Αφηρημένο

Ο ρόλος της νεο-αγγειογένεσης στον καρκίνο του προστάτη ανάπτυξη και μετάσταση (PCA) είναι καθιερωμένη, αλλά η ανάπτυξη αποτελεσματικών και μη-τοξικά φαρμακολογικές αναστολείς της αγγειογένεσης παραμένει ανεκτέλεστο στόχος. Σε αυτό το πλαίσιο, που στοχεύουν στην ανώμαλη αγγειογένεση μέσω μη-τοξικά φυτοχημικά θα μπορούσε να είναι μια ελκυστική angiopreventive στρατηγική κατά της PCA. Το σκεπτικό της παρούσας μελέτης ήταν να συγκριθεί η αντι-αγγειογενετική δυναμικό των τεσσάρων καθαρών διαστερεοϊσομερών flavonolignans, δηλαδή σιλυμπίνη Α, Β σιλυμπίνη, ισοσιλυβίνη Α και Β ισοσιλυβίνη, που ιδρύσαμε στο παρελθόν ως βιολογικά ενεργά συστατικά στο εκχύλισμα Milk Thistle. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η στοματική σίτιση αυτών flavonolignans (50 και 100 mg /kg σωματικού βάρους) αναστέλλουν αποτελεσματικά την ανάπτυξη των προηγμένων ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου PCA DU145. Ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι αυτοί flavonolignans αναστέλλουν βιοδείκτες όγκου αγγειογένεση (CD31 και νεστίνης) και μόρια σηματοδότησης που ρυθμίζουν την αγγειογένεση (VEGF, VEGFR1, VEGFR2, φωσφο-Ακί και HIF-1α) χωρίς να επηρεάζεται δυσμενώς το σκάφος καταμέτρηση σε φυσιολογικούς ιστούς (ήπαρ, πνεύμονες, και νεφρό) των ποντικών που φέρουν όγκο. Αυτές flavonolignans επίσης ανέστειλε την μικροαγγείων βλάστησης από ποντίκι αορτές ραχιαίο

ex vivo

, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που επάγεται με VEGF, σχηματισμός τριχοειδούς σωλήνα-όπως και διεισδυτικότητα των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων ομφάλιας φλέβας (HUVEC)

in vitro

. Περαιτέρω μελέτες σε HUVEC έδειξε ότι αυτές οι διαστερεοϊσομερή στόχευση του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και VEGF-επαγόμενη καταρράκτη σηματοδότησης. Τρισδιάστατη δοκιμασία ανάπτυξης καθώς και εισβολή συν-καλλιέργεια και

in vitro μελέτες

αγγειογένεσης (με HUVEC και DU145 κύτταρα) πρότεινε τη διαφορική αποτελεσματικότητα των διαστερεοϊσομερών προς PCA και ενδοθηλιακά κύτταρα. Συνολικά, οι μελέτες αυτές διευκρινιστεί το συγκριτικό αντι-αγγειογενετική αποτελεσματικότητα της καθαρής flavonolignans από Milk Thistle και προτείνουν τη χρησιμότητά τους στο PCA angioprevention

Παράθεση:. Βαθιά G, Gangar SC, Rajamanickam S, Raina Κ, Gu Μ, Agarwal C , et al. (2012) Angiopreventive Αποτελεσματικότητα της Καθαρής Flavonolignans από Milk Thistle Απόσπασμα κατά του καρκίνου του προστάτη: Η στόχευση VEGF-VEGFR σηματοδότησης. PLoS ONE 7 (4): e34630. doi: 10.1371 /journal.pone.0034630

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Δεκ του 2011? Δεκτές: 2, Μάρτη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Βαθιά et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από NCI R01 επιχορηγήσεις CA102514 και CA104286. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται μη-δερματική κακοήθεια μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες, και είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1]. Κλινική και πειραματική απόδειξη έχουν προτείνει ότι ανθρώπινων όγκων θα μπορούσε να διαρκέσει για χρόνια ως μικροσκοπικές αλλοιώσεις σε μια κατάσταση αδράνειας και η περαιτέρω ανάπτυξη τους εξαρτάται κρίσιμα από την επίτευξη ενός «αγγειογόνο φαινότυπο» [2], [3], [4], [5] . «Αγγειογονικοί διακόπτες» που αφορούν την υψηλή VEGF και των υποδοχέων του VEGF έχουν επίπεδα (VEGFR) έχουν ταυτοποιηθεί και θεωρείται υπεύθυνη για την PCA εξέλιξη από το PIN χαμηλής ποιότητας (προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία) στάδιο να PIN υψηλής ποιότητας και περαιτέρω σε πιο επιθετική, ελάχιστα διαφοροποιημένες και ανδρογόνα ανεξάρτητος κακοήθη στάδια [6]. Επιπλέον, το επίπεδο της αγγειογένεσης στο PCA έχει συσχετιστεί άμεσα με το σκορ Gleason, το στάδιο του όγκου, εξέλιξη, μετάσταση και επιβίωση [6], [7], [8]. Ως εκ τούτου, η αγγειογένεση στόχευσης έχει αποτελέσει αντικείμενο πολλών κλινικών ερευνών για τη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών με καρκίνο [9], [10], [11]. Επιπλέον, αποτρέποντας την εμφάνιση της αγγειογένεσης σε όγκους βραδείας εξέλιξης (που αναφέρεται ως «angioprevention») έχει προταθεί ως μια νέα και λογική προσέγγιση για τον έλεγχο της ανάπτυξης PCA, κακοήθη πρόοδο και μετάσταση σε δευτερογενείς θέσεις. Κινήθηκαν

ξενομοσχεύματα DU145 και στους ποντικούς χορηγήθηκε είτε όχημα (CMC) ή 50 και 100 mg δόσεων /kg σωματικού βάρους κάθε διαστερεοϊσομερούς. (Α) Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε και σχεδιάστηκε ως μια συνάρτηση του χρόνου (ημέρες). Κάθε τιμή στις καμπύλες είναι μέση τιμή ± SEM των 10-12 ποντικών. (Β-D) ξενομοσχεύματος ιστοί αναλύθηκαν για PCNA, TUNEL και διασπασμένη κασπάση-3 (CC3) με IHC. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στα διαγράμματα μπαρ είναι ο μέσος όρος ± SEM 4-5 δείγματα. Συντομογραφίες: Sil Α: σιλυμπίνη Α? Sil Β: σιλυμπίνη Β? Iso Α: ισοσιλυβίνη Α, Iso Β: ισοσιλυβίνη Β? *, P ≤ 0.001? #, P ≤ 0,01? $, P ≤ 0,05.

Η

DU145 ιστούς ξενομοσχεύματος αναλύθηκαν για CD31, νεστίνη, VEGF και VEGFR2 από την IHC. Ποσοτικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Zeiss Axioscope 2 μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Γερμανία) και οι φωτογραφίες είχαν αρχικά συλληφθεί (σε 400x) με μια κάμερα Carl Zeiss AxioCam MRC5 με Axiovision Σχετ 4.5 του λογισμικού. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στα διαγράμματα μπαρ είναι ο μέσος όρος ± SEM 4-5 δείγματα. Συντομογραφίες: Sil Α: σιλυμπίνη Α? Sil Β: σιλυμπίνη Β? Iso Α: ισοσιλυβίνη Α, Iso Β: ισοσιλυβίνη Β? *, P ≤ 0,001.

Η

DU145 ιστούς ξενομοσχεύματος αναλύθηκαν για VEGFR1, HIF-1α, φωσφορυλιωμένη Akt

Ser473 και τα συνολικά επίπεδα Akt από την IHC. Ποσοτικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Zeiss Axioscope 2 μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Γερμανία) και οι φωτογραφίες είχαν αρχικά συλληφθεί (σε 400x) με μια κάμερα Carl Zeiss AxioCam MRC5 με Axiovision Σχετ 4.5 του λογισμικού. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στα διαγράμματα μπαρ είναι ο μέσος όρος ± SEM 4-5 δείγματα. Συντομογραφίες: Sil Α: σιλυμπίνη Α? Sil Β: σιλυμπίνη Β? Iso Α: ισοσιλυβίνη Α, Iso Β: ισοσιλυβίνη Β? *, P ≤ 0,001.

Η

Περίπου πριν από τέσσερις δεκαετίες, Judah Folkman προέβλεψε πρώτα τον πιθανό ρόλο για την αντι-αγγειογενετική αναστολείς έναντι στερεών καρκίνων, και μέχρι σήμερα, αρκετές αναστολέων αγγειογένεσης έχουν δοκιμαστεί ενάντια σε πολλές κακοήθειες [ ,,,0],12], [13], [14], [15]. Πολλοί από αυτούς τους αναστολείς έχουν ήδη εγκριθεί από την FDA για τη χρήση τους, είτε μόνο του ή σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά φάρμακα καρκίνου [13], [15], [16]. Για παράδειγμα, ανθρωποποιημένο αντίσωμα VEGF εγκρίθηκε κατά ορθοκολικού, του εγκεφάλου, των πνευμόνων, και η νεφρική καρκίνους [16]. Ομοίως, η αναστολείς της τυροσινικής κινάσης sorafenib και sunitinib, οι οποίες στοχεύουν δραστηριότητα VEGFR, έχουν εγκριθεί για χρήση κατά προχωρημένο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [16]. Αν και αναστολή της αγγειογένεσης στον καρκίνο, κατ ‘αρχήν, είναι ένας ήχος προληπτική /θεραπευτική στρατηγική, η τρέχουσα προσέγγιση της στόχευσης ένα μοναδικό μόριο όπως VEGF ή VEGFR είναι λανθασμένη, καθώς τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσουν αντίσταση μέσα από παράκαμψη αυτών των μορίων και συνεχίζουν να διαδίδουν αγγειακών δικτύων [17 ]. Εκτός από περιορισμένη αποτελεσματικότητα τους όσον αφορά την βελτίωση στην επιβίωση του ασθενούς, αυτές οι θεραπευτικές επιλογές είναι εξαιρετικά ακριβά και έχουν δείξει μη αποδεκτά επίπεδα τοξικότητας [18], [19]. Ως εκ τούτου, μπορούμε να εξορθολογιστούν την ανάγκη να εντοπιστούν μη τοξικές φυσικές ουσίες με αντι-αγγειογενετική δραστικότητα ευρέως φάσματος? και στο πλαίσιο αυτό, στην παρούσα μελέτη, που επικεντρώθηκε στην αντι-αγγειογενετική αποτελεσματικότητα των τεσσάρων καθαρών διαστερεοϊσομερών από Milk Thistle (

Silybum marianum

) εξάγει, δηλαδή σιλυμπίνη Α, Β σιλυμπίνη, ισοσιλυβίνη Α και Β ισοσιλυβίνη Αυτά τα διαστερεοϊσομερή είναι flavonolignans με πανομοιότυπο φλαβονοειδές τμήμα και διαφέρουν μόνο σε διαμορφώσεις τους για το ήμισυ λιγνανών, και έχουν χημικές και βιολογικές τους ιδιότητες έχουν λεπτομερώς νωρίτερα [20], [21], [22], [23], [24]. Εδώ, για πρώτη φορά, αναλύσαμε την angiopreventive αποτελεσματικότητα αυτών των flavonolignans στο μοντέλο ξενομοσχεύματος PCA και διάφορα

ex vivo

,

in vivo

και

in vitro

δοκιμασίες αγγειογένεσης.

(Α-Β) πνεύμονες, το ήπαρ και τα νεφρά από κάθε ποντικό συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για CD31 ανοσοαντιδραστικότητα καθώς επίσης και για ιστοπαθολογικές αναλύσεις. Ποσοτικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Zeiss Axioscope 2 μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Γερμανία) και οι φωτογραφίες είχαν αρχικά συλληφθεί (σε 400x) με μια κάμερα Carl Zeiss AxioCam MRC5 με Axiovision Σχετ 4.5 του λογισμικού. Συντομογραφίες: Sil Α: σιλυμπίνη Α? Sil Β: σιλυμπίνη Β? Iso Α: ισοσιλυβίνη Α, Iso Β: ισοσιλυβίνη Β

Η

(Α) Flavonolignans αναστέλλουν την αγγειογένεση

ex vivo

. αορτές Mouse απλώθηκαν επί matrigel και κατεργάζεται με flavonolignans. Τα βέλη στην εικόνα σηματοδοτήσει τις αναδυόμενες σκαφών από τις αορτές. (Β) Flavonolignans αναστέλλει τον σχηματισμό σωλήνα που επάγεται από VEGF σε HUVEC. HUVEC καλλιεργήθηκαν επί matrigel και το αποτέλεσμα της θεραπείας επί του σχηματισμού διαστερεοϊσομερών σωλήνα επαγόμενης από VEGF αναλύθηκε. Αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες σωληνωτό δίκτυο εμφανίζεται στο 100x (πάνω πίνακα). μήκος σωλήνα ποσοτικά, όπως περιγράφεται στο «Μέθοδοι» (κάτω πίνακας). Συντομογραφίες: Sil Α: σιλυμπίνη Α? Sil Β: σιλυμπίνη Β? Iso Α: ισοσιλυβίνη Α, Iso Β: ισοσιλυβίνη Β? *, P ≤ 0,001.

Η

(Α) HUVEC επάγονται με VEGF και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κάθε flavonolignan σε 0.5% ορού μέσα, και ο συνολικός αριθμός των κυττάρων αναλύθηκε μετά από 24 ώρες. (Β) HUVEC καλλιεργήθηκαν στον άνω θάλαμο με DMSO ή επιμέρους διαστερεομερές, ενώ VEGF προστέθηκε στον κάτω θάλαμο και HUVEC εισβολή μελετήθηκε. Συντομογραφίες: Sil Α: σιλυμπίνη Α? Sil Β: σιλυμπίνη Β? Iso Α: ισοσιλυβίνη Α, Iso Β: ισοσιλυβίνη Β? *, P ≤ 0.001? #, P ≤ 0,01? $, Σ ≤ 0,05.

Η

(Α-Β) HUVEC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή μεμονωμένες flavonolignan και αναλύθηκαν για συνολικό αριθμό κυττάρων και η κατανομή του κυτταρικού κύκλου. (Γ) HUVEC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flavonolignans, και 24 ώρες αργότερα, τα συνολικά κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου. Οι τιμές πυκνότητας που παρουσιάζονται κάτω από τις ζώνες είναι «φορές αλλαγή» σε σύγκριση με τον έλεγχο μετά τη φόρτωση ελέγχου (α-τουμπουλίνης) κανονικοποίηση. (D) HUVEC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flavonolignans (στα 30 μΜ δόση) για 36 ώρες και αναλύθηκαν για μορφολογία (τα αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες δείχνονται σε 100χ), τα επίπεδα του cPARP, διασπασμένη κασπάση 3 και 9, και το ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων. Συντομογραφίες: Sil Α: σιλυμπίνη Α? Sil Β: σιλυμπίνη Β? Iso Α: ισοσιλυβίνη Α, Iso Β: ισοσιλυβίνη Β? *, P ≤ 0.001? #, P ≤ 0,01? $, Σ ≤ 0,05.

Η

HUVEC στερήθηκαν τον ορό για 22 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαστερεοϊσομερή για 2 ώρες και διεγέρθηκαν με VEGF (10 ng /ml) για 10 λεπτά. Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για αναφερθέντων μορίων σηματοδότησης. Οι τιμές πυκνότητας που παρουσιάζονται κάτω από τις ζώνες είναι «fold αλλαγή» σε σύγκριση με τον έλεγχο μετά τη φόρτωση ελέγχου (β-ακτίνη) κανονικοποίηση.

Η

(Α) Επίδραση της flavonolignans (σε 90 μΜ δόση) για την τρισδιάστατη αύξηση των κυττάρων DU145 μελετήθηκε όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Αντιπροσωπευτικά σφαιροειδή μικροφωτογραφίες παρουσιάζονται στο 100x και 400x. (Β) Σε δοκιμασία εισβολής Transwell, είτε κύτταρα DU145 (απλώνονται στον κάτω θάλαμο) ή HUVEC (plated στον άνω θάλαμο) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μεμονωμένα διαστερεοϊσομερή (30 δόση μΜ), και μετρήθηκε HUVEC διεισδυτικότητα. (C) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με μεμονωμένα διαστερεοϊσομερή (30 δόση μΜ) και εμπλουτισμένο μέσο συνελέγη. HUVEC καλλιεργήθηκαν επί Matrigel, μαζί με 0.5% FBS ή ρυθμισμένα μέσα από διαφορετικές ομάδες θεραπείας? και ο σχηματισμός σωλήνα αναλύθηκε. Οι αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες σωληνωτών δικτύων εμφανίζονται σε 100x. Συντομογραφίες: Sil Α: σιλυμπίνη Α? Sil Β: σιλυμπίνη Β? Iso Α: ισοσιλυβίνη Α, Iso Β: ισοσιλυβίνη Β? CM: Προσαρμοσμένα μέσα? *, P ≤ 0.001? #, Ρ ≤ 0,01.

Η

σιλυβίνη Α, σιλυβίνη Β, Α και ισοσιλυβίνη ισοσιλυβίνη αγγειογένεση στόχος Β σε όγκους του προστάτη μέσω της στόχευσης μορίων σηματοδότησης σε κύτταρα PCA καθώς και σε ενδοθηλιακά κύτταρα, το σημαντικό συστατικό της PCA μικροπεριβάλλον.

η

Μέθοδοι

Γραμμή κυττάρων και αντιδραστήρια

Ανθρώπινα κύτταρα PCA DU145 ήταν από την ATCC (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω [25]. HUVEC ήταν από την Lonza (Walkersville, MD) και αναπτύχθηκαν σε μέσο με EBM2 EGM-2 συμπληρώματα SingleQots. Matrigel και θάλαμο εισβολή ήταν από BD Biosciences (New Bedford, ΜΑ). κιτ δοκιμασίας TUNEL ήταν από την Promega (Madison, WI). Καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη (CMC), Harris αιματοξυλίνη και αντίσωμα β-ακτίνης ήταν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ). κιτ DAB ήταν από την Vector Laboratories (Burlingame, CA). Η στρεπταβιδίνη και PCNA αντίσωμα ήταν από την Dako (Carpinteria, CA). Αντισώματα για CD31, VEGF και νεστίνης ήταν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Αντισώματα για VEGFR1, VEGFR2, και HIF-1α [χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία (IHC) ανάλυση] καθώς και αντισώματα για CDK2, CDK4, Cdc2, κυκλίνη D1, κυκλίνη D3, κυκλίνη Β1, ρ21, ρ27, Skp 2, cdc25A και Cdc25C και φυσιολογικό ορό κατσίκας ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). αντίσωμα ρ27 ήταν από NeoMarkers (Fremont, CA) και αντίσωμα ρ21 ήταν από την Upstate (Charlottesville, VA). Αντισώματα που αναγνωρίζουν το φωσφορυλιωμένο και /ή ολικά επίπεδα πρωτεΐνης VEGFR1, VEGFR2, Src, ERK1 /2, Akt, Bad, mTOR, p70S6K, διασπασμένη κασπάση 3, διασπασμένη κασπάση 9, και συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού ήταν από τη Cell σηματοδοσίας (Beverly, ΜΑ). σύστημα ανίχνευσης ECL και δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP αντι-ποντικού ήταν από GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). VEGF ήταν από την R & amp? D (Minneapolis, ΜΝ). Σιλυμπίνη Α, Β σιλυμπίνη, ισοσιλυβίνη Α και ισοσιλυβίνη Β απομονώθηκαν (καθαρότητα & gt? 97%) από την σκόνη εκχύλισμα των καρπών του

Silybum marianum

(L.) Gaertn. [Προέρχονται από Euromed, S.A. (Βαρκελώνη, Ισπανία)]. Τα υβριδικά χρωματογραφίας /κατακρημνιστική τεχνικές και διαδικασίες για τον καθαρισμό κλίμακα γραμμάριο αυτά flavonolignans έχουν ήδη αναφερθεί στο παρελθόν [26].

In Vivo

ξενομοσχεύματος όγκου Μελέτη

αθυμικά (

ηυ /ηυ

) αρσενικά γυμνά ποντίκια ήταν από την NCI (Frederick, MD). Το πρωτόκολλο θεραπείας εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου του Κολοράντο. Περίπου 3 × 10

6 DU145 κύτταρα αιωρήθηκαν σε 50 μι του μέσου χωρίς ορό, αναμιγνύεται με 50 μΙ Matrigel, και ενέθηκαν s.c. στο δεξί πλευρό του κάθε ποντικού. Την ημέρα μετά την εμφύτευση ξενομοσχευμάτων, οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε εννέα ομάδες, και όλες οι θεραπείες έγιναν από του στόματος καθετηριασμό ως: ποντίκια της Ομάδας Ι (ομάδα ελέγχου οχήματος) με 200 μι 0,5% CMC (w /v) σε αποστειρωμένο νερό? Ομάδες II και III ποντικών με 50 και 100 mg /kg βάρους σώματος της σιλυβίνης Α? Ομάδες IV και V ποντικών με 50 και 100 mg δόσης /kg σωματικού βάρους της σιλυβίνης Β? Ομάδες VI και VII ποντικών με 50 και 100 mg /kg βάρους σώματος του ισοσιλυβίνη Α? και των Ομάδων VIII και IX ποντικών με 50 και 100 mg /kg βάρους σώματος του ισοσιλυβίνη Β, αντίστοιχα. Όλες αυτές οι θεραπείες (5 ημέρες /εβδομάδα) δόθηκαν σε 200 μL 0,5% CMC. Όπως και οι τέσσερις ενώσεις έχουν ίδιο μοριακό βάρος (482,1), κάθε επίπεδο δόσης ήταν ισομοριακές σε αυτούς τους παράγοντες. Μόλις ανάπτυξη ξενομοσχεύματος όγκου είχε αρχίσει, τα μεγέθη όγκων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ψηφιακή δαγκάνα και του όγκου του όγκου υπολογίστηκε με τον τύπο: 0,5236 L

1 (L

2)

2, όπου το L

1 είναι μακρύς διάμετρο, και εάν L

2 είναι μικρή διάμετρο.

IHC αναλύσεις

δείγματα όγκων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και ανοσο-βάφτηκαν ακόλουθες δημοσιευμένες μεθόδους [27], [28], [29]. Ποσοστό PCNA, TUNEL, διασπασμένη κασπάση 3 και θετικά κύτταρα HIF-1α υπολογίστηκε μετρώντας τον αριθμό των θετικών χρωματισμένων κυττάρων (καφέ χρώση) και ο συνολικός αριθμός των κυττάρων σε πέντε αυθαίρετα επιλεγμένα πεδία από κάθε όγκου σε μεγέθυνση 400χ. Μικροαγγείων βάφονται με CD31 και νηστίνη ήταν ποσοτικά σε 5 τυχαία μικροσκοπική (μεγέθυνση 400Χ) πεδία ανά όγκο. VEGF, VEGFR1, VEGFR2, pAkt

Ser473, και Akt ανοσολογική αντίδραση αναλύθηκε σε 5 τυχαία περιοχές για κάθε ιστό του όγκου και βαθμολογήθηκε με 0+ (χωρίς χρώση), 1+ (ασθενής χρώση), 2+ (μέτρια χρώση), 3+ (ισχυρή χρώση), 4+ (πολύ ισχυρή χρώση).

Ex Vivo

τριχοειδή σχηματισμό Δοκιμασία

αορτές απομονώθηκαν από ποντίκια καθαρισμένα, κομμένα σε μικρά κομμάτια και τοποθετούνται σε φρεάτια matrigel-καλύπτονται και καλύπτεται με ένα άλλο 100 μι matrigel. Μετά από αυτές τις αορτές καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες, το μέσο (πλήρες μέσο HUVEC) αντικαταστάθηκε με ή χωρίς flavonolignans (30 και 60 μΜ). Θεραπείες αντικαταστάθηκαν μετά από 48 ώρες. Μετά από 6 ημέρες συνολικής επώασης, σκάφη βλάστησης από τις αορτές φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας κανόνι ισχύος Shot κάμερα A640 στο Zeiss ανεστραμμένου μικροσκοπίου.

Tube Δοκιμασία Σχηματισμού

HUVEC (4 × 10

4) καλλιεργήθηκαν σε 1 κ.εκ. EBM2 (συμπληρωμένο με 0,5% FBS και 4 ng /mL VEGF) με διάφορες διαστερεοϊσομερών (5-30 μΜ) σε πλάκες επικαλυμμένες Matrigel. Μετά από 9 ώρες επώασης, ο σχηματισμός σωληνοειδή δομή προσδιορίστηκε ποσοτικά υπολογίζοντας το μήκος του σωλήνα (σε 100x) με Zeiss ανεστραμμένο μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας κανόνι δύναμης shot φωτογραφική μηχανή A640 και το λογισμικό AxioVision Rel.4.7. Σε ένα σχετικό πείραμα, τα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 30 μΜ δόση του κάθε flavonolignan για 72 ώρες και προστέθηκε και συλλέχθηκε μετά από 12 ώρες (με την ένδειξη «εμπλουτισμένο μέσο») φρέσκα μέσα (0,5% FBS). Τα ρυθμισμένα μέσα αναμιγνύονται με 0,5% FBS συμπληρωμένο EBM2 μέσων (75:25 αναλογία) προστέθηκε στη συνέχεια σε HUVEC και σχηματισμού σωλήνα μελετήθηκε όπως περιγράφεται ανωτέρω.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

HUVEC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς VEGF (10 ng /mL) και διαφορετικές συγκεντρώσεις flavonolignans (5-30 μΜ). Μετά την επιθυμητή αγωγή, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο.

Transwell Δοκιμασία Invasion

Σε αυτή τη δοκιμασία, οι κάτω θαλάμους Transwell πληρώθηκαν με EBM2 μέσα που περιέχουν 0,5% FBS συμπληρωμένο με 4 ng /mL VEGF, και στην κορυφή των θαλάμων HUVEC (4 × 10

4) σπάρθηκαν σε 500 μL EBM2 (0,5% FBS) συν 30 δόση μΜ από κάθε flavonolignan. Μετά από 10 ώρες, τα κύτταρα επεμβατικές ποσοτικοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30], [31]. Παρόμοια δοκιμασία πραγματοποιήθηκε επίσης με κύτταρα DU145 επιστρώθηκαν στον κάτω θάλαμο (μέσου RPMI με 0.5% ορό) και (media EBM2 με 0,5% ορό) HUVEC στον ανώτερο θάλαμο. Σε δύο ξεχωριστά πειράματα, flavonolignans προστέθηκαν είτε στα ανώτερα τμήματα ή στα κάτω επιμελητήρια και εισβολής των HUVEC μελετήθηκε σε κάθε περίπτωση.

κυτταρικού κύκλου διανομής και απόπτωση

Η κατανομή κυτταρικού κύκλου (σαπωνίνη /ΡΙ χρώση) και την απόπτωση (χρώση αννεξίνης-ΡΙ) αναλύθηκαν με FACS [32], [33].

ανοσοαποτύπωσης

HUVEC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 30 μΜ δόση του κάθε flavonolignan με ή χωρίς διέγερση VEGF, παρασκευάστηκαν προϊόντα λύσης και αναλύθηκαν με πρότυπη μέθοδο ανοσοκηλιδώσεως όπως περιγράφεται προηγουμένως [33], [34]. α-τουμπουλίνης και β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσουν ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης.

Τρισδιάστατο σφαιροειδές Δοκιμασία Σχηματισμού

σε πλάκες 24 φρεατίων, προστέθηκαν 100 μι Matrigel. Στη συνέχεια, 100 μΐ RPMI-1640 και μίγμα matrigel (50:50) που περιέχει ~ 1 × 10

3 DU145 κύτταρα προστέθηκε. Μετά από 15 λεπτά, 1 mL RPMI-1640 με 10% FBS που περιέχει φορέα DMSO ή 90 μΜ συγκέντρωση του κάθε flavonolignan προστέθηκαν στο πηγάδι? θεραπείες αντικαταστάθηκαν κάθε 48 ώρες για 2 εβδομάδες. Στο τέλος του πειράματος, ο σχηματισμός σφαιροειδές μετρήθηκε κάτω Zeiss ανεστραμμένο μικροσκόπιο σε 100x.

Στατιστικές Αναλύσεις

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Sigma Stat έκδοση λογισμικού 2.03 (Jandel Scientific, San Rafael, CA ). Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ ελέγχου και αγωγή ομάδων προσδιορίσθηκε με δοκιμή t και ρ & lt του Student? 0.05 αξία θεωρήθηκε σημαντική. Ένας τρόπος ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή Tukey χρησιμοποιήθηκε για πολλαπλές συγκρίσεις. Τα αυτοραδιογραφήματα /ζώνες σαρώθηκαν, και η μέση πυκνότητα των ζωνών (όπου αναφέρονται) προσδιορίστηκε με τη χρήση του Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems, San Jose, CA).

Αποτελέσματα

Επίδραση των Flavonolignans στο PCA DU145 ξενομοσχεύματος Growth

σε σχέση με την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου, η από του στόματος χορήγηση του flavonolignans ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των DU145 ξενομοσχευμάτων σε γυμνά ποντίκια, και αυτό ήταν διακριτό από την τρίτη εβδομάδα και μετά (Σχ. 1Α). Στο τέλος του πειράματος (10 εβδομάδες), σιλυβίνη ΕΝΑ θεραπεία ανέστειλε τον όγκο του όγκου κατά 44% και 50 με 50 και 100 mg /kg σωματικού βάρους δόσεις, αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05) (Εικ. 1Α)? ενώ σιλυβίνη Β ανέστειλαν τον όγκο του όγκου κατά 38 και 47% κατά ίδιες δόσεις, αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05) (Σχ 1Α.). Σε ισοσιλυβίνη ένα επεξεργασμένο ποντικούς, ο όγκος του όγκου ανεστάλη κατά 44 και 50% (ρ & lt? 0,05) (Εικ. 1Α), ενώ στους ποντικούς που έλαβαν ισοσιλυβίνη Β όγκου του όγκου ανεστάλη κατά 46 και 67% με 50 και 100 mg /kg δόσεις το σωματικό βάρος, αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05) (Σχ 1Α.). Συνολικά, ισοσιλυβίνη Β ήταν πιο αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης ξενομοσχεύματος DU145, που ακολουθείται από σιλυβίνη Α ή ισοσιλυβίνη Α και Β σιλυβίνη Μολονότι, αυτές οι διαφορές στο βιολογικό αποτέλεσμα εκάστου διαστερεοϊσομερούς δεν πέτυχε στατιστική σημαντικότητα? αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με προηγουμένως αναφερθείσες

in vitro

μελέτες [21], [22].

Κατά τη στιγμή της νεκροψίας, όλα τα ζώα εξετάστηκαν για παθολογικά συμπτώματα, και δεν παρατηρήσαμε οποιαδήποτε σημάδια ανωμαλίας σε όλα τα ζωτικά όργανα που εξετάστηκαν. Επιπλέον, η χορήγηση αυτών των ενώσεων μέσω του στόματος καθετηριασμό δεν προκάλεσε καμία σημαντική μεταβολή του τρόπου διεξαγωγής κατανάλωση δίαιτας ή το σωματικό βάρος κέρδος των ποντικών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επίσης, δεν παρατηρήσαμε καμία αρνητική επίδραση από την άποψη της γενικής συμπεριφοράς των ζώων, γεγονός που υποδηλώνει μια συνολική ασφαλή φύση αυτών των ενώσεων.

Επίδραση των Flavonolignans για πολλαπλασιασμό και την απόπτωση σε DU145 Ξενομοσχεύματα

Η IHC ανάλυση των δειγμάτων όγκου DU145 έδειξαν ότι η θεραπεία flavonolignans αναστέλλει σημαντικά την ανοσοχρώση για PCNA (ένας βιοδείκτης για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων) (Εικ. 1Β), αλλά αυξάνει τις TUNEL και διασπάται-κασπάσης 3 θετικά κύτταρα (βιοδείκτες για απόπτωση) (Εικ. 1C και 1D ). Αν και στατιστικά σημαντική, η επίδραση της flavonolignans στον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση που σχετίζονται βιοδεικτών ήταν μέτρια, και δεν μπορούσε να εξηγήσει πλήρως την παρατηρούμενη βραδύτερη ανάπτυξη ξενομοσχεύματος και κοντά στο 50% αναστολή της ανάπτυξης με την θεραπευτική αγωγή flavonolignan (Εικ. 1Α). Ως εκ τούτου, το επόμενο αναλύσαμε τους ιστούς του όγκου για flavonolignans επίδραση στην αγγειογένεση, η οποία είναι απολύτως αναγκαία για την όγκους να αναπτυχθούν πέρα ​​από το μέγεθος 1-2 mm [3].

Επίδραση των Flavonolignans την αγγειογένεση σε DU145 Ξενομοσχεύματα

για να διερευνηθεί εάν αυτές οι μεμονωμένες flavonolignans ανέστειλε την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος με την καταστολή της αγγειογένεσης των όγκων, που χρωματίζονται το τμήμα του όγκου με CD31 (ένας βιοδείκτης για ωριμάσει μικροαγγείων) και νεστίνη (α βιοδείκτη για ανώριμα και νεοσυσταθείσας μικροαγγείων). Και οι τέσσερις ενώσεις ανέστειλαν την πυκνότητα μικροαγγείων, τόσο ώριμο και πρόσφατα σχηματισμού, αλλά ισοσιλυβίνη Β ήταν σχετικά πιο αποτελεσματική στην ανασταλτική δράση της επί νεστίνη-θετικών μικροαγγείων (Σχ. 2). Ο VEGF είναι ένας ισχυρός προ-αγγειογόνο παράγοντα [17], [35], και IHC αναλύσεις τμημάτων όγκου σαφώς έδειξαν ότι η θεραπεία με αυτά τα διαστερεοϊσομερή μειώνει τόσο VEGF και της έκφρασης VEGFR2 σε ιστούς όγκου (Εικ. 2). Αξίζει να σημειωθεί ότι, εκτός σιλυβίνη Α, η έκφραση VEGFR1 επίσης μειώθηκε σημαντικά από αυτούς τους παράγοντες (Εικ. 3). Συνολικά, ισοσιλυβίνη Β ήταν σχετικά πιο ισχυρή στην αποτελεσματικότητα της σχετικά με VEGF, VEGFR2 και έκφραση VEGFR1. HIF-1α είναι ο κύριος μεταγραφικός παράγοντας που είναι σταθεροποιημένο κάτω από υποξικές συνθήκες σε αναπτυσσόμενους όγκους και το μεταβολισμό του όγκου ελέγχων, καθώς και την έκφραση των προ-αγγειογόνων παραγόντων όπως VEGF [36], [37], [38]. Παρά το γεγονός ότι η σταθεροποίηση HIF-1α λαμβάνει χώρα υπό συνθήκες χαμηλού οξυγόνου, η έκφρασή του ελέγχεται επίσης από την κινάση σερίνης /θρεονίνης Akt [39]. Akt παίζει επίσης σημαντικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, όπως κυτταρική επιβίωση, απόπτωση, μετανάστευση και τον μεταβολισμό [40], [41]. IHC αναλύσεις των όγκων έδειξε ότι οι τέσσερις από τους flavonolignans μειωθούν σημαντικά HIF-1α και pAkt

επίπεδα Ser473, με οριακή επίδραση στη συνολική Akt έκφραση μόνο από ισοσιλυβίνη Α και Β ισοσιλυβίνη (Εικ. 3).

επίδραση της flavonolignans την αγγειογένεση σε μη στοχευόμενα όργανα

για να επιβεβαιώσετε ότι τα αντι-αγγειογενετική αποτελέσματα αυτών των flavonolignans είναι ειδικές για ιστούς όγκων, αναλύσαμε τα όργανα μη στόχους (ήπαρ, πνεύμονες και τα νεφρά) για CD31 έκφραση για τον προσδιορισμό της πυκνότητας μικροαγγείων. Δεν υπήρχε διαφορά στην πυκνότητα των μικροαγγείων σε ήπαρ, πνεύμονα και νεφρό μεταξύ ελέγχου και ποντίκια που τρέφονταν με καθαρό flavonolignans (Σχ. 4Α, δεδομένα CD31 ποσοτικοποίηση δεν φαίνονται). H & amp? Ε αναλύσεις έδειξαν επίσης ότι αυτά τα διαστερεοϊσομερή δεν έχουν δυσμενείς επιπτώσεις στην ιστολογία των κανονικών οργάνων (Εικ. 4Β).

Επίδραση των Flavonolignans την αγγειογένεση στο

Ex Vivo

και

In Vitro

Αναλύσεις

Εξετάσαμε περαιτέρω την αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα των flavonolignans στο

ex vivo

δοκιμασία σχηματισμό τριχοειδών χρησιμοποιώντας αορτής ραχιαίο ποντίκι. Μετά από έξι ημέρες καλλιέργειας επί matrigel υπό αγγειογόνες συνθήκες, παρατηρήσαμε ένα σημαντικό αριθμό σκαφών βλάστησης από τις αορτές ποντικού (σημειωμένες με βέλη), η οποία ανέστειλε με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με flavonolignans θεραπεία (Εικ. 5Α).

ένα από τα σημαντικά βήματα κατά τη διάρκεια νεο-αγγειογένεση είναι ο σχηματισμός και η συγχώνευση των σωλήνων που παράγονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα που σχηματίζουν ένα σύνθετο δίκτυο αιμοφόρων τριχοειδών αγγείων και [42], [43]. Να κατανοήσουν την επίδραση των flavonolignans σε αυτό το βιολογικό γεγονός, πραγματοποιήθηκε δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, κάτω πάνελ, και οι τέσσερις ενώσεις ανέστειλαν σημαντικά την επαγόμενη από VEGF μήκους σωλήνα σε HUVEC. Όπως φαίνεται και στις φωτογραφίες (Σχ. 5Β, άνω πλαίσιο), η θεραπεία VEGF που επάγεται τον σχηματισμό σωληνοειδούς δικτύων από HUVEC, η οποία διαταράσσεται από flavonolignan θεραπείες.

Επίδραση της Flavonolignans επί νΕΟΡ-επαγόμενου πολλαπλασιασμού και Χημειοτακτική Κινητικότητα

VEGF παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια νεο-αγγειογένεση μέσω μιτογόνο και μιτογονική επίδραση του επί των ενδοθηλιακών κυττάρων [17], [35]. Στις μελέτες μας, θεραπευτική αγωγή VEGF που επάγεται την ανάπτυξη HUVEC που ήταν έντονα αναστέλλεται από flavonolignans αγωγή (Σχ. 6Α). Τέτοιες θεραπείες επίσης ανέστειλε την χημειοτακτική κινητικότητα των HUVEC προς VEGF στην ανίχνευση εισβολής Transwell (Εικ. 6Β). Σημαντικά, ισοσιλυβίνη Β ήταν η λιγότερο αποτελεσματική σε σύγκριση με τις άλλες διαστερεοϊσομερή από την άποψη της ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της χημειοτακτική κινητικότητα των HUVEC.

Επίδραση της Flavonolignans στη βιωσιμότητα, κυτταρικού κύκλου Progression και Απόπτωση σε HUVEC

για να διευκρινιστεί περαιτέρω η βιολογική δράση αυτών των flavonolignans σε ενδοθηλιακά κύτταρα, αναλύσαμε βιωσιμότητα, τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση σε HUVEC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α, οι τέσσερις flavonolignans (5-30 μΜ) ανέστειλε HUVEC βιωσιμότητα σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Οι αναλύσεις κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι όλα τα διαστερεοϊσομερή επάγεται G1 σύλληψης μετά από 24 ώρες της θεραπείας, αλλά μόνο σιλυβίνη Α, Β και σιλυβίνη ισοσιλυβίνη Α προκάλεσε επίσης G2 /M σύλληψης (Εικ. 7Β). Μετά από 48 ώρες θεραπείας, η αξιοσημείωτη επίδραση της σιλυβίνης Α, Β και σιλυβίνη ισοσιλυβίνη Α σε HUVEC ήταν η επαγωγή της G2 /M σύλληψης, το οποίο έλειπε με θεραπεία ισοσιλυβίνη Β (Σχ. 7Β). Ισοσιλυβίνη Μια θεραπεία (σε 30 μΜ) σημαντικά επαγόμενη διακοπή φάσης S μετά από 48 ώρες θεραπείας, η οποία θα μπορούσε να συνδεθεί με ισχυρή αποπτωτικό θάνατο που επάγεται από ισοσιλυβίνη Α (Σχ. 7Β).

Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της αυτά τα flavonolignans σε διάφορα ρυθμιστικά μόρια κυτταρικού κύκλου, δηλαδή κυκλίνες, οι αναστολείς Cdks και Cdk, καθώς και τις ρυθμιστικές αρχές τους Skp2 και φωσφατάσες Cdc25. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7C, οι τέσσερις flavonolignans μείωσε τα επίπεδα της Cdk2 και Cdk4 με οριακή επίδραση στην Οάο2. Αυτές οι ενώσεις επίσης μείωσε τα επίπεδα της κυκλίνης D1, κυκλίνης D3, κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1 και. Σιλυμπίνη Α και ισοσιλυβίνη μια μέτρια αύξησε την έκφραση p27, αλλά μειώθηκε κατά ισοσιλυβίνη Β (Σχ. 7C). Αντιθέτως, η έκφραση ρ21 μειώθηκε κατά σιλυβίνη Α, Β και σιλυβίνη ισοσιλυβίνη Α αλλά όχι με ισοσιλυβίνη Β (Σχ. 7C). Ωστόσο, όλα τα τέσσερα διαστερεοϊσομερή μείωσε έντονα την έκφραση του Skp2 και Cdc25C χωρίς ή μέτρια ανασταλτική δράση στο επίπεδο cdc25A (Εικ. 7C). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι αυτά τα τέσσερα διαστερεοϊσομερή έχουν λίγες παρόμοια (αλλά διαφέρουν ως προς την έκταση) και λίγοι αντίθεση επιδράσεις στην έκφραση ρυθμιστικών μορίων κυτταρικού κύκλου.

Στη συνέχεια εξετάσαμε το αποτέλεσμα των καθαρών flavonolignans (στα 30 μΜ) επί της απόπτωσης μετά από 36 ώρες θεραπείας σε HUVEC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7D, ισοσιλυβίνη Β ήταν η λιγότερο αποτελεσματική από την άποψη της επαγωγής απόπτωσης που σχετίζονται μορφολογικά χαρακτηριστικά (απόσπαση και στρογγυλοποίησης), μόρια που εμπλέκονται στην απόπτωση (cPARP, διασπασμένη κασπάση 3 και 9) και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε πληθυσμό HUVEC σηματοδότησης. Αντίθετα, σιλυμπίνη Α, σιλυμπίνη Β και ισοσιλυβίνη ένα ισχυρά προκαλείται από αποπτωτικό θάνατο σε HUVEC (Σχ. 7D).

Επίδραση των Flavonolignans στην επαγόμενη από VEGF σηματοδότηση στα HUVEC

Στη συνέχεια, εξετάσαμε flavonolignans αποτέλεσμα σχετικά με την επαγόμενη από VEGF καταρράκτη σηματοδότησης που ελέγχει το σχηματισμό πολλαπλασιασμό, κινητικότητα και σωλήνα σε ενδοθηλιακά κύτταρα [35]. αγωγή VEGF αύξησε έντονα την φωσφορυλίωση VEGFR2 στο Ser1175 τοποθεσία, ένα αξιόπιστο δείκτη για τη δραστηριότητά του, η οποία ανεστάλη από την προ-κατεργασία με flavonolignans (Εικ. 8). Παρομοίως, VEGF αύξησε τη φωσφορυλίωση της VEGFR1, Src, ERK1 /2, Akt, BAD, mTOR και p70S6K. Όπως φαίνεται στο Σχ. 8, εκτός ERK1 /2 και mTOR, φωσφορυλίωση σε άλλες θέσεις αναστέλλεται από τις ενώσεις αυτές αν και σε διαφορετικό βαθμό. Σε σύγκριση με άλλα διαστερεοϊσομερή του, ισοσιλυβίνη Β ήταν η λιγότερο αποτελεσματική από την άποψη της επίδρασης επί των επαγόμενη από VEGF μόρια σηματοδότησης σε HUVEC.

διαφορετικής ευαισθησίας της Flavonolignans Προς PCA και ενδοθηλιακά κύτταρα

Νωρίτερα ευρήματα [ ,,,0],20], [21], [22], [24] και η παρούσα μελέτη προτείνει ότι μεταξύ των τεσσάρων καθαρό flavonolignans, ισοσιλυβίνη Β είναι η πιο αποτελεσματική από την άποψη της αποτελεσματικότητας έναντι κυττάρων PCA αλλά, κατά εκπληκτικό τρόπο, έχει το λιγότερο αποτελεσματικότητα σε όρους η επίδρασή του στην HUVEC (αναστολή της χημειοτακτικής κινητικότητας ή επαγωγή απόπτωσης) (Εικ. 6 και 7). Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε μια σειρά πειραμάτων για να αποσαφηνιστεί η σχετική αποτελεσματικότητα αυτών των τεσσάρων διαστερεοϊσομερών εναντίον κυττάρων PCA έναντι-vis ενδοθηλιακά κύτταρα. Πρώτα, αναλύσαμε τις επιπτώσεις τους στην τρισδιάστατη ανάπτυξη των κυττάρων DU145 σε matrigel. Η θεραπεία με τις ενώσεις αυτές ανέστειλαν ισχυρά τον αριθμό και το μέγεθος των σφαιροειδών που αποτελούνται από κύτταρα DU145 με ισοσιλυβίνη Β να είναι πιο αποτελεσματικές (Εικ. 9Α). Στη συνέχεια, θα πραγματοποιηθεί μελέτες συν-καλλιέργεια χρησιμοποιώντας θαλάμους Transwell. Εμείς επιστρώθηκαν HUVEC στον άνω θάλαμο, ενώ τα κύτταρα DU145 καλλιεργήθηκαν στον κατώτερο θάλαμο. Σε δύο ξεχωριστά πειράματα, HUVEC ή DU145 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καθαρό flavonolignans, και εν συνεχεία, HUVEC εισβολή μέσω Matrigel μελετήθηκε σε κάθε περίπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 9Β, ισοσιλυβίνη Β ήταν το πιο αποτελεσματικό στη μείωση της μετανάστευσης HUVEC όταν τα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε θεραπεία, αλλά ήταν λιγότερο αποτελεσματική όταν HUVEC υποβλήθηκαν σε θεραπεία.

Για να ακολουθήσετε αυτό, αντιμετωπίζεται DU145 κύτταρα με αυτά τα διαστερεοϊσομερή (30 μΜ) και συλλέγονται τα ρυθμισμένα μέσα. Η προ-αγγειογενετική δυναμικού της ρυθμισμένα μέσα αναλύθηκε σε μία δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα με χρήση HUVEC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 9C, προσαρμοσμένα μέσα από κύτταρα DU145 αύξησε το μήκος του σωλήνα, καθώς και σωληνοειδές δίκτυο που σχηματίζεται από HUVEC. Ρυθμισμένα μέσα από τα κύτταρα DU145 αγωγή flavonolignan μειώθηκε σημαντικά το μήκος του σωλήνα, καθώς και σωληνοειδές δίκτυο (Σχ. 9C). Σε αυτή τη δοκιμασία επίσης, ισοσιλυβίνη Β ήταν το πιο αποτελεσματικό διαστερεοϊσομερές (Σχ. 9C).