Abstract

Autophagy περιγράφεται ότι εμπλέκεται στην ομοιοστασία, την ανάπτυξη και την ασθένεια, τόσο ως επιβίωση και μια διαδικασία θανάτου. τη συμμετοχή της σε κυτταρικό θάνατο προχωρά από τις αλληλεπιδράσεις με το αποπτωτικό μονοπάτι. Εστιάσαμε στην αυτοφαγία επιβίωση και διερευνάται interplays του με τον αποπτωτικό μηχανήματα. Βρήκαμε ότι ενώ Mcl-1 παρέμεινε αναποτελεσματική, Bcl-2 και Bcl-xL ήταν απαραίτητα για πεινασμένα κύτταρα να εμφανίζουν ένα πλήρως λειτουργικό αυτοφαγικά μονοπάτι όπως φαίνεται από τη δραστηριότητα πρωτεόλυση και ανίχνευση αυτοφαγικά κυστιδίων. Τέτοια προ-αυτοφαγικά λειτουργίες του Bcl-2 και Bcl-xL ήταν ανεξάρτητες του Βαχ. Ωστόσο, αυτά φαίνεται να λειτουργούν μέσω μη απολυμένους μηχανισμών όπως Bcl-xL χειριζόταν ένα αυστηρότερο έλεγχο από Bcl-2 πάνω από τη ρύθμιση των αυτοφαγία: σε αντίθεση με Bcl-2, Bcl-xL και τις πράξεις χειραγώγησης ATG7 απέδωσε ταυτόσημες φαινοτύπων που υποδηλώνει ότι θα μπορούσαν να είναι τα συστατικά του ίδιου σηματοδότησης μονοπάτι; Bcl-xL υποκυτταρικό εντοπισμό τροποποιήθηκε μετά την πείνα, και το σημαντικότερο Bcl-xL ενεργήσει ανεξάρτητα από Beclin 1. Ακόμα μία ανέπαφη περιοχή ΒΗ3-δέσμευσης που απαιτείται για την Βοΐ-χ για την τόνωση ένα πλήρως λειτουργικό αυτοφαγικά οδού. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι, εκτός από την καθιερωμένη λειτουργία αντι-θανάτου τους κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, Bcl-2 και Bcl-xL έχουν ευρύτερο ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων. Πρέπει Bcl-2 και Bcl-xL σταθεί στο σταυροδρόμι μεταξύ της προ-επιβίωσης και αυτοφαγία pro-θάνατος, η μελέτη αυτή εισάγει την νέα έννοια ότι η ρύθμιση της αυτοφαγία από Bcl-2 και Bcl-XL είναι προσαρμόζεται ανάλογα με την επιβίωσή του ή την αποτέλεσμα το θάνατο

Παράθεση:. Priault Μ, Hue E, F Marhuenda, Pilet P, Oliver L, Vallette FM (2010) Διαφορικές Εξάρτηση από Beclin 1 για τον κανονισμό της Pro-επιβίωση Autophagy από Bcl-2 και Bcl -Χι σε κύτταρα HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 5 (1): e8755. doi: 10.1371 /journal.pone.0008755

Επιμέλεια: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), η Βραζιλία

Ελήφθη: 15 Σεπτεμβρίου του 2009? Αποδεκτές: 15 Δεκεμβρίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιαν 2010

Copyright: © 2010 Priault et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), το Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université de Nantes, Université de Bordeaux, το Conseil Περιφερειακής d’Aquitaine (στο UMR 5095), και η Agence Nationale pour la Recherche (έργο ΜΑΒΑ να FV). Σ.Τ. υποστηρίχθηκε από μια μετα-διδακτορική υποτροφία από το INSERM. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Macro-αυτοφαγία (εφεξής αυτοφαγία) είναι μια καταβολική διαδικασία ενορχηστρωμένη από τα εξελικτικά συντηρημένη

ATG

γονίδια (για την αυτοφαγία) [1], [2], και συνίσταται στην τυχαία παγίδευση των μακρομορίων από νεοσύστατου διπλά ή πολλαπλά κυστίδια δεσμεύεται μεμβράνη που ονομάζεται αυτοφαγοσώματα. Λόγω του μεγέθους τους (συνήθως μεταξύ 500-1500 nm σε κύτταρα θηλαστικών) [3], [4], μπορεί να περικλείει αυτοφαγοσώματα διαλυτό υλικό καθώς επίσης και ολόκληρο οργανίδια. Υποβάθμιση του φορτίου επιτυγχάνεται μετά τη γενέσει αυτοφαγικά κενοτόπια έχουν λιωμένο με λυσοσώματα [5]. Τα προκύπτοντα προϊόντα είναι τότε διαθέσιμες για ανακύκλωση σε βιοσυνθετικά μονοπάτια? έτσι αυτοφαγία είναι μία από τις κύριες οδούς λυσοσωμικών για βιολογικό κύκλο εργασιών υλικό.

Autophagy χαρακτηρίστηκε αρχικά ως ένας μηχανισμός επιβίωσης δεδομένου ότι επιτρέπει στα κύτταρα να ξεπεραστούν αυστηρές συνθήκες επεκτείνοντας έτσι τη διάρκεια ζωής. Κατά την πείνα, μεταλλάξεις στο

ATG

γονίδια οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο στη ζύμη, χλώρωση στα φυτά, και μειωμένη διάρκεια ζωής των ενηλίκων στο

daf-2

elegans Caenorhabditis μεταλλαγμένα [1]. Στα θηλαστικά, αυτοφαγία υπάρχει σε ένα βασικό επίπεδο και ελέγχει ομοιοστατική λειτουργίες. Η διέγερση της αυτοφαγία ήταν γνωστό από καιρό ως απάντηση στην πείνα ή ορμονική διέγερση [6]? Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν επεκτείνει την κυτταροπροστατευτική ρόλος του αυτοφαγία με τη συντήρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας, αποδεικνύοντας ότι

ATG

γονίδια είναι απαραίτητα για την επιβίωση σε διαφορετικές ρυθμίσεις στα θηλαστικά [7] – [10]. Παρεμπιπτόντως σε αυτά τα έργα, αυτοφαγία ήταν κομψά φαίνεται να είναι κρίσιμη για την Βιοενέργεια συντήρηση και τη βιωσιμότητα των κυττάρων in vitro, αλλά και να παίξουν σημαντικό ρόλο στην ζωή στην επιβίωση ολόκληρου του οργανισμού.

Εκτός από αυτό το φυσιολογικό ρόλο στον ιστό ομοιόσταση, αυτοφαγία είναι επίσης παραδόξως σχετίζεται με κυτταρικό θάνατο. Η έννοια αυτή προέκυψε από τη διαπίστωση ότι η αυτοφαγία είναι κοινώς δει σε κύτταρα πεθαίνουν όταν μαζική εξάλειψη απαιτείται όργανα [11]. Η ύπαρξη «αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου» και όχι «κυτταρικό θάνατο με αυτοφαγία» [12] ήταν μεγάλη αμφισβήτηση επειδή αυτοφαγία και την απόπτωση συχνά ενεργοποιούνται μαζί σε απάντηση στο στρες [13] – [15], αν και εμφανίζει διακριτές μορφολογίες [16]. Άμεση απόδειξη ένα

ATG

εξαρτώμενη κυτταρικό θάνατο ασκήθηκε τόσο από την απώλεια των μελετών λειτουργία δείχνουν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των

ATG7

ή

ATG5

θα μπορούσε να καταστείλει τον κυτταρικό θάνατο σε απόπτωση με ανεπάρκεια κυττάρων [17], [18], καθώς και από υπερ-έκφραση πειράματα που δείχνουν ότι η έκτοπη έκφραση των μεταλλαγμένων του

ATG6

/Beclin 1 θα μπορούσε να προκαλέσει διέγερση αυτοφαγία η οποία οδήγησε σε

ATG5

εξαρτώμενη κυτταρικό θάνατο [19]. Έτσι, αυτοφαγία μπορεί να προβλεφθεί ως εναλλακτικό πρόγραμμα θάνατο, τουλάχιστον σε κύτταρα με μειωμένη μηχανήματα απόπτωση. Ωστόσο, αν αυτοφαγικά θάνατος έχει πλέον αναγνωρισθεί, η αιτιώδης εκδήλωση για την έναρξη του εξακολουθεί να είναι άγνωστη, όπως (i) καμία οριστική απόδειξη της αυτοφαγία ως η κύρια εμπνευστής του θανάτου έχει αναφερθεί, και (ii) αποδεικτικά στοιχεία που εξακολουθεί να λείπει από ένα ερέθισμα που θα λοξή αυτοφαγία προ-επιβίωσης σε μια θανάσιμη πρόγραμμα.

Πιο πρόσφατα, το πεδίο ενδιαφέροντος για αυτοφαγικά θάνατο των κυττάρων έχει διευρυνθεί λόγω της διαπίστωσης ότι η αυτοφαγία απορρύθμιση εμπλέκεται στον καρκίνο, και επειδή το μοριακό interplays έχουν τεκμηριώσει μια λογομαχία μεταξύ απόπτωση και αυτοφαγία [20]. Ως εκ τούτου, η μοίρα των κυττάρων είναι αναμφίβολα αποκλείεται από τη συντονισμένη ρύθμιση της απόπτωσης και αυτοφαγία, αλλά το πότε και πώς είναι ακόμα αναπάντητα ερωτήματα [21], [22]. Ένα αποφασιστικό εγχείρημα ως προς το τελευταίο αυτό σημείο ήταν το εύρημα ότι το κλειδί ρυθμιστής του autophagy Beclin 1 φιλοξενεί ένα περιοχή ΒΗ3 [23] η οποία συνδέεται με τους τομείς ΒΗ1-ΒΗ2 των αντι-αποπτωτικών Bcl-2 [19] ή Bcl-xL [24 ]. Διαδοχικά, σε βάθος αναλύσεις του κανονισμού της αυτοφαγία από Bcl-2 και Bcl-xL έγιναν και αποκάλυψε ότι η σύνδεση τους με Beclin 1 είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της αυτοφαγία. Αυτή η σύνδεση είχε προτείνει αρχικά να εκτρέψουν Beclin 1 από την αλληλεπίδραση με και την τόνωση ΙΙΙ φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-3-κινάσης Vps34 [19] τάξης, αλλά μια συναίνεση υποστηρίζει τώρα ενάντια σε αμοιβαία αποκλειόμενα αλληλεπιδράσεις των Beclin 1 με Bcl-2 και Vps34 [24] – [26], υπογραμμίζοντας ότι αυτοφαγικά δραστηριότητα δεν καθοδηγείται αποκλειστικά από Beclin 1 συσχέτιση με Bcl-2 /Bcl-xL. Κατά συνέπεια, Zeng et al. ανέφεραν ρυθμίσεις όπου Beclin 1 δεν δεσμεύει Bcl-xL ούτε Bcl-2 [27], δείχνοντας ότι αυτές οι αλληλεπιδράσεις δεν είναι υποχρεωτικά. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η λειτουργική συνάφεια του Bcl-2 /Beclin 1 ή Bcl-xL /Beclin 1 αλληλεπιδράσεις δεν είναι πλήρως κατανοητή ακόμη. Ακόμη περισσότερο, η άποψη του Bcl-2 ως ένα αντι-αυτοφαγικά πρωτεΐνη [28] – [30] αμφισβητήθηκε από την ανακάλυψη ότι η υπερέκφραση του Bcl-2 σε απόπτωση με ανεπάρκεια κύτταρα θα μπορούσαν αντί να ενισχύσει autophagy [18]

για να διερευνήσει περαιτέρω το θέμα, αποφασίσαμε να διερευνήσει τις λειτουργίες αυτοφαγικά των μελών της οικογένειας Bcl-2 υπό συνθήκες όπου η διέγερση αυτοφαγία χρησιμεύει ως μια διαδικασία επιβίωσης: παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε με το θάνατο-προώθηση αυτοφαγία, βρήκαμε ότι η αυτοφαγία επιβίωσης είναι ειδικά εμπλακεί με αντι-αποπτωτική λειτουργίες του Bcl-2 και Bcl-xL? Ωστόσο έχει ενδιαφέρον, και οι δύο βρέθηκαν να τονώσει αυτοφαγία και επέδειξαν διαφορετικές εξάρτηση από τις Beclin 1 για να παίξει τέτοια καθήκοντα προ-επιβίωσης.

Αποτελέσματα

Ο λιμός-Induced Autophagy είναι μια διαδικασία επιβίωσης σε HCT116 κύτταρα

Η διαμάχη ως προς την προ-επιβίωσης [7], [10] ή προ-θανάτου [17] – [19] έκβαση της χειραγώγησης της αυτοφαγία υπό θρεπτικών περιοριστικές συνθήκες έχει τροφοδοτήθηκε από την αντιμετώπιση αρκετών μελετών . Γι ‘αυτό καθορίζεται για πρώτη φορά να αντιμετωπίσει τη μοίρα του πεινασμένο κυττάρων στις ρυθμίσεις μας: ορθοκολικού κύτταρα HCT116 επελέγησαν ως εμφανίστηκαν, μεταξύ των όλες τις κυτταρικές σειρές που έχουμε δοκιμάσει, να παρουσιάζουν την ισχυρότερη απόκριση αυτοφαγικά όταν έρχονται αντιμέτωποι με τον περιορισμό των θρεπτικών συστατικών (αδημοσίευτα στοιχεία μας ). Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε μέσο στέρησης και ακολούθησε μικροσκοπία βίντεο σε διάστημα 48 ωρών. Μορφομετρικές αναλύσεις (Εικ. 1Α) αποκάλυψε ότι HCT116 μητρικά κύτταρα εμφανίζονται ως επί το πλείστον αποπτωτικά χαρακτηριστικά (-55%), όπως επιβεβαιώνεται από κασπάσης 3 ενεργοποίηση (Εικ. 1Β), ενώ περίπου 30% υποβλήθηκε σε μια προεπιλεγμένη θάνατο που προκύπτει από μια ταχεία οσμωτική διάλυση (εντός 20 έως 30 λεπτά μετά την αποσύνδεση από την πλάκα), και λιγότερο από 5% παρέμειναν ζωντανοί. HCT116-BaxKO υποκλώνος αναλύθηκε επίσης για να προσδιοριστεί το αποτέλεσμα της λιμοκτονίας σε ελλειμματικά κύτταρα απόπτωση: όπως αναμενόταν μορφομετρική ανάλυση (Εικ. 1Α) και στύπωμα Western (Εικ. 1Β) απέτυχε να ανιχνεύσει οποιαδήποτε αποπτωτική λειτουργία, και παρατηρήσαμε ότι το κλάσμα των κυττάρων που υποβάλλονται την οσμωτική διάλυση παρέμεινε αμετάβλητο (~ 30%). Είναι ενδιαφέρον ότι, μια άλλη φαινότυπο κυριάρχησε ως περισσότερο από το 50% των κυττάρων HCT116-BaxKO αποκολληθεί από την πλάκα, αλλά διατήρησε βιωσιμότητα αφού ανακτηθεί κανονική προσκόλληση και πολλαπλασιασμό όταν μεταφέρονται πίσω στο πλήρες μέσον (Εικ. 1 C). Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτά τα κύτταρα δεν αποσπάται μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν μιτωτικά κύτταρα μετά από 48 ώρες από την πείνα αφού περιορισμός θρεπτικού είναι γνωστό ότι προκαλεί ταχεία διακοπή του κυτταρικού κύκλου [10], [31]. Για να διαπιστωθεί ότι αυτή η αναστρέψιμη «κατάσταση στάσης» ήταν σχετική του αυτοφαγικά μεταβολικά ηρεμίας φαινότυπο Lum et al. έχουν περιγράψει [10], από την επόμενη προσδιορίστηκε η απαίτηση για ένα λειτουργικό αυτοφαγικά μηχανημάτων. Αυτοφαγία χρησιμοποιεί δύο συστήματα σύζευξης ουβικιτίνης-όπως για την ολοκλήρωση αυτοφαγοσώματα, που και οι δύο αφορούν ATG7, μια πρωτεΐνη που θυμίζει τις Ε1 ένζυμα ουβικιτίνης-ενεργοποίησης [32] ουσιαστικό για την αυτοφαγία [33]. Ως αποτέλεσμα, Atg5 είναι συζευγμένο με Atg12 όταν autophagy ενεργοποιείται? στύπωμα western αποκάλυψε ότι μαζικά επάγεται λιμοκτονία αυτοφαγία σε HCT116 BaxKO υποκλώνο συγκριτικά με γονικά κύτταρα (Εικ. 1Β). Γενετική ανεπάρκεια του autophagy πραγματοποιήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας shRNA στόχευση των ATG7, και πέθαναν από κύτταρα HCT116-BaxKO shAtg7 βρέθηκαν να υποβληθούν σε μαζική οσμωτική κυτταρικό θάνατο (~ 80%), λόγω ελαττωματικού είσοδο στο αυτοφαγικά κατάσταση στάσης (& lt? 5%) (Σχ . 1Α), όπως επιβεβαιώθηκε από τη δραματική μείωση στην συζυγούς Atg5-Atg12 σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 1Β). Η κατάσταση στάσης εξαρτάτο από την αυτοφαγία και αποδείχθηκε ένα μέσο για να κρατήσει το θάνατο στο κόλπο. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι, αν και παροδική, επειδή τα κύτταρα πεθαίνουν τελικά αν πείνα είναι παρατεταμένη, αυτοφαγία παρέχει ένα πλεονέκτημα επιβίωσης στις ρυθμίσεις μας.

(Α) Μορφομετρική ανάλυση των κυττάρων πεινασμένο για 48 ώρες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μικροσκόπιο βίντεο media και time-lapse ξεκίνησε κατά τη μεταφορά σε HBSS. Τα βιώσιμα κύτταρα ορίζονται ως προσκολλημένα κύτταρα, τα αποπτωτικά κύτταρα ορίζονται ως κύτταρα που εμφανίζουν πολλαπλές κύστες μεμβράνης, θάνατο από απώλεια της οσμωτικής ακεραιότητα ορίζεται ως κύτταρα που εμφανίζουν τη διόγκωση ενός ενιαίου κύστης, και τα κύτταρα στάση ορίζονται ως κύτταρα τα οποία έχουν αποκολληθεί από το υπόστρωμα αλλά τη διατήρηση της ακεραιότητας της μεμβράνης πλάσματος. Ένα ελάχιστο 700 κύτταρα αναλύθηκαν επί τριπλών πειραμάτων. bar Κλίμακα: 50 μm. (Β) στυπώματα Western που δείχνει ενεργοποίηση κασπάσης 3 και συζυγούς Atg5-Atg12 σε ακέραια κύτταρα εκχυλίσματα από κύτταρα λιμοκτονούν για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. (Γ) Τα μη προσκολλημένα κύτταρα HCT116-BaxKO από 24 ώρες το πεινασμένο καλλιέργειες συλλέχθηκαν και μεταφέρθηκαν σε πλήρες μέσο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 6 ώρες, στη συνέχεια μικροσκοπία time-lapse βίντεο ξεκίνησε για 48 ώρες. μπαρ κλίμακα:. 100 μm

Η

Η αυτοφαγικά Ικανότητες του παχέος εντέρου HCT116 κύτταρα είναι ανεξάρτητη από Bax

Το προηγούμενο πείραμα πρότεινε ότι όταν τα κύτταρα μπορεί να εκτελέσει τόσο την απόπτωση και την αυτοφαγία, αποπτωτικό φαινότυπο υπερισχύουν αυτοφαγικά χαρακτηριστικά. Ως εκ τούτου, μας αφορά η πιθανότητα ότι η αυτοφαγικά απάντηση θα μπορούσε πράγματι να επηρεαστεί από την εκτέλεση της απόπτωσης. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, έχουμε συγκριτικά το αυτοφαγικά ικανότητα των HCT116 και HCT116-BaxKO κύτταρα κάτω από συνθήκες όπου μακροαυτοφαγία είναι η κυρίαρχη μορφή της υποβάθμισης πρωτεΐνη, δηλαδή μετά από 6-9 ώρες από την πείνα [34]. Σύκο. 2Α δείχνει την αποικοδόμηση της L – [

14C] βαλίνη-επισημασμένο μακρόβιων πρωτεϊνών. Η βασική πρωτεόλυση μετρούμενη υπό συνθήκες ελέγχου ήταν συγκρίσιμη και στις δύο κυτταρικές γραμμές και, αντιστοίχως, ως εσωτερική αναφορά (λευκές ράβδοι). Η πείνα ομοίως οδήγησε σε διπλάσια αύξηση της πρωτεόλυση στις δύο κυτταρικές σειρές (μαύρες ράβδοι). Αυτή η πρωτεόλυση ήταν (i) ουσιαστικά λυσοσωμικού αφού βαφιλομυκίνη Α1 (BAF Α1, ένας αναστολέας της λυσοσωματικής ΑΤΡάσης αντλίας πρωτονίων) απέτρεψε εντελώς επαύξηση (σκούρο γκρι ράβδοι) της, και (ii) που συνδέονται με autophagy αφού διέγερση του σημαντικά αντιστράφηκε από 3-MA (ανοιχτό γκρι μπάρες). Ως έλεγχος, ένα αποπτωτική επαγωγή από ετοποσίδη κατά την ίδια χρονική περίοδο δεν διέγειρε καμία πρωτεόλυση (γραμμοσκιασμένες ράβδοι). Έχουμε δοκιμάστηκαν επίσης τη μετατροπή του κυτοσολικού Atg8 /LC3-Ι στο autophagosome δεσμευμένου συζυγούς φωσφατιδυλαιθανολαμίνη LC3-ΙΙ, η οποία είναι ένα από τα χαρακτηριστικά του αυτοφαγία. Κηλίδες Western (Εικ. 2Β), επιβεβαιώθηκε ότι HCT116 και HCT116-BaxKO τόσο παράγονται συγκρίσιμες ποσότητες LC3-ΙΙ κατά την ασιτία. Η διάχυτη του κυτταροπλάσματος των στικτή εντοπισμό των mCherry-LC3 επίσης παρακολουθείται σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (ΠΜΑ) ως εναλλακτική κυτταρική σειρά, και έδειξε ότι η πείνα προκάλεσε το ίδιο autophagosomal μετεγκατάσταση της LC3 στην ΠΜΑ άγριου τύπου και Bax νοκ-out ΠΜΑ (Εικ . S1). Στο σύνολό τους, τα πειράματά μας δείχνουν ότι η εκτέλεση της απόπτωσης δεν επηρεάζει την αυτοφαγικά απάντηση, και καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η αυτοφαγικά ικανότητα είναι ανεξάρτητη από Bax

(Α) HCT116 και HCT116-BaxKO κύτταρα επωάστηκαν με L -. [

14C] βαλίνη, και κυνήγησαν για 9 ώρες σε πλήρες μέσο (λευκές ράβδοι), HBSS (μαύρες μπάρες) ή HBSS συμπληρωμένο με είτε 0,1 μΜ ΒΑΡ Α1 (σκούρο γκρι μπάρες), ή 10 mM 3-ΜΑ (ανοιχτό γκρι μπάρες), ή σε πλήρες μέσο 20 μΜ ετοποσίδη (γραμμοσκιασμένες ράβδοι). Αποτελέσματα αναφέρουν την διέγερση της πρωτεόλυσης σε σχέση με τα αντίστοιχα βασικά επίπεδα μετράται υπό μη λιμοκτονούν συνθήκες (λευκές ράβδοι). Οι τιμές είναι οι μέσοι όροι τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα ± s.d. (Β) στύπωμα Western και ποσοτικοποίηση της μετατροπής της LC3-Ι σε φωσφατιδυλαιθανολαμίνη-συζευγμένο LC3-ΙΙ. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο ή στερήθηκαν για 9 ώρες με την παρουσία της Ε-64d (20 μg /ml) και λευπεπτίνη (20 μg /ml) για να αποτρέψει την υποβάθμιση της ενδο-autophagosomal LC3-ΙΙ. 150 μg λύματος ολόκληρου κυττάρου φορτώθηκαν σε 15% SDS-PAGE. * Τεστ Student p & lt?. 0,02

Η

έκτοπη έκφραση των Bcl-2 και Bcl-XL, αλλά όχι Mcl-1, διεγείρει Autophagy

Το τελευταίο αποτέλεσμα παρέχεται γείωση για μας ανάλυση για την απόπτωση με ανεπάρκεια υποκλώνος HCT116-BaxKO για την αντιμετώπιση της ρύθμισης του autophagy προ-επιβίωσης από αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, διαχωρίζοντας τη συμβολή των μελών της οικογένειας Bcl-2 στην απόπτωση. κύτταρα HCT116-BaxKO επιμολύνθηκαν με πλασμίδια που κωδικοποιούν είτε Bcl-2, Bcl-xL ή Mcl-1, με αποτέλεσμα αντίστοιχα σε 9, 2 και 3 αύξηση πρωτεΐνη φορές (Σχ. 3Α). Ο λιμός δεν τροποποιούν τα προφίλ έκφρασης (Εικ. S2). Βίντεο μικροσκοπία πεινασμένο κυττάρων έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του Bcl-2 και Bcl-xL αύξησε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων που εισέρχονται στην κατάσταση αυτοφαγικά στάση (Εικ. 3Β, αντίστοιχα 88% και 82%), ενώ Mcl-1 υπερέκφραση επαυξημένης αντί ο αριθμός των βιώσιμων προσκολλημένων κυττάρων (Σχ. 3Β, λευκό bar = 48%). Έτσι, Bcl-2 και Bcl-xL είχαν σαφώς διαφορετική επίδραση από ό, τι Mcl-1 επί αυτοφαγία. Αυτό επιβεβαιώθηκε από αυτοφαγικά πρωτεόλυση (Σχ. 3C) και ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μεταδόσεως (ΤΕΜ) όπου αποικοδομητικές κυστίδια ήταν πιο άφθονο σε κύτταρα που εκφράζουν Bcl-2 και Bcl-xL, ενώ εκείνοι που εκφράζουν Mcl-1 παρέμεινε ως μη επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3D, και Εικ. S3 για μεγέθυνση)? της σημείωσης, περιστασιακά, εκτεταμένη κενοτοπιώδη εμφανίστηκε στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων που υπερεκφράζουν Bcl-xL (Σχ. 3D, αριστερό πάνελ). Όταν χρησιμοποιείται BaxKO ΠΜΑ και παρακολουθείται mCherry-LC3 πρότυπο φθορισμού, βρήκαμε ότι η μετεγκατάσταση της πρωτεΐνης προς δομές στικτή ήταν σημαντικά διεγείρεται σε επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3Ε) Bcl-2 ή Bcl-xL, δείχνοντας έτσι ότι το φαινόμενο ήταν διατηρημένη σε μια εναλλακτική κυτταρική γραμμή. Όλες οι πρότυπες τεχνικές χρυσού που χρησιμοποιείται μέχρι σήμερα ομόφωνα έδειξε ότι μόνο αυτοφαγικά κυστίδια (AVS) που επηρεάζονται από Bcl-2 ή Bcl-xL υπερ-έκφραση, ενώ άλλα λιπιδική κυστίδια, όπως multi-φυσαλιδώδη φορείς δεν είναι? Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε monodansylpentane (ΕΥΚ) [35] (μια λιπόφιλη χρωστική η οποία έχει ήδη αποδειχθεί AVS λεκέ [36]) για να τρέξει αναλύσεις με τη βοήθεια υπολογιστή του AVS, μετρούν το μέγεθος τους, και να καθορίσει τη συχνότητα τους ανίχνευσης (Εικ S4.): Starved κύτταρα HCT116-BaxKO επιμολυσμένα με Bcl-2 ή Bcl-xL αποκάλυψε μια αύξηση του αριθμού των AVS, συσχετίζεται με αυξημένη συχνότητα εμφάνισης μεγαλύτερων AVS, κάποιοι που δύο φορές τόσο μεγάλη όσο την κλασική αυτοφαγοσώματα όπως επιβεβαιώθηκε από περιστασιακές TEM. Στην απέναντι, Mcl-1 επιμολυσμένα κύτταρα δεν ήταν στατιστικά διαφορετικό από μη επιμολυσμένα κύτταρα. Ως εκ τούτου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι, ενώ η Mcl-1 δεν παίζει ουσιαστικό ρόλο στην αυτοφαγία επιβίωσης, Bcl-2 και Bcl-xL διεγείρουν ειδικά την αυτοφαγικά ικανότητα και να αυξήσουν τον αριθμό και το μέγεθος AVS.

(Α) Western blots των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με ένα άδειο φορέα, ή φορείς που κωδικοποιούν Bcl-2 ή Bcl-xL ή Mcl-1. 50 μg εκχυλισμάτων πρωτεΐνης αναλύθηκαν επί 12% SDS-PAGE. Mcl-1 ανιχνεύθηκε ως μία ώριμη πρωτεΐνη (m), μια ματισμένη παραλλαγή (ες) και μιας κασπάσης-διασπασμένο προϊόν (γ). (Β) Η μορφομετρική ανάλυση των HCT116-BaxKO προερχόμενο σταθερές κυτταρικές σειρές: τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλήρες μέσο και time-lapse μικροσκοπία βίντεο ξεκίνησε όταν τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε HBSS (ασιτία) ή όχι (πλήρη). Ένα ελάχιστο 700 κύτταρα αναλύθηκαν τουλάχιστον εις τριπλούν πειραμάτων. (C) Σχετική διέγερση από την πείνα επαγόμενης 3-MA-ευαίσθητο αποικοδόμηση των μακρόβιων πρωτεϊνών σε κυτταρικές σειρές HCT116-BaxKO επιμολυσμένα ή όχι με Bcl-2 ή Bcl-xL ή Mcl-1. Τα κύτταρα παρακολουθήθηκαν για 6 ώρες σε HBSS ή HBSS + 3-ΜΑ. Η ευαίσθητη δραστηριότητα 3-ΜΑ που μετράται σε κύτταρα HCT116-BaxKO ορίστηκε σε 1 και τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τις ευαίσθητες 3-MA δραστηριότητες της κάθε κυτταρικής σειράς σε σχέση με αυτή που βρίσκεται στο μη επιμολυσμένα κύτταρα. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος (± Τ.Α.) Από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για στατιστική σημασία των αποτελεσμάτων σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα: (*) ρ = 0.010 (**) ρ = 0.001 και (***) ρ = 0.479. (D) ΤΕΜ κυττάρων HCT116-BaxKO υπερεκφράζουν Bcl-2 ή Bcl-xL ή Mcl-1 μετά από 6 ώρες ασιτία σε HBSS. Τα βέλη δείχνουν σε αποικοδόμησης αυτοφαγοσώματα. bar Κλίμακα: 2 μm. (Ε) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση είτε με mCherryLC3 μόνο, ή με mCherryLC3 και Flag-Bcl-xL ή Flag-Bcl-2, τα κύτταρα MEF BaxKO αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο ή στερήθηκαν για 6 ώρες είχαν καθοριστεί. Immonocytochemistry αποκαλύπτει Flag-tagged κατασκευές (πράσινο). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές τουλάχιστον 4 ανεξάρτητα πειράματα. μπαρ κλίμακα:. 10 μm

Η

κάτω ρύθμιση των Bcl-XL είναι πιο ισχυρός αναστολέας της Autophagy από εκείνη των Bcl-2

Είμαστε δίπλα διερευνηθεί η επίδραση της Bcl-2 και Bcl-xL κάτω ρύθμιση σε σύγκριση με εκείνη του ATG7 σε πεινασμένο κύτταρα. Μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 4 προκάλεσε τουλάχιστον 90% αποσιώπηση των γονιδίων στόχων (Σχ. 4Α) χωρίς εγκάρσια επίδραση πάνω στην άλλη (δεν φαίνεται). Κατά τη διάρκεια του χρονικού πλαισίου του πειράματος, η βιωσιμότητα των κυττάρων σε μεταγωγή παρέμεινε στο τιμές ελέγχου (& gt? 90%, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), τόσο σε πλήρες μέσο ή μετά την ασιτία 6h. ΤΕΜ έδειξε ότι δεσμεύεται κυστίδια διπλής μεμβράνης ήταν μόλις ανιχνεύσιμη σε πεινασμένα κύτταρα όπου Bcl-2, Bcl-xL ή ATG7 είχε ρυθμίζεται προς τα κάτω σε σύγκριση με SCR σε μεταγωγή κύτταρα (Σχ. 4Β). Το πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για τη μεταγωγή του Τα siRNAs κωδικοποιεί την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και θα μπορούσαμε έτσι συσχετίζονται την αποτελεσματικότητα της μόλυνσης από τον αυτοφαγικά απόκριση αποκαλύπτεται από mCherryLC3 εντοπισμού (Εικ. 4C). Μετά πείνα, κύτταρα που εμφανίζουν έναν υψηλό βαθμό μεταγωγή με shAtg7 (εξαιρετικά GFP-θετικά κύτταρα) εμφάνισαν μια διάχυτη κυτοσολική διανομή mCherryLC3 δείχνοντας ότι autophagy ήταν αποτελεσματικά μειωμένη, ενώ τα μη μετατραπέντα κύτταρα εμφανίζονται στικτή οργάνωση mCherryLC3. Στη διατήρηση, πεινασμένο κύτταρα όπου shBcl-2 ή shBcl-Χι είχε αποτελεσματικά σε μεταγωγή εμφάνισε μια διάχυτη χρώση mCherryLC3, αν shBcl-Χι προκάλεσε επαναλήψιμα μια ισχυρότερη ανασταλτική φαινότυπο από shBcl-2. Έτσι, Bcl-2 ή Bcl-xL κάτω ρύθμιση είχε ανασταλτικό αποτέλεσμα επί αυτοφαγία, ωστόσο αυτό το πείραμα θα μπορούσε να δείξει ότι Bcl-2 και Bcl-xL δεν μπορεί να είναι εντελώς περιττή για το μοριακό έλεγχο της αυτοφαγία επιβίωσης. Σε μια προσπάθεια να ποσοτικοποιηθούν μια τέτοια διαφορά, μπορούμε τελικά προσδιορίστηκαν λιμοκτονία επαγόμενη πρωτεόλυση Τα siRNAs μεταγόμενων κυττάρων: για ένα ΜΟΙ 4, Bcl-2 νοκ-κάτω τα κύτταρα διατηρούνται 75% του ευαίσθητου πρωτεόλυση 3-ΜΑ σε σύγκριση με ένα σκαρφάλωμα shRNA (SCR). Αυτό οροπέδιο είχε ήδη επιτευχθεί με ΜΟΙ 2 και παρέμεινε αμετάβλητη ακόμη και για υψηλότερες ΜΟΙ (δεν φαίνεται). Σε αντίθεση, Bcl-xL και ATG7 σίγηση μείωσε το ρυθμό αποικοδόμησης, σε 15 και 17% (Σχ. 4D). Ως εκ τούτου, Bcl-2 και Bcl-xL knock-down δύο είχαν ένα συναρπαστικό ανασταλτικό αποτέλεσμα επί αυτοφαγικά πρωτεόλυση. Ωστόσο, μόνο Bcl-xL κάτω ρύθμιση μιμήθηκε εκείνη του ATG7 και αποδείχθηκε καθοριστικό μοριακό έλεγχο της αυτοφαγία.

(Α) κηλίδες Western των κυττάρων HCT116-BaxKO μολυνθεί με αυξανόμενες ποσότητες ιικών σωματιδίων μεταγωγής shRNA έναντι Bcl- 2, Bcl-xL ή ATG7, ή ένα κωδικοποιημένο shRNA (SCR). Σύνολο πρωτεϊνικά εκχυλίσματα έγιναν, και 50 μg πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε SDS-PAGE. (Β) κύτταρα HCT116-BaxKO μολύνθηκαν με ιικά σωματίδια που μεταφέρουν shRNA έναντι Bcl-2, Bcl-xL ή ATG7 με ένα ΜΟΙ = 4 αναλύθηκαν για αυτοφαγικά αποικοδόμηση των μακρόβιων πρωτεϊνών σύντομα μετά τη μόλυνση. Τα κύτταρα παρακολουθήθηκαν για 6 ώρες σε HBSS ή HBSS + 10 mM 3-ΜΑ. 3-MA ευαίσθητη δραστηριότητα μετρήθηκε σε SCR-μολυσμένα κύτταρα ορίστηκε σε 100%, και τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τις 3-MA ευαίσθητες δραστηριότητες του κάθε μολυσμένης κυτταρικής σειράς σε σχέση με αυτή που βρίσκεται στο SCR-μολυσμένα κύτταρα. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος (± Τ.Α.) Από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Όταν το σφάλμα δεν ενδείκνυται, μπαρ ήταν πολύ μικρό για να δει. κύτταρα (C) HCT116-BaxKO σταθερά επιμολυσμένα με mCherryLC3 μολύνθηκαν με ιικά σωματίδια που μεταφέρουν shRNA έναντι Bcl-2, Bcl-xL ή ATG7 με ένα ΜΟΙ = 4. Τα κύτταρα αναλύθηκαν για GFP φθορισμό τους (μολυσμένα κύτταρα) και LC3 μετεγκατάσταση μετά από 6 ώρες από την πείνα. μπαρ κλίμακας: 15 μm. (D) ΤΕΜ μετά από 6 ώρες από την πείνα των κυττάρων HCT116-BaxKO όπου σίγησε Bcl-2 ή Bcl-xL ή έκφραση ATG7. μπαρ κλίμακα:. 2 μm

Η

Bcl-xL Ρυθμίζει Επιβίωση Autophagy Ανεξάρτητα από Beclin 1

Μελέτες αναφέρουν αντι-αυτοφαγικά λειτουργίες των Bcl-2 και Bcl-xL απεικονίζουν συνθήκες όπου διεγείρεται αυτοφαγία οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο, και έδειξε ότι η σύνδεση τους με Beclin 1 μπλοκάρει την έναρξη της αυτοφαγία. Στην απέναντι, Zeng et al. ανέφεραν ότι σε μη-πεινασμένο U-251 κύτταρα γλοιοβλαστώματος, ούτε Bcl-2 ούτε Bcl-xL ήταν φυσιολογικά ενδογενείς οντότητες σύνδεσης για Beclin 1 [27], υποδηλώνοντας ότι ανάλογα με τις ρυθμίσεις, αυτές οι πρωτεΐνες δεν είναι υποχρεωτικά εταίρους.

Στο παράδειγμα μας κυτταροπροστατευτικών αυτοφαγία, ενδογενής Beclin 1 ανοσοκατακρημνίσθηκε από τον έλεγχο ή πέθαναν από κυτταρολύματα (Εικ. 5Α). Bcl-2 αποτελεσματικά τραβιέται κάτω, αλλά όχι bcl-xL? της σημείωσης, Bcl-2 /Beclin 1 ένωση δεν διαφέρουν σε πεινασμένα έναντι κύτταρα ελέγχου. Το αντίστροφο ανοσοκατακρήμνιση της ενδογενούς Bcl-2 επιβεβαίωσε αυτές τις παρατηρήσεις, ενώ Bcl-xL απέτυχαν και πάλι να τραβήξει προς τα κάτω οποιαδήποτε ανιχνεύσιμη Beclin 1. Τα πειράματα αυτά υποστηρίζουν μια διαφορική ρύθμιση της αυτοφαγία προ-επιβίωσης από Bcl-2 και Bcl-XL, αλλά απαιτούνται περαιτέρω πειράματα απαιτήθηκαν για να βεβαιωθεί ότι Bcl-xL ενήργησαν ανεξάρτητα από Beclin 1. Υποκυτταρική κλασματοποίηση έδειξε ότι εκτός από την μιτοχονδριακή τμήμα του Bcl-2, σημαντικές ποσότητες του Bcl-2 και Beclin 1 αλληλεπικαλύπτονται σε ελαφρά κλάσματα, και σε περαιτέρω φύλαξη με τα αποτελέσματα έρευνας, κανένας αυτών των πρωτεϊνών άλλαξε τον εντοπισμό σε έλεγχο ή πεινασμένο κύτταρα. Σε αντίθεση, Bcl-xL ανιχνεύθηκε σε ολόκληρη την κλίση σε κύτταρα ελέγχου και relocalised σε πολύ φως κλάσματα στα πεινασμένα κύτταρα? λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των διαμερισμάτων στα οποία Bcl-XL είναι παρούσα, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι μπορεί να αλληλεπιδρούν με πολλούς εταίρους, και αυτό μπορεί να ευθύνεται για το γεγονός ότι Beclin 1 δεν έχει βρεθεί ως κύριο αλληλεπιδρούν εταίρους της μέσω πειραμάτων IP. Ομοεστιακή αναλύσεις έδειξαν ότι το Bcl-xL συν-εντοπισμένη με την μιτοχονδριακή εσωτερική μεμβράνη πρωτεΐνη ATP1 στον έλεγχο και στερήθηκαν κύτταρα (Σχ 5C.)? ως εκ τούτου, τα ελαφρά κλάσματα φιλοξενία Bcl-XL στην πεινασμένο κύτταρα είναι σε στενή γειτνίαση των μιτοχονδρίων.

(Α) Συν-ανοσοκατακρήμνιση των ενδογενών Beclin 1 με ενδογενή Bcl-2 και Bcl-XL στην HCT116-Βαχ κύτταρα ΚΟ αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο ή σε νηστεία επί 6 ώρες. (Β) Υποκυτταρική κλασματοποίηση των κυττάρων HCT116-Bax KO αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο ή σε νηστεία επί 6 ώρες. Τα κύτταρα έσπασαν με ομογενοποιητή Dounce, μετά την πυρηνική υπερκείμενα φορτώθηκαν στην κορυφή ενός συνεχούς κλίσης σακχαρόζης 10-55% για υπερφυγοκέντρηση τη διάρκεια της νύχτας. Κλάσματα των 500 μΙ συλλέχθηκαν, και η συνολική πρωτεΐνη καταβυθίστηκε. Ο ίδιος όγκος κάθε κλάσμα διαχωρίστηκε σε 14% τρις-τρικίνης SDS-PAGE. Western blots-ήταν όπως περιγράφεται στο τμήμα των μεθόδων. (Γ) Η ανοσοκυτταροχημεία στην ενδογενή Bcl-xL και ATP1 σε κύτταρα HCT116-BaxKO αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο ή σε νηστεία επί 6 ώρες.

Η

Επειδή πειράματα ΠΕ έδειξαν μία αλληλεπίδραση μεταξύ Bcl-2 και Beclin 1 αλλά ήταν ασαφή για Bcl-xL και Beclin 1, τελικά αποφάσισε να δημιουργήσει μια τελευταία σειρά από πειράματα για να διερευνήσει περαιτέρω τις λειτουργικές διαφορές μεταξύ των Bcl-2 και Bcl-xL και την εξάρτησή τους από Beclin 1. Αναλύσαμε αυτοφαγία στα κύτταρα που υπερεκφράζουν Beclin 1 ή το ΒΗ3 μεταλλάγματα Beclin 1

F123A και Beclin 1

125Α τα οποία αντιστοίχως χαλαρά ή να διατηρούν τη σύνδεσή τους με Bcl-2 και Bcl-xL [19], [37] (τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης δείχνονται στο Σχ. S5 ). Fig.6A δείχνει ότι, όπως αναμενόταν, Beclin 1 έκτοπη έκφραση διεγείρεται πείνας που προκαλείται από αυτοφαγικά πρωτεόλυση. Ένα τέτοιο χαρακτηριστικό ήταν εξαρτάται αυστηρά από μια λειτουργική περιοχή ΒΗ3 (δηλαδή σε θέση να αλληλεπιδράσουν με ΒΗ1-ΒΗ2 περιέχει εταίροι) από την Beclin 1

125A μιμήθηκε τον άγριου τύπου πρωτεΐνη, ενώ Beclin 1

F123A ήταν εντελώς ανίκανοι να προκαλέσει αυτοφαγία. Τα μεταλλάγματα ΒΗ1 του Bcl-2 και Bcl-xL (δηλαδή Bcl-2

G145A ή Bcl-xL

G138A), που και οι δύο χαλαρά αλληλεπίδραση τους με την περιοχή ΒΗ3 των Beclin 1 [19], [24] ήταν αμοιβαίως αναλυθεί. Τα επίπεδα της υπερ-έκφραση σε κύτταρα HCT116-BaxKO ήταν παρόμοια με εκείνα της έκτοπης Bcl-2 και Bcl-xL (Εικ. S2). Εμποδίζοντας τη δέσμευση του Bcl-2 προς 1 Beclin κατήργησε εντελώς την τόνωση της αυτοφαγικά πρωτεόλυση που παρατηρήθηκε με την φυσική Bcl-2. ΤΕΜ επιβεβαίωσε ότι η ποσότητα και το μέγεθος των αυτοφαγικά κυστιδίων σε Bcl-2

κύτταρα G145A εκφράζουν ήταν πολύ διαφορετικές από Bcl-2 εκφράζοντα κύτταρα, και ήταν πράγματι συγκρίσιμες με μη επιμολυσμένα κύτταρα (σύγκρινε Σχ. 3D και το Σχ. 6Β δεξιά). Ως εκ τούτου, Bcl-2 προ-αυτοφαγικά λειτουργίες βασίζονται εξ ολοκλήρου στην δέσμευση ενός περιέχει συνεργάτη ΒΗ3 (πιθανώς Beclin 1 σύμφωνα με τα πειράματα IP και με τα στοιχεία που πρωτεόλυση που λαμβάνονται με Beclin 1

F123A). Σε αντίθεση, Bcl-xL

G138A διατηρούνται ακόμα μια μικρή ικανότητα να διεγείρουν αυτοφαγικά υποβάθμιση, αν και ήταν πολύ λιγότερο αποδοτική από την φυσική αντίστοιχό του (Εικ. 6Α). ΤΕΜ έδειξαν ότι Βοΐ-χ

G138A διεγείρεται η σύνθεση AVS τόσο αποτελεσματικά όσο Bcl-xL (συγκρίνετε Σχ. 6Β αριστερά με το Σχ. 3D). Μετεγκατάσταση της mCherry-LC3 στο BaxKO-ΠΜΑ επιμολυσμένα με Βοΐ-χ

G138A επιβεβαίωσε αυτή την παρατήρηση (συγκρίνετε Εικ. 6C με το Σχ. 3Ε). Colocalisation της LC3 και Lamp1A στο πεινασμένο κύτταρα HCT116 BaxKO εκφράζουν Bcl-xL ή Βοΐ-χ

G138A έδειξε ότι αυτοφαγικά κυστίδια περιείχαν δύο δείκτες, και ως εκ τούτου αντιπροσωπεύουν αποικοδόμησης αυτοφαγοσώματα. Ως εκ τούτου, η μετάλλαξη του θέση πρόσδεσης Bcl-xL ΒΗ3 οδήγησε σε δομικά άθικτο αλλά λειτουργικά εξασθενημένη μονοπάτι αυτοφαγικά. Αυτό το σύνολο των δεδομένων που δείχνουν ότι τα αποδομητικά AVS σχηματίζονται σε Βοΐ-χ

G138A αλλά απαιτούνται περαιτέρω πειράματα που απαιτούνται για να εξηγήσει γιατί αυτά τα AVS είναι λιγότερο λειτουργική σχέση με Βοΐ-χ κύτταρα που εκφράζουν. Σύγκριση της ποσότητας του συζυγούς Atg5-Atg12 σε μη επιμολυσμένα κύτταρα ή σε κύτταρα που εκφράζουν Bcl-xL ή Bcl-xL

G138A απέτυχε να εντοπίσει τυχόν διαφορά, υποδεικνύοντας ότι το στάδιο σύζευξης δεν είναι περιοριστική και δεν μπορεί να διεγερθεί περαιτέρω με Bcl- έκφραση xL (Εικ. S6). Μελλοντικά πειράματα θα στοχεύουν στη σύγκριση των κινητική της AVS ωρίμανση σε Bcl-xL και Bcl-χ

G138A κύτταρα που εκφράζουν. Ως συμπέρασμα, Bcl-2 και Bcl-xL παρουσιάζουν μια διαφορική εξάρτηση από τα Beclin 1 εμφανίζουν φιλο-αυτοφαγικά λειτουργίες τους. Ενώ Bcl-2 στηρίζεται πλήρως επί της σύνδεσης του με Beclin 1, Bcl-xL δεν ελέγχει το σχηματισμό αυτοφαγοσώματα μέσω Beclin 1, και προτείνουμε ότι μια πρωτεΐνη η οποία χρησιμοποιεί την περιοχή ΒΗ3 δέσμευσης βοηθά Bcl-xL διέγερση μιας λειτουργικής αυτοφαγικά οδό.

(Α) Σχετική διέγερση από την πείνα επαγόμενης 3-MA-ευαίσθητο αποικοδόμηση των μακρόβιων πρωτεϊνών σε κυτταρικές σειρές HCT116-BaxKO επιμολυσμένα ή όχι με Bcl-2, Bcl-2

G145A, Bcl- xL, Bcl-xL

G138A, Beclin 1, Beclin 1

F123A ή Beclin 1

I125A. Τα κύτταρα παρακολουθήθηκαν για 6 ώρες σε HBSS ή HBSS + 3-ΜΑ. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τους ευαίσθητους 3-MA δραστηριότητες της κάθε κυτταρικής σειράς σε σχέση με αυτή που βρίσκεται στο μη επιμολυσμένα κύτταρα. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος (± Τ.Α.) Από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για στατιστική σημασία των αποτελεσμάτων σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα? σ τιμές δεν φαίνεται στο γράφημα είναι p & lt? 0,01. (Β) TEM των κυττάρων HCT116-BaxKO επιμολυσμένα με Βοΐ-χ

G138A (αριστερά) ή Bcl-2

G145A (δεξιά) μετά από 6 ώρες από την πείνα. bar Κλίμακα: 2 μm. (C) 24 ώρες μετά την συνδιαμόλυνση του mCherryLC3 με Flag-Bcl-xL

G138A, BaxKO ΠΜΑ που καλλιεργούνται σε πλήρες μέσο ή στερήθηκαν για 6 ώρες είχαν καθοριστεί. Immonocytochemistry αποκαλύπτει Flag-tagged κατασκευές (πράσινο). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές τουλάχιστον 4 ανεξάρτητα πειράματα. μπαρ κλίμακας: 10 μm. κύτταρα (D) HCT116BaxKO υπερεκφράζουν Bcl-xL ή Bcl-xL

G138A επιμολύνθηκαν με mCherryLC3 και mEGFP-Lamp1A. Μετά από 6 ώρες από την πείνα, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και παρατηρήθηκαν με ένα 100x στόχο. (Γραμμή κλίμακας: 5 μm)

Η

Συζήτηση

Οι μοριακές βάσεις για την πρόβλεψη της κυτταροπροστατευτικών ή το προ-