Αφηρημένο

betulinic οξύ είναι πεντακυκλικόν τριτερπενοειδείς που εμφανίζει αντικαρκινική λειτουργίες σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Αυτή η μελέτη αποδεικνύει ότι betulinic οξύ είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό κατά του ανθρώπινου καρκίνου του τραχήλου κυτταρική σειρά HeLa επάγοντας δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη απόπτωση. Η αποπτωτική διεργασία ερευνήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση πρωτεϊνωματική να αποκαλύψει τις αλλαγές έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα HeLa μετά από θεραπεία betulinic οξύ. Πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε ότι υπήρχαν έξι ανάντη και τριάντα ρυθμισμένα προς τα κάτω σε πρωτεΐνες οξύ επαγόμενη κύτταρα HeLa betulinic, και αυτές οι πρωτεΐνες στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λειτουργική ανάλυση οδού χρησιμοποιώντας πολλαπλές λογισμικό ανάλυσης. UDP-γλυκόζη 6-αφυδρογονάση, 6-φωσφογλυκονικής αφυδρογονάση αποκαρβοξυλιώσεως, αλυσίδα Α Horf6-α νέο ένζυμο ανθρώπινη υπεροξειδάσης που εμπλέκονται στη διαδικασία οξειδοαναγωγής, βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διαδικασία της απόπτωσης του μονοπατιού οξειδωτική αντίδραση στρες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας στο πρωτεϊνικό επίπεδο, μια αύξηση της ενδοκυτταρικής αντιδραστικά είδη οξυγόνου παρατηρήθηκε σε κύτταρα betulinic οξύ-θεραπεία. Οι πρωτεΐνες που ρυθμίζεται από γλυκόζη TIP47 πρωτεΐνης και φορτίων επιλογής πρωτεΐνη, οι οποίες συμμετέχουν στο ενδοπλασματικό δικτύωμα μονοπάτι, ρυθμίστηκαν προς τα πάνω με κατεργασία betulinic οξύ. Εν τω μεταξύ, 14-3-3 πρωτεΐνες οικογένειας, συμπεριλαμβανομένων 14-3-3β και 14-3-3ε, ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε απόκριση σε θεραπεία betulinic οξύ, το οποίο είναι συνεπές με την μείωση στην έκφραση του στόχου γονιδίων

14 -3-3β

και

14-3-3ε

. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η αντιαποπτωτικών

bcl-2

γονίδιο ρυθμίζεται προς τα κάτω, ενώ η προ-αποπτωτικών

bax

γονίδιο ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά την αγωγή betulinic οξύ σε κύτταρα HeLa. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι betulinic οξύ επάγει την απόπτωση των κυττάρων HeLa ενεργοποιώντας τόσο το ενδοπλασματικό μονοπάτι δίκτυο και την ROS μεσολάβηση μιτοχονδριακό μονοπάτι

Παράθεση:. Xu Τ, Pang Q, Zhou D, Zhang Α, Luo S, Γουάνγκ Y, et al. (2014) πρωτεομικής Έρευνα betulinic Οξύ απόπτωση των ανθρωπίνων καρκίνο του τραχήλου HeLa κύτταρα. PLoS ONE 9 (8): e105768. doi: 10.1371 /journal.pone.0105768

Επιμέλεια: Daniela Flavia Hozbor, Universidad Nacional de La Plata, Αργεντινή

Ελήφθη: 18, Απρίλη 2014? Αποδεκτές: 26 Ιουλ του 2014? Δημοσιεύθηκε: 22 Αυγούστου 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε οικονομικά από τη Research Ειδικό Ταμείο Δασικής Βιομηχανίας για Κοινής Ωφέλειας (201004069) και των Θεμελιωδών Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές Πανεπιστήμια ( DL13EA02-03). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

betulinic οξύ (3β-υδροξυ-lup-20 (29) -εν-28-ικό οξύ) (BA) είναι ένα φυσικό lupane τύπου τριτερπενίου που βρέθηκαν στο φλοιό της λευκής σημύδας δέντρα. BA διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο ως πηγή για τις πιθανές αντικαρκινικές ενώσεις [1]. In vitro μελέτες έχουν δείξει ότι αυτός ο παράγοντας είναι ισχυρά αποτελεσματικό ενάντια σε μια ευρεία ποικιλία καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, της λευχαιμίας, καρκινώματος του κόλου, καρκίνωμα του πνεύμονα, καρκίνωμα του προστάτη και του πολλαπλού μυελώματος [2] – [8], την ίδια στιγμή, η ΒΑ και τα ανάλογά της θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί θεραπευτικοί παράγοντες για τη λοίμωξη HIV-1 [9], [10]. Είναι γνωστό ότι τα μιτοχόνδρια παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενδογενή οδό της απόπτωσης των θηλαστικών. Μια μείωση στη μιτοχονδριακή εσωτερική διαμεμβρανικό δυναμικό σχετίζονται με τη θεραπεία της ΒΑ, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενδογενής οδός είναι μιτοχονδριακή εμπλέκονται στην BA-επαγόμενη απόπτωση. Το μιτοχονδριακό μονοπάτι προηγείται από την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και ρυθμίζεται από την Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών, η οποία αποτελείται από prosurvival (π.χ., Bcl-2, Bcl-XL και Mcl-1) και προαποπτωτική (Βαχ , κακός και ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες) τα μέλη [10], [11]. ΒΑ έχει δειχθεί ότι επάγει απόπτωση σε ένα CD-95 και ρ53-ανεξάρτητο τρόπο από μια άμεση επίδραση στην μιτοχόνδρια [4], [12], [13]. Σχηματισμοί των ROS και η πρωτεΐνη neosynthesis έχουν αναφερθεί ότι απαιτούνται για BA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο [14], [15], [16]. Μια προηγούμενη μελέτη της απόπτωσης από την ΒΑ διαπίστωσε ότι η μιτοχονδριακή μονοπάτι ανεστάλη από Bcl-2 /Bcl-xL υπερέκφραση σε κύτταρα ανθρώπινου πολλαπλού μυελώματος [15], η ΒΑ επάγει απόπτωση μέσω κυρίως ενός μιτοχονδριακής οδού με ειδικότητα όγκου.

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο τρίτος πιο συνηθισμένος τύπος όγκου στις γυναίκες [17]. Αρκετές θεραπείες που χρησιμοποιούνται για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, αλλά το καθένα από αυτά έχει σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες. Ως εκ τούτου, εξακολουθεί να είναι απαραίτητο να βρεθεί μια ασφαλέστερη και πιο αποτελεσματική θεραπεία. ΒΑ είναι ένα φυτό που προέρχεται από πεντακυκλική τριτερπενοειδείς που είναι τοξική για τα καρκινικά κύτταρα, αλλά δεν έχει καμία επίδραση επί μη μετασχηματισμένα κύτταρα [1], [2], [8]. Έχει αναφερθεί ότι η BA προκαλεί ανασταλτική δράση για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [18], αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί της διαδικασίας αυτής δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

Ο κύριος σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών της δυνητικές αντικαρκινικές δράσεις της ΒΑ στις ανθρώπινου τραχηλικού καρκινικά κύτταρα. Παγκόσμια proteome προφίλ οδήγησε στον εντοπισμό αρκετών οδών που ανταποκρίνονται στη θεραπεία BA και βοήθησε να κατανοήσουμε καλύτερα τους μηχανισμούς απόπτωσης που σχετίζονται ΒΑ. Σε αυτήν την εργασία, χαρακτήρισε την απόπτωση που σχετίζονται με το προφίλ πρωτεΐνης του ΒΑ επεξεργασμένα κύτταρα HeLa χρησιμοποιώντας μια συγκριτική προσέγγιση πρωτεομική 2-DE. Τα μοριακά λειτουργίες και βιολογικές διεργασίες που εμπλέκονται στο μηχανισμό της BA-επαγόμενη απόπτωση θα συζητηθούν. Αλλαγές στην έκφραση των τεσσάρων γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με την απόπτωση αναλύθηκαν εκτελώντας ανάλυση πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR).

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

BA αγοράστηκε από Boyle Chemical CO., LTD (Σαγκάη, Κίνα). Ο καρκίνος ανθρώπινη κυτταρική σειρά HeLa αγοράστηκε από το Κέντρο Tumor (Πεκίνο, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT, USA) με 10% FBS (ΡΑΑ, Αυστρία), 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Hyclone, Logan, UT, USA). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μικροπλάκες 96 αυλάκων και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. Μετά από 24 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις της ΒΑ. Στη συνέχεια, 30 μλ 3 mg /mL ΜΤΤ (Amresco, USA) σε PBS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και στη συνέχεια η πλάκα επωάστηκε περαιτέρω επί 4 ώρες. Το απομένον υπερκείμενο απομακρύνθηκε, και 150 μι DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και αναμίχθηκε πλήρως για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης που σχηματίστηκε. Μετά από 10 λεπτά επώασης, η απορρόφηση εκάστου φρεατίου αναγνώσθηκε στα 490 nm με τη χρήση ενός μετρητή πλακιδίων BioTek-ELISA (BioTek Instruments, Winooski, USA). Η συγκέντρωση του ΒΑ αναστέλλοντας την κυτταρική ανάπτυξη κατά 50% (τιμή IC50) υπολογίστηκε από τις καμπύλες δόσης-απόκρισης. Όλοι οι προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

μορφολογικές αλλαγές

Για την ανίχνευση μορφολογικές αλλαγές που συνέβησαν κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, πυρηνική χρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα 5 μg /mL Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, ΜΟ , USA) λεκέ, και τα δείγματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Nikon (ECLIPSE Ti-S, Nikon, Tokyo, Japan) [19].

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της κυτταρικής απόπτωσης

βα- επαγόμενη απόπτωση παρατηρήθηκε από Αηηβχίην-FITC /χρώσης ΡΙ (Beyotime Biotech, Πεκίνο, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η κυτταρομετρία ροής (Partec ροής, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει τις διαφορές στην απόπτωση μεταξύ ελέγχου και BA-αγωγή (15 μmol /L, 30 μmol /L και 50 μmοl /L) κύτταρα στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία. Τα κύτταρα συλλέγονται και αναλύονται μετρώντας κανονικά κύτταρα, τα αποπτωτικά κύτταρα σε πρώιμα στάδια, και όψιμου σταδίου αποπτωτικά νεκρωτικών κυττάρων /σε τρία οπτικά πεδία του μικροσκοπίου. Η απόκτηση και η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Flomax. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή και αναλύθηκαν εις τριπλούν.

Παρασκευή

Πρωτεΐνη για 2-DE

Hela κυττάρων σε επεξεργασία με 30 mmol /L BA συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες επώασης. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS, στη συνέχεια εκχυλίζεται με ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 7 mol /L ουρία, 2 mol /L θειουρία, 4% CHAPS, 2% ρΗ 3-10 /4-7 γραμμικό ρυθμιστικό IPG (GE Healthcare, ΗΠΑ ), 20 mmol /L dithiothreilol (DTT, Sigma, USA), 40 mmol /L Tris (Sigma, USA) και πλήρη mini EDTA-free κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, USA). Μετά sonicating10 φορές για 30 s με 30 s παύσεις σε ένα λουτρό πάγου-νερού και στη συνέχεια επώαση στους 4 ° C για 1 ώρα, κυτταρολύματα φυγοκεντρήθηκαν στις 14.000 rpm για 1 ώρα στους 4 ° C. Οι πρωτεΐνες στο προκύπτον υπερκείμενο προσδιορίστηκαν ποσοτικά σύμφωνα με αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad σύμφωνα με τη μέθοδο Bradford (Bio-Rad, Hercules, USA) [19].

δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πηκτής

Προϊόντα λύσης κυτταρικής πρωτεΐνης (130 μg) αναμείχθηκαν με διάλυμα επανυδάτωσης περιέχει 7 mol /L ουρία, 2 mol /L θειουρίας, 2% CHAPS, 0.5% ρυθμιστικό IPG και 0,002% μπλε βρωμοφαινόλης και DTT σε έναν τελικό όγκο 450 μL. Προκατασκευασμένα 24 cm ακινητοποιημένο ταινίες pH κλίση (IPG, pH 3-10, pH 4-7, GE Healthcare) επαναενυδατώθηκαν για 12 ώρες στους 30 V. Ο διαχωρισμός σε Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare, Γερμανία) πραγματοποιήθηκε με την ακόλουθες παραμέτρους: 100 V για 2 ώρες, 200 V για 1 ώρα, 500 V για 1 ώρα 1000 V για 1 ώρα και 8000 V για 3 ώρες, ακολουθούμενο από ένα μοτίβο βήμα-και-hold 8000 V για 8 ώρες. Μετά την εστίαση ισοηλεκτρική, οι λωρίδες επωάστηκαν για 15 λεπτά σε διάλυμα εξισορρόπησης I (6 mol /L ουρία, 2% SDS, 30% γλυκερόλη, 1% DTT, 0,002% βρωμοφαινόλη μπλε, 50 mmol /L Tris-HCl, ρΗ 8.8) και για άλλα 15 λεπτά σε διάλυμα εξισορρόπησης II (1% DTT αντικαταστάθηκε με 2,5% ιωδοακεταμίδιο). Στη συνέχεια, IPG λωρίδες μεταφέρθηκαν στην κορυφή της πηκτών πολυακρυλαμιδίου και ενσωματωμένων χρησιμοποιώντας 0,5% (w /v) διάλυμα αγαρόζης που περιέχει βρωμοφαινόλη μπλε. Δύο-διαστάσεων SDS-PAGE διεξήχθη στους 25 ° C και 3,5 W /πηκτή για 30 λεπτά και στη συνέχεια 17,5 β /gel για 4 ώρες και 30 λεπτά μέχρις ότου το μέτωπο βρωμοφαινόλης μπλε χρωστική έφθασε στο κάτω μέρος των πηκτών χρησιμοποιώντας το Ettan DALT έξι σύστημα (GE Healthcare). Οι γέλες σταθεροποιήθηκαν σε ένα μείγμα από 40% αιθανόλη και 10% κρυσταλλικό οξικό οξύ επί μία νύκτα. Πρωτεΐνες έγιναν ορατές με χρώση αργύρου, και εικόνες τζελ αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ImageScanner (GE Healthcare) με Image κύριο 2D Platinum έκδοση λογισμικού 7.0 (GE Healthcare). Προκειμένου να λάβει αξιόπιστα αποτελέσματα από 2-DE εικόνες, κηλίδες καλά επιλυθεί στις τρεις βιολογικούς επαναλήψεις. Μια μέτρηση διεξήχθη για κάθε βιολογικό επαναληπτικές και κανονικοποιημένο όγκοι υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την συνολική διαδικασία κανονικοποίησης κηλίδα όγκος του λογισμικού. Η κανονικοποιημένη όγκος κάθε κηλίδα υποτέθηκε ότι αντιπροσωπεύει αφθονία έκφρασή του. Μόνο εκείνα τα σημεία που άλλαξε σταθερά και σημαντικά (πάνω από 1,5 φορές και

σ

& lt? 0,05). Επιλέχθηκαν για ανάλυση φασματομετρίας μάζας

φασματομετρία μάζας και πρωτεΐνη ταξινόμηση

πεπτίδιο MS και MS /MS εκτελέστηκαν σε ένα φασματόμετρο MALDI-TOF /TOF Plus μάζα ΑΒΙ 5800 (Applied Biosystems, USA). Τα δεδομένα που αποκτήθηκαν σε μία θετική ανακλαστήρα MS χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο CalMix5 τη βαθμονόμηση του οργάνου (ABI5800 Calibration Μείγμα). Τόσο η MS και MS /MS δεδομένα εντάχθηκαν και επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό € 3,6 GPS Explorer (Applied Biosystems, USA) με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους. Βασισμένο σε συνδυασμό MS /MS φάσματα MS και, πρωτεΐνες επιτυχία ταυτοποιείται με βάση την 95% ή μεγαλύτερο διάστημα εμπιστοσύνης των βαθμολογιών τους στη μηχανή ΜΑΣΚΩΤ V2.3search (Matrix Science Ltd., UK), χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους αναζήτησης: NCBInr-humandatabase ? θρυψίνη ως ένζυμο πέψη? μια χαμένη θέση αποκοπής? σταθερές τροποποιήσεις Carbamidomethyl (C)? μερικές τροποποιήσεις της ακετυλο (πρωτεΐνη Ν-όρος), Αποαμιδιωμένο (NQ), Dioxidation (W), οξείδωση (Μ)? 100 ppm για την ανοχή πρόδρομου ιόντος και 0,5 Da για την ανοχή θραύσμα ιόντων.

Με βάση την ταξινόμηση PANTHER (έκδοση 7.2, https://www.pantherdb.org/), μοριακή λειτουργία και τη βιολογική διαδικασία της αντίστοιχης προσδιορίζονται πρωτεΐνες ταξινομήθηκαν [20]. Το δίκτυο αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης που παράγεται με STRING (έκδοση 9.05, https://string-db.org) αποκάλυψε τις λειτουργικές συνδέσεις μεταξύ των διαφορετικών πρωτεϊνών [21], [22].

Μέτρηση οξειδωτικού στρες

Τα επίπεδα ενδοκυτταρικής ROS προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας ROS (Beyotime Biotech, Κίνα) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες θεραπείας BA /L 30 μmol και μετά πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επωάστηκαν με DCFH-DA (10 μmol /L) στους 37 ° C για 40 λεπτά σε ένα σκοτεινό θάλαμο για την τελική ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Όλοι οι προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

απομόνωση του RNA και ανάλυση qRT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, USA). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα PrimeScriptTM αντίστροφης μεταγραφάσης (Takara, Tokyo, Japan), και μεταγραφές στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε qRT-PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR Αντιδραστήρια Kit (Takara, Tokyo, Japan). Ποσοτικές δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με τη χρήση 1 μι cDNA (1:10 αραίωση) και SYBR Green κύριο μίγμα (Takara, Tokyo, Japan) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ΑΒΙ 7500 (Applied Biosystems, USA). Η ενίσχυση του γλυκεραλδεϋδο-3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος και για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Οι λεπτομέρειες των χρησιμοποιούμενων εκκινητές φαίνονται στον Πίνακα 1 [23].

Η

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) δειγμάτων εις τριπλούν. Διεξήχθη στατιστική ανάλυση με το λογισμικό στατιστικής (SPSS έκδοση 17.0). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από πολλαπλές συγκρίσεις Bonferroni του. Η τιμή του

σ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Επίδραση της ΒΑ στον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων HeLa

της κύτταρα

HeLa ήταν. υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (15 μmol /L, 30 μmol /L, 50 μmol /L) του ΒΑ για 24 ώρες, 48 ώρες, και 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εμφανίζεται μια γενική πτώση με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του ΒΑ στο μέσο και θεραπεία διάρκειας όπως αναλύθηκε με μία ανίχνευση ΜΤΤ (Εικ. 1Α). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η ΒΑ αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HeLa σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Το IC

50 ήταν 30,42 ± 2,39 μΜ όταν τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΒΑ για 48 ώρες.

(Α) Επίδραση της ΒΑ έναντι κυττάρων Hela, όπως καθορίζεται από τη δοκιμή ΜΤΤ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συγκεντρώσεις BA (0 μmol /L, 15 μmol /L, 30 μmol /L, 50 μmol /L) για προκαθορισμένο χρόνο (24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες). Οι τιμές για κάθε συγκέντρωση δοκιμάστηκε BA αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές τριών πειραμάτων, τα datas παρουσιάζονται ως μέση ± SD μέσος? **

ρ

& lt? 0,01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (0 μmol /L ΒΑ). (Β) Hoechst 33258-χρώση κυττάρων HeLa σε επεξεργασία με 15 μmol /L, 30 μmol /L ΒΑ. Κόκκινα βέλη δείχνουν αρκετές αποπτωτικά κύτταρα με χαρακτηριστική συμπύκνωση της χρωματίνης.

Η

Για να καθοριστεί αν η ανασταλτική δράση που προκαλείται από την ΒΑ σε κύτταρα HeLa έγινε μέσω της επαγωγής της απόπτωσης, αξιολογήσαμε την απόπτωση από μορφολογική εξέταση χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού και κυτταρομετρία ροής. Μετά τη θεραπεία με 15 μmol /L και 30 μmol /L ΒΑ για 48 ώρες, τα κύτταρα HeLa βάφτηκαν με 5 μg /ml Hoechst 33258 και ορατή χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού. Η τυπική μορφολογία της αποπτώσεως ανιχνεύθηκε σε BA-κατεργασμένα κύτταρα HeLa (Σχ. 1Β). Αυτό αποκάλυψε υπήρξε μια σημαντική αύξηση στο ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων μετά τη θεραπεία ΒΑ σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, η ΒΑ προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη απόπτωση όπως υποδεικνύεται από Αηηβχίην-FITC /ΡΙ χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Το συνολικό ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ήταν 20.53 ± 0.81% (13,45 ± 0,80% των κυττάρων πρώιμων αποπτωτικών και 7,07 ± 0,51% των κυττάρων αργά αποπτωτικών) και 38,56 ± 1,79% (30,92 ± 1,22% των κυττάρων πρώιμων αποπτωτικών και 7,64 ± 0,53% της κύτταρα αργά αποπτωτικών) για κύτταρα κατεργασμένα με 30 μmol /L και 50 μmol /L της ΒΑ στις 48 ώρες, αντίστοιχα (όπως φαίνεται στο Σχ. S1).

2-DE ανάλυση των διαφορών στην έκφραση της πρωτεΐνης που προκαλείται από BA

Πρωτεομική είναι μια ισχυρή πλατφόρμα για τη διερεύνηση της έκφρασης της πρωτεΐνης και τροποποίηση ως απάντηση σε συγκεκριμένες φυσιολογικές συνθήκες σε βιολογικά συστήματα. Οι των πρωτεϊνών του ελέγχου και /L BA-κατεργασμένα κύτταρα HeLa 30 μmol αναλύθηκαν με 2-DE. Δύο κλίση εμβέλειας IPG λωρίδες (ρΗ 3-10 και 4-7) χρησιμοποιήθηκαν ως το πρώτο διάσταση. Εκπρόσωπος μοτίβα πρωτεΐνης 2-DE στην περιοχή ρΐ 3-10 έδειξαν ότι οι πρωτεΐνες επικεντρώθηκε κυρίως στο εύρος ρΗ 4,2 έως 7,0 (Εικ. 2Α). Για την περαιτέρω διαχωρισμό αυτού του δείγματος, κλίσεις ρΗ στενό εύρος (4-7) χρησιμοποιήθηκαν (Εικ. 2Β), δίνοντάς μας τη δυνατότητα να αυξήσει τόσο το φορτίο της πρωτεΐνης στα πηκτώματα και την ανάλυση των πρωτεϊνών σε αυτό το εύρος. Οι κηλίδες πρωτεΐνης με αλλοιώσεις πάνω από 1,5 φορές (

ρ

& lt? 0,05) στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό πρωτεΐνης με MALDI TOF /TOF-MS ανάλυση (Πίνακας S1). 2D τζελ Συνολικά 18 πρωτεΐνης κηλίδες από το ευρύ φάσμα IPG με βάση (pH 3-10) και 19 πρωτεΐνης κηλίδες από στενότερο φάσμα τζελ IPG-based 2D (pH 4-7) έδειξε επαναλήψιμη και στατιστικά σημαντικές αλλαγές σε δείγματα BA-θεραπεία σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου (Εικ. 2). Πρωτεΐνες από όλες τις πρωτεΐνες κηλίδες ταυτοποιήθηκαν με επιτυχία από τα κράτη μέλη και ΜΑΣΚΩΤ αναζητήσεις βάση δεδομένων με υψηλή εμπιστοσύνη (Πίνακας 2). Πρωτεΐνη προφίλ (ρΗ 3-10) αποκάλυψε 5 επάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνες και 13 ρυθμισμένα προς τα κάτω πρωτεϊνών σε κύτταρα BA-θεραπεία. Επιπλέον, η πρωτεΐνη προφίλ (ρΗ 4-7) αποκάλυψε 1 επάνω ρυθμισμένο πρωτεΐνη και 18 ρυθμισμένα προς τα κάτω πρωτεϊνών σε κύτταρα BA-θεραπεία. Απροσδόκητα, υπήρχε μόνο 1 πρωτεΐνη (gi4826760) στην επικάλυψη μεταξύ του pH 3-10 (Spot NO. 868) και pH 4-7 (Spot NO. 626) τζελ.

(Α) 2-DE διεξήχθη με 130 μg πρωτεΐνης με τη χρήση 24-cm ρΗ 3-10 NL IPG λωρίδες και 12,5% SDS-PAGE. (Β) 2-DE διεξήχθη με 130 μg πρωτεΐνης με τη χρήση 24-cm ρΗ 4-7 NL IPG λωρίδες και 15% SDS-PAGE. Οι πηκτές έγιναν ορατές με χρώση αργύρου και αναλύονται με Image κύριο λογισμικό.

Η

Λειτουργικές κατηγορίες διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών

Για την καλύτερη ταξινόμηση των εντοπισμένων πρωτεϊνών, δύο ανεξάρτητες κατηγορίες του γονιδίου οντολογίες χρησιμοποιούνται για να περιγράψουν τη λειτουργία των γονιδιακών προϊόντων: μοριακή λειτουργία και βιολογικές διεργασίες, όπως προσδιορίζονται από το σύστημα ταξινόμησης πάνθηρα. Επειδή EEF (gi530425157, επιτόπου 932) ήταν αποφασισμένος να είναι το ίδιο με EEF2 (gi4503483, επιτόπου 673) και GLOD4 (gi4929769, επιτόπου 146) δεν είχε εντοπιστεί από το σύστημα ταξινόμησης PANTHER, 34 άλλαξε πρωτεΐνες αναλύθηκαν από το λογισμικό. Οι εντοπίστηκαν πρωτεΐνες ταξινομήθηκαν σε 9 ομάδες βασίζονται σε βιολογικές διεργασίες: μεταβολικών διεργασιών (31.90%), τις κυτταρικές διεργασίες (19,10%), κυτταρική οργάνωση συστατικό ή βιογένεση (14,90%), αναπτυξιακές διαδικασίες (10,60%), εντοπισμού (10,60%), βιολογική ρύθμιση (4,30%), απόκριση σε ερέθισμα (4,30%), πολυκύτταροι διεργασίες οργανισμικό (2,10%) και των διαδικασιών του ανοσοποιητικού συστήματος (2,10%) (Σχ. 3Α). θεραπεία BA ανέστειλε πρωτεΐνη αναδίπλωσης (σημείο 81, 655, 1109, 613, 981), το οποίο είναι σημαντικό για τη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών. Επιπλέον, γλυκόλυση (spot 372), μετάφρασης (σημείο 673, 885) και ματίσματος mRNA (spot 868) εμπλέκονται σε μεταβολικές διεργασίες και ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω από την BA-θεραπεία. BA καταστέλλει περισσότερες βιολογικές διαδικασίες για να εμποδίσει την κανονική μεταβολικές διαδικασίες, όπως τις κυτταρικές διεργασίες (spot 361, 128, 1087, 970, 823, 991, 842), αναπτυξιακές διαδικασίες (spot 361, 128, 1087, 970), εντοπισμού (spot 120, 970, 991), οι απαντήσεις σε ερεθίσματα (σημείο 81), πολυκύτταροι διαδικασίες οργανισμικό (σημείο 81), και τις διαδικασίες του ανοσοποιητικού συστήματος (σημείο 81). Στην πραγματικότητα, ορισμένες πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε πολλαπλές βιολογικές διεργασίες, και πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε κυτταρικές διεργασίες συνέβαλε επίσης στη κυτταρική οργάνωση συστατικό (σημείο 361, 128, 1087, 970). Σύμφωνα με το μοριακό τους λειτουργία, τα διαμορφωμένα πρωτεΐνες ταξινομήθηκαν σε 5 ομάδες: την καταλυτική δραστηριότητα (36,00%), δραστικότητα δομικό μόριο (32,00%), η δέσμευση (20,00%), δραστικότητα ρυθμιστής μετάφρασης (8,00%), και αντιοξειδωτική δράση (4.00% ) (Σχ. 3Β). Στην κατηγορία καταλυτική δραστηριότητα, η δραστηριότητα της ισομεράσης δισουλφιδίου πρωτεΐνης (spot 655, 1109) και δραστικότητα οξειδοαναγωγάσης (spot 542, 526, 1120, τα οποία βρίσκονται στην μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων) ανεστάλησαν από κατεργασία ΒΑ. Ταυτόχρονα, αντιοξειδωτική δράση (spot 542) επίσης μειώθηκε κατά τη θεραπεία ΒΑ. Επιπλέον, οι περισσότερες πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη δραστηριότητα δομικό μόριο (σημείο 81, 361, 1085, 1087, 970), η σύνδεση (spot 128, 573, 868) και δραστηριότητα ρυθμιστής μετάφραση (spot 673, 885) μειώθηκαν σημαντικά σε BA επεξεργασμένα κύτταρα HeLa .

Με βάση την ταξινόμηση PANTHER και το γονίδιο της κατηγορίας, βιολογική διαδικασία (Α) και μοριακή λειτουργία (Β) του αντίστοιχου εντοπίστηκαν πρωτεΐνες ταξινομήθηκαν.

η

Ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης που παράγεται με χορδών, η οποία προσφέρει μία βελτίωση στην λειτουργική ανάλυση (Εικ. 4). Το δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης παρέχει μια πλατφόρμα για την ανάλυση των λειτουργιών των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών », οι αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, βιολογικά μονοπάτια και μοριακές λειτουργίες. Συνεπώς, δημιουργήθηκαν τέσσερα μεγάλα δίκτυα: (1) νευροτροφίνη οδό σηματοδότησης, (2) μακροχρόνια κατάθλιψη, (3) αρρυθμογόνου δεξιάς κοιλίας, και (4) VEGF μονοπάτι σηματοδότησης. MAP2K2 (spot 942), YWHAB (spot 823) και YWHAE (spot 842) ήταν οι κεντρικές πρωτεΐνες των αλληλεπιδρώντων δικτύων, και τα επίπεδά τους μειώθηκαν με επεξεργασία ΒΑ, η οποία μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην οδό σηματοδότησης νευροτροφίνη. Από τις ταυτοποιημένες πρωτεΐνες, οι πρωτεΐνες 14-3-3 εμπλέκονται σε πολλές φυσιολογικές οδούς, και οι εν λόγω πρωτεΐνες έχουν δειχθεί ότι είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη και την αποπτωτική ικανότητα πολλών κακοηθών όγκων.

Ο άλλαξε από πρωτεΐνες πρωτεομική ανάλυση ανέβηκαν στο εργαλείο STRING για τον εντοπισμό λειτουργικά δίκτυα σηματοδότησης. Οι προβλεπόμενες λειτουργικές συνδέσεις αποτελούνται από έως και οκτώ γραμμές:. Ένα χρώμα για κάθε είδος αποδεικτικών στοιχείων

Η

γενιά ROS στην BA-επεξεργασμένα κύτταρα HeLa

ROS παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης επειδή εμπλέκεται στην μιτοχονδριακή μεμβράνη διαπερατοποίηση και επαγωγή κυτταρικού θανάτου. Σύμφωνα με την πρωτεΐνη προφίλ των κυττάρων BA-θεραπεία, UDP-γλυκόζη 6-αφυδρογονάση (spot 526), ​​αφυδρογονάση 6-φωσφογλυκονικής (spot 1120) και το ένζυμο της υπεροξειδάσης (spot 542) συμμετείχαν στη βιολογική διαδικασία της αντίδρασης στο στρες οξειδάσης, η οποία συσχετίζεται με BA-επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων HeLa. Το επίπεδο της παραγωγής ROS ανιχνεύθηκε μετά την επεξεργασία των κυττάρων HeLa με BA (15 μmol /L, 30 μmol /L) για 48 ώρες. Το επίπεδο του ROS στα κύτταρα BA-θεραπεία αυξήθηκε σημαντικά. Το επίπεδο του ROS στα κύτταρα BA-αγωγή ήταν 9,28 φορές και 12,77 φορές υψηλότερο από το επίπεδο του ROS στα κύτταρα ελέγχου για τις θεραπείες των 15 μmol /L και 30 μmol /L, αντίστοιχα, και ένα επάνω ρυθμισμένη τάση παρατηρήθηκε καθ ‘όλη το πείραμα (Σχ. 5). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ΒΑ προκαλεί απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του ROS μεσολάβηση μηχανισμών κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα HeLa.

κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15 μmol /L, 30 μmol /L ΒΑ για 48 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με 10 mmol /L DCFH-DA για 40 λεπτά. Η ένταση φθορισμού της DCFH μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. (Α) Πραγματική φάσματα από έναν εκπρόσωπο μόνο πείραμα. (Β) Η ένταση φθορισμού των χρωματισμένων κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Στήλες δείχνουν μέσες τιμές τριών πειραμάτων (± SD). **

σ

& lt? 0,01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (0 μmol /L BA)

Η

ανάλυση qRT-PCR των γονιδίων που εμπλέκονται στην BA-επαγόμενη κυτταρική απόπτωση

.

Επειδή οι 14-3-3 πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε πολλές φυσιολογικές οδούς, συμπεριλαμβανομένων της ανάπτυξης και της απόπτωσης, επελέγησαν οι αλλαγές σε έκφραση των δύο γονιδίων που κωδικοποιούν την εντοπίστηκαν 14-3-3 οικογένεια πρωτεϊνών για περαιτέρω ανάλυση με qRT-PCR. Η ρύθμιση προς τα κάτω των δύο επιλεγμένων γονιδίων (

14-3-3β

και

14-3-3ε

) στο επίπεδο της μεταγραφής ήταν σύμφωνα με τα στοιχεία 2-DE. Τα επίπεδα έκφρασης του

14-3-3β

και

14-3-3ε

ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται με επεξεργασία ΒΑ. Γονίδια

Bcl-2

και

Bax

διερευνήθηκαν για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της συσσώρευσης ROS στην BA-επαγόμενη απόπτωση επειδή το μιτοχονδριακό μονοπάτι ρυθμίζεται από prosurvival Bcl-2 και Bax προαποπτωτικής. Το επίπεδο έκφρασης του

παρατηρήθηκε Bcl-2

να είναι σημαντικά χαμηλότερο από το επίπεδο ελέγχου. Αντίθετα, η έκφραση των προ-αποπτωτικών

Βαχ

ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τους ελέγχους από qRT-PCR (Εικ. 6).

κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 30 mmol /L ΒΑ για 24 ώρες και στη συνέχεια Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ αντιδραστήριο. Στήλες δείχνουν μέσες τιμές τριών πειραμάτων (± SD). *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (0 μmol /L)

Η

Συζήτηση

ΒΑ, ένα φυσικό πεντακυκλική τριτερπενοειδείς με τη δυνατότητα να σκοτώσει κύτταρα μελανώματος [1], έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση σε πολλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές [2] – [8]. BA έχει αναφερθεί ότι είναι άνευ κυτταροτοξικά αποτελέσματα έναντι υγιών κυττάρων. Τα φυσιολογικά κύτταρα, όπως δερματικούς ινοβλάστες, το περιφερικό αίμα λεμφοβλάστες [2], μελανοκύτταρα [14] και την ανθρώπινη αστροκύτταρα [15], έχει αποδειχθεί ότι είναι ανθεκτικά σε θεραπεία BA in vitro. Αρκετές μελέτες έχουν δώσει σημαντική γνώση σε BA-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. BA κατέστειλε επίσης την ανάπτυξη του όγκου in vivo σε σειρά μελετών σε ζώα. Σε ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος χορήγησης ωοθηκών ΒΑ αύξησε σημαντικά το χρόνο επιβίωσης [25]. Schettino, Μ Τ εκμεταλλεύτηκε ΒΑ στη θεραπεία του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων που θεωρείται απαραίτητη για την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, τα αποτελέσματα δείχνουν BA μπορεί να είναι ένα από τα ελπιδοφόρα φάρμακα για τη θεραπεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [26]. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αποκάλυψη του μοριακού μηχανισμού (ων) των αποπτωτικών αποτελεσμάτων της ΒΑ σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή (HeLa) και να διερευνηθούν οι επιδράσεις του ΒΑ την ανάπτυξη των κυττάρων HeLa.

για τον προσδιορισμό της κατάλληλης συγκέντρωσης της ΒΑ για τους πρωτεομική πειράματα, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μία σειρά συγκεντρώσεων ΒΑ για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες, και στη συνέχεια η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ και ο ρυθμός της απόπτωσης αναλύθηκε με ροή κυτταρομετρία. Το αποτέλεσμα αποκάλυψε το BA αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HeLa σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο, και το IC

50 ήταν 25,93 ± 1,87 μΜ για 72 ώρες, η οποία ήταν σύμφωνη με την IC

50 (26,0 ± 2,1 μΜ) από Rita C δοκιμάστηκαν κύτταρα HeLa που εκτίθενται σε θεραπεία ΒΑ για 72 ώρες [24]. Σημαντική αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση των κυττάρων παρατηρήθηκαν όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 30 mmol /L ΒΑ για 48 ώρες. Να συμμορφωθούν με ένα πρότυπο που κυτταρικής απόπτωσης πρέπει να προκαλείται, αλλά αρκετά ζωντανών κυττάρων πρέπει επίσης να διατηρηθεί για την εκχύλιση των πρωτεϊνών και πρωτεομική μελέτη, 30 mmol /L ΒΑ επιλέχθηκε για την κατεργασία των κυττάρων HeLa.

Πρωτεομική προσφέρει μια μέθοδο για τον εντοπισμό της οποίας πρωτεΐνες μεσολαβούν αποπτωτικών οδών σε κύτταρα κατεργασμένα με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [27] – [29]. Επειδή ο μοριακός μηχανισμός που εμπλέκεται στην επαγωγή της αναστολής του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης από ΒΑ δεν είναι ακόμη σαφής, έχουμε εφαρμόσει ένα σύστημα πρωτεομική για την καθολική αναζήτηση για διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών σε κύτταρα HeLa που πλήττονται από την ΒΑ. Οι περισσότερες πρωτεΐνες (30 σημεία) μειώθηκαν και μερικές πρωτεΐνες (6 σημεία) ενισχύθηκαν με κατεργασία ΒΑ. ανάλυση Λειτουργική κατηγορία που υποδηλώνει ότι οι μεταβολές στην έκφραση της πρωτεΐνης μετά τη θεραπεία ΒΑ συνδέεται με διαφορετικές βιολογικές διαδικασίες και μοριακές λειτουργίες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η BA-επαγόμενη απόπτωση κυττάρων HeLa βασίζεται κυρίως στην αναστολή των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη σύνθεση και το μεταβολισμό.

Μεταξύ των πρωτεϊνών δεκαπέντε μεταβολική σχετίζονται διαδικασία, δύο από τα πάνω ρυθμισμένα πρωτεΐνες (HSPA5, επιτόπου και 613 PLIN3, επιτόπου 248) εμπλέκονται στο μονοπάτι ενδοπλασματικού δικτύου (ER), η οποία εμπλέκεται στην αποπτωτική συγκρότημα αποκρίσεις. Η απόκριση στρες ER μπορεί να προωθήσει την κυτταρική επισκευή και παρατεταμένη επιβίωση με τη μείωση του φορτίου του ξεδιπλωμένη πρωτεϊνών μέσω της παγκόσμιας εξασθένησης της πρωτεϊνικής σύνθεσης ή πάνω ρύθμιση της συνοδούς, ένζυμα, και δομικά στοιχεία του ER [30]. Αν και ο μηχανισμός είναι ακόμα ασαφής, όταν ER στρες είναι συντριπτική, τα κύτταρα υφίστανται απόπτωση [31]. Η γλυκόζη ρυθμίζεται πρωτεΐνη HSPA5 (spot 613), το οποίο είναι ένα ER-κάτοικος συνοδού, ανταποκρίνεται στην οδό ER μέσω ενός δικτύου των ρυθμιστικών αρχών και των νέων μηχανισμών που οδηγούν σε διακοπή της ανάπτυξης [32]. Φορτίου, συμπεριλαμβανομένων των PLIN3 (spot 248), μετατοπίζεται στο ER και στη συνέχεια ενσωματώνεται σε μικρά φυσαλιδώδη φορείς που μεσολαβούν μεταφορά στο Golgi διαμερίσματα [33]. Ένα άλλο επάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνη είναι IL18 (spot 27), μία νέα προ-φλεγμονώδης κυτοκίνη που επάγει την έκφραση του παράγοντα νέκρωσης όγκων α (TNF-α) και Fas συνδετήρα, καθώς και πυρηνική μετατόπιση του πυρηνικού παράγοντα κΒ (ΝΡ-κΒ) [ ,,,0],34], [35]. ΝΡ-κΒ είναι βασικός ρυθμιστής του στρες που προκαλείται από μεταγραφική ενεργοποίηση, και ΒΑ έχει επίσης αναφερθεί ότι αναστέλλει φλεγμονώδη ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ [36]. Στην παρούσα εργασία, up-ρυθμιζόμενη έκφραση της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε, το οποίο μπορεί να μεσολαβεί η διαδικασία ER της ΒΑ στα κύτταρα HeLa.

Δύο κάτω-ρυθμίζονται αντιοξειδωτική πρωτεΐνες δραστηριότητα, UGDH (spot 526) και PGD (spot 1120) , καταλύουν την οξείδωση του C6 αλκοόλες σε καρβοξυλικά οξέα σε δύο διαδοχικές NAD

+ – εξαρτώμενη βήματα χωρίς την απελευθέρωση ενός ενδιάμεσου αλδεϋδης, και αυτές οι πρωτεΐνες είναι πολύ σημαντικές για την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων στα μιτοχόνδρια [37], [38]. Επιπλέον, το αντιοξειδωτικό PRDX6 πρωτεΐνη δραστηριότητα (spot 542) μπορεί να παρέχει προστασία από nitroxidative άγχος και την επισκευή κατεστραμμένων οξειδωτικά μόρια, και αυτή η πρωτεΐνη παίζει σημαντικό ρόλο στην σαρώσεως ROS σε φυσιολογικές συνθήκες [39]. Την ίδια στιγμή, το επίπεδο της παραγωγής ROS ανιχνεύεται με κυτταρομετρία ροής αυξήθηκε μετά την κατεργασία των κυττάρων HeLa με την ΒΑ, και αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα προηγούμενων δοκιμασιών δραστικότητας οξειδορεδουκτάσης και μπορεί να βοηθήσει να εξηγήσει τις αποπτωτικά αποτελέσματα της ΒΑ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η οδός μιτοχόνδρια ενεργοποιήθηκε από την ΒΑ, η οποία στη συνέχεια επάγεται απόπτωση των κυττάρων HeLa. Το οξειδωτικό στρες έχει γίνει γνωστό ότι είναι ένας μεσολαβητής της απόπτωσης που επάγεται από μια ποικιλία σκανδάλες, και τα μιτοχόνδρια θεωρούνται ως αισθητήρες της οξειδωτικής βλάβης και μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην απόπτωση [40], [41]. Η οικογένεια Bcl-2 πρωτεϊνών μπορεί να ρυθμίσει την οδό μιτοχόνδρια μέσω μεταβληθεί διαπερατοποίηση μιτοχονδριακής μεμβράνης [42]. Αντι-αποπτωτική Bcl-2 και Bax προαποπτωτικά είναι πολύ σημαντικές για την διαμεσολάβηση της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης διαπερατότητας και μιτοχονδριακής απόπτωσης μονοπάτι [43]. Βρήκαμε ότι η θεραπεία ΒΑ κατέστειλε την έκφραση του

Bcl-2

μεταγραφές, διευκόλυνε την έκφραση του

Bax από

qRT-PCR.