν είτε με το ουορτμανίνη ρ-ΑΚΤ αναστολέα (100 ηΜ) ή DMSO για διάφορους χρόνους από 24 ώρες έως 48 ώρες, και οι κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν. Μία ανάλυση Western blotting έδειξε ότι wortmannin θεραπεία προώθησε την έκφραση της Ε-καδερίνης και ανέστειλε την έκφραση του MTA1 μετά από 24 ώρες. Ο αστερίσκος (*), διαμάντι (◊), ή τρίγωνο (Δ) δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) στην MTA1, Ε-καδερίνης ή ρ-ΑΚΤ επίπεδα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα DMSO-θεραπεία. (Γ) Η αναγκαστική υπερέκφραση του ρ-ΑΚΤ με παροδική διαμόλυνση του MYR-ΑΚΤ πλασμίδιο μείωσε την έκφραση της Ε-καδερίνης και αύξησε την έκφραση του MTA1 μετά από 24 ώρες. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών δείχνεται (επάνω). (D) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με MTA1 siRNA με την παρουσία ή απουσία του MYR-ΑΚΤ πλασμιδίου ή wortmannin για 48 ώρες. Μία ανάλυση Western blotting χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις αλλαγές στην έκφραση Ε-καδερίνης. Ο αστερίσκος (*), διαμάντι (◊), ή τρίγωνο (Δ) δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) στις MTA1, Ε-καδερίνης ή ρ-ΑΚΤ επίπεδα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα. Η ποσοτικοποίηση των εντάσεων ζωνών δείχνεται (επάνω). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Η

Ανοσοϊστοχημεία

Μια ανοσοϊστοχημική ανάλυση MTA1 διεξήχθη χρησιμοποιώντας την μέθοδο συμπλόκου αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης. Αποκηρωμένα και επανυδατώθηκαν τομές ιστού επωάσθηκαν επί μία νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου MTA1 σε αραίωση 1:100 και στη συνέχεια πλένονται με PBS. Βιοτινυλιωμένο κατσίκας αντι-κουνελιού ανοσοσφαιρίνη (ϋΑΚΟ, Kyoto, Japan) προστέθηκε στη συνέχεια στα τμήματα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά οι τομές πλύθηκαν με PBS, στη συνέχεια εφαρμόστηκε συζευγμένο με υπεροξειδάση αβιδίνη (ϋΑΚΟ). Η δράση υπεροξειδάσης ανιχνεύθηκε με έκθεση των τμημάτων σε ένα διάλυμα από 0,05% 3, 3-διαμινοβενζιδίνη και 0,01% Η

2O

2 σε ρυθμιστικό Tris-HCl (3, διάλυμα 3-διαμινοβενζιδίνη) για 3 έως 6 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές με αιματοξυλίνη.

(Α) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον MYR-ΑΚΤ πλασμιδίου ή κενό φορέα για 48 ώρες παρουσία ή απουσία Ε-καδερίνης siRNA. Η συγκολλητική ικανότητα ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ, και ένα τυπικό πειραματικά αποτελέσματα φαίνονται. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα. Ένα τρίγωνο (Δ) δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο MYR-ΑΚΤ κωδικοποιεί απουσία Ε-καδερίνης siRNA. (Β) Τα κύτταρα επωάστηκαν με wortmannin (100 ηΜ) ή DMSO για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς Ε-καδερίνης siRNA για 48 ώρες. Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ, η κολλητική ικανότητα των κυττάρων ελέγχθηκε. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με κύτταρα DMSO-θεραπεία. Ένα τρίγωνο (Δ) δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τις ουορτμανίνη-επεξεργασμένα κύτταρα σε απουσία Ε-καδερίνης siRNA. (C, D, και Ε) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον MYR-ΑΚΤ πλασμιδίου ή ένα άδειο φορέα για 48 ώρες παρουσία ή απουσία του πλασμιδίου Ε-καδερίνης. Ένα Matrigel

σύστημα transwell TM-επικαλυμμένο χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα επεμβατικές δυνατότητες των κυττάρων. Η ποσοτικοποίηση του αριθμού των μεταστατικών κυττάρων από τον πυθμένα των ένθετων transwell εμφανίζεται (δεξί πάνελ). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα. Ένα τρίγωνο (Δ) δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο myr-ΑΚΤ κωδικοποιεί απουσία Ε-καδερίνης siRNA. (F, G, και Η) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον MYR-ΑΚΤ πλασμιδίου ή ένα άδειο φορέα για 48 ώρες παρουσία ή απουσία του πλασμιδίου Ε-καδερίνης. Οι αλλαγές στην κυτταρική κυτταροσκελετού παρακολουθήθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Red χρώση αντιπροσωπεύει α-τουμπουλίνης, και μπλε χρώση αντιπροσωπεύει τους πυρήνες (400 φορές). (Ι, J, και Κ) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με wortmannin (100 ηΜ) ή DMSO για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς Ε-καδερίνης siRNA για 48 ώρες. Μια Matrigel

σύστημα φρεατίων TM-επικάλυψη χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των αλλαγών στην κυτταρική επεμβατική ικανότητα. Η ποσοτικοποίηση του αριθμού των μεταστατικών κυττάρων από τον πυθμένα του ενθέτου transwell εμφανίζεται (δεξί πάνελ). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα DMSO-θεραπεία. Ένα τρίγωνο (Δ) δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τις ουορτμανίνη-επεξεργασμένα κύτταρα σε απουσία Ε-καδερίνης siRNA. (L, M, και Ν) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με wortmannin (100 ηΜ) ή DMSO για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς Ε-καδερίνης siRNA για 48 ώρες. Οι αλλαγές στην κυτταρική κυτταροσκελετού παρακολουθήθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Red χρώση αντιπροσωπεύει α-τουμπουλίνης, και μπλε χρώση αντιπροσωπεύει τους πυρήνες (400 φορές). Ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα από τρία πειράματα δείχνεται για όλα τα δεδομένα.

Η

RT-PCR και ανοσοστύπωμα

Για την ανάλυση RT-PCR, απομονώθηκε το ολικό RNA από τις κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας το ΤπζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), και το cDNA συνετέθη με την M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Promega, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ενισχύσεως PCR (Biometra, USA). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Oligo 6 το λογισμικό, που προσδιορίζονται από το Basic Local Alignment Tool Αναζήτηση (BLAST? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) και αγοράστηκε από την Invitrogen. Οι αλληλουχίες των εκκινητών MTA1 ήταν ως εξής: Εμπρός: 5′-CTCTGCGCATCTTGTTGGACATA -3 ‘και αντίστροφη: 5′-TCAGCTTCGTCGTGTGCAGATAG -3’. Για ένα εσωτερικό πρότυπο, οι ακολουθίες εκκινητή β-ακτίνης ήταν ως εξής: Εμπρός: 5′-GCACCACACCTTCTACAATG -3 ‘και αντίστροφη: 5′-TGCTTGCTGATCCACATC TG-3’.

Για τις αναλύσεις κηλίδας Western, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris /HCl, ρΗ 7,2, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.1% SDS, και 0.5% (w /v) δεοξυχολικό νάτριο). Ισοδύναμες ποσότητες των κυτταρικών εκχυλισμάτων (150 μg) διαχωρίστηκαν σε ένα 10% νάτριο δωδεκυλ θειικό γέλη πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 25 mM Tris (ρΗ 8.0) που περιέχει 125 mM NaCl, 0,1% Tween 20, και 5% άπαχο γάλα για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα αραιωμένα (MTA1: 1:200, Ε-καδερίνης και ρ -Akt: 1:2000 και β-ακτίνης: 1:1000) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την επώαση με τα πρωτογενή αντισώματα, τα δευτερογενή αντισώματα προστέθηκαν σε μια αραίωση 1:1000. Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με αλκαλική φωσφατάση και κηλίδωση ΒΟΙΡ /ΝΒΤ.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, ολικό RNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές σειρές σε αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen , Cergy Pontoise, France). σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ σύνθεσης cDNA (Amersham Bioscience, NJ). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA) με τη χρήση ενός QuantiTect SYBR Green κιτ (Qiagen, CA). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer Express 3.0 λογισμικό, που προσδιορίζονται από Basic Local Alignment Search Εργαλείο (BLAST) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) και αγοράστηκε από την Invitrogen. Κάθε δείγμα εις τριπλούν. Προϋποθέσεις για την ποσοτική αντίδραση PCR ήταν ως ακολούθως, ένας κύκλος 50 ° C για 15 λεπτά, ένας κύκλος των 94 ° C για 2 λεπτά, 40 κύκλοι των 94 ° C για 15 s, 56 ° C για 20 s, και 70 ° C για 20 s. Στο τέλος της αντίδρασης PCR, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε μία ανάλυση τήξης για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του αμπλικονίου. Οι ακολουθίες MTA1 έναυσμα ήταν: Εμπρός: 5′-GCAGCTGAAGCTGAGAGCAAGTTA-3 ‘? Αντίστροφη: 5’-CCTTGACGTTGTTGACGCTGA -3 ‘. Οι αλληλουχίες των εκκινητών E-cadherin ήταν: Εμπρός: 5’-TACACTGCCCAGGAGCCAGA -3 ‘? Αντίστροφη: 5 ‘TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3′? Για εσωτερικό πρότυπο, οι ακολουθίες GAPDH έναυσμα ήταν: Εμπρός: 5’-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3 ‘? Αντίστροφα:. 5’- ACCCTGTTGCTGTAGCCA -3 ‘

διαμόλυνσης κυττάρων

Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε πλάκες ή φιάλες 6 φρεατίων ιστοκαλλιέργειας στους 37 ° C με 5% CO2 σε υγροποιημένο επωαστή (Heraeus, Γερμανία). Για την επιμόλυνση siRNA, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 200 pmol /ml του siRNA duplex χρησιμοποιώντας 5 μΙ Lipofectamine

TM 2000 (Invitrogen) όταν τα κύτταρα ήταν 20% συρρέοντα σύμφωνα πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι έλεγχοι περιελάμβαναν μη επιμολυσμένα κύτταρα και τα κύτταρα που είχαν επιμολυνθεί με ένα περιπλεγμένο αρνητικό έλεγχο siRNA (Ruibo, Κίνα). Για το πλασμίδιο επιμόλυνση, 4 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα πλακίδιο 6 φρεάτων και επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας 4 μα πλασμιδίου και 10 μΐ Lipofectamine

TM 2000 ανά φρεάτιο. Το πλασμίδιο MTA1 πλήρους μήκους (pEGFP-C1 /MTA1) παρασχέθηκε ευγενώς από τον καθηγητή μου Mahoney (Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον), και το κενό φορέα (pEGFP-C1) διατηρήθηκε από το εργαστήριο μας. Η PCMV-αθλητισμό6 πλασμίδιο Ε-καδερίνης αγοράστηκε από YRBIO (Κίνα), και το γονίδιο Ε-καδερίνης υποκλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pcDNA από εργαστήριο μας. Το pcDNA MYR-HA-ΑΚΤ2 (MYR-ΑΚΤ) πλασμίδιο αγοράστηκε από Addgene (https://www.addgene.org/? Addgene πλασμίδιο 9016), και ο κενός φορέας pcDNA επίσης διατηρείται στο εργαστήριο μας. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και τα επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν με κηλίδωση Western. Οι αλληλουχίες siRNA MTA1 ήταν ως εξής: Εμπρός: 5 ‘CCCUGUCAGUCUGCUAUAA dTdT 3’ και Αντίστροφη: 3 ‘DTDTGGGACAGUCAGACGAUAUU 5’. Οι αλληλουχίες siRNA E-cadherin είχαν ως εξής: Εμπρός: 5’CAGACAAAGACCAGGACUA dTdT 3 ‘και Αντίστροφη: 3’ dTdT GUCUGUUUCUGGUCCUGAU 5 ‘

Η εισβολή δοκιμασία

Για την ανίχνευση εισβολής, 5 ×. 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 100 μΙ RPMI 1640 στην κορυφή του τερεφθαλικού πολυαιθυλενίου (ΡΕΤ) μεμβράνες επικαλυμμένες με Matrigel

ΤΜ (1.5 mg /ml, BD Biosciences) εντός παρεμβλημάτων Transwell κυτταρικής καλλιέργειας (ένθετα 24 φρεατίων , 8 μm μέγεθος πόρων? Corning Επιστήμες της ζωής, Corning, ΝΥ). Το κάτω μέρος του θαλάμου γέμισε με 600 μΐ RPMI 1640 που περιέχει 20% FBS και το υπερκείμενο από κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 (ποντικού εμβρυϊκών ινοβλαστών κυτταρική γραμμή) για να δράσει ως χημειοτακτικός παράγοντας (CF). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C με 5% CO

2. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 2.5% (ν /ν) γλουταραλδεΰδη και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες. Τα επεμβατική κύτταρα στον πυθμένα γέλη οπτικοποιήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο (Leica, Germany) και ποσοτικοποιείται με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων σε τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία σε 100-πλάσια μεγέθυνση.

Η δοκιμασία προσκόλλησης στερεάς φάσης

Η δοκιμασία προσκόλλησης διεξήχθη χρησιμοποιώντας το με βάση τετραζόλιο χρωματομετρικό προσδιορισμό (ΜΤΤ). Ίσοι αριθμοί κυττάρων (4 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων που είχαν προεπικαλυμμένα με 1 μg /ml ινονεκτίνης (FN) (Sigma, Germany). Ως σύγκριση, ένας ίσος αριθμός κυττάρων επίσης σπάρθηκαν σε πλάκες επικαλυμμένες με αλβουμίνη βόειου ορού (1% w /v). Μετά από 1 ώρα, οι πλάκες εμβαπτίζονται σε PBS που περιέχει 1 mM ΜαΟΙ

2 να απομακρυνθούν τα μη προσκολλημένα κύτταρα. Στη συνέχεια, ο αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων μετρήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ και αναγνώστηκε στα 490 nm. Οι τιμές OD αντανακλούσε την αναλογία των κυττάρων τα οποία προσκολλώνται στην FN επικαλυμμένα πλάκα 96 φρεατίων. Το ποσοστό πρόσφυσης υπολογίστηκε με την ακόλουθη εξίσωση: την τιμή της OD του πειράματος /αξίας της απορροφητικότητας του ελέγχου χ 100%

συνεστιακή μικροσκοπία απεικόνισης

Για χρώση ανοσοφθορισμού. , 1 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε γυάλινες καλυπτρίδες (διαμέτρου 13 mm). Αφού τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS, οι κυτταρικές μεμβράνες διαπερατά με 0,2% (ν /ν) Triton Χ-100 σε PBS, και μη ειδικές θέσεις σύνδεσης αποκλείστηκαν με 5% BSA (β /ο) σε PBS. Το πρώτο αντίσωμα εφαρμόστηκε στα πλακίδια στους 4 ° C όλη τη νύκτα (α-τουμπουλίνης: 1:50, MTA1: 1:20, και Ε-καδερίνη: 1:100). Μετά την επώαση με το πρώτο αντίσωμα, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS και επωάστηκαν με FITC- ή Cy3-συζευγμένο IgG σε αραίωση 1:50 σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πυρήνες βάφτηκαν για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με DAPI. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus, Ιαπωνία).

συνανοσοκαθίζησης (Co-IP)

κύτταρα 1Ε8 μεγάλωσε σε cm πιάτα 10 στη συνέχεια συλλέχθηκαν σε μη -denaturing ρυθμιστικού λύσης (20 mM Tris ,, ρΗ 8, 135 mM NaCl, 10% γλυκερόλη, 1% Nonidet Ρ-40 (ΝΡ-40), 2 mM EDTA, Roche πλήρης μίνι αναστολείς πρωτεάσης κοκτέιλ. Όλες οι ακόλουθες διαδικασίες ήταν εκτελούνται στον πάγο. Lysis buffer-διαλυτά προϊόντα λύσης, συλλέγονται μετά από εξαγωγή για 4 ώρες και φυγοκέντρηση στις 12.000 rpm 20 λεπτά στους 4 ° C. σε ένα λύμα σωλήνα 1mg κύτταρο προστέθηκε με αντίσωμα MTA1 40 μΐ, και επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C . την επόμενη μέρα, κυτταρικό λύμα που περιέχει αντίσωμα εφαρμόστηκαν σε πρωτεΐνη G-συζευγμένο σφαιρίδια sepharose (Abcam) για 4 ώρες στους 4 ° C. τα σφαιρίδια πλύθηκαν 3 φορές σε ρυθμιστικό λύσης. Τέλος, το υπερκείμενο προστέθηκαν σε 25 μΙ 2 χ ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης . κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε μετά τον διαχωρισμό της πρωτεΐνης και τα σφαιρίδια με βράσιμο.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με ANOVA. Η στατιστική ανάλυση δημιουργήθηκε πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SPSS έκδοση 13.0 του λογισμικού.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της MTA1 στον προστάτη καρκίνωμα

Για να επιβεβαιωθεί η έκφραση της MTA1 στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη, η ανοσοϊστοχημική χρώση ανάλυση για MTA1 διεξήχθη σε φυσιολογικό προστάτη, εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη και τα δείγματα μεταστατικό καρκίνο του προστάτη ιστών (τους πόρους και τα κριτήρια για τις ονομασίες των ιστών περιγράφονται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι). Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι σε φυσιολογικά δείγματα προστάτη, η έκφραση MTA1 ήταν μόλις ανιχνεύσιμη (Σχήμα 1Α). Ωστόσο, στις εντοπισμένο δείγματα καρκίνου του προστάτη, θετική χρώση για MTA1 παρατηρήθηκε στους πυρήνες των 6 από τα 15 ιστούς που εξετάστηκαν (Σχήμα 1Β). Επιπλέον, σε 27 από τα 30 καρκινικών ιστών μεταστατικό καρκίνο του προστάτη, παρατηρήθηκε ένα υψηλό επίπεδο χρώσης MTA1 τόσο στο κυτταρόπλασμα και πυρήνες των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 1C). Μια ποσοτική ανάλυση για την θετική χρώση MTA1 στο Σχήμα 1Α-C φαίνεται στην Εικόνα S1. Ένα RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθησαν για να μετρηθεί η έκφραση του MTA1 RNA και πρωτεΐνης τα επίπεδα, αντίστοιχα, σε PC-3M-1Ε8 (1Ε8) και PC-3M-2Β4 (2Β4) κύτταρα [29], [30]. Τα αποτελέσματα από αυτές τις αναλύσεις δείχνονται στο Σχήμα 1D και Ε, οι οποίες αποδεικνύουν ότι τα επίπεδα MTA1 RNA και πρωτεΐνη ήταν παρούσα σε δύο κυτταρικές σειρές αλλά σε διαφορετικά επίπεδα έκφρασης. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της MTA1 ήταν 0,38 ± 0,01 και 0,83 ± 0,02 για τις 2Β4 και 1Ε8 κύτταρα, αντίστοιχα, και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης στο 2Β4 και τα κύτταρα 1Ε8 ήταν 0,58 ± 0,04 και 0,83 ± 0,02, αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05, η = 3 για το καθένα). Βρήκαμε ότι τα κύτταρα 1Ε8 εξέφρασαν περίπου δύο φορές υψηλότερα επίπεδα από MTA1 RNA και 1,5 φορές υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης MTA1 σε σύγκριση με τα κύτταρα 2Β4. Ως εκ τούτου, η κυτταρική γραμμή 1Ε8 επιλέχθηκε για να ερευνήσει τις βιολογικές ιδιότητες του MTA1 σε καρκίνωμα του προστάτη in vitro.

Η επίδραση της αποσιώπησης MTA1 στην κακοήθη φαινότυπο των κυττάρων 1Ε8

Χρησιμοποιήσαμε siRNA προς τα κάτω -regulate την έκφραση MTA1 στα κύτταρα 1Ε8. Τρία ζευγάρια των siRNAs κατά MTA1 σχεδιάστηκαν. Επαληθεύσαμε την αποτελεσματικότητα του siRNA με κηλίδωση Western (Σχήμα S2). Τουλάχιστον 60% knockdown του επιπέδου της πρωτεΐνης ΜΤΑ 1 ελήφθη με τη χρήση του siRNA-3 #, έτσι επιλέξαμε αυτό το ζεύγος για περαιτέρω μελέτη μας (Εικόνα 2Α). Μπορούμε επίσης υπερεκφράζονται MTA1 στο φόντο του MTA1 siRNA, η οποία επιβεβαίωσε την επίδραση που ασκήθηκε από siRNA-3 # σε κύτταρα (Σχήμα S3). Τα κύτταρα siRNA επιμολυσμένα αναλύθηκαν επίσης για την έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης. Μια ανάλυση κηλίδος Western έδειξε το επίπεδο έκφρασης της Ε-καδερίνης ήταν υψηλότερη στα κύτταρα siRNA κατεργασμένα MTA1 (48 ώρες μετά την επιμόλυνση), η οποία έδειξε ότι MTA1 μπορεί να παίζει ρόλο στην αρνητική ρύθμιση της Ε-καδερίνης. Στη συνέχεια, αναλύσαμε την ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων 1Ε8 siRNA επεξεργασμένα MTA1 χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία στερεάς φάσης σε συνδυασμό με τη δοκιμασία ΜΤΤ (βλέπε την ενότητα υλικά και μέθοδοι). Για τον ίδιο επιφάνεια επικαλυμμένα συγκέντρωση του FN, η ικανότητα προσκόλλησης των MTA1 siRNA-επεξεργασμένα κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερο από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. Οι συγκολλητικές τιμές για τον μη επεξεργασμένο, αρνητικός έλεγχος siRNA επεξεργασμένα και MTA1 κύτταρα siRNA αγωγή ήταν 40,07 ± 6,23, 50,22 ± 4,99 και 99,62 ± 9,62, αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05, η = 3, Σχήμα 2Β). Μελετήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της MTA1 στην εισβολής των κυττάρων 1Ε8 χρησιμοποιώντας ένα Matrigel

TM-επικάλυψη μοντέλο φρεατίων. Οι ποσότητες των κυττάρων στον πυθμένα της μεμβράνης, η οποία αντικατοπτρίζεται η διεισδυτικότητα των κυττάρων ήταν 597 ± 6.24, 590 ± 5,77 και 201 ± 2.40 για τον μη επεξεργασμένο, αρνητικός έλεγχος siRNA επεξεργασμένα και MTA1 κύτταρα siRNA-αγωγή, αντιστοίχως (ρ & lt? 0.05, η = 3 Σχήμα 2C-Ε). Μεταβολές της κυτταρικής οργάνωσης κυτταροσκελετού και την πολικότητα που εμπλέκονται επίσης σε κύτταρο όγκου μετάσταση [31] Ως εκ τούτου, εξετάσαμε τις δομές του κυτταροσκελετού των κυττάρων siRNA επεξεργασμένα MTA1 με συνεστιακή μικροσκοπία και διαπίστωσε ότι τα «πόδια» των κυττάρων siRNA κατεργασμένα MTA1 ήταν συντομευθεί και ότι η κυτταρική πολικότητα εξασθένησε σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 2F-H MTA1: κόκκινο? πυρήνες: μπλε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν περαιτέρω ότι MTA1 μπορεί να ενέχεται στις κακοήθεις φαινοτύπους των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων πρόσφυση, διεισδυτικότητα, κυτταροσκελετική δομή και την κυτταρική πολικότητα.

MTA1 ρυθμίζει την έκφραση Ε-καδερίνης

Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος του MTA1 στη ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης, εμείς κατεργασμένα κύτταρα 1Ε8 με MTA1 siRNA και ένα πλασμίδιο με πλήρες μήκος MTA1 για διάφορους χρόνους από 24 έως 48 ώρες (μεταφραστικό επίπεδο).