Αφηρημένο

Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα-κίνηση (ΤΠΕ στο ολιγοθέσιο σχολείο) είναι το πιο κακοήθεις κυτταρικές υποπληθυσμό σε όγκους λόγω της αντοχής τους στη χημειοθεραπεία ή θεραπεία ακτινοβολίας. Στόχευση TICs μπορεί να είναι μια σημαντική καινοτομία για τη θεραπεία του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι ΡΡΑΚγ αγωνιστές ανέστειλε την κυτταρο-φαινότυπο καρκινικά βλαστικά και εξασθενημένα ανάπτυξης όγκου των ανθρώπινων κυττάρων ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC). Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ξεκίνησε από NOX2 αυξητική ρύθμιση ήταν μερικώς υπεύθυνη για τα ανασταλτικά αποτελέσματα που προκαλούνται από αγωνιστές ΡΡΑΚγ. Ωστόσο, ΡΡΑΚγ αγωνιστή μεσολάβηση παραγωγή ROS ενεργοποιούνται σημαντικά ΑΚΤ, η οποία με τη σειρά της προωθείται TIC επιβίωση περιορίζοντας την παραγωγή ROS. Αναστολή της ΑΚΤ, είτε φαρμακολογικές αναστολείς ή ΑΚΤ siRNA, ενίσχυσε σημαντικά ΡΡΑΚγ αγωνιστή μεσολάβηση αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ιδιότητες σε κύτταρα HCC. Είναι σημαντικό ότι, σε άτριχα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με κύτταρα HCC Huh7, δείξαμε μία συνεργιστική ανασταλτική επίδραση της ροσιγλιταζόνης PPARγ αγωνιστή και του αναστολέα ΑΚΤ triciribine στην ανάπτυξη του όγκου. Εν κατακλείδι, παρατηρήσαμε μια αρνητική αλληλεπίδραση μεταξύ του οξειδωτικού στρες και της ΑΚΤ hyperactivation στο PPARγ αγωνιστή μεσολάβηση κατασταλτικές επιδράσεις στις ΕΑΣ. Συνδυαστική εφαρμογή ενός αναστολέα ΑΚΤ και ένα PPARγ αγωνιστή μπορεί να παρέχει μια νέα στρατηγική για την αναστολή των ιδιοτήτων των βλαστικών κυττάρων, όπως στην ΕΑΣ και τη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος

Παράθεση:. Liu L, Yang Z, Xu Υ, Λι J , Xu D, Zhang L, et al. (2013) Αναστολή του οξειδωτικού στρες-Προκαλείται AKT ενεργοποίηση Διευκολύνει PPARγ αγωνιστή-διαμεσολαβούμενη αναστολή των Βλαστικών Κυττάρων χαρακτήρων και αύξηση όγκου των κυττάρων καρκίνου του ήπατος. PLoS ONE 8 (8): e73038. doi: 10.1371 /journal.pone.0073038

Επιμέλεια: Γιν Tintut, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, στο Λος Άντζελες, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6η Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 16 του Ιούλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 Αυγ 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα κινεζική Key (2013ZX10002-011). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) κατατάσσεται ως η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο. Ωστόσο, HCC έχει ένα υψηλό ποσοστό χημειοθεραπεία αντίσταση και υψηλή συχνότητα εμφάνισης υποτροπής και μετάσταση μετά την χειρουργική θεραπεία, η οποία καθιστά ως η τρίτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο [1], [2]. Πολλαπλές μελέτες έχουν καταδείξει ότι HCC μπορούν να προέρχονται από έναν υποπληθυσμό των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, που ονομάζονται ογκογενή κύτταρα (TICs) ή αρχέγονα κύτταρα του καρκίνου, οι οποίες χαρακτηρίζονται από την έκφραση ειδικών δεικτών επιφανείας και οθόνη αυτο-ανανέωση, τη διαφοροποίηση, την έναρξη του όγκου , και η αντοχή στα φάρμακα [3] – [10]. Αν και η sorafenib φάρμακο έχει πρόσφατα εγκριθεί για τη θεραπεία HCC, έχουν περιορισμένα οφέλη επιβίωσης για τους ασθενείς με τελικού σταδίου HCC και χωρίς ισχυρή αποτελεσματικότητα στη μετάσταση του όγκου έχει αποδειχθεί [11], [12]. Ως εκ τούτου, οι εναλλακτικές θεραπευτικές μεθόδους για την εξάλειψη ή τον περιορισμό της υποπληθυσμό των τικ μπορεί να είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για την θεραπεία HCC.

Ο ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα γ (ΡΡΑΚγ) είναι ένας παράγοντας μεταγραφής εξαρτώμενη από συνδετήρα που ανήκει στον πυρηνικό ορμόνη υπεροικογένεια υποδοχέων. Οι αγωνιστές για την ενεργοποίηση του ΡΡΑΚγ περιλαμβάνουν ενδογενείς λιπόφιλες συνδέτες, όπως 15-δεοξυ-Δ

12,14-προσταγλανδίνη J

2 (15d-PGJ

2) και λιπαρά οξέα, καθώς επίσης και το συνθετικό θειαζολιδινεδιόνες (μία κατηγορία αντιδιαβητικών φαρμάκων), συμπεριλαμβανομένων των ροσιγλιταζόνη, τρογλιταζόνη, σιγλιταζόνη, πιογλιταζόνη και ενγλιταζόνη [13]. ενεργοποίηση Ligand αυτού του παράγοντα μεταγραφής οδηγεί στην έκφραση γονιδίων στόχων για τον έλεγχο πολλές βασικές φυσιολογικές διαδικασίες, όπως ο μεταβολισμός, η διαφοροποίηση των κυττάρων, την απόπτωση, και φλεγμονή των ιστών [14]. ΡΡΑΚγ αγωνιστές έχουν επίσης δειχθεί να συλλάβουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, επάγουν απόπτωση, μειώνουν την κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση, προάγουν τη διαφοροποίηση των καρκινικών κυττάρων διαφορετικών προελεύσεων [15] – [22]. PPARγ μπλοκ καρκινογένεση και οι επεμβατικές και μεταστατικό δυναμικό του HCC [23], [24], υποδεικνύοντας ότι η εφαρμογή των αγωνιστών ΡΡΑΚγ μπορεί να είναι μια θεραπευτική προοπτική για θεραπεία HCC. Είναι ενδιαφέρον, ΡΡΑΚγ αγωνιστές έχουν πρόσφατα ενοχοποιηθεί για την οδήγηση της ΕΤ-743 με τη μεσολάβηση διαφοροποίηση των κυττάρων μυξοειδές λιποσάρκωμα γύρος [15] και την αναστολή των τικ στον καρκίνο του εγκεφάλου [25].

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι ΡΡΑΚγ αγωνιστές (15d-PGJ

2 ή ροσιγλιταζόνη) ανέστειλαν αποτελεσματικά βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ιδιότητες σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του ήπατος, και ότι NADPH οξειδάση-2 (NOX2) προκληθείσα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) λειτούργησε ως βασικό κατάντη συμβάν. Ως αρνητική απάντηση ανάδρασης, αυξημένη ROS προκάλεσε υπερενεργοποίηση ΑΚΤ, που παρεμπόδισαν σημαντικά PPARγ αγωνιστή μεσολάβηση αναστολή των ιδιοτήτων των βλαστικών κυττάρων, όπως σε κύτταρα HCC.

In vivo

πειράματα έδειξαν επίσης ότι η διακοπή της αρνητικής βρόχου ανάδρασης από το triciribine αναστολέα της ΑΚΤ διευκόλυνε σημαντικά την PPARγ αγωνιστή ροσιγλιταζόνη μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι ο συνδυασμός ενός αναστολέα ΑΚΤ και ένα PPARγ αγωνιστή μπορεί να παρέχει μια πολλά υποσχόμενη πιθανή θεραπεία για καρκίνο του ήπατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ζωικά πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας Ιατρικής Πειραματική ζώων της Σαγκάης Ινστιτούτου Καρκίνου (ID έγκριση. ShCI-11-020).

Cell Culture

κυτταρικές σειρές SK-ΗΕΡ1 και Hep3B λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Huh7 κυτταρική γραμμή ήταν από Riken Τράπεζας Κυττάρων (Tsukuba Science City, Japan). SMMC 7721 κυτταρική γραμμή που παρέχονται από το Τμήμα Παθολογίας του Β Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Σαγκάη, Κίνα) [26]. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε DMEM με υψηλή γλυκόζη (GIBCO, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (GIBCO) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (1% [ν /ν]? GIBCO) στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Μετά τα κύτταρα αρχικά αναπτύχθηκαν, πολλαπλά δείγματα κρυοσυντηρήθηκαν και όλες οι κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν εντός 6 μηνών από την ανάνηψη.

Για τα πειράματα της θεραπείας, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και αναπτύχθηκαν για όλη τη νύχτα, το μέσο στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης μέσο που περιέχει 1% ορό εμβρύου μόσχου, και επωάστηκαν με 15d-PGJ

2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), ροσιγλιταζόνη (Cayman Chemical, Αηη Arbor, ΜΙ), Ν-acetylatedcysteine ​​(NAC) (Calbiochem, Darmstadt, Γερμανία), triciribine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), και /ή LY294002 (Sigma-Aldrich), για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές.

ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS) Ανάλυση

Μετά την επώαση υπό υποδεικνύεται συνθήκες καλλιέργειας, τα κύτταρα διαχωρίστηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS που περιέχει 0.5% BSA στους 4 ° ΝΤΟ. ΡΕ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD133 αντίσωμα (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία) προστέθηκε για επώαση στους 4 ° C για 30 λεπτά. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε σε ροή FACSCalibur κυτταρόμετρο (BD Biosciences, San Jose, CA). Rat IgG1 /κ αντίσωμα συζευγμένο με φυκοερυθρίνη χρησίμευσε ως έλεγχος ισοτόπου. Τα νεκρά κύτταρα αποκλείστηκε με χρώση με 7-AAD (Sigma-Aldrich) πριν την ανάλυση. Για ταξινόμηση των κυττάρων, CD133

+ ή GFP

+ κύτταρα αυστηρά οριοθετημένα και απομονώθηκε χρησιμοποιώντας MoFlo XDP (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Κυττάρου Βιωσιμότητας Δοκιμασία

τηλέφωνα βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με 3- (4,5-διμεθυλο-2-θειαζολυλ) 2,5- διφαινυλ- 2Η-τετραζολίου μέθοδος βρωμίδιο (ΜΤΤ) (Sigma-Aldrich). Εν συντομία, ένα σύνολο 1.000 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε τελικό όγκο 200 μΙ. Μετά την επώαση με 15d-PGJ

2 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, 20 μΙ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS) προστέθηκε στο μέσον και καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 3 ώρες. Στη συνέχεια, το διάλυμα ΜΤΤ απομακρύνθηκε και 150 μΙ διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, Sigma-Aldrich) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Η απορροφητικότητα του κάθε φρεάτιο μετρήθηκε σε μήκος κύματος 540 nm.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Η έκταση της απόπτωσης αξιολογήθηκε με Pharmingen ™ FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) σύμφωνα με την οδηγίες που παρέχονται κατασκευαστή. Στη συνέχεια, η ανάλυση ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλογή κυττάρων διεξήχθη επί της ροής FACSCalibur κυτταρόμετρο (BD Biosciences). Ενιαία χρώση χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC ή 7-AAD μόνη πραγματοποιήθηκε ως μάρτυρες.

BrdU Δοκιμασία

Pharmingen APC BrdU Kit Flow ™ (BD Biosciences) χρησιμοποιήθηκε για βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) δοκιμασία ενσωμάτωσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

RNA Extraction και Real-time PCR

το συνολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα με το αντιδραστήριο RNAiso (Takara, Dalian, Κίνα). Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) διεξήχθη χρησιμοποιώντας 500 ng του συνολικού RNA για τη σύνθεση cDNA σε έναν όγκο αντίδρασης 10 μΐ, χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript ™ RT (Takara) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Χρησιμοποιώντας Προμίγματα Ex Taq ™ (Takara), ποσοτική PCR διεξήχθη για

Nanog

,

Oct4

, και

AFP

. Για την ανίχνευση του

Notch1

,

ΠΕΑ

,

NOX2, NOX4, Ρ22

phOx, Ρ47

phOx, P67

phOx

και

Rac

έκφρασης, ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο μείγμα από TaKaRa σε 7300 real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA).

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα S1.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) Επιμόλυνση

Η siRNAs ειδικά για

NOX2

,

PPARγ

,

ΑΚΤ1

και

ΑΚΤ2

αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Οι αλληλουχίες siRNA που παρατίθενται στον Πίνακα S2. Μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων χωρίς αντιβιοτικά. Τα siRNAs (60 ηΜ) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carisbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανάλυση Western Blotting

Τα κύτταρα λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ( Beyotime, Nantong, Κίνα) που περιέχουν αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ και PhosSTOP φωσφατάσης αναστολέα (Roche, Monza, IT). Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα: anti-CD133, αντι-ΡΡΑΚγ, αντι-ΑΚΤ, αντι-φωσφο-ΑΚΤ (Ser473) (όλα από την Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ)? αντι-GAPDH, αντι-α-τουμπουλίνης (όλα από την Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)? και αντι-NOX2 (Abcam, Cambridge, UK). Το σύστημα ChemiDoc ™ XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) χρησιμοποιήθηκε για τη λήψη εικόνων.

σφαιροειδή σχηματίζουν Δοκιμασία

Ενιαία κύτταρα σπάρθηκαν σε πιάτα εξαιρετικά χαμηλή κουλτούρα συνημμένο (Costar , Coring, ΝΥ) σε πυκνότητα 500 κύτταρα /ml σε ένα απαλλαγμένο από ορό 1:01 DMEM: F12 (Gibco), συμπληρωμένο με Β27 (1:50? GIBCO), 20 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και 20 ng /ml βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (bFGF) (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ). Όλες οι καλλιέργειες επωάστηκαν για 7 ημέρες και μετρήσεις διεξήχθησαν σφαιροειδείς.

Μέτρηση της ROS Συσσώρευσης

Η οξείδωση-ευαίσθητος φθορίζων ανιχνευτής Dihydroethidium (DHE) (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της ενδοκυτταρικής επίπεδο του ROS. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 5 μΜ DHE για 30 λεπτά σε επωαστήρα 37 ° C. Ο φθορισμός μετρήθηκε με ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur.

In vivo πειράματα

Αρσενικά γυμνά ποντίκια BALB /c, 6 εβδομάδων, στεγάσθηκαν υπό συνθήκες άνευ παθογόνων , και όλα τα πειράματα με ποντίκια έγιναν σύμφωνα με την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση της Σαγκάης και το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου.

Huh7 κυττάρων με την έκφραση του GFP (2 × 10

6) αιωρήθηκαν σε 100 μΙ PBS και εμβολιάστηκαν υποδορίως (sc) στο δεξί πλευρό αρσενικών γυμνών ποντικών. Τα υποδόρια μοντέλα χορηγήθηκαν φάρμακα αρχίζοντας την ημέρα 4 μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου. Rosiglitazone (GlaxoSmithKline, Marly le Roi, France) αναμίχθηκε με αποστειρωμένο νερό, σε συγκέντρωση 4 mg /ml. Triciribine (Santa Cruz Biotechnology) διαλύθηκε σε PBS, σε συγκέντρωση 200 μg /ml. Για εφάπαξ θεραπεία, οι ποντικοί υποδόρια τυχαιοποιήθηκαν σε όχημα και θεραπεία με ροσιγλιταζόνη ομάδα (η = 7 ανά ομάδα). Rosiglitazone (100 mg /kg) χορηγήθηκε καθημερινά ενδογαστρικώς (ig) για 12 ημέρες. Για τη θεραπεία συνδυασμού, οι ποντικοί υποδόρια χωρίστηκαν τυχαία σε 4 πειραματικές ομάδες (η = 5 ανά ομάδα). Οι 4 πειραματικές ομάδες ήταν ως ακολούθως: χωρίς θεραπεία ομάδα ελέγχου, ομάδα αγωγής ροσιγλιταζόνη (100 mg /kg /ημέρα, χορηγούμενη την ημέρα 6, 7, 10, 11 με Ig), ομάδα αγωγής triciribine [1 mg /kg /ημέρα, χορηγούμενη σε ημέρες 4, 5, 8, 9, 12, 13 με ενδοπεριτοναϊκή (ίρ)], και την ομάδα θεραπείας triciribine ροσιγλιταζόνη σε συνδυασμό (χορηγείται με τη χρήση του ίδιο χρονοδιάγραμμα για κάθε φάρμακο, όπως περιγράφεται για την ενιαία επεξεργασία). Όλοι οι ποντικοί ελέγχου χορηγήθηκαν με ίσο όγκο οχήματος με καθετηριασμό ή έγχυση, αντίστοιχα. Το μέγεθος του όγκου, μετρούνται ξεχωριστά καθημερινά με microcalipers μετά τη θεραπεία, υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο:

V =

(

w

1 ×

w

2 ×

w

2) /2, όπου

w

1 είναι το μήκος και το

w

2 είναι το πλάτος του όγκου. Όλοι οι ποντικοί θανατώθηκαν με αυχενική εξάρθρωση την ημέρα μετά την τελευταία αγωγή. μάζες όγκων χειρουργικά αποκόπηκαν, ζυγίστηκαν χονδρικά και διαχωρίστηκαν σε μεμονωμένα κύτταρα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ΡΕ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD133 αντίσωμα (Miltenyi Biotec) για τον προσδιορισμό της έκφρασης CD133 σε GFP

+ κύτταρα του όγκου, ή GFP

+ καρκινικά κύτταρα απομονωμένα από τη ροή διαλογή χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση σφαιροειδή σχηματίζουν ικανότητα .

Στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό Graphpad Prism. Στατιστικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το

t

τεστ του φοιτητή. Το κριτήριο για την στατιστική σημαντικότητα ήταν

P

αξία μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

PPARγ αγωνιστές αναστέλλουν την Βλαστικών Κυττάρων-όπως Ιδιότητες και ανάπτυξη όγκου του HCC κύτταρα

Πρέπει πρώτα ελεγχθεί αν PPARγ αγωνιστές ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα HCC. Συνεπής με προηγούμενες παρατηρήσεις ότι ΡΡΑΚγ αγωνιστές αναστέλλουν συνήθως τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, βρήκαμε ότι η θεραπεία με 15d-PGJ

2, μια φυσική ενδογενής συνδετήρας του ΡΡΑΚγ, ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε όλα εξετάζονται κυτταρικές σειρές HCC (Σχήμα 1Α). Εξετάσαμε περαιτέρω την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με βλαστική ικανότητα σε τέσσερις κυτταρικές σειρές HCC, Huh7, SK-ΗΕΡ1, SMMC 7721, και τα κύτταρα Hep3B, με ή χωρίς 15d-PGJ

2 θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1A, ενός αριθμού γονιδίων που σχετίζονται με βλαστική ικανότητα, συμπεριλαμβανομένων των

Nanog

,

Notch 1

,

Oct4

, και

SMO

, έδειξε μια τάση προς την ρύθμιση προς τα κάτω σε όλα τα

2-επεξεργασμένα κύτταρα 15d-PGJ, υποδεικνύοντας ότι PPARγ αγωνιστές μπορεί να έχουν επίδραση στην HCC τικ. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η CD133

+ υποπληθυσμό σε κύτταρα Huh7 αντιπροσωπεύει μία δεξαμενή κυττάρων που περιέχουν τικ και είναι απαραίτητη για την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου [28], [29]. Ως εκ τούτου, αναλύθηκε έκφραση CD133, σφαιροειδή σχηματίζουν την ικανότητα, και

in vivo

ογκογονικότητα των κυττάρων Huh7 μετά την αγωγή με αγωνιστές ΡΡΑΚγ. Βρήκαμε μια μικρή αύξηση στην απόπτωση των κυττάρων Huh7 κατά την κατεργασία με 15d-PGJ

2 για 48 ώρες (Εικόνα S1B). Είναι ενδιαφέρον ότι, μετά τη χρήση χρώσης 7-AAD για τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων, παρατηρήσαμε μια έντονη μείωση του ποσοστού των CD133

+ κύτταρα σε 15d-PGJ

κύτταρα 2-αγωγή (Εικόνα 1Β). Η μειωμένη έκφραση του CD133 πρωτεΐνης σε 15d-PGJ

2-επεξεργασμένα κύτταρα Huh7 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με κηλίδωση Western ανάλυση (Σχήμα 1 C). Εξετάσαμε επίσης τα κύτταρα αγωνιστή επεξεργασμένα ΡΡΑΚγ για ενσωμάτωση BrdU και χρώση CD133, και βρήκαμε ότι το ποσοστό των BrdU-επισημασμένου CD133

+ κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη μετά την επεξεργασία με 15d-PGJ

2. Επιπλέον, στην υποπληθυσμό αρνητικά για χρώση BrdU, μια δραματική μείωση στην έκφραση CD133 παρατηρήθηκε επίσης (Σχήμα 1 D). Επιπλέον, η θεραπεία με 1 μg /ml 15d-PGJ

2 σημαντικά μειωμένους αριθμούς σφαιροειδές κυττάρων Huh7 (Σχήμα 1 Ε).

Α, Huh7, SK-ΗΕΡ1, SMMC 7721 και Hep3B κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5 μg /ml 15d-PGJ

2 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01, έναντι κύτταρα ελέγχου. Β, κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,5 μg /ml 15d-PGJ

2 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και χρωματίστηκαν με CD133-ΡΕ. Πριν από την ανάλυση, η 7-AAD χρησιμοποιήθηκε για να αποκλείσει τα νεκρά κύτταρα. Αντιπροσωπευτικά προφίλ FACS εμφανίζονται (αριστερό πάνελ). Ποσοστά CD133 είναι

+ κύτταρα εμφανίζονται ως το μέσο ± S.E.M (n = 3) (δεξιός πίνακας). *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01. C, τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,5 μg /ml 15d-PGJ

2 για 24 ώρες και συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται για ανάλυση της έκφρασης CD133. Όλα τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν σε έκφραση GAPDH. D, τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,5 μg /ml 15d-PGJ

2 για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την ενσωμάτωση BrdU και χρώση CD133. Οι ποσοτικοί ιστογράμματα που παρουσιάζονται ως μέσο ± S.E.M (n = 3). *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Ε, τα κύτταρα Huh7 καλλιεργήθηκαν σε σφαιροειδή σχηματίζουν μέσο που περιέχει 15δ-PGJ

2 (1 μg /ml) για 7 ημέρες. Αντιπροσωπευτικά μικροσκοπικές εικόνες εμφανίζονται (αριστερό πάνελ). Κλίμακα bar = 100 μm. Οι ποσοτικοί ιστογράμματα παρουσιάζεται ως το μέσο ± S.E.M. (N = 3) (δεξιός πίνακας). *,

P

& lt?. 0.05

Η

Για να τεκμηριώσει τις παρατηρήσεις μας με

in vivo

πειραμάτων, αντιμετωπίζονται ποντίκια που φέρουν GFP

+ Huh7 όγκους με ένα PPARγ αγωνιστή. Επειδή η βιολογική δραστικότητα του 15d-PGJ

2 είναι συνήθως περιορισμένη

in vivo

[30], [31], η ροσιγλιταζόνη, ένα συνθετικό αγωνιστή ΡΡΑΚγ, χρησιμοποιήθηκε σε

in vivo πειράματα

σε δόση 100 mg /kg /ημέρα (το πρόγραμμα θεραπείας που φαίνεται στο Σχήμα 2Α). Ένα αποτέλεσμα αύξηση κατά του όγκου της ροσιγλιταζόνης παρατηρήθηκε (Σχήμα 2Β). Η ανάπτυξη του όγκου ανεστάλη κατά περίπου 60% (

P

& lt? 0.001). Εκτιμήσαμε περαιτέρω το δυναμικό σφαιροειδή σχηματισμού των καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από τον έλεγχο και τα ποντίκια που έλαβαν ροσιγλιταζόνη. Αξιοσημείωτα, GFP

+ καρκινικά κύτταρα που απομονώνονται από πρωτογενείς όγκους σε ποντίκια που έλαβαν ροσιγλιταζόνη σχηματίζονται μικρότερα και λιγότερα σφαίρες από εκείνα από την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 2C). Η χορήγηση 100 mg /kg /ημέρα ροσιγλιταζόνης επίσης μείωσε σημαντικά την αναλογία της GFP

+ CD133

+ κυττάρων όγκου (Σχήμα 2D). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν μια εξέχουσα ανασταλτική επίδραση του PPARγ αγωνιστή για την ανάπτυξη του όγκου και βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με τις ιδιότητες των κυττάρων HCC Huh7

in vivo

.

GFP

+ Huh7 κύτταρα (2 × 10

6) ήταν sc εμβολιάζεται σε γυμνά ποντίκια. Μετά από 4 ημέρες, τα ποντίκια με όγκους υπέστησαν αγωγή ημερησίως με φορέα ή ροσιγλιταζόνη (100 mg /kg /ημέρα) από ig για 12 ημέρες (η = 7 ανά ομάδα). Α, Σχηματική σκιαγράφηση της πειραματικής διάταξης. Β, οι Αρχικό εικόνες του ξενομοσχεύματος όγκοι εμφανίζονται (αριστερό πάνελ). Το βάρος του όγκου μετρήθηκε στο τέλος της αγωγής (δεξί πάνελ). Κάθε τελεία αντιπροσωπεύει το βάρος ενός ατόμου όγκου ξενομοσχεύματος. Οριζόντιες μπάρες αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (η = 7). ***

P

& lt? 0.001. C, ιστοί όγκου από τον έλεγχο και την αγωγή ομάδες ενζυματικά διαχωρίστηκαν σε μονοκύτταρους αναστολές και GFP

+ κύτταρα όγκου συλλέχθηκαν με διαλογή ροής και καλλιεργήθηκαν σε σφαιροειδή μέσο σχηματισμού για 7 ημέρες. Μια αντιπροσωπευτική φωτογραφία εμφανίζεται (αριστερό πάνελ). Κλίμακα bar = 100 μm. Ένα γράφημα περίληψη bar (μέση τιμή ± SD) εμφανίζεται στη δεξιά πλευρά. *,

P

& lt? 0,05. D, Τα διαχωρισμένα μονά κύτταρα όγκου από κάθε ποντικό βάφτηκαν με CD133-ΡΕ. Το ποσοστό των GFP

+ CD133

+ κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Εκπρόσωπος κυτταρομετρίας ροής προφίλ ανάλυσης εμφανίζονται (αριστερό πάνελ). Η αναλογία των CD133

+ κύτταρα σε GFP

+ κύτταρα όγκου παρουσιάζεται ως μέση ± SD (δεξί πάνελ). ***

P

& lt?. 0.001

Η

PPARγ αγωνιστές εμποδίζουν τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με φαινότυποι μέσω NOX2-εξαρτώμενη ROS γενιάς

Έχει αναφερθεί ότι ΡΡΑΚγ αγωνιστές επάγουν την παραγωγή ROS σε πολλαπλούς τύπους καρκινικών κυττάρων [32], [33]. Δεδομένου ότι έχει παρατηρηθεί η ρύθμιση της διαφοροποίησης των κυττάρων να είναι μια κρίσιμη λειτουργία των ROS [34], [35], ερευνήσαμε την πιθανότητα ότι η παραγωγή ROS συνέβαλαν στην PPARγ αγωνιστή που προκαλείται από την καταστολή των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με τις ιδιότητες στα κύτταρα HCC. Δοκιμάσαμε πρώτα επίπεδα ROS στα κύτταρα HCC μετά από έκθεση σε 15d-PGJ

2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα της ενδοκυτταρικής ROS ήταν δραματική αύξηση σε κύτταρα τόσο Huh7 και SK-ΗΕΡ1 μετά από θεραπεία με 15d-PGJ

2 για 72 ώρες (Εικόνα S2A). Έχουμε περαιτέρω απομονωμένες CD133

+ υποπληθυσμούς από κύτταρα Huh7 με FACS διαλογή και τους καλλιεργήθηκαν με την παρουσία ή απουσία 15d-PGJ

2 και το αντιοξειδωτικό NAC, ένας πρόδρομος της ενδοκυτταρικής γλουταθειόνης που αναστέλλει την παραγωγή ROS. Μετά από 3 ημέρες σε καλλιέργεια, το ποσοστό των CD133

+ κυττάρων στα κύτταρα ελέγχου μειώθηκε σε 74,84%, ενώ 15d-PGJ

2 θεραπεία προκάλεσε σημαντικά μεγαλύτερες μειώσεις του ποσοστού των CD133

+ κυττάρων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Α). Εντυπωσιακά, η συχνότητα του CD133

+ κυττάρων μειώθηκε στο 20,39% όταν η συγκέντρωση της 15d-PGJ

2 ήταν 1,0 μg /ml. Ωστόσο, η θεραπεία NAC εξασθενημένο σθεναρά αυτή 15d-PGJ

2 με τη μεσολάβηση της αναστολής και διατήρησε την CD133

+ διαμέρισμα (Σχήμα 3Α). Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση, η ανασταλτική επίδραση του 15d-PGJ

2 επί του σχηματισμού σφαιροειδές ήταν δραματικά μειωμένη όταν τα κύτταρα Huh7 προκατεργάστηκαν με NAC (σχήμα S2B). Επιπλέον, NAC εξασθενημένο επίσης την μείωση της έκφρασης του βλαστική ικανότητα που σχετίζονται με τα γονίδια τόσο Huh7 και τα κύτταρα SK-ΗΕΡ1 (Σχήμα S2C). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι PPARγ αγωνιστές ανέστειλε τις κυτταρικές-όπως φαινοτύπων καρκινικά βλαστικά μέσω θετική ρύθμιση της παραγωγής ROS. Επιπλέον, η εξάντληση του ΡΡΑΚγ με siRNA είχε μόνο ανεπαίσθητες επιδράσεις στην παραγωγή ROS που επάγεται από 15d-PGJ

2 (Σχήμα S3), υποδεικνύοντας ότι τα αποτελέσματα της θεραπείας ΡΡΑΚγ επαγωγή ROS ως επί το πλείστον μέσω μιας PPARγ-ανεξάρτητο μονοπάτι.

Α, Απομονωμένα CD133

+ Huh7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15d-PGJ

2 (0.5, 0.75 ή 1.0 μg /ml) και NAC (10 mM) είτε μόνο του ή σε συνδυασμό, και το ποσοστό των CD133

+ κυττάρων ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από 72 ώρες. Β, κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,5 μg /ml 15d-PGJ

2 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Η έκφραση του mRNA των γονιδίων της οξειδάσης του ΝΑϋΡΗ (

NOX2

και

NOX4

) μετρήθηκε με ποσοτική RT-PCR. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.E.M. (N = 3). ***

P

& lt? 0.001. C, τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,5 μg /ml 15d-PGJ

2 για 24 ώρες. Η έκφραση

P22

phOx, Ρ47

phOx, P67

phOx

και

Rac

mRNA προσδιορίστηκε με ποσοτική RT-PCR. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01. D, Huh7 και SK-ΗΕΡ1 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 0.5 μg /ml 15d-PGJ

2 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται για ανάλυση της έκφρασης NOX2. Ε, τα κύτταρα Huh7 επιμολύνθηκαν παροδικά με αρνητικό siRNA ελέγχου ή NOX2 siRNA-3, μετά το οποίο τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πιάτα εξαιρετικά χαμηλή κουλτούρα συνημμένο και καλλιεργήθηκαν σε σφαιροειδή σχηματίζουν μέσο που περιέχει 15δ-PGJ

2 για 7 ημέρες. Αριθμός σφαιροειδή που σχηματίζονται παρουσιάζεται ως το μέσο ± S.E.M. (N = 3). *,

P

& lt? 0,05. κύτταρα F, Huh7 επιμολύνθηκαν παροδικά με αρνητικό μάρτυρα siRNA ή NOX2 siRNA-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,5 μg /ml 15d-PGJ

2 για 72 ώρες και χρωματίστηκαν με CD133-ΡΕ. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.E.M. (N = 3). *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Το NADPH οξειδάσης (NOX) οικογένεια πρωτεϊνών είναι υπεύθυνη για την παραγωγή ROS [36]. Για να προσδιορίσετε αν οι οξειδάσες NADPH ρυθμίζεται προς τα πάνω και contributable στην αυξημένη παραγωγή ROS από τη διέγερση των PPARγ αγωνιστές, αναλύσαμε την αφθονία των διαφόρων

NOX

mRNA, συμπεριλαμβανομένων των

NOX2

και

NOX4

, σε κύτταρα κατεργασμένα με 15d-PGJ

2. Η έκφραση του

NOX2

και

NOX4

έγιναν αμέσως ρυθμίζεται προς τα πάνω, ξεκινώντας περίπου 3 ώρες μετά τη θεραπεία με 15d-PGJ

2 (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, βρήκαμε ότι επιμόλυνση siRNAs ειδικό για

NOX4

δεν επηρέασε δυσμενώς την 15d-PGJ

2-επαγόμενη παραγωγή ROS (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), ενώ τα επίπεδα του mRNA των διαφόρων κύριων συστατικών NOX2, όπως

P22

,

Ρ47

,

P67

και

Rac

, ήταν σημαντικά αυξημένη σε 15d-PGJ

2-επεξεργασμένα κύτταρα Huh7 (Σχήμα 3C) . Επιπλέον, το επίπεδο πρωτεΐνης του NOX2 ήταν ιδιαίτερα αυξημένα στα κύτταρα τόσο Huh7 και SK-ΗΕΡ1 κατά την κατεργασία με 15d-PGJ

2 (Σχήμα 3D). Εμείς απεμπλουτισμένο περαιτέρω έκφραση NOX2 με ειδικές siRNAs στα δύο κύτταρα Huh7 και SK-ΗΕΡ1, και βρήκαν ότι NOX2-εξαντλημένο κύτταρα παρουσίασαν ασθενέστερη επαγωγή των ROS σε απόκριση προς 15d-PGJ

2 θεραπεία σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (Εικόνα S4A). Η αποτελεσματικότητα του

NOX2

siRNAs στην αναστολή της έκφρασης NOX2 ελέγχθηκε με κηλίδωση Western και ποσοτική ανάλυση RT-PCR (Σχήμα S4B και C). Πράγματι, προς τα κάτω ρύθμιση NOX2 αντισταθμίζεται σημαντικά 15d-PGJ

2-διαμεσολαβούμενη αναστολή του σφαιροειδούς σχηματισμού και μέγεθος πισίνα του CD133

υποσύνολο + σε κύτταρα Huh7 (Σχήμα 3Ε και F). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρύθμιση προς τα πάνω της NOX2 ήταν υπεύθυνος για PPARγ αγωνιστή μεσολάβηση αναστολή των ιδιοτήτων των βλαστικών κυττάρων, όπως σε κύτταρα HCC.

Αμοιβαίες κανονισμού της ROS Παραγωγής και AKT ενεργοποίηση σε PPARγ αγωνιστή που έλαβαν HCC κύτταρα

στη συνέχεια, θα διερευνηθούν ενδεχόμενες αλλαγές στα μονοπάτια σηματοδότησης που ρυθμίζουν τις επιδράσεις που προκαλούνται από τους αγωνιστές ΡΡΑΚγ. Περιέργως, βρήκαμε ότι και οι δύο 15d-PGJ

2 και ροσιγλιταζόνη ενισχυθεί σημαντικά τη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, και αυτή η ενεργοποίηση PPARγ αγωνιστή που επάγεται από ΑΚΤ εξασθένισε με NAC σε Huh7 κύτταρα (Σχήμα 4Α). Ένα παρόμοιο φαινόμενο συνέβη επίσης σε κύτταρα SK-ΗΕΡ1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΡΡΑΚγ αγωνιστή που επάγεται ROS προκαλείται ΑΚΤ υπερενεργοποίηση. Να εξετάσει την πιθανή σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης ΑΚΤ και της παραγωγής ROS, χρησιμοποιήσαμε το triciribine αναστολέα ΑΚΤ και το LY294002 αναστολέα της PI3K για να καταστείλει δραστηριότητα ΑΚΤ, και βρήκαμε ότι τη δόση ή το χρόνο-εξαρτώμενη καταστολή της φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ έγινε παράλληλα με τη σταδιακή αυξητική αλλαγή στην έκφραση NOX2 (Σχήμα 4Β και C). Επιπλέον, συνδυαστική αγωγή των κυττάρων Huh7 τόσο με 15d-PGJ

2 και triciribine οδήγησαν σε ένα υψηλότερο επίπεδο της ενδοκυτταρικής ROS από ότι το κάθε αγωγή (Εικόνα 4D). Αυτή η συνεργιστική επίδραση παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα συν-κατεργασία με 15d-PGJ

2 και LY294002 (Σχήμα 4Ε). Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω τις παρατηρήσεις μας με τη χρήση συγκεκριμένων siRNAs κατά ΑΚΤ1 και ΑΚΤ2. Το siRNA κατά ΑΚΤ1 αυξήθηκε περαιτέρω επαγωγή ROS παρουσία 15d-PGJ

2 (Σχήμα 4F). Η αποτελεσματικότητα των ΑΚΤ1 και ΑΚΤ2 siRNAs στην αναστολή της ολικής και φωσφορυλιωμένης έκφραση ΑΚΤ ελέγχθηκε με κηλίδωση Western ανάλυση (Σχήμα 4F). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΡΡΑΚγ ενεργοποίησης ΑΚΤ που προκαλείται από αγωνιστή διαμορφωμένο NOX2 μεσολάβηση γενιάς ROS μέσω αρνητικής ανάδρασης.

Α, τα κύτταρα Huh7 προκατεργάστηκαν με NAC (10 mM) για 30 λεπτά ακολουθούμενη από 15d-PGJ

2 (0,5 μg /ml) για την πρόσθετη υποδεικνυόμενους χρόνους (άνω πάνελ). κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ροσιγλιταζόνη (5, 20 ή 50 μΜ) και NAC (10 mM) είτε μόνο του ή σε συνδυασμό για 6 ώρες (κάτω πίνακας). Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται για ανάλυση των Ρ-ΑΚΤ, ΑΚΤ, και έκφραση GAPDH. Β, κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον αναστολέα triciribine ΑΚΤ για 3 ώρες και η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται για την ανάλυση του NOX2, Ρ-ΑΚΤ, ΑΚΤ, και έκφραση GAPDH. C, τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LY294002 (10 μΜ) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και το επίπεδο πρωτεΐνης του NOX2 εξετάστηκε με ανάλυση Western blotting. D, τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15d-PGJ

2 και triciribine είτε μόνα τους ή σε συνδυασμό για 48 ώρες, μετά την οποία σημάνθηκαν με DHE και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.E.M. (N = 3). *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01. Ε, τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15d-PGJ

2 και LY294002 είτε μόνα τους ή σε συνδυασμό για 72 ώρες, μετά την οποία σημάνθηκαν με DHE και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.E.M. (N = 3). *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01. κύτταρα F, Huh7 επιμολύνθηκαν παροδικά με ΑΚΤ1 siRNA και ΑΚΤ2 siRNA είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, μετά την οποία τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5 μg /ml 15d-PGJ

2 για άλλες 3 ώρες (αριστερός πίνακας). Τα επίπεδα της Ρ-ΑΚΤ και πρωτεΐνες ΑΚΤ μετρήθηκαν με ανάλυση Western blotting. κύτταρα Huh7 επιμολύνθηκαν παροδικά με αρνητικό μάρτυρα siRNA ή ΑΚΤ1 siRNA, μετά την οποία τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,5 μg /ml 15d-PGJ

2 για ακόμη 72 ώρες (δεξί πάνελ). Η ενδοκυτταρική παραγωγή ROS αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (σημαίνει ± δ.Ε.Μ, η = 3). *,

P

& lt?. 0.05

Η

Η ΑΚΤ αναστολέας Triciribine Συνεργάζεται με PPARγ αγωνιστές να εμποδίζουν τον καρκίνο Stem Cell-όπως φαινότυποι και ανάπτυξη όγκου

Τα πιο πάνω αποτελέσματα μας ώθησε να υποθέσουμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία ενός PPARγ αγωνιστή και έναν αναστολέα της ΑΚΤ μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου πιο αποτελεσματικά από μόνα τους είτε αντιδραστήριο. Αξιολογήσαμε πρώτα εάν triciribine αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων HCC προς ΡΡΑΚγ αγωνιστή απόπτωση. Πράγματι, και στις δύο κύτταρα Huh7 και SK-ΗΕΡ1, ο συνδυασμός triciribine με 15d-PGJ

2 ή ροσιγλιταζόνη ενισχύεται σημαντικά την επαγωγή της απόπτωσης σε σύγκριση με είτε μόνο του (Σχήμα 5Α). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η θεραπεία συνδυασμού των κυττάρων Huh7 τόσο με 15d-PGJ

2 και triciribine δεν προκάλεσε περαιτέρω μείωση του ποσοστού του CD133

+ κυττάρων σε σύγκριση με τη θεραπεία του 15d-PGJ

2 μόνο. Ωστόσο, η θεραπεία συνδυασμού ήταν περισσότερο αποτελεσματική στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κύτταρα Huh7 σύγκριση με θεραπευτική αγωγή είτε ατομικών παράγοντα μόνο του (Σχήμα 5Β), που δείχνει ότι η θεραπεία συνδυασμού μείωσε περαιτέρω τον απόλυτο αριθμό των CD133

+ Huh7 κύτταρα. Στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με δύο 15d-PGJ

2 και triciribine, βρήκαμε ότι ο αριθμός των CD133 + κυττάρων

μειώθηκε κατά 70,9%, το οποίο ήταν υψηλότερο από το 46,1% στο 15d-PGJ

2 επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5C). Ομοίως, ο αριθμός των CD133

+ κυττάρων μειώθηκε κατά 89,6% με συνδυασμό θεραπεία της ροσιγλιταζόνης και triciribine, υψηλότερο από το 37,5% με τη θεραπεία με ροσιγλιταζόνη μόνο του (Σχήμα 5C). Επιπλέον, ο συνδυασμός θεραπείας κατέστειλε σφαιροειδή σχηματισμό των κυττάρων Huh7 πιο σημαντικά από ό, τι είτε 15d-PGJ

2 ή ΑΚΤ αναστολέα μόνη της (Σχήμα 5D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ΑΚΤ αναστολή από triciribine μπορεί να οξύνει τα ανασταλτικά αποτελέσματα των PPARγ αγωνιστές στον πληθυσμό της CD133

+ κύτταρα με απευθείας επαγωγής κυτταρικού θανάτου.

Α, Huh7 και SK-ΗΕΡ1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 15d-PGJ

2, η ροσιγλιταζόνη και triciribine είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων εκτιμήθηκε 48 ώρες αργότερα με χρώση Annexin V-FITC /7-AAD. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.E.M. (N = 3). *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001. Β, κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15d-PGJ

2 και triciribine είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. ***

P

& lt? 0.001. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01. Κλίμακα bar = 100 μm. *,

P

& lt? 0,05. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01. *,

P

& lt? 0,05? Κλίμακα bar = 100 μm. *,

P

& lt? 0,05? *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01.