έχουν

Abstract

οδών που εμπλέκονται στη σύνθεση του νευροδιαβιβαστή γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA) έχουν εμπλακεί στην παθογένεση του υψηλού βαθμού νευροενδοκρινικών (ΝΕ) νεοπλάσματα καθώς και νεοπλάσματα από γενεαλογία μη-ΝΕ. Χρήση Η Cancer Genome Atlas, η υπερέκφραση του συνθετικού ενζύμου GABA, γλουταμικό αποκαρβοξυλάση 1 (

GAD1

), βρέθηκε να σχετίζεται με μειωμένη ασθένεια ελεύθερο επιβίωση σε αδενοκαρκίνωμα του προστάτη και μειωμένη συνολική επιβίωση σε σαφή κύτταρο καρκινώματα νεφρικών κυττάρων . Επιπλέον,

GAD1

βρέθηκε να εκφράζεται σε ευνουχισμού ανθεκτικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, αλλά δεν αποκρίνονται στο ανδρογόνο κυτταρικές γραμμές. Χρησιμοποιώντας μια νέα δοκιμασία ενζυματική μικροπλάκα φθορισμού σε συνδυασμό για GABA διαμεσολαβείται μέσω της μείωσης της ρεζαζουρίνης σε ένα καρκίνωμα νευροενδοκρινικά προστάτη (PNEC) κυτταρική γραμμή, οξύ μικροπεριβάλλον που προκαλείται από το άγχος αυξημένα επίπεδα GABA, ενώ αλκαλικό μικροπεριβάλλον που προκαλείται από το άγχος μειώθηκε GABA μέσω της διαφοροποίησης των GAD1 και της συνθετάσης της γλουταμίνης (GLUL) δραστηριότητες. Επιπλέον, γλουταμίνη αλλά όχι στέρηση γλυκόζης μειώθηκε GABA μέσω της διαφοροποίησης των GLUL. Συνεπής με αποδεικτικά στοιχεία σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς ότι η σύνθεση GABA μεσολάβηση GAD1 μπορεί να διαδραματίσει καθοριστικό ρόλο στην επιβίωση του στρες, το GABA μπορεί να είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της επιβίωσης στρες σε νεοπλάσματα. Τα ευρήματα αυτά προσδιορίζουν τη σύνθεση GABA και το μεταβολισμό ως ένα εν δυνάμει σημαντικό μονοπάτι για τη ρύθμιση αντίδραση στο στρες των καρκινικών κυττάρων, καθώς και ένας πιθανός στόχος για τις θεραπευτικές στρατηγικές

Παράθεση:. Ippolito JE, Piwnica-Worms D (2014) Μια φθορισμού-Coupled Δοκιμασία για Gamma αμινοβουτυρικό οξύ (GABA) αποκαλύπτει μεταβολικό στρες-Induced Modulation of Content GABA στον Καρκίνο Νευροενδοκρινής. PLoS ONE 9 (2): e88667. doi: 10.1371 /journal.pone.0088667

Επιμέλεια: Domenico Κόπολα, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 του Οκτώβρη 2013? Αποδεκτές: 15 Ιανουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Ippolito, Piwnica-Worms. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από τον Ακτινολογικής Εταιρείας Βορείου Αμερικής (RR1031? https://www.rsna.org) και τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (Ρ50 CA94056). Ο πυρήνας HTS υποστηρίζεται εν μέρει από την καταβολή επιχορήγησης στο Κέντρο Siteman Καρκίνου (P30 CA091842). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή σύστημα

Ο νευροενδοκρινείς (ΝΕ) είναι ένα διάχυτο δίκτυο των κυττάρων διανέμεται σε όλο διάφορους ιστούς και όργανα που μπορεί να παράγει τοπική ή συστηματική επιδράσεις στη φυσιολογία μέσω της έκκρισης των ορμονών ή νευροδιαβιβαστές. Παρά το γεγονός ότι ορισμένα κύτταρα προκύπτουν από νευρική ακρολοφία, η πλειοψηφία προέρχονται από πολυδύναμα επιθηλιακά προγονικά κύτταρα [1]. Νευροενδοκρινείς (ΝΕ) καρκινώματα, πιστεύεται ότι προέρχονται από το σύστημα ΒΑ, συμβαίνουν σχεδόν σε όλες τις ανατομικές θέσεις και εμφανίζουν ένα ευρύ φάσμα φαινοτυπική συμπεριφορές από καλοήθη σε μεταστατικό [2], [3]. Για παράδειγμα, το «κλασικό» καρκινοειδών όγκων ή καρκινωμάτων NE χαμηλού βαθμού είναι καλά διαφοροποιημένο, έχουν χαμηλό μιτωτικό δείκτη, και μοιάζουν με υπερπλασία ΝΕ κυττάρων [2], [3], ενώ οι μικρές καρκινώματα ή καρκινώματα ΝΕ υψηλής ποιότητας είναι επιθετική και πτωχά διαφοροποιημένο [4] – [9]. Υψηλής ποιότητας καρκινώματα ΝΕ έχουν χαρακτηριστικά πολλές περιοχές νέκρωσης, ένα υψηλό μιτωτικό δείκτη [2], [3], και μία κακή πρόγνωση. Οι συμβατικές θεραπείες δεν βελτιώνουν την επιβίωση των ασθενών σε ασθενείς με καρκίνωμα υψηλής ποιότητας ΒΑ [10].

αδενοκαρκινώματα, τα οποία είναι πολύ πιο συχνή, προκύπτουν από ένα επιθηλιακής προέλευσης και να εμφανίσει ένα αδενικό μοντέλο ανάπτυξης [11]. Είναι ενδιαφέρον, αδενοκαρκινώματα μπορεί να εμφανίζουν NE χαρακτηριστικά χαρακτηρίζεται μοριακά ως έκφραση του γονιδίου προϊόντα που σχετίζονται με την ΒΑ κυτταρικής γραμμής. Αυτό το φαινόμενο έχει αποδειχθεί σε πολλούς τύπους αδενοκαρκινώματος, συμπεριλαμβανομένων εκείνων από πνεύμονα, του προστάτη, του παχέος εντέρου και, και συσχετίζεται με την επιθετικότητα του όγκου, μετάσταση, και να συντομευθούν επιβίωση [12] – [19]. Συγκεκριμένα, στην περίπτωση του καρκίνου του προστάτη, η έκφραση του ΝΕ διαθέτει θετικά συσχετίζεται με μεταστατικό δυναμικό και τον ευνουχισμό ανθεκτικά ανάπτυξη [19] – [21]. Δυστυχώς, η βιολογία των κυττάρων ΝΕ, καθώς και τη συμβολή τους στην ομοιόσταση του οργάνου παραμένουν ατελώς καθορίζεται, εν μέρει λόγω της έλλειψης αυτών των κυττάρων σε φυσιολογικά όργανα [22].

Προηγουμένως, χρησιμοποιήσαμε ένα συνδυασμό της γονιδιακής έκφρασης προφίλ, φασματομετρία μάζας, και φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού για τη διαλεύκανση μιας σειράς μεταβολικών δικτύων που εμπλέκονται στην επιθετική NE καρκίνων χρησιμοποιώντας ένα γενετικής μηχανικής μοντέλο ποντικού για μεταστατικό καρκίνωμα ΝΕ προστάτη, και ένα παράγωγο του προστάτη ΝΕ καρκινώματος (PNEC) κυτταρική γραμμή, όπου η cryptdin 2 υποκινητής καθοδηγεί την έκφραση των ογκογόνων μεγάλο Τ αντιγόνο (CR2-tag) [13], [23] – [25]. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων αυτών προσδιόρισε την σύνθεση και το μεταβολισμό του γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA) που προέρχονται από τα δύο οξύ (TCA) ενδιάμεσα και πολυαμίνες τρικαρβοξυλικού κύκλου (αναφέρονται συλλογικά ως η αναστόμωση GABA) ως ένα μεταβολικό δίκτυο ευδιάκριτα επάνω ρυθμίζεται σε επιθετική καρκινώματα NE [ ,,,0],13].

Σύγχρονη εξειδικευμένα όργανα που χρησιμοποιούνται για τις μεταβολικές αναλύσεις, όπως η φασματομετρία μάζας (MS) και πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) είναι ακριβά, απαιτούν σημαντική εκπαίδευση για να λειτουργήσει, και μπορεί να μην είναι άμεσα διαθέσιμα σε πολλά πανεπιστημιακά εργαστήρια . Κλασική ενζυματική που βασίζεται μεταβολίτη ποσοτικοποίηση, από την άλλη πλευρά, παρέχει ένα αποδοτικό, εύκολα προσιτές, ευαίσθητο μέσο για την ποσοτική ανάλυση των μεταβολιτών [26]. Παρά το γεγονός ότι δεν μπορούν να παράσχουν ταυτόχρονα πληροφορίες για τις ποσότητες των πολλαπλών μεταβολιτών, ενζυματική ποσοτικοποίηση προσφέρει την δυνατότητα για τον ποσοτικό προσδιορισμό συγχρόνως μια δεδομένη μεταβολίτη σε πολλά δείγματα σε μια πλατφόρμα υψηλής απόδοσης [27] – [29].

Πυριδίνη νουκλεοτιδίων ενζυματικές δοκιμασίες που βασίζονται ζευγάρι η παραγωγή NADH ή NADPH (συλλογικά αναφέρονται ως NAD (P) H) σε μια βιοχημική αντίδραση είναι ελκυστικά, καθώς αυτά τα νουκλεοτίδια μειωμένη φθορίζουν και μπορεί επομένως να χρησιμοποιηθεί για την ποσοτική ένδειξη του ενζύμου επίπεδα δραστηριότητας ή του μεταβολίτη. Ωστόσο, το υπόβαθρο φθορισμού σε βιολογικούς ιστούς μπορεί να περιορίσει την ευαισθησία της ανίχνευσης NAD (P) H [26].

πολλαπλές στρατηγικές για την ενίσχυση της φωτονικών εξόδου και να βελτιωθεί η ευαισθησία των ενζυμικών αντιδράσεων έχουν αναπτυχθεί [26], [ ,,,0],30] – [32]. Μία στρατηγική περιλαμβάνει τη σύζευξη του NAD (P) H σύνθεση για μιτοχονδριακή lipoyl αφυδρογονάση (διαφοράση) το οποίο ενεργοποιεί χημικά υποστρώματα για χρωμογόνο ή φθορισμού δοκιμασίες. Η ρεσαζουρίνη είναι μια τέτοια ένωση που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ενζυματικά συζευγμένο και προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας [27], [33], [34]. Εδώ, αναφέρουμε μία νέα ενζυματική δοκιμασία για τον ποσοτικό προσδιορισμό του GABA και επιτυχώς χρησιμοποιήσει αυτή τη δοκιμασία για να χαρακτηρίσει αλλαγές στην κυτταρική GABA σε κύτταρα PNEC υπό μεταβολικό στρες.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Όλες οι χημικές και ενζυματικές αντιδραστήρια αγοράστηκαν από Sigma.

Cell Culture

Όλες οι κυτταρικές σειρές δοκιμάζονται σε τακτική μυκόπλασμα αρνητικά. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε χαμηλή διέλευση υπό συμβατικές συνθήκες σύμφωνα με τα πρωτόκολλα ATCC σε 95% O

2/5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Ένα αυτο-προσάρτηση υποκλώνος της κυτταρικής γραμμής [35] Prostate Cancer Νευροενδοκρινής (PNEC) καλλιεργήθηκε όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [36]. Εν συντομία, DMEM /F12 μέσο (Invitrogen) συμπληρώθηκε με 10% θερμοαπενεργοποιημένο FBS (Gibco), 1% μη-βασικά αμινοξέα (ΝΕΑΑ, Gibco), Β27 συμπλήρωμα ορού (Invitrogen), 5 ng /ml EGF (BDBiosciences), 5 ng /ml bFGF (Sigma), και 15 mM 4- (2-υδροξυαιθυλο) -1-πιπεραζινοαιθανοσουλφονικό οξύ (HEPES) ρυθμιστικό διάλυμα (Gibco). Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέγιστο 75% συρροή. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, εξουδετερώθηκε με μέσο ανάπτυξης και διαβιβάσθηκαν. Οι σβώλοι κυττάρων για RNA ή βιοχημικές δοκιμασίες περιδινίστηκαν σε 125 Χ g για 5 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με παγωμένο φωσφορικό, και φυγοκεντρήθηκαν ξανά. Τα υπερκείμενα αναρροφήθηκαν και τα σφαιρίδια καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο. Όλα τα δείγματα αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση.

Αξιολόγηση της επιβίωσης Καμπύλες από τον καρκίνο Genome Atlas (TCGA)

Η cBioPortal για τον Καρκίνο Genomics [37], [38] που παρέχονται μέσα από το Cancer Genome Atlas Data Portal χρησιμοποιήθηκε για να έχουν πρόσβαση και να απεικονίσει την κλινική και την έκφραση του γονιδίου σύνολα δεδομένων του αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου προστάτη [39] και του καρκινώματος της ανθρώπινης σαφή κυττάρων των νεφρικών κυττάρων [40]. Μόνο οι «έκφραση mRNA z-score εναντίον Normals» επιλογή ελέγχθηκε. Επιλέχθηκαν «Όλοι οι όγκοι» για το ερώτημα. δεδομένων RNASeq χρησιμοποιήθηκε για τις σαφείς σύνολα δεδομένων καρκίνωμα. Οι καμπύλες επιβίωσης εκτιμήθηκαν με βάση την έκφραση των γονιδίων εντός της παροχέτευσης GABA. Δείγματα επιδεικνύουν αυξημένη

GAD1

έκφρασης (βαθμολογία z & gt? 2 ή 3) και μειωμένη

GLUL

έκφρασης (z & lt? -2) Εντοπίστηκαν και κλινικές πληροφορίες που εξάγονται. Οι καμπύλες επιβίωσης κατασκευάσθηκαν με GraphPad Prism.

Real Time PCR Primer Σχεδιασμός

Αστάρια για πραγματικού χρόνου PCR σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας PrimerBLAST.

GAD1

(NM_000817.2), αλλά όχι 18S rRNA (

RNA18S5

? NR_003286.2), σχεδιάστηκε κατά μήκος ενός κόμβου ιντρόνης-εξόνης. Επιλεγμένους εκκινητές δεν είχε καμία προβλεπόμενη ενίσχυση εκτός στόχου στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Primer θερμοκρασίες τήξεως σχεδιάστηκαν μεταξύ 61 ° C και 63 ° C. Οι εκκινητές ελέγχθηκαν με PCR από cDNA που συντέθηκε από κυτταρικές σειρές LNCaP NCI-H660 και. Αμπλικόνια αναμενόμενο μήκος (GAD1:145 bp? 18S: 182 bp) ελήφθησαν από παρασκευάσματα cDNA και δεν ήταν εμφανείς σε αντιδράσεις PCR χρησιμοποιώντας γονιδιωματικό DNA ως μήτρα ή νερό μόνο. Λιώστε καμπύλες και αποδοτικότητες ενίσχυση όλων των ζευγών εκκινητών διεξήχθησαν. Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι οι εξής:

GAD1

(προς τα εμπρός): 5′-ATGGGGTTCGCACAGGTCATCC-3 ‘,

GAD1

(reverse): 5′-TCCATGAGGACAAACACTGGTGCA-3′?

RNA18S5

(προς τα εμπρός): 5′-GGGCATTCGTATTGCGCCGC-3 ‘,

RNA18S5

(reverse): 5′-GAATAACGCCGCCGCATCGC-3′.

Real Time PCR

RNA απομονώθηκε από θραύση σφαιρίδια κατεψυγμένων κυττάρων χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen). Μετά την εκχύλιση του RNA, όλα τα δείγματα RNA δειγματίστηκαν και φυλάχθηκαν στους -80 ° C. Όλα τα δείγματα RNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dnase TURBO (Ambion) για την αφαίρεση του γενωμικού DNA. Όλα RNA που χρησιμοποιείται για ποσοτική PCR αμέσως σε αντίστροφη μεταγραφή με το κιτ iScript (BioRad). Η καθαρότητα του cDNA αξιολογήθηκε με ενίσχυση 18S rRNA PCR του δείγματος cDNA και ένα αρνητικό δείγμα ελέγχου RNA που έλειπε το αντίστροφης μεταγραφάσης. Όλα τα δείγματα που χρησιμοποιούνται για τα μετέπειτα πειράματα QPCR δεν είχε ανιχνεύσιμη γενωμικού μόλυνση DNA, όπως αποδεικνύεται από την έλλειψη ενός 18S αμπλικονίου ακόλουθες 40 κύκλους της αντίδρασης έλλειψη ανάστροφης μεταγραφάσης. Κάθε δείγμα δοκιμάστηκε εις τριπλούν σε 50 ng cDNA. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR πράσινο κύριο μείγμα (BioRad) και 100 ηΜ συγκέντρωση του ειδικού εκκινητή σε ένα όργανο Bio-Rad CFX96 PCR (95 ° C για 10 λεπτά, στη συνέχεια 40 κύκλους των 95 ° C για 30 s , 61 ° C για 1 λεπτό, και 74 ° C για 1 λεπτό). 18S rRNA εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικό πρότυπο.

Μεταβολικά πειράματα στρες

Για θρεπτικών πειράματα στέρησης, χωρίς γλυκόζη, χρησιμοποιήθηκε μέσο DMEM /F12 πυροσταφυλικό και γλουταμίνη (USBiological). Το μέσο συμπληρώθηκε με τα ακόλουθα συστατικά: θερμοαπενεργοποιημένο διαπίδυση ορό με αποκοπή 10 KDa μοριακού βάρους (Sigma), 1% μη-βασικά αμινοξέα (ΝΕΑΑ, Gibco), 5 ng /ml EGF (BDBiosciences), και 5 ng /ml bFGF (Sigma). Γλυκόζη και γλουταμίνη (Gibco) συμπληρώθηκαν με τα εξειδικευμένα μέσα ενημέρωσης όταν χρειάζεται. Γλυκόζη προστέθηκε στο μέσο χρησιμοποιώντας πρότυπες συγκεντρώσεις σκευάσματος DMEM /F12 των 17,5 mm. Γλουταμίνη χρησιμοποιήθηκε σε 6 mM. Πριν από την μεταβολική πειράματα στρες, τα κύτταρα PNEC απλώθηκαν σε πυκνότητα 400.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μια πλάκα 12 με 1,5 ml προτύπου μέσο ανάπτυξης. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες. Media ήταν αντάλλαξαν στη συνέχεια για 1,5 media άγχος mL. Για όλα τα πειράματα στρες ρΗ, τα συμβατικά μέσα ανάπτυξης PNEC χρησιμοποιήθηκε χωρίς διττανθρακικό ή HEPES ρυθμιστικά και τροποποιήθηκε ως εξής. Για στρες οξύ, 2 – (

N-μορφολινο

) αιθανοσουλφονικό οξύ (MES), ρΗ 6,5 προστέθηκε για μια τελική συγκέντρωση 20 mM. Για τους συμβατικούς pH, HEPES, ρΗ 7,4 προστέθηκε για μια τελική συγκέντρωση 20 mM και όξινο ανθρακικό νάτριο προστέθηκαν για τελική συγκέντρωση 0,34 g /L. Για αλκαλική στρες, τρις ​​(υδροξυμεθυλ) αμινομεθάνιο (Tris) ρΗ 8,5 προστέθηκε για μια τελική συγκέντρωση 20 mM και όξινο ανθρακικό νάτριο προστέθηκαν για τελική συγκέντρωση 0,34 g /L. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε υγροποιημένο θάλαμο χωρίς CO

2 στους 37 ° C για 24 ώρες.

Παρασκευή Δείγματος

Η προετοιμασία των δειγμάτων για την δοκιμασία ενζυματική τροποποιήθηκε από προηγουμένως περιγραφείσες μεθόδους [13 ], [26]. Για πειράματα στρες, τα μέσα γρήγορα αναρροφήθηκε από τα φρεάτια και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με 1 mL PBS. Για τα πειράματα οξέος και βάσης στρες, τα φρεάτια ξεπλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο στο κατάλληλο ρΗ με 20 mM MES ή HEPES ως ανωτέρω. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν σε 200 μι διαλύματος παγωμένου λύσης (50 mM υδροξείδιο του νατρίου και 1 mM EDTA) και ανακινήθηκε ήπια για 30 δευτερόλεπτα. Ένας ίσος όγκος 100 mM υδροχλωρικού οξέος προστέθηκε στη συνέχεια οξίνιση του προϊόντος λύσης. Οι πλάκες καλύφθηκαν με κολλητική ταινία σφράγισης PCR και επωάζονται σε ένα λουτρό νερού στους 60 ° C για 30 λεπτά για να καταστραφεί η ενδογενής δραστικότητα του ενζύμου, καθώς και ενδογενείς NADH. Μετά την επώαση, οι πλάκες εν συντομία φυγοκεντρούνται στα 100 χ g (Allegra 6R? Beckman Coulter-) για την εξάλειψη του συμπυκνώματος. Η ταινία απομακρύνθηκε και 100 μλ 400 mM Tris Base προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, για έναν συνολικό όγκο 500 μι κυτταρολύματος σε κάθε φρεάτιο (τελικό ρΗ περίπου 8). Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στα 15.000 χ g για 5 λεπτά για να κατακρημνιστούν τα συντρίμμια και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι περαιτέρω χρήσης.

Η ρεσαζουρίνη που βασίζεται Δοκιμασία για GABA και ηλεκτρικής ημιαλδεΰδης Προσδιορισμός

Μετά βελτιστοποίηση αντιδραστήριο, ο βασικού μείγματος για την ποσοτικοποίηση GABA και ηλεκτρικής ημιαλδεΰδης (Ssal) σε δείγματα αποτελούνταν από 0.063 U /mL GABase, 0.063 U /mL διαφοράση, 6,25 μΜ ρεσαζουρίνη, 100 μΜ φωσφορικού νικοτιναμιδο-αδενινο δινουκλεοτιδίου (NADP), 5 mM α-κετογλουταρικού και 3,125 μΜ διθειοθρεϊτόλη (DTT) σε 100 mM Tris βάση, ρΗ 8.8. Η βασικού μείγματος έγινε φρέσκο ​​πριν από κάθε πείραμα.

Ένα βασικού μείγματος για τον ποσοτικό προσδιορισμό μόνο Ssal περιλαμβάνονται τα παραπάνω αντιδραστήρια καθώς και 50 mM όξινο θειικό 2-αμινοαιθύλιο, έναν αναστολέα του συστατικού GABA τρανσαμινάση του παρασκευάσματος ενζύμου GABase. Ο αναστολέας προστέθηκε στο βασικού μείγματος για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την προσθήκη του βασικού μείγματος στα δείγματα. Ένα φρέσκο ​​παρασκεύασμα του αναστολέα παρασκευάσθηκε πριν από όλα τα πειράματα.

Κλάσματα του δείγματος (10 μΙ) προστέθηκαν σε φρεάτια μιας 96 φρεατίων διαυγούς πυθμένα πλάκα μαύρο καλλιέργειας (Costar) που ακολουθείται από προσθήκη 90 μλ βασικού μείγματος με ένα ηλεκτρονικό πολυκάναλη πιπέτα. Δύο κλάσματα του ίδιου δείγματος χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της συνολικής GABA συν Ssal ή Ssal μόνος στην ίδια πλάκα. Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, η αντίδραση διεξάγεται σε θερμοκρασία δωματίου και προστατεύθηκε από το φως επί 30 λεπτά. Το σήμα που λαμβάνεται από ρεζορουφίνη, το φθορίζον προϊόν ρεσαζουρίνης, ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας Fluostar Optima (BMG Labtech) με ένα /590 σετ φίλτρων nm εκπομπή 544 nm διέγερση (κέρδος, 1327? 10 αναλαμπών ανά φρεάτιο). Κινητική αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τους κύκλους 1 λεπτού.

Το σήμα για το σύνολο των GABA συν Ssal σε κάθε δείγμα αφαιρέθηκε από την μόνη σήμα Ssal για να ληφθεί το σήμα για GABA. Πρότυπες καμπύλες για GABA και Ssal κατασκευάστηκαν για ποσοτικοποίηση και διορθώθηκαν για την αντίδραση κενό με και χωρίς την παρουσία του όξινου θειικού 2-αμινοαιθυλ. GABA και Ssal μετρήσεις κανονικοποιήθηκαν σε πρωτεΐνη στα προϊόντα λύσης, ποσοτικοποιείται με τη δοκιμασία δικινχονινικού οξέος (BCA) (Pierce) χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού πρότυπη καμπύλη. Τα δεδομένα υποβάλλονται σε επεξεργασία με GraphPad Prism. Θρεπτικά και στρες ρΗ ομάδων αναλύθηκαν με έναν τρόπο ANOVA και Dunnett μετα-τεστ για στατιστική ανάλυση.

Η ρεσαζουρίνη που βασίζεται Δοκιμασία για Γλουταμινικό Προσδιορισμός

Μία ενζυματική δοκιμασία για τον προσδιορισμό του γλουταμικού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41]. Εν συντομία, τα συστατικά της αντίδρασης περιλάμβανε 10 μΜ ρεσαζουρίνη, 4 U /mL αφυδρογονάση γλουταμικού, 0,25 U /mL τρανσαμινάσης του γλουταμικού πυρουβικού, 100 μΜ αλανίνης, 0,5 mg /mL NAD +, και 0,5 U /mL διαφοράση σε 100 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5. 10 μL από τα παραπάνω δείγματα προστέθηκαν σε 90 μL του μίγματος της αντίδρασης και δοκιμασίες διεξήχθησαν στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Ρεζορουφίνη σήμα μετρήθηκε στα 15 λεπτά. Θρεπτικών ουσιών και το άγχος ρΗ ομάδες αναλύθηκαν με έναν τρόπο ANOVA και Dunnett μετα-τεστ για στατιστική ανάλυση.

NAD (P) H φθορισμού με βάση GABase Δοκιμασία

Η δοκιμασία αυτή τροποποιήθηκε από Passoneau [26 ]. Η βασικού μείγματος αποτελείτο από 0.08 U /mL GABase, 5 mM α-κετογλουταρικό, 500 μΜ NADP, 100 μΜ ϋΤΤ και 4 mM EGTA σε 100 mM πυροφωσφορικού νατρίου, ρΗ 8.6. Κλάσματα του δείγματος (10 μΙ) προστέθηκαν σε 96 φρεατίων οπτικής πλάκες (Falcon 353261) που ακολουθείται από 90 μι βασικού μείγματος. Η αντίδραση διεξήχθη σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και μετρήθηκαν σε ένα Fluostar Optima με ένα σετ φίλτρων εκπομπής 340 nm διέγερση /450 nm (κέρδος, 2103, 10 αναλαμπών ανά φρεάτιο).

Western Blotting των μεταβολικών ενζύμων

κύτταρα PNEC απλώθηκαν, τόνισε, και πλένονται όπως περιγράφεται παραπάνω. 100 μΙ παγωμένου ρυθμιστικού RIPA (10 mM Tris ρΗ 8,0, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 140 mM χλωριούχο νάτριο, 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), 0,1% δεοξυχολικό νάτριο, και 1% Triton Χ-100) που περιέχει 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο και φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF) προστέθηκε. Τα κύτταρα ξύστηκαν από τα φρεάτια σε πάγο και προστέθηκε σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα 10.000 χ g στους 4 ° C για να απομακρυνθεί το αδιάλυτο ίζημα. Η πρωτεΐνη προσδιορίστηκε ποσοτικά με δοκιμασία BCA όπως περιγράφεται ανωτέρω

Ένα σύνολο 30 μα πρωτεΐνης φορτώθηκε σε 4-12% Bis-Tris γέλη πολυακρυλαμιδίου (Bolt? Life Technologies). Με αναγωγικό παράγοντα σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Η πηκτή μεταφέρθηκε σε μεμβράνη Immobilon (Millipore) και αποκλείστηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό που περιέχει 5% αλβουμίνη ορού βοοειδών και 0.1% Tween-20. Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-GAD1 (MAB5406? Millipore) σε 1:5000 αραίωση, αντι-ALDH5A1 (HPA029716? Sigma) σε 1:1000 αραίωση, αντι-GLUL (MAB302? Millipore) σε 1:1000 αραίωση, και αντι-ACTB (ab8226? Abcam) σε 1:4000 αραίωση. Πρωτογενή αντισώματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Δευτερογενής κατσίκας αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού υπεροξειδάσης συζευγμένο αντίσωμα (Cell Signaling) στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε σε 1:5000 αραίωση. Η ίδια κηλίδα χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση της έκφρασης όλων των πρωτεϊνών. Μετά τη χρήση του κάθε αντίσωμα, το στύπωμα απογυμνώθηκε με Western Re-ανιχνευτή (G Biosciences) σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης WesternBright Quantum (Advansta).

ενζυματικές αναλύσεις

κύτταρα PNEC απλώθηκαν, τόνισε, και πλένονται όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα αποξέστηκαν σε 100 μΙ παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (100 mM φωσφορικό νάτριο, ρΗ 7,0, 20 μΜ φωσφορικής πυριδοξάλης και 0.1% Triton Χ-100) και επαναλαμβάνεται μια δεύτερη φορά για κάθε φρεάτιο. Τα δείγματα για λίγο σε επεξεργασία με υπερήχους (2-3 δευτερόλεπτα) σε πάγο και στη συνέχεια φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στα 10.000 χ g στους 4 ° C για να απομακρυνθεί το αδιάλυτο υλικό. Πριν από τη δειγματοληψία ποσοτικό προσδιορισμό, όλοι οι προσδιορισμοί αξιολογήθηκαν για γραμμικότητα σε σχέση με το χρόνο και την ποσότητα της προστιθέμενης λύματος. Όλες οι ενζυμικές δραστηριότητες κανονικοποιήθηκαν με το χρόνο και την ποσότητα της πρωτεΐνης στο κυτταρόλυμα. Στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

δοκιμασία αποκαρβοξυλάση γλουταμικού.

Η μέθοδος τροποποιήθηκε από ένα αρχικό πρωτόκολλο [42]. Το ρυθμιστικό δοκιμασίας περιείχε 100 mM φωσφορικό νάτριο ρΗ 7.0, 250 μΜ φωσφορική πυριδοξάλη, 50 mM γλουταμικό και 0,4% β-μερκαπτοαιθανόλη. Ένα κενό αντίδραση διεξήχθη για κάθε δείγμα και δεν περιείχαν φωσφορική πυριδοξάλη ή γλουταμινικού. 50 μι λύματος προστέθηκαν σε 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης σε μία πλάκα PCR και επωάστηκαν για έως και 8 ώρες στους 37 ° C σε ένα θερμοκυκλοποιητή χωρίς θερμαινόμενο καπάκι. Η δοκιμασία τερματίστηκε με την προσθήκη 17 μL 350 mM HCl και θερμαίνεται επί 30 λεπτά στους 60 ° C σε ένα θερμοκυκλοποιητή. Η πλάκα απομακρύνθηκε και εν συντομία φυγοκεντρούνται για την εξάλειψη του συμπυκνώματος. 17 μί 400 mM Tris βάση προστέθηκε για την εξουδετέρωση του δείγματος και η πλάκα φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα 1000 χ g για την εξάλειψη της πρωτεΐνης ίζημα. Τα φρεάτια στη συνέχεια αραιώνεται δέκα φορές για τη μέτρηση του GABA, το προϊόν της ενζυμικής αντίδρασης, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία GABase-ρεζαζουρίνης όπως περιγράφεται παραπάνω.

δοκιμασία συνθετάσης της γλουταμίνης.

Η μέθοδος τροποποιήθηκε από ένα αρχικό πρωτόκολλο χρησιμοποιώντας φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό της γ-γλουταμυλ υδροξαμίδιο [43]. Το ρυθμιστικό δοκιμασίας περιείχε 50 mM ιμιδαζολίου, ρΗ 6.8, 50 mM υδροξυλαμίνης, ρΗ 6,8, 100 mM γλουταμίνη, 25 mM αρσενικικού νατρίου, 0,2 mM διφωσφορική αδενοσίνη (ADP), και 0.5 mM χλωριούχο μαγγάνιο. Ένα κενό αντίδραση διεξήχθη για κάθε δείγμα και δεν περιείχαν αρσενικό, ADP, ή γλουταμίνη. 10 μι λύματος προστέθηκαν σε 90 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης σε μία πλάκα PCR και επωάστηκαν για έως και 8 ώρες στους 37 ° C σε ένα θερμοκυκλοποιητή χωρίς θερμαινόμενο καπάκι. Η αντίδραση τερματίστηκε με την προσθήκη 100 μL του αντιδραστηρίου ανάπτυξης (χλωριούχο 0.37 Μ σιδήρου (III), 0,3 Μ τριχλωροξεικού οξέος, 0,6 Μ HCl). Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθεί ίζημα και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 505 nm. απορρόφηση δείγμα βαθμονομηθεί με γ-γλουταμυλ υδροξαμική πρότυπο.

ALDH5A1 (SSADH) δοκιμασία.

Η μέθοδος αυτή τροποποιήθηκε από προηγούμενα πρωτόκολλα [26], [44]. Το ρυθμιστικό δοκιμασίας περιείχε 100 mM Tris ρΗ 8.8, 50 mM χλωριούχο κάλιο, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 2.5 mM νικοτιναμιδο αδενινο δινουκλεοτιδίου (NAD), 1.25 mM Ssal, και 0,02% αλβουμίνη βόειου ορού. Ένα κενό αντίδραση διεξήχθη για κάθε δείγμα και δεν περιέχουν Ssal. 10 μι λύματος προστέθηκαν σε 90 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης σε μία πλάκα PCR και επωάστηκαν για έως και 8 ώρες στους 45 ° C σε ένα θερμοκυκλοποιητή χωρίς θερμαινόμενο καπάκι. Οι αντιδράσεις μεταφέρθηκαν σε μικροπλάκα και η απορρόφηση του NADH, το ενζυματικό προϊόν, μετρήθηκε στα 355 nm. απορρόφηση δείγμα βαθμονομηθεί με πρότυπο NADH.

Αποτελέσματα

κλινικές επιπτώσεις από τις GABA Παράλληλοι

Έχουμε ήδη καθοριστεί με την έκφραση αναλύσεις ότι η σύνθεση GABA είναι εμπλουτισμένο σε κακοήθειες NE υψηλής ποιότητας [13] και επικύρωσε την παρουσία ενός λειτουργικού διακλάδωση του GABA στον καρκίνο του προστάτη ΒΑ (PNEC) κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό της γονιδιακής έκφρασης προφίλ, μεταβολίτη και του ενζύμου ποσοτικοποίηση δραστηριότητα [13], [25]. GABA μπορεί να προέρχεται από τρικαρβοξυλικό οξύ (TCA) τα ενδιάμεσα του κύκλου και πολυαμίνης /προϊόντα κατιονικά αμινοξύ που μεταβολισμό ζευγάρι GABA να πολλαπλές οδούς στον μεταβολισμό κυτταρικής ενέργειας (Εικ. 1). Σε μία οδό, GABA παράγεται από γλουταμινικό αποκαρβοξυλάση 1 (GAD1) ​​μεσολάβηση αποκαρβοξυλίωση του γλουταμικού προέρχεται είτε από γλουταμίνη ή άλφα-κετογλουταρικό από τον κύκλο TCA. Σε μια δεύτερη οδό, τα προϊόντα πολυαμίνης και της υποβάθμισης κατιονικά αμινοξέος μέσω πουτρεσκίνη υφίστανται οξειδοαναγωγής διαμεσολαβούμενη μετατροπή σε GABA. GABA μπορεί στη συνέχεια να μεταβολίζονται από αμινοβουτυρικό τρανσαμινασών (ABAT, GABA-T) και ημιαλδεΰδης αφυδρογονάση ηλεκτρικό οξύ (ALDH5A1, SSADH) σε ηλεκτρική για την έναρξη του κύκλου TCA

GLUD:. Αφυδρογονάση γλουταμικού? GLS: νλουταμινάσης? GLUL: γλουταμινικό-αμμωνία λιγάση? GAD1: γλουταμινικό αποκαρβοξυλάση? ODC1: αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης? ABP1: διαμίνη οξειδάση? ABAT: GABA τρανσαμινάση? Ssal: ηλεκτρικό ημιαλδεΰδης? ALDH5A1: ηλεκτρικό αφυδρογονάσης ημιαλδεΰδης οξύ? ALDH9A1: αλδεΰδη αφυδρογονάση? SAT1:. Σπερμιδίνη /σπερμίνη Ν-ακετυλτρανσφεράση

Η

Κατ ‘αρχάς, για να καθοριστεί αν η υπερέκφραση των ενζύμων διακλάδωσης GABA ήταν ανιχνεύσιμα σε ανθρώπινο προστάτη κακοήθειες και αν η υπερέκφραση συσχετίζονται με ανεπιθύμητες ενέργειες, χρησιμοποιήσαμε το cBioPortal [37] [38], της TCGA να ανακρίνουν έναν δημόσια διαθέσιμο σύνολο δεδομένων γονιδιακής έκφρασης του καρκίνου του προστάτη και των αντίστοιχων κλινικών πληροφοριών της [39] για ομάδες ασθενών των οποίων ο καρκίνος υπερεκφράζεται συστατικά του shunt GABA. Από όλα τα ένζυμα που αναφέρονται στο Σχ. 1,

GAD1

ήταν το μόνο γονίδιο του οποίου η υπερέκφραση συσχετίστηκε με μειωμένη επιβίωση ελεύθερη νόσου. Εμείς εντόπισε συνολικά 6 ασθενείς από ένα σύνολο 216 ασθενών (2,8%), των οποίων οι καρκίνοι εμφανίζονται

GAD1

υπερέκφραση με z-score μεγαλύτερο από 2. Οι ασθενείς με καρκίνους που υπερεκφράζονται

GAD1

είχαν διάμεσο ασθένεια ελεύθερο χρόνο επιβίωσης 19,8 μήνες έναντι 110,3 μήνες (p = 0,003) (Σχ. 2Α). Αυτή η ομάδα ασθενών είχε ένα ευρύ φάσμα επιπέδων αντιγόνου στον ορό του προστάτη (PSA) που κυμαίνονται από 3,5 έως 40,2 mg /dL, Gleason τάξεων που κυμαίνονται από 3 + 3 με 4 + 5, και σταδιοποίηση κυμαίνονται από T2C να T3B. Αν και υπήρχε μόνο μία τεκμηριωμένη περίπτωση μεταστατικού λεμφαδενοπάθεια κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης, όλα τα δείγματα απέδειξαν εξωκαψική επέκταση. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μειωμένη έκφραση της συνθετάσης γλουταμίνης (

GLUL

), που μπορούν δυνητικά να ανταγωνιστεί με το ένζυμο GAD1 για γλουταμικού συνδέθηκε επίσης με μειωμένη επιβίωση χωρίς ασθένεια. Συνολικά 14 ασθενείς με z-score κάτω από -2 ταυτοποιήθηκαν με μέση επιβίωση 27,9 μήνες έναντι 110,3 μήνες (p = 0,006? Εικ. 2Β).

Α.

GAD1

υπερέκφραση του mRNA στα αδενοκαρκινώματα του προστάτη συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση ελεύθερη νόσου. Όγκους με ένα

GAD1

έκφραση z-score μεγαλύτερο από 2 οθόνη μειωμένη επιβίωση ελεύθερη νόσου (διάμεσος 19,8 μήνες) σε σχέση με τους όγκους που δεν έχουν αυξηθεί

GAD1

έκφρασης (διάμεση 110,3 μήνα? p = 0,002). Β

GLUL

ρύθμιση προς τα κάτω σε αδενοκαρκινώματα του προστάτη συσχετίζεται με την ελεύθερη νόσου επιβίωση (μέσος όρος 27,9 μήνες) σε σχέση με τους όγκους χωρίς να

GLUL

ρύθμιση προς τα κάτω (διάμεση 110,3 μήνα? P = 0,006). Γ

GAD1

έκφραση mRNA σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη που μετράται με ποσοτική PCR.

GAD1

έκφραση είναι ανιχνεύσιμη σε ευνουχισμού ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-H660, PC3 και DU145, αλλά δεν αποκρίνονται στο ανδρογόνο κυτταρικές γραμμές LNCaP και LAPC4. 18S rRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. ΔΟ

t είναι η διαφορά του κύκλου όριο των

GAD1

και τον κύκλο κατώφλι του 18S rRNA. ΝΔ: Δεν ανιχνεύονται. Δ

GAD1

υπερέκφραση του mRNA με σαφείς καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων συσχετίζεται με μειωμένη συνολική επιβίωση. Όγκους με ένα

GAD1

z-score & gt? +2 Οθόνη μειωμένη συνολική επιβίωση (μέσος όρος 52,5 μήνες) σε σχέση με τους όγκους που δεν έχουν αυξηθεί

GAD1

έκφραση (μέσος όρος 80,6 μήνες? P = 0,01 ). Όγκοι με

GAD1

βαθμολογία-z & gt? 3 απεικόνιση μεγαλύτερο μειωμένη μέσος χρόνος επιβίωσης (διάμεση 31,1 μήνες) σε σχέση με το υπόλοιπο των όγκων (διάμεση 78,4 μήνες? P = 0.002)

Καθώς η έκφραση των γονιδίων ΝΕ έχει ενοχοποιηθεί στην ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο προστάτη, ειδικά σε σχέση με την αυξημένη έκφραση του δείκτη αποκαρβοξυλάση NE αρωματικό αμινοξύ (

DDC

) σε ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη καρκίνο [21], θα καθορίζεται εάν

GAD1

mRNA εμπλουτίστηκε σε ανθρώπινο ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη. Είναι ενδιαφέρον ότι,

GAD1

mRNA έκφραση ήταν ανιχνεύσιμη μόνο σε ευνουχισμού ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές (Σχ. 2C), με παρόμοια επίπεδα έκφρασης στο κυτταρική σειρά καρκίνου NCI-H660 ΝΕ και την PC3 και κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος DU145. Καμία ανιχνεύσιμη έκφραση της GAD1 ταυτοποιήθηκε με οποιονδήποτε από τους αποκρίνονται στο ανδρογόνο κυτταρικές γραμμές LNCaP και LAPC4.

Λόγω της εκθέσεως της έκφρασης πρωτεΐνης GAD1 σε ένα υποσύνολο των καρκινωμάτων των νεφρικών κυττάρων [45], μπορούμε ανακρίνεται ένας πρόσφατα δημοσιευμένη μελέτη του διαυγούς κυττάρου υποτύπου του καρκινώματα νεφρικών κυττάρων [40] που παρέχονται μέσω της cBioPortal να προσδιοριστεί αν υπήρχαν παρόμοια χαρακτηριστικά επιβίωσης. Εντοπίσαμε 39 ασθενείς από ένα σύνολο 499 ασθενών (8%), των οποίων οι όγκοι υπερεκφράζεται

GAD1

mRNA με z score μεγαλύτερο από 2. Η ομάδα αυτή εμφανίζεται μια σημαντικά μειωμένη συνολική επιβίωση σε σχέση με το συνολικό πληθυσμό σαφής καρκινικών κυττάρων με μέσο χρόνο επιβίωσης 52,5 μήνες σε σύγκριση με 80,6 μήνες (ρ = 0,01). Στη συνέχεια απομονώνεται μια ομάδα του

GAD1

όγκων που υπερεκφράζουν (n = 18) με z-score μεγαλύτερο από 3, και προσδιόρισε περαιτέρω μείωση στη συνολική επιβίωση, με μέσο χρόνο επιβίωσης 31,1 μήνες έναντι 78,4 μηνών (ρ = 0.002) (Σχ. 2D). Δεν υπήρχε σημαντική επίδραση της

GLUL

έκφραση του mRNA για την επιβίωση των ασθενών σε αυτόν τον πληθυσμό.

Δοκιμασία Ανάπτυξης

Το δυναμικό για GABA να έχουν προγνωστική σημασία στον εντοπισμό υποομάδες των ασθενών με καρκίνο με μειωμένη επιβίωση μας ώθησε να αναπτύξουμε μια δοκιμασία για GABA που θα μπορούσε να υιοθετηθεί ευρέως και είναι ανεξάρτητη από τεχνικά προκλητικό οργάνων, όπως η φασματομετρία μάζας και NMR. Το σχηματικό του συζευγμένου αντίδρασης που απαιτείται για να ποσοτικοποιηθεί GABA παρέχεται στο Σχ. 3. Η εμπορικά διαθέσιμη «GABase» παρασκεύασμα από

Pseudomonas fluorescens

είναι ένας συνδυασμός των δραστηριοτήτων ενζύμου ABAT και ALDH5A1 που οξειδώνουν GABA μέσω μιας σειράς δύο αντιδράσεις σε ηλεκτρικό, με αποτέλεσμα τη μείωση του συμπαράγοντα NADP προς NADPH. NADPH στη συνέχεια οξειδώνεται προς ΝΑϋΡ από μιτοχονδριακές διαφοράσης σύζευξη έτσι τη μείωση του ρεσαζουρίνη σε φθορίζουσα ρεσορουφίνη προϊόν. Αν και ALDH5A1 μπορεί να χρησιμοποιήσει τόσο NAD + και NADP ως υποστρώματα, NADP έχει συμβατικά χρησιμοποιηθεί ως συμπαράγοντας με το ένζυμο αυτό παρασκεύασμα [26].

Η παρασκευή GABase, ένας συνδυασμός ABAT και ένζυμα ALDH5A1 από

P. fluorescens

μετατρέπει GABA προς ηλεκτρικό μέσω της μετατροπής του α-κετογλουταρικού σε γλουταμικό και NADP να NADPH. Αν και NAD ή NADP μπορεί δυνητικά να χρησιμοποιηθούν ως υποστρώματα με ALDH5A1, NADP χρησιμοποιείται συμβατικά ως συμπαράγοντας για αυτήν την παρασκευή. Ηλεκτρικής ημιαλδεΰδης (Ssal), ένα ενδιάμεσο του μεταβολισμού GABA επίσης μεταβολίζεται από το παρασκεύασμα GABase. Διαφοράσης οξειδώνει το NADPH και μειώνει resazurin να φθορισμού ρεσορουφίνη. Εφαρμογή του όξινου θειικού 2-αμινοαιθυλ (2-AEHS), ένας αναστολέας της ABAT μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της συμβολής της Ssal προς το συνολικό σήμα που παράγεται από GABA και Ssal σε προϊόντα λύσης κυττάρου.

Η

Δοκιμασία Βελτιστοποίηση

μία δοκιμασία δραστικότητας ενζύμου κλασικής φθορισμού NADPH [26] χρησιμοποιήθηκε ως βάση για τη βελτιστοποίηση των επιμέρους συστατικών ενός ρεζαζουρίνης που βασίζεται ανάγνωση των GABA. Κάθε συστατικό τιτλοδοτείται επί ένα εύρος συγκεντρώσεων, διατηρώντας όλα τα άλλα συστατικά σταθερά (Εικ. 4). Όπως ήταν αναμενόμενο, η δοκιμασία ήταν ευαίσθητη προς ρεσαζουρίνη, επιδεικνύοντας μια αύξηση 5,9 φορές σε σχέση με το υπόβαθρο του σήματος σε μία συγκέντρωση 6,25 μΜ.