Αφηρημένο

αλληλεπίδραση στρωματικά-επιθηλιακά έχει αποδειχθεί ότι για την προώθηση των τοπικών την ανάπτυξη του όγκου και μακρινή μετάσταση. Εμείς προσπαθήσαμε να δημιουργήσουμε μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση της γονιδιακής θεραπείας ότι ο καρκίνος του συν-στόχων και την υποστήριξη των στρωματικών κυττάρων του για την καταπολέμηση του ευνουχισμού ανθεκτικά όγκων του προστάτη. Εδώ, δείξαμε ότι το ανθρώπινο οστεονεκτίνη υπερεκφράζεται στο επιθήλιο του καρκίνου του προστάτη και στρώματος του όγκου σε σύγκριση με την κανονική ομόλογό τους. Σχεδιάσαμε μια νέα ανθρώπινη υποκινητή οστεονεκτίνη (HON-522E) που περιέχει θετικά μεταγραφικά ρυθμιστικά στοιχεία που εντοπίζονται τόσο τον υποκινητή και το εξώνιο 1 περιοχή του ανθρώπινου γονιδίου οστεονεκτίνη.

In vitro

δοκιμασίες δημοσιογράφος αποκάλυψε ότι ο υποκινητής Hon-522E είναι ιδιαίτερα ενεργή στην ανδρογόνων αρνητικά και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη και των οστών στρωματικά κύτταρα υποδοχέα σε σχέση με τον καρκίνο του προστάτη με θετικούς υποδοχείς ανδρογόνων κυττάρων. Επιπλέον,

in vivo

προστάτη-προαγωγής όγκων δραστικότητα του υποκινητή Hon-522E επιβεβαιώθηκε με ενδοφλέβια χορήγηση ενός αδενοϊικού φορέα που περιέχει το γονίδιο HON-522E υποκινητή καθοδηγείται λουσιφεράσης (Ad-522E-Luc) σε ποντικούς φέρουν ορθοτοπική ξενομοσχεύματα ανθρώπινου όγκου του προστάτη. Επιπλέον, ένας αδενοϊικός φορέας με την Hon-522E-υποκινητή καθοδηγείται απλού έρπητα θυμιδίνης του ιού γονίδιο της κινάσης (Ad-522E-ΤΚ) ήταν εξαιρετικά αποτελεσματική έναντι της ανάπτυξης του ανεξάρτητου από ανδρογόνο κυτταρική γραμμή PC3M ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη και των οστών στρωματικά

in vitro

και σε προκαθορισμένες όγκων PC3M

in vivo

κατά την προσθήκη του ganciclovir προφαρμάκου. Λόγω της ετερογένειας των ανθρώπινων όγκων του προστάτη, υποστηρικτής μεσολάβηση γονιδιακή θεραπεία Hon-522E έχει τη δυνατότητα για τη θεραπεία της ορμονοάντοχο και των οστών μεταστατικών καρκίνων του προστάτη

Παράθεση:. Sung SY, Chang JL, Chen KC, Yeh SD, Liu YR, Su YH, et al. (2016) Co-Στόχευση του καρκίνου του προστάτη επιθήλιο και το στρώμα των οστών από τα ανθρώπινα Οστεονεκτίνη-Ανάδοχος-διαμεσολαβείται Αυτοκτονία Γονιδιακή θεραπεία αποτελεσματικά Αναστέλλει ανδρογόνων-Ανεξάρτητη προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου. PLoS ONE 11 (4): e0153350. doi: 10.1371 /journal.pone.0153350

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 3 Φλεβάρη του 2016? Αποδεκτές: 28 Μαρ 2016? Δημοσιεύθηκε: 7 του Απριλίου 2016

Copyright: © 2016 Sung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την Grant ΠΙΟ 103-2320-B-038-040-my3 (CLH) και 103-2320-B-038 -039-my3 (SYS) από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας, MOHW105-TDU-Β-212 έως 134001 (SYS) από το Υπουργείο Υγείας και Πρόνοιας, και TMUTOP103003-6 (CLH), TMUTOP103003-3 (SYS) και 104TMU-ΕΛΕΡΠΕ-01-3 (YHS) από την Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους τόσο στην Ευρώπη όσο και στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) θεωρείται βασική θεραπεία ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με άλλες θεραπευτικές αγωγές. Οι περισσότεροι ασθενείς ανταποκρίνονται αρχικά σε ADT? Ωστόσο, η πραγματική φύση της ετερογένειας των κυττάρων του όγκου έχει σαν αποτέλεσμα αντοχή στην θεραπεία και την εξέλιξη σε παθολογική νόσο που ονομάζεται ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνου του προστάτη (CRPC) εντός 18-24 μηνών [2]. Τελικού σταδίου CRPC συνήθως συνδέεται με την οστεώδη μετάσταση, η οποία προκαλεί σημαντική θνησιμότητα και νοσηρότητα με την ανάπτυξη σοβαρών σκελετικών επιπλοκών σε προσβεβλημένους ασθενείς. Πρόσφατες κλινικές προσεγγίσεις χρησιμοποιώντας παράγοντες που στοχεύουν διακριτούς μηχανισμούς δράσης, συμπεριλαμβανομένης της χημειοθεραπείας σύνδεσης τουμπουλίνης (καμπαζιταξέλη)? ανοσοθεραπεία (sipuleucel-T)? CYP-17 αναστολή (αμπιρατερόνη)? υποδοχέα ανδρογόνων (AR) αποκλεισμός (enzalutamide)? και η θεραπεία ραδιοϊσοτόπων (ραδίου-223), αν και έχουν δείξει ελπιδοφόρα αποτελέσματα στην καθυστέρηση των σκελετικών επιπλοκών, αλλά και τη βελτίωση της συνολικής επιβίωσης [3], η διαχείριση των ασθενών με μεταστατικό CRPC παραμένει μια πρόκληση, με μέσο χρόνο επιβίωσης λιγότερο από 19 μήνες [4] . Έτσι, η ανάπτυξη νέων παραγόντων με πιο αποτελεσματική αντικαρκινική δράση είναι ζωτικής σημασίας για τη θεραπεία μεταστατικού CRPC. Ειδικότερα, τα φάρμακα που χρειάζονται ότι ο καρκίνος του στόχου ορμονοάντοχου κύτταρα του προστάτη ανεξάρτητα από την κατάσταση διαφοροποίησης, με διάφορα επίπεδα του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) έκφρασης.

Προηγούμενες γενετικές και μοριακές μελέτες που πραγματοποιήθηκε ότι τα κύτταρα του όγκου είναι ετερογενής και μετέπειτα μεταστάσεις τους είναι τα αποτελέσματα της μη-τυχαία, διαδοχική και πολλαπλών βημάτων επιλεκτική διεργασίες μεταξύ των κυτταρικών πληθυσμών προϋπάρχουσες. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν αποδείξει την περίπλοκη ενδοκυτταρική επικοινωνία μεταξύ επιθηλιακών κυττάρων στρώματος και του καρκίνου που οδηγεί σε μόνιμη γενετική και συμπεριφορικές αλλαγές όχι μόνο στα επιθηλιακά κύτταρα, αλλά και στον καρκίνο που σχετίζεται με στρωματικά κύτταρα που κινεί αλλαγές περαιτέρω γενετική και γονιδιακή έκφραση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [ ,,,0],5, 6]. Μέσα από μια σειρά πολύπλοκων, οικεία αμφίδρομης επικοινωνίας μεταξύ του καρκίνου του προστάτη και του στρώματος υποδοχής, τα καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν πρόσθετα πλεονεκτήματα ανάπτυξη και την επιβίωση και, τελικά, να διαδίδουν σε απομακρυσμένα όργανα με θανατηφόρα αποτελέσματα [7-9]. Ετσι, συν-στόχευση τόσο του όγκου και την υποστήριξη στρωματικών κυττάρων του μπορεί να βελτιώσει θεραπευτικές αποκρίσεις και τη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη [10-13]. Δεδομένου ότι η γονιδιακή θεραπεία έχει ταυτοποιηθεί ως η προτιμώμενη θεραπεία για μεταστατικούς καρκίνους [14], η ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής στρατηγικής για την παράδοση και έκφραση θεραπευτικών γονιδίων στο επιθήλιο του όγκου και των παρακείμενων στρώμα είναι απαραίτητη για τη διάθεση τέτοιας θεραπείας.

Οστεονεκτίνη (επίσης γνωστή ως βασικής μεμβράνης-40 [BM-40] και εκκρινόμενης πρωτεΐνης όξινα πλούσια σε κυστεΐνη [SPARC]) κατανέμεται ευρέως σε διάφορους ιστούς κατά την ανάπτυξη και κυτταρική βλάβη [15] και παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής προσκόλλησης, πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, και αναδιαμόρφωση ιστού [16]. Στο μικροπεριβάλλον των οστών, οστεονεκτίνη είναι η πλέον άφθονη πρωτεΐνη μήτρας μη-κολάζ που εκφράζεται έντονα στις αρχές του οστεοβλαστική διαφοροποίηση και είναι κρίσιμης σημασίας για τη διατήρηση της οστικής μάζας [17]. Ο ρόλος των οστεονεκτίνη στον καρκίνο του προστάτη έχει αναγνωριστεί ως ένα χημειοελκτικό για καρκίνο του προστάτη κύτταρα των οστών επεμβατική [18-20]. Υψηλά επίπεδα έκφρασης οστεονεκτίνη έχουν παρατηρηθεί σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη που προέρχονται από μεταστάσεις και στον καρκίνο του προστάτη μεταστατικές εστίες [21]. Επιπλέον, αυξημένα επίπεδα οστεονεκτίνη στην πρωτογενή καρκίνο του προστάτη που σχετίζεται με την επακόλουθη ανάπτυξη της μετάστασης [22], υποδεικνύοντας ότι ο καρκίνος του προστάτη κύτταρο μετάσταση στο οστό διαμεσολαβείται εν μέρει από το οστεονεκτίνη μεσολάβηση προώθηση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων, δραστικότητα πρωτεάσης, και εισβολή. Επειδή συμβαίνει έκφραση οστεονεκτίνη και στις δύο επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα και τα κύτταρα των οστών, ο υποκινητής οστεονεκτίνη θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να οδηγήσει ένα θεραπευτικό γονίδιο συν-στόχο το οστό μεταστατικό καρκίνο του προστάτη και την υποστήριξη μικροπεριβάλλον του, ανεξάρτητα από το βασικό επίπεδο AR και PSA έκφραση.

σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να δημιουργήσουμε ένα προαγωγό διαμεσολαβείται θεραπευτικού παράγοντα που συν-στόχους του καρκίνου του προστάτη και των γύρω στρωματικά κύτταρα του. Βρήκαμε ότι οστεονεκτίνη ρυθμίζεται αυξητικά στα επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου του προστάτη και του καρκίνου που σχετίζεται με στρωματικά κύτταρα σε σύγκριση με τα κανονικά αντίστοιχά τους. Σχεδιάσαμε μια νέα HON υποκινητή (Hon-522E) που περιέχει θετικά μεταγραφικά ρυθμιστικά στοιχεία που εντοπίζονται τόσο τον υποκινητή και εξόνιο 1 περιοχή του γονιδίου Hon. Κατασκευάσαμε επίσης μία αδενοϊικό φορέα ελαττωματικής αντιγραφής που φέρουν τον ιό του απλού έρπητα θυμιδίνης κινάσης (Ηδν-ΤΚ) γονίδιο που κατευθύνεται από έναν εξαιρετικά δραστικό 580 bp HON προαγωγό (HON-522E). Η θεραπεία με αυτό το κατασκεύασμα, Ad-522E-ΤΚ, σε συνδυασμό με το ganciclovir προφάρμακο (GCV) βρέθηκε για πρώτη φορά για να σκοτώσει τα δύο ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκίνου του προστάτη και κυτταρικές γραμμές των οστών στρωματικά

in vitro

και να αναστέλλουν η ανάπτυξη του όγκου του προστάτη σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος. Λόγω της ετερογένειας των ανθρώπινων όγκων του προστάτη, Ad-522E-ΤΚ μπορεί να εφαρμοστεί ως συμπληρωματική θεραπεία με άλλους τρόπους AR-στόχευση για θεραπεία ορμονοάντοχο και των οστών μεταστατικών καρκίνων προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές και καλλιέργεια κυττάρων

Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη LNCaP ανθρώπινη, C4-2, C4-2B, PC3, DU145 και PC3M, και μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος MG63 που έχουν χρησιμοποιηθεί σε προηγούμενες μας μελέτες [6, 23, 24], διατηρήθηκαν σε μέσο Τ και συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου (FBS). hFOB 1,19 κυτταρικές σειρές στρώμα μυελού οστών ανθρώπου HS27A ανθρωπίνων οστεοβλαστών και αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA, USA) και διατηρήθηκαν σε ένα 1: 1 μίγμα F12 μέσο Ham /Τροποποιημένο Μέσο και RPMI 1640 μέσο Eagle Dulbecco, αντίστοιχα, με το 10% FBS. Η κυτταρική σειρά συσκευασίας αδενοϊού 293 (Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario, Canada) διατηρήθηκε σε Μέσο Eagle Minimal και συμπληρωμένο με 10% FBS και 2 mM γλουταμίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Όλα τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας και τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Invitrogen. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 37 ° C επωαστή με 5% CO

2 και ανακαλλιεργήθηκαν φτάνοντας το 90% συρροή.

ανθρώπινο υποκείμενο και σύλληψη Laser μικροδιατομής (LCM)

Πειράματα με ανθρώπινα δείγματα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας (IRB) στο Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο (ΤΜΣ-JIRB 20131253). Μια μικροσυστοιχία προστατικού ιστού (TMA) που περιέχει 49 πυρήνες ιστού που αντιπροσωπεύουν δείγματα από 40 περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη και 9 συμφωνημένα κανονική παρακείμενους ιστούς ελήφθη από το Super Bio Chips (CA4, Σεούλ, Κορέα). Κατεψυγμένα δείγματα ιστών ανθρώπινου προστάτη ελήφθησαν από το ΤΜΣ κοινή Βιοτράπεζα βασίζεται στην Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο και των συνδεδεμένων νοσοκομείων από άτομα με γραπτή συγκατάθεση. LCM χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση επιλεκτικά καθαροί πληθυσμοί κύτταρα καρκίνου προστάτη και μη νεοπλαστικά επιθηλιακά κύτταρα, καθώς και το στρώμα πλησίον Gleason βαθμού 3 και βαθμού 4 αδένες και στρώμα παρακείμενα σε μη κακοήθεις αδένες από κατεψυγμένες τομές δειγμάτων προστατεκτομής που προέρχονται από τέσσερις ασθενείς . Εν συντομία, οκτώ-micron-τομές πάχους του κατεψυγμένου ιστού χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το Arcturus HistoGene Κατεψυγμένα τμήμα χρώσης Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Περιοχές των επιλεγμένων κυτταρικών πληθυσμών ήταν μικροτομή από τα τμήματα και συλλέγονται με τη χρήση του συστήματος ArcturusXT και Καπέλα CapSure ΕΣ LCM. Οι ρυθμίσεις του λέιζερ ήταν ως ακολούθως: κηλίδα διαμέτρου καθορίστηκε σε 30 μm, ισχύς 70 mW, και διάρκεια παλμού 25 χιλιοστά του δευτερολέπτου. Ολικό RNA από κάθε δείγμα μικροδιατομή εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το PicoPure RNA Kit Απομόνωση ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. LCM όργανο και όλα τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα ελήφθησαν από Thermo Fisher Scientific Inc. (Madison, WI, USA).

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας η υψηλής καθαρότητας Απομόνωση RNA Kit (Roche, Indianapolis, ΙΝ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το πρώτο-κλώνου συμπληρωματικού DNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές και Moloney ιός λευχαιμίας ποντικού ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen) και υποβλήθηκε σε PCR πραγματικού χρόνου με τη χρήση του LightCycler 480 με τον κύριο κιτ Light Cycler TaqMan σε συνδυασμό με τον ανιχνευτή καθολική ProbeLibrary (Roche) σύμφωνα με τις τις οδηγίες του κατασκευαστή. γονιδίων στόχων ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για HON (προς τα εμπρός: 5′-GTGCAGAGGAAACCGAAGAG-3 ‘και να αντιστραφεί: 5′-TGTTTGCAGTGGTGGTTCTG-3’., μετρήστε 77), και το γονίδιο καθαριότητας, HSPCB (προς τα εμπρός: 5′-AGCCTACGTTGCTCACTATTACG-3 «και να αντιστραφεί: 5′-GAAAGGCAAAAGTCTCCACCT-3 ‘, μετρήστε όχι 55).. Η σχετική έκφραση γονιδίου του οστεονεκτίνη στις κυτταρικές σειρές αναπαρίσταται ως 2

-ΔCT, με ΔCt προσδιορίζεται αφαιρώντας τον μέσο κύκλο κατώφλι HSPCB γονίδιο housekeeping από τη μέση τιμή του γονιδίου-στόχου.

Το πλασμίδιο κατασκευή

Όλα τα κατασκευάσματα υποκινητή δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα κλωνοποίησης ΤΟΡΟ τΑ (Invitrogen) και στη συνέχεια υποβάλλεται σε πέψη με τη χρήση κατάλληλων θέσεων περιορισμού στον πολυσυνδέτη να επιτρέπει την εισαγωγή εντός του φορέα pGL3-βασικό (Promega, Madison, WI, USA) που περιέχει την περιοχή κωδικοποίησης του ο γονίδιο λουσιφεράσης πυγολαμπίδας. Όλα τα κατασκευάσματα υποκινητή είχε το ίδιο 5 ‘άκρο. Ο αποστάτης μεταξύ των GGA-κουτιά 1 και 2 διεγράφησαν με ανασυνδυασμένη PCR χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα σύνολα εκκινητών: 522-Ν: (5’ACTAGTAGCAGCTTGTCTTGTC3 ‘), spdel-C: (5’CTTCTCCCCTGTCTCTGTCTT3’), και spdel-Ν: (5 «AAGACAGAGACAGGGGAGAAG3 ‘) σε συνδυασμό με την αυτή κατεύθυνση εναρκτήρες: Intron-C: (5’TACCTCAGTGGCAGGCAGGCAG3’), το εξόνιο-C: (5’CAGGCAGGCAGGCGGCAG ‘), και Hafner-C: (5’GCGCGCTCTCCGGGCAGTCTG3’) για να κατασκευαστεί HON-522I, Ουν- 522E, και Hon-522H, αντίστοιχα. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τα κύτταρα DU145 για το πρότυπο. Όλες οι κατασκευές συμπεριλαμβανομένων PCR παραγμένα κομμάτια DNA επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

διαμόλυνση DNA και Λουσιφεράσης δοκιμασία

Τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με διάφορες οστεονεκτίνη λουσιφεράσης υποκινητή πλασμίδια ανταποκριτές και pCMV-βgal (γαλακτοσιδάση) σε μια 5 : 1 μοριακή αναλογία με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Μετά από 48 ώρες επώασης, τα κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν για τις αξιολογήσεις δραστικότητα λουσιφεράσης και β-gal χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας Λουσιφεράσης και σύστημα β-γαλακτοσιδάσης Δοκιμασία Ενζύμου (Promega), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης υπολογίστηκε ως τα λουσιφεράση πυγολαμπίδας σχετικές μονάδες φωτός (RLU) διαιρείται με την αντίστοιχη τιμή για τη δραστηριότητα β-gal που υπάρχει σε κάθε δείγμα. Τρία ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν.

Σχεδιασμός φορέων αδενοϊού

Τα Ad-522E-ΤΚ και Ad-522E-Luc αδενοϊικοί φορείς (τύπος 5) σχεδιάστηκαν και μαζικής παραγωγής σύμφωνα με το καθιερωμένο πρωτόκολλο [25]. Εν συντομία, τα πλασμίδια p522E-TK και p522E-Luc που περιέχει ένα γονίδιο υποκινητή και του ιού του απλού έρπητα γονίδιο ΤΚ και λουσιφεράσης HON-522E, αντίστοιχα, κατασκευάστηκε με εισαγωγή της κασέτας έκφρασης εντός του Ε1Α διαγράφεται περιοχή του Ad5 αδενοϊικού φορέα μεταφοράς ρΔ E1sp1B. Μία αντιγραφή-ελλειμματικό ανασυνδυασμένο Ad522E-ΤΚ αδενοϊός δημιουργήθηκε σε κύτταρα 293 με συν-επιμόλυνση αυτών των κυττάρων τόσο με το μεταφοράς πλασμιδίου έκφρασης και ένα πλασμίδιο κυκλικό γονιδίωμα Ad (pJM17) χρησιμοποιώντας την πρότυπη μέθοδο καθίζησης φωσφορικού ασβεστίου [26]? Ad-CMV-ΤΚ και Ad-CMV-Luc κατασκευάστηκαν παρομοίως.

θυμιδίνης δραστηριότητα κινάσης δοκιμασία

δραστηριότητας ΤΚ σε ad-522E-ΤΚ και Ad-CMV-TK-μολυσμένες κυτταρικές σειρές αναλύθηκε μέσω φωσφορυλίωσης [

3Η] GCV [27]. Εν συντομία, το υπερκείμενο κλάσμα του ακάθαρτου κυτταρικά εκχυλίσματα αναμίχθηκαν με ένα ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος προσδιορισμού ΤΚ που περιέχει 0.2 μCi [

3Η] GCV (Moravek Biochemicals, CA, USA), 3 mM MgCl

2, 3 mM ΑΤΡ, 10 μg /μL αλβουμίνη βόειου ορού και 50 mM ρυθμιστικό φωσφορικού νατρίου (ρΗ 6.5). Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 37 ° C για 90 λεπτά, μεταφέρθηκε σε DE-81 δίσκους (Whatman, Hillsboro, OR, USA), ξηραίνεται στον αέρα και πλύθηκε καλά με 50% αιθανόλη. Η φωσφορυλιωμένη [

3Η] GCV δεσμεύονται στους δίσκους προσδιορίζεται με ένα μετρητή σπινθηρισμού (Beckman Coulter Inc., Schaumburg, IL, USA). Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

In vitro δοκιμασίες κυτοτοξικότητας

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-522E-ΤΚ στο εύρος 0-100 πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ). Μετά από 2 ώρες προσρόφησης, το μέσο που περιέχει ιό αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία 10 μg /mL GCV για 5 ημέρες ακολουθούμενη από χρώση κρυσταλλικού ιώδους? στη συνέχεια, ο σχετικός αριθμός των κυττάρων εκτιμήθηκε σε οπτική πυκνότητα (OD) 590 nm μετά από χρώση. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

μελέτη των ζώων

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από και συμμορφώθηκε με τους κανονισμούς της Επιτροπής Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) της Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο (LAC- 2.013 έως 0.047). Έξι εβδομάδων-old άνδρες αθυμικά γυμνά ποντίκια ποντίκια BALB /cAnN.Cg-Foxn1nu /CrlNarl ελήφθησαν από το Εθνικό Εργαστήριο του Κέντρου Ζώων (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Τα ζώα κρατήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες ελεύθερες παθογόνων και φροντίζονται σύμφωνα με τα κριτήρια που περιγράφονται στην Εθνική Ακαδημία Επιστημών Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση Ζώων Εργαστηρίου. Για την ανάλυση της δραστηριότητας προαγωγού HON-522E

in vivo

, 1 × 10

5 κύτταρα PC3M σε 10 μL PBS εγχύθηκαν στις κοιλιακοί προστάτες των ποντικών. Στις 5 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου, που φέρει όγκο ή χωρίς θεραπεία ποντικοί έλαβαν ενδοφλέβια χορήγηση 1 × 10

9 pfu Ad-522E-Luc ή Ad-CMV-Luc μέσω της φλέβας της ουράς (η = 5). όργανα ποντικών και ξενομοσχεύματα όγκου προστάτη συλλέχθηκαν για τη δοκιμασία δραστικότητας λουσιφεράσης 2 ημέρες μετά την ιική ένεση. Για την αξιολόγηση του Ad-522E-ΤΚ σε συνδυασμό με GCV επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

, 5 × 10

5 PC3M κύτταρα σε 50 μL PBS εγχύθηκαν υποδορίως στα πλευρά των ποντικών. Όταν ο όγκος έγινε ψηλαφητός (3-4 mm σε διάμετρο), τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία σε 4 πειραματικές ομάδες (η = 8 για κάθε ομάδα): ομάδα 1, θεραπεία PBS? ομάδα 2, μόνο GCV? ομάδα 3, Ad-522E-ΤΚ σε συνδυασμό με PBS? και η ομάδα 4, Ad-522E-ΤΚ σε συνδυασμό με GCV. Ad-522E-ΤΚ (50 μι? 2 χ 10

9 pfu) σε PBS χορηγήθηκε μέσω εντός του όγκου έγχυση κάθε δεύτερη μέρα για 3 φορές. GCV (100 μL) χορηγήθηκε καθημερινά μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης σε μια δόση των 40 mg /kg σωματικού βάρους για 2 εβδομάδες. Δισδιάστατη μετρήσεις του όγκου διεξήχθησαν δύο φορές την εβδομάδα με παχύμετρο, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον απλοποιημένο τύπο για μία περιστροφική ελλειψοειδές (L × w

2 × 0,5236). Τα ζώα θυσιάστηκαν 5 εβδομάδες μετά από θεραπεία με τη χρήση CO

2 για ευθανασία και οι όγκοι ήταν ενθουσιασμένος για ιστοπαθολογική εξέταση.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

χρώση IHC διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Novolink Polymer Σύστημα Ανίχνευσης (Leica Microsystems, Newcastle Upon Tyne, Ηνωμένο Βασίλειο), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Ki-67 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε ξενομοσχεύματα όγκου με αντιανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού Ki-67 (1: 100? NCL-Ki67-MM1, Leica Biosystems). Η απόπτωση εκτιμήθηκε με τη χρήση του Apo-BrdU-IHC In Situ DNA κατακερματισμός Assay Kit (BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA) όπως περιγράφεται [28]. IHC χρώση για οστεονεκτίνη διεξήχθη επί του προστάτη TMA χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπινης-οστεονεκτίνη (1:50? NCL-O-nectin, Leica Biosystems). Κάθε σημείο TMA εξετάστηκε από παθολόγο (J.L.C.) με τη χρήση συστήματος βαθμολόγησης Allred [29]. Η αριθμητική τιμή για τη συνολική ένταση (βαθμολογία ένταση) βασίζεται σε ένα σύστημα 4-σημείων: 0, 1, 2, και 3 (για κανένα, ελαφρά, μεσαία, ή σκούρο χρώση). Η αριθμητική τιμή τοις εκατό βάφονται (βαθμολογία αναλογία) προσδιορίζεται από μια γεωμετρική κατανομή? Δεν λεκέ = 0? ≤1 /100 κύτταρα βάφονται = 1? ≤1 /10 κύτταρα βάφονται = 2? ≤1 /3 κύτταρα βάφονται = 3, ≤2 /3 κύτταρα χρωματίστηκαν = 4? όλα τα κύτταρα βάφονται = 5. Η προσθήκη των δύο τιμών δίνει το συνολικό Allred σκοράρει [30].

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται ως μέση τιμή (τυπική απόκλιση [SD]), εκτός αν άλλως διευκρινίζεται. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με χρήση t-test δύο ουρά Student. P & lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της οστεονεκτίνης στον καρκίνο του προστάτη και στρωματικά κύτταρα

Η συσχέτιση της έκφρασης οστεονεκτίνης με την εξέλιξη του καρκίνου του ανθρώπου που είχε εκτιμηθεί αρχικά μέσω real-time RT -PCR στην αποκρίνονται στο ανδρογόνο LNCaP και ανδρογόνο αναίσθητη κυτταρικές γραμμές καρκίνου προστάτη PC3. Στη σειρά των κυτταρικών γραμμών LNCaP γράμμωσης, η έκφραση του οστεονεκτίνη συσχετίζεται με μεταστατικό δυναμικό αυξήθηκε οστών, στην οποία η πυρίμαχη ορμόνη και οστού μεταστατικό C4-2B εξέφρασε υψηλότερο επίπεδο από ό, τι οστεονεκτίνη γονική ανδρογόνο-εξαρτώμενη LNCaP και ανεξάρτητου από ανδρογόνο C4 του -2 κύτταρα. Ομοίως, PC3M, το παράγωγο πολύ μεταστατικός εκφράζεται 18 φορές υψηλότερα επίπεδα οστεονεκτίνη σύγκριση με γονικά κύτταρα PC3 τους που αρχικά προέρχεται από οστικές μεταστάσεις του καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 1Α). Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν μια συσχέτιση μεταξύ αυξημένη έκφραση οστεονεκτίνης και μεταστατική εξέλιξη CRPC. Όπως προστάτη μετάσταση στα οστά του καρκίνου θεωρείται ως ένα μικροπεριβάλλον με γνώμονα ασθένεια, τα υψηλότερα επίπεδα οστεονεκτίνη εκφράζεται από τα κύτταρα των οστών στρωματικά ανθρώπινα από εκείνη του καρκίνου του προστάτη κύτταρα παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας hFOB των οστεοβλαστών και του μυελού των οστών που προέρχονται κυτταρικές σειρές ινοβλαστών HS27A (Σχήμα 1Α). Για να εκτιμηθεί η διαφορική έκφραση οστεονεκτίνη μεταξύ των noncancerous και καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη, καθώς και τα φυσιολογικά και σχετίζονται με τον καρκίνο στρωματικά κύτταρα σε ίδια άτομα, LCM αποκόπηκαν δείγματα από χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενείς όγκους του προστάτη. Μεταξύ των ζευγών των κανονικών και κακοηθών ιστών του προστάτη, τα δείγματα 3 από τους 4 ασθενείς «εμφανίζεται μια σημαντικά αυξημένη έκφραση του οστεονεκτίνη σε καρκινικά κύτταρα και τον καρκίνο-γειτονικά στρωματικά κύτταρα σε σύγκριση με τις κανονικές ομόλογό τους? και το άλλο, έδειξε μειωμένη πρότυπο έκφρασης σε ιστούς όγκων (Σχήμα 1Β).

ποσοτική ανάλυση RT-PCR της έκφρασης mRNA οστεονεκτίνη στο (Α) ένα σειριακό του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη και των οστών στρωματικά (hFOB και HS27A) κυτταρικές σειρές και στο (Β) LCM-απομονώνεται επιθηλιακά προστάτη και στρωματικά κύτταρα από ζεύγη του πρωτογενούς όγκου του προστάτη (Τ) και φυσιολογικό προστάτη (Ν) ιστών που προέρχονται από 4 ασθενείς (Pt του 1 ~ 4). Η σχετική γονιδιακή έκφραση οστεονεκτίνης εκπροσωπήθηκε ως 2

-ΔCT, με ΔΟΙ προσδιορίζεται αφαιρώντας το μέσο όρο του κύκλου όριο HSPCB γονίδιο καθαριότητας από τη μέση τιμή του γονιδίου-στόχου. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. * P & lt? 0.05, ** p & lt? 0.001 έναντι των φυσιολογικών κυττάρων. (Γ) διάγραμμα διασποράς βαθμολογίας χρώσεως IHC για οστεονεκτίνη σε επιθήλιο προστάτη και στρώμα στα τμήματα του μικροσυστοιχίας ανθρώπινου ιστού προστάτου που περιέχουν πρωτογενή όγκο του προστάτη (n = 40) και φυσιολογικά δείγματα προστάτη (n = 9). Εκπρόσωπος εικόνες της IHC χρώση οστεονεκτίνης σε ζεύγη όγκου του προστάτη και φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη από δύο μεμονωμένους ασθενείς με μεγέθυνση 40 × και 100 × παρουσιάστηκε στα δεξιά. Το βέλος και βέλος υποδεικνύει θετική χρώση στα στρωματικά και επιθηλιακά κύτταρα, αντίστοιχα.

Η

Για να επικυρώσετε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ της υπερέκφραση οστεονεκτίνης και καρκινογένεσης του προστάτη σε κλινικά δείγματα, ανοσοϊστοχημική ανάλυση (IHC) διεξήχθη σε μια μικροσυστοιχία προστατικού ιστού που περιέχει 40 πρωτογενείς όγκους του προστάτη και 9 συμφωνημένα φυσιολογικά δείγματα προστάτη. Σε κάθε πυρήνα, ανοσοαντιδραστικότητα για οστεονεκτίνη μετρήθηκαν σε τομές που περιέχουν κανονικό στρώμα, φυσιολογικό επιθήλιο, στρώμα όγκου και επιθήλιο του όγκου. Αν και αυτές οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (Ρ = 0.2654 και 0.4042), οι τάξεις των συνολικής βαθμολογίας Allred στα συνολικά δείγματα του επιθηλίου του όγκου και στρώματος του όγκου ήταν μεγαλύτερη σε σχέση με φυσιολογικό επιθήλιο και φυσιολογικό στρώμα, αντίστοιχα (Σχήμα 1 C). Η διαφορά ήταν περισσότερο σημαντική όταν μόνο ζεύγη του όγκου του προστάτη και φυσιολογικό προστάτη δείγματα αναλύθηκε (Ρ = 0.085 και 0.2165 για τα επιθηλιακά χρώση και χρώση στρωματικά, αντίστοιχα). Η έλλειψη στατιστικής σημασίας μπορεί να οφείλεται στο μικρό μέγεθος δείγματος. Επιπλέον, η ισχυρή χρώση οστεονεκτίνη μπορεί να ανιχνευθεί στο δείγμα των οστικών μεταστάσεων καρκίνου του προστάτη (S1 Εικ). Η κατεύθυνση της επίδρασης προτείνει τις αυτοκρινείς και παρακρινείς δράσεις οστεονεκτίνης από όγκο και μικροπεριβάλλον του όγκου προκαλώντας κακοήθειας του καρκίνου του προστάτη και τη μετάσταση.

Προσδιορισμός των πρόσθετων μεταγραφικά ρυθμιστικά στοιχεία στην περιοχή του υποκινητή της ανθρώπινης οστεονεκτίνη

Η GGA-box 1 στην περιοχή του υποκινητή της ανθρώπινης οστεονεκτίνης (Hon) είναι ζωτικής σημασίας για την μέγιστη μεταγραφική δραστηριότητα, ενώ η πυριμιδίνης πλούσια σε διαχωριστικό ανάμεσα GGA-κουτιά 1 και 2 ασκεί μειωτικά αποτέλεσμα [31]. Σύγκριση των βοοειδών, ποντικού, και ανθρώπινες αλληλουχίες DNA οστεονεκτίνη εξόνιο 1 αποκάλυψε μια αξιοσημείωτη πολλαπλάσιο επανάληψη της αλληλουχίας CCTG σε όλα τα είδη, με μια συνεπή σύμπλεγμα 7-8 βάσεις ανοδικά από την αρχή του εξονίου 1 [32]. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε 2 κατασκευάσματα Hon-προαγωγός-ρεπόρτερ, p522E-Luc και p522H-Luc, να διερευνήσει το ρόλο της ακολουθίας CCTG σε λειτουργία υποστηρικτής Hon. Το θραύσμα υποκινητή σε p522H-Luc είναι πανομοιότυπη με εκείνη στο pGL2-spdel, η οποία έχει δυνατότητες δραστικότητα μεταγραφικής σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές [31]. p522E-Luc έχει ένα 5 ‘περιοχή του προαγωγού HON αλληλουχίες παρόμοιες με εκείνη του p522H-Luc, αλλά το 3’ άκρο εκτείνεται σε bp + 62, στην οποία 4 μονάδες CCTG περιλαμβάνονται (Σχήμα 2Α). Η επιμόλυνση αυτών των κατασκευασμάτων και pGL-3-ΤΑΤΑ (το οποίο χρησιμεύει ως αναφορά δραστηριότητας προαγωγού) σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές οστού στρωματικών, συμπεριλαμβανομένων hFOB, HS27A και οστεοσάρκωμα MG63 έδειξε αξιοσημείωτη αύξηση στην δραστικότητα της λουσιφεράσης με p522E-Luc σε σύγκριση με p522H- Luc (Σχήμα 2Β). Περαιτέρω 3 ‘επέκταση του υποκινητή σε bp 73 που βρίσκεται στην περιοχή ενδονίου 1 (p522I-Luc) είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη δραστικότητα λουσιφεράσης, καταδεικνύοντας σαφώς ότι η περιοχή μεταξύ bp 39 και 62 bp είναι υπεύθυνη για την πρόσθετη ρύθμιση προς τα πάνω του προαγωγού HON δραστηριότητας σε ανθρώπινα κύτταρα οστού, ενώ η περιοχή μεταξύ bp 63 και bp 73 περιέχει ένα αρνητικό ρυθμιστικό στοιχείο.

(Α) Schema διαφόρων οστεονεκτίνης-υποκινητή με γνώμονα δομές λουσιφεράσης. Ολες οι αλληλουχίες αριθμημένα σε σχέση με 1 (η θέση έναρξης της μεταγραφής). Μερική αλληλουχία του υποκινητή οστεονεκτίνη από τις βάσεις +40 να +62 περιέχει 4 μοτίβα CCGT (υπογραμμισμένη). Ένα τροποποιημένο κατασκεύασμα pGL3 (pGL3-ΤΑΤΑ) με ένα τεχνητό ΤΑΤΑ κουτί εισάγεται ανοδικά του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος της δραστικότητας υποκινητή βασικό επίπεδο. (B, C) Σύγκριση της δραστικότητας λουσιφεράσης των κατασκευασμάτων Hon-υποκινητή σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές οστού στρωματικών και κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη από το

in vitro

επιμόλυνση, και (δ) τα όργανα ποντικού με

σε vivo

παράδοσης γονιδίου. (B, C) Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης των διαφόρων κατασκευασμάτων διαιρέθηκε με την κανονικοποιημένη δραστηριότητα του κενού φορέα (pGL3-ΤΑΤΑ) και εκφράζεται ως πολλαπλή μεταβολή έναντι του ελέγχου. * P ≤ 0,05 έναντι p522H-Luc. (D) λουσιφεράσης δραστηριότητες (σε σχετικές μονάδες φωτός [RLU] ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης) προσδιορίστηκαν στα αντιπροσωπευτικά όργανα 2 ημέρες μετά την ενδοφλέβια ένεση από 1 × 10

9 pfu του Ad-522E-ΤΚ ή Ad-CMV-TK σε ενήλικα ποντίκια (η = 5).

η

Αξιολογήσαμε επόμενο την μεταγραφική δραστικότητα του προαγωγού Hon-522E σε διάφορες καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές που αντανακλούν διαφορετικά στάδια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η διαμόλυνση δράση προαγωγού HON-522E ανιχνεύτηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Ωστόσο, η σύγκριση της δράσης της λουσιφεράσης των εν λόγω επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη και αυτών με ενδογενή έκφραση οστεονεκτίνη RNA (Εικ 1Α) απεκάλυψε ότι η δραστικότητα προαγωγέα HON-522E είναι σχετικά υψηλότερο σε AR-αρνητικό, πιο επιθετική, και μεταστατικές κυτταρικές γραμμές, περιλαμβανομένων DU145 , PC3 και PC3M κύτταρα σε σύγκριση με AR-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν LNCaP, C4-2 και C4-2B (Σχήμα 2C).

για να αξιολογηθεί η δυνητική χρησιμότητα του υποκινητή Hon-522E στην έκφραση ενός διαγονιδίου σε ένα ιστοειδικό τρόπο

in vivo

, ένας αδενοϊικός φορέας περιέχει τον προαγωγό HON-522E ή την πανταχού παρούσα κυτταρομεγαλοϊού (CMV) που κατευθύνει το γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης (Ad-522E-Luc ή Ad-CMV-Luc) χορηγήθηκε ενδοφλεβίως σε αρσενικά ποντίκια χωρίς θύμο αδένα, είτε υγιή ή την άσκηση ορθοτοπική όγκους PC3M. Μετά από 2 ημέρες ιικής χορήγησης, κύρια όργανα, συμπεριλαμβανομένου του ήπατος, των πνευμόνων, των νεφρών, σπλήνα, το έντερο, την καρδιά, τον εγκέφαλο, κόλον, όρχεις, προστάτη, και τους μυς, και ξενομοσχεύματα όγκου PC3M συλλέχθηκαν για να μετρηθεί η έκφραση της λουσιφεράσης (Σχήμα 2D) . Παρατηρήσαμε ότι στα φυσιολογικά όργανα, Ad-522E-Luc μεσολάβηση έκφραση διαγονιδίου λουσιφεράσης στο ήπαρ, σπλήνα, και πνεύμονα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη του Ad-CMV-Luc, με ποσοστά μείωσης του 16%, 41%, και & lt? 1%, αντίστοιχα. Συνεπής με μια προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε αυξημένη έκφραση του mRNA οστεονεκτίνη σε παγκρεατικά επιθηλιακά κύτταρα του πόρου [33], η δράση της λουσιφεράσης σε μεταγωγή με Ad-522E-Luc στο πάγκρεας ήταν 34 φορές υψηλότερη από αυτή που επάγεται από Ad-CMV-Luc. Ενώ η δραστικότητα λουσιφεράσης μόλις ανιχνεύθηκε στο κανονικό προστάτη ποντικού, ανεξάρτητα από τη χορήγηση Ad φορέα, εξαιρετικά υψηλή έκφραση λουσιφεράσης με Ad-522E-Luc παρατηρήθηκε σε ξενομοσχεύματα προστάτη PC3M, με έκφραση 5 φορές μεγαλύτερη από ότι με την Ad-CMV-Luc. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο υποκινητής HON-522E είναι κατάλληλη σε σχέση με την αποτελεσματική και επιλεκτική έκφραση διαγονιδίου για μεταγραφική στόχευση του AR-αρνητικών και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη κύτταρα.

Αξιολόγηση

in vitro κυτταροτοξικότητα των

ανασυνδυασμένου Ad-522E-ΤΚ στον καρκίνο του προστάτη και των οστών στρωματικά κύτταρα

για να αξιολογηθεί η σκοπιμότητα της Hon υποκινητή-σκηνοθεσία συν-στόχευση γονιδιακή θεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη, σχεδιάσαμε ένα ελλειμματικό αναπαραγωγής αδενοϊικό φορέα, Ad-522E- TK, που φέρει το γονίδιο ΤΚ του ιού του απλού έρπητα Hon-522E υποκινητή-οδηγείται. Η αποτελεσματικότητα της απελευθέρωσης γονιδίου ΤΚ στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και των οστών στρωματικά προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία δραστηριότητας ΤΚ ενζυματική μετά από έκθεση αυτών των κυττάρων σε Ad-522E-TK και ομαλοποιούνται στη εξωτερικού ελέγχου Ad-CMV-ΤΚ για ιική μολυσματικότητα. Οι κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, συμπεριλαμβανομένου κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και των οστών στρωματικά, αποκάλυψε επιτυχής μεταγωγή γονίδιο ΤΚ με Ad-522E-ΤΚ με τουλάχιστον δύο φορές ισχυρότερη δραστηριότητα στο AR-αρνητικά καρκινικά κύτταρα προστάτη DU145, PC3 και PC3M καθώς και των οστών στρωματικά κύτταρα MG63 και HS27A σε σύγκριση με AR-θετικά LNCaP γενεαλογία κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α), η οποία ήταν παρόμοια με το αποτέλεσμα της δραστικότητας ανταποκριτή λουσιφεράσης μέσω p522E-Luc (Σχήμα 2C). Πιο εντυπωσιακά, Ad-522E-ΤΚ-μολυσμένα κύτταρα PC3M παρουσίασαν μια υψηλότερη παρά χαμηλότερη σε δραστηριότητα ΤΚ από τα κύτταρα μολυσμένα με Ad-CMV-TK? Αυτό το αποτέλεσμα ήταν σύμφωνο με αυτό της δραστηριότητας διαγονιδίου Ad-522E-Luc σε όγκους ξενομοσχεύματος PC3M (Σχήμα 2D). Μετά την πρόσθετη ganciclovir προφαρμάκου θεραπεία (GCV), Ad-522E-TK σημαντικά και δοσοεξαρτώμενο μείωσε την ανάπτυξη των κυττάρων PC3M με υψηλότερη αποτελεσματικότητα από εκείνη του Ad-CMV-Luc? Ad-522E-ΤΚ ή GCV εξασκείται μόνος κανένα κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί κυττάρων PC3M (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η μόλυνση του MG63 και HS27A με Ad-522E-ΤΚ προκάλεσε επίσης σημαντική κυτταρικό θάνατο όταν συνδυάζεται με GCV (Σχήμα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν την ικανότητα του Ad-522E-TK να στοχεύουν τόσο καρκίνου του προστάτη και τα κύτταρα των οστών στρωματικά.

(Α). Σύγκριση της έκφρασης του διαγονιδίου ΤΚ στα κύτταρα των καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη και κυτταρικές σειρές των οστών στρωματικά από Ad-522E-ΤΚ και Ad-CMA-ΤΚ.