Αφηρημένο

Παρά την καλύτερη κατανόηση της παθογένειας του καρκίνου του στόματος, το αποτέλεσμα της θεραπείας της παραμένει φτωχή. Έτσι, υπάρχει μια ανάγκη για νέες θεραπευτικές στρατηγικές για να βελτιώσει την πρόγνωση της ασθένειας αυτής. Παρεμβολή RNA (RNAi) φαίνεται να είναι ένα υποσχόμενο θεραπευτικό εργαλείο για την θεραπεία πολλών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στόματος. Ωστόσο, ένα εμπόδιο για μεσολάβηση RNAi θεραπείες υπήρξε παράδοση, συγκεκριμένα, η διατήρηση των μικρών παρεμβαλλόμενα RNA (siRNAs) σε ενδοσώματα και την επακόλουθη αποικοδόμηση τους σε λυσοσώματα, με αποτέλεσμα την αναποτελεσματική γονιδιακή σίγηση. Έτσι, η παρούσα μελέτη εξέτασε τη σκοπιμότητα του σχεδιασμού και χρησιμοποιώντας ένα πεπτίδιο, που ονομάζεται 599, που αποτελείται από ένα συντηκογόνα πεπτιδική αλληλουχία συνθετικού ιό γρίππης προερχόμενο ενδόσωμα-διασπαστικές και ένα τέντωμα του κατιονικού Νόνα κυττάρου-διεισδυτική (D-αργινίνη) υπολείμματα, να παραδώσει siRNAs εντός του στόματος καρκινικά κύτταρα και να επάγει σίγηση του θεραπευτικού στόχου, CIP2A, μια ογκοπρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στόματος. Η αύξηση της μοριακής αναλογίας 599 πεπτιδίου-προς-siRNA επέδειξε μία υψηλότερη ικανότητα σύνδεσης για μόρια siRNA και ενισχυμένη παροχή siRNA στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων από το στόμα. Στην πραγματικότητα, ποσοτικές μετρήσεις της παράδοσης siRNA σε κύτταρα έδειξαν ότι μία μοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA θα μπορούσε να παραδώσει 18 φορές υψηλότερες ποσότητες siRNAs σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν μόνο siRNA χωρίς σημαντικές μακροπρόθεσμες κυτταροτοξικά αποτελέσματα. Το πιο σημαντικό, ο 599 μέσω πεπτιδίου παράδοσης siRNA προωθούνται σημαντικές CIP2A mRNA και η πρωτεΐνη σίγηση η οποία οδήγησε σε μειωμένη στοματική καρκινικών κυττάρων διεισδυτικότητα και ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη. Μαζί, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι ένα χιμαιρικό πεπτίδιο που αποτελείται από ένα συντηκογόνα αλληλουχίας, σε συνδυασμό με υπολείμματα κυττάρων-διεισδυτική, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να παραδώσει αποτελεσματικά siRNAs εντός του στόματος καρκινικά κύτταρα και επάγουν την αποσιώπηση του γονιδίου στόχου του, πιθανώς προσφέροντας μια νέα θεραπευτική στρατηγική σε την καταπολέμηση του καρκίνου του στόματος

Παράθεση:. Cantini L, Attaway CC, Butler Β, Andino LM, Sokolosky ML, Jakymiw Α (2013) Συντηκογόνα-Oligoarginine μέσω πεπτιδίου Παράδοση siRNAs Στόχευση την CIP2A Oncogene σε προφορική καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (9): e73348. doi: 10.1371 /journal.pone.0073348

Επιμέλεια: Kin-Hang Kok, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: May 14, 2013? Αποδεκτές: 19, Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 3 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Cantini et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την NIDCR και NCRR χορηγεί R00DE018191 (AJ) και P20RR017696, αντίστοιχα. Το έργο αυτό χρηματοδοτείται επίσης από τη χορήγηση Bankhead-Coley Καρκίνου Φλόριντα Ερευνητικό Πρόγραμμα 08BN-02 (AJ). Τεχνική υποστήριξη παρέχεται από τη Διευκόλυνση Clemson Φως Imaging κατέστη δυνατή με το Εθνικό Βραβείο Ιδρύματος Επιστημών # 1126407 και επιχορήγηση Διευκόλυνσης Πανεπιστήμιο Clemson πυρήνα να Terri F. Bruce. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

εκτιμάται ότι περίπου 40.000 νέες περιπτώσεις και περίπου 8.000 θάνατοι που σχετίζονται με τον καρκίνο της στοματικής κοιλότητας και του φάρυγγα θα συμβεί κάθε χρόνο στις ΗΠΑ το 2012 [1]. Τον καρκίνο του στόματος κοιλότητα αυτή τη στιγμή κατατάσσεται ως η 6η συχνότερος καρκίνος παγκοσμίως, με πλακωδών κυττάρων καρκινώματα του βλεννογόνου του στόματος είναι ο πιο κοινός τύπος (-90%) [2], [3]. Παρά την τεράστια ποσά της έρευνας και η πρόοδος στους τομείς της ογκολογίας και της χειρουργικής, το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για τον καρκίνο του στόματος έχει μόνο μέτρια βελτιωθεί τα τελευταία 30 χρόνια και την πρόγνωση της παραμένει φτωχότερη σε σύγκριση με του μαστού, του παχέος εντέρου, ή του καρκίνου του προστάτη [1] . Ως εκ τούτου, οι νέες θεραπευτικές στρατηγικές για τη βελτίωση της έκβασης της νόσου.

παρεμβολή RNA (RNAi) είναι ένας ρυθμιστικός μηχανισμός άκρως συντηρημένη μετα-μεταγραφική γονιδιακή ενεργοποιούνται από μικρές, μη-κωδικοποίησης των μορίων δίκλωνου RNA το οποίο μπορεί ειδικά σιωπή γονιδιακής έκφρασης είτε καταστολή μετάφραση και /ή την επαγωγή αποικοδόμησης mRNA [4], [5]. Σύντομη δίκλωνα μόρια RNA, που είναι γνωστή ως μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA) είναι λειτουργικά μόρια που σε συνδυασμό με την επιλογή στόχου mRNA RNA επαγόμενη φίμωση σύμπλοκο (RISC) μεσολαβούν αλληλουχία-ειδικά και διάσπαση [6], [7], [8 ], [9]. Η ανακάλυψη ότι η εισαγωγή της χημικώς συντίθενται siRNAs σε κύτταρα θηλαστικών θα μπορούσαν αποτελεσματικά να επάγει αλληλουχία-ειδική αναστολή της γονιδιακής έκφρασης [6], έκανε εμφανές το θεραπευτικό δυναμικό της αξιοποίησης RNAi ως μέσο για να στοχεύει ειδικά και γονίδια που προκαλούν ασθένειες σιωπή. Μεταγενέστερες προκλινικά πειράματα σε ζώα και πιο πρόσφατες κλινικές δοκιμές έχουν επικυρωθεί περαιτέρω siRNAs ως ισχυροί αναστολείς του μια ποικιλία γονιδίων που προκαλούν ασθένειες και ως μια πολλά υποσχόμενη νέα κατηγορία θεραπευτικών [8], [10], [11].

Παρά το γεγονός ότι ο σχεδιασμός του θεραπευτικού βαθμού siRNAs έχει βελτιωθεί [8], [10], η παράδοση εξακολουθεί να παραμένει το ενιαίο μεγαλύτερο εμπόδιο προς τη διαδεδομένη χρήση των siRNAs για θεραπευτικές εφαρμογές [8]. Επειδή θεραπευτική μακρομόρια γενικά παραδίδεται μέσω ενδοκυττάρωσης [12], ένα από τα σημαντικότερα περιοριστικά στάδια για πολλές προσεγγίσεις παράδοσης, συμπεριλαμβανομένης της παράδοσης siRNA, είναι ενδοσωμιακό παγίδευση και την επακόλουθη αποδόμηση της θεραπευτικής φορτίου σε λυσοσώματα [11], [12], [13] . Έτσι, για να ενισχύσει την ενδοκυτταρική βιοδιαθεσιμότητα siRNAs, οι αποτελεσματικές στρατηγικές για διαφυγή ενδοσωμική χρειάζεται.

Για τη μεταφορά του ιικού γονιδιώματος στο κυτταρόπλασμα, ζώο ιούς που εσωτερικεύονται μέσω ενδοκυττάρωσης με μεσολάβηση υποδοχέα, χρησιμοποιούν πρωτεΐνες με ενδοσώματος-διασπαστική αλληλουχίες πεδίου πεπτίδιο σύντηξης να μεσολαβήσει αποσταθεροποίηση της μεμβράνης κυττάρου-ξενιστή ενδοσωματικής [14]. Η μέθοδος με την οποία οι εν λόγω ιικές πρωτεΐνες αποσταθεροποιήσει ενδοσωμιακό μεμβρανών λαμβάνει χώρα σε μια αύξηση της οξύτητας με τρόπο που εξαρτάται και να έχει μιμήθηκε με συνθετικά πεπτίδια, που ονομάζονται συντηκογόνα πεπτίδια [15], [16]. Ειδικότερα, αρκετά συνθετικά συντηκογόνα πεπτίδια που βασίζονται στην Ν-τελική περιοχή σύντηξης της ΗΑ2 υπομονάδα της πρωτεΐνης αιμοσυγκολλητίνης του ιού της γρίπης έχουν αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματικές στον επηρεασμό της γονιδιακής μεταφοράς [15]. Μεταξύ αυτών συντηξογονικά πεπτίδια, τόσο το INF-7 πεπτιδίου και διμερή μορφή της diINF-7, έδειξαν ενδόσωμα διασπαστική τους ικανότητα μέσω της βελτίωσης των μη-ιικά συστήματα μεταφοράς γονιδίων και ενισχύοντας τόσο την κυτοσολική παράδοση ανοσολιποσώματος παγιδευμένης μακρομορίων και λιποφεκταμίνη μεσολάβηση siRNA- επαγόμενη γονιδιακή σίγηση [15], [16], [17]. Επιπλέον, η συν-επώαση των χιμαιρικών πεπτιδίων που αποτελείται από την ΗΑ2 ενδοσώματος-διασπαστική πεπτίδιο συγχωνευμένο με πεπτίδια κυττάρων-διεισδυτική (ΠΠΚ? Κατιονικά φορείς πεπτίδιο που μπορεί ταχέως να επάγει τη δική τους κυτταρική ενσωμάτωση μέσω διαφόρων μορφών ενδοκυττάρωση [18]), έχουν επίσης αποδειχθεί για την ενίσχυση της ενδοσωμική διαφυγή του CPP-συμπλοκοποιημένη φορτίου, κατά συνέπεια προώθηση ισχυρότερων βιολογικές επιδράσεις [12], [18], [19]. Σε μια συγκεκριμένη μελέτη, συν-επώαση των ΗΑ2-συνδεδεμένη CPP πεπτίδια με CPP-συμπλοκοποιημένο siRNAs βρέθηκε να βελτιώνει μέτρια την αποσιώπηση του στοχευόμενου γονιδίου αναφοράς [20].

Αν και οι ανωτέρω περιγραφείσες στρατηγικές έχουν αποδείξει βελτιώσεις στην siRNA μεσολάβηση φίμωση εφέ, πολλά προβλήματα εξακολουθούν να υπάρχουν ότι θα μπορούσαν να περιορίσουν την αποτελεσματικότητα της συντηξογονικά πεπτιδίου με τη μεσολάβηση του κυτταροπλάσματος παράδοση siRNAs. Πρώτον, επειδή οι συντηκογόνα ή ΗΑ2-χιμαιρικά πεπτίδια δεν συμπλέκεται με τις siRNAs, η προσέγγιση αυτή δεν εγγυάται ότι τα πεπτίδια θα συν-εντοπίζονται εντός των ιδίων ενδοκυτταρικά κυστίδια με το φορτίο siRNA [12]. Συν-εντοπισμός απαιτείται προκειμένου να απελευθερώσει τα μόρια siRNA από την ενδοκυτταρική κυστιδίων [12]. Δεύτερον, λόγω αυτής της έλλειψης αλληλεπίδρασης μεταξύ των πεπτιδίων και siRNAs, είναι πιθανό ότι τα πεπτίδια θα μπορούσαν να ξεφύγουν από τα ενδοσώματα χωρίς σοβαρά διάρρηξη των μεμβρανών ενδοσωμιακό, τελικά αφήνοντας το φορτίο siRNA παγιδευμένο μέσα στο κυστίδιο [12]. Έτσι, για να παρακαμφθούν αυτά τα προβλήματα, η παρούσα μελέτη προσπάθησε να σχεδιάσει ένα χιμαιρικό πεπτίδιο που αποτελείται από ένα συντηκογόνα αλληλουχία συνδέεται με CPP που θα επιτρέπουν τη σταθερή δέσμευση με τα siRNA μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων και την προώθηση της ενδοκυτταρικής διανομής και ενδοσωμική διαφυγή τους, προκειμένου να επάγει την θεραπευτική σίγηση μιας στοχευμένης ογκογονιδίου σε προφορική καρκινικά κύτταρα. Επειδή το INF-7 πεπτίδιο είναι ένα πιο ισχυρό πεπτίδιο μεμβράνη αποσταθεροποιώντας σε σύγκριση με το πεπτίδιο μητρική ΗΑ2 και κατιονικά Νόνα (D-αργινίνη) πεπτίδια είναι πολύ αποδοτικό ΠΠΚ ικανό για ενισχυμένη κυτταρική πρόσληψη [12], [21], καθώς και την παράδοση του siRNAs σε όγκους και εγκεφάλους ποντικών [22], [23], σχεδιάσαμε ένα χιμαιρικό πεπτίδιο, που ονομάζεται 599, αυτό θα αξιοποιήσει τις δύο αυτές τις ιδιότητες σε ένα μοναδικό μόριο για απευθείας πολύπλοκη και να ενισχύσει την ενδοκυτταρική βιοδιαθεσιμότητα της siRNAs. Εδώ, αποδεικνύουμε ότι η 599 πεπτίδιο παραδίδει αποτελεσματικά siRNAs σχεδιάζονται για τη στόχευση CIP2A, μια ογκοπρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο κεφάλι και το λαιμό καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (HNSCCs), συμπεριλαμβανομένης της στοματικής καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (OSCCs) [24], [25], [26] , σε προφορική καρκινικά κύτταρα, μεσολαβεί αποδοτική αποσιώπηση CIP2A, και ως εκ τούτου αναστέλλει τον καρκίνο του στόματος κυττάρων εισβολής και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη.

Αποτελέσματα

Το 599 Peptide αποτελεσματικά δεσμεύει και παραδίδει τα siRNA σε καρκίνο του στόματος κύτταρα

προκειμένου να ελεγχθεί εάν το πεπτίδιο 599 μέσω κατιονικά Νόνα της (D-αργινίνη) υπολειμμάτων θα μπορούσε να συνδεθεί αποτελεσματικά αρνητικά φορτισμένα siRNAs βασίζονται σε ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, μία δοκιμασία μετατόπισης γέλης αγαρόζης διεξήχθη (Εικ. 1). Χρησιμοποιώντας διάφορες ποσότητες του 599 πεπτιδίου, που κυμαίνονται από 1 έως 50-πλάσια μοριακή περίσσεια siRNAs, καταδείχθηκε ότι η 599 πεπτίδιο θα μπορούσε πράγματι δεσμεύουν μόρια siRNA σχεδιασμένα να στοχεύουν CIP2A (siCIP2A) καθυστερώντας την siCIP2A που αρχίζουν με ένα πεπτίδιο-to- μοριακή siRNA (P: Ν) αναλογία 20:01, χωρίς ελεύθερα siRNAs ανιχνεύσιμα στο πήκτωμα σε 50:1. Στο P: N αναλογίες 10:01, το πεπτίδιο είχε μόνο μέτρια αποτελέσματα επί της σύνδεσης siRNA, ενώ στην 1:01 ήταν εντελώς αναποτελεσματική

μία χρώση βρωμιούχου αιθιδίου δοκιμασία μετατόπισης πηκτώματος αγαρόζης 4% που εξετάζει την ικανότητα του. διάφορες ποσότητες του 599 πεπτιδίου (που κυμαίνεται από 1 έως 50 φορές μοριακή περίσσεια siRNAs) να σχηματίζουν σύμπλοκα με siCIP2A. siCIP2A, siRNA που στοχεύει το ογκογονίδιο CIP2A? MWM, δείκτης μοριακού βάρους (ο αριθμός των ζευγών βάσεων σε κάθε θραύσμα DNA δείχνονται)

Η

Κατά αποδεικνύοντας ότι η 599 πεπτίδιο θα μπορούσε να συνδεθεί προς siRNAs σε συγκεκριμένες P:. Ν αναλογίες, έχουμε την επόμενη εξετάσαμε την ικανότητα του πεπτιδίου για να παραδώσει με φθορισμό σημασμένο siRNAs εντός του στόματος καρκινικά κύτταρα με ανάλυση μικροσκόπιο φθορισμού (Σχ. 2Α). Χρησιμοποιώντας ένα με φθορισμό σημασμένο siRNA, DY547 συζευγμένο με siCIP2A (D-siCIP2A), σε σύμπλοκο με αυξανόμενες ποσότητες 599 πεπτιδίου, που κυμαίνονται από 1 έως 50-πλάσια μοριακή περίσσεια siRNAs, παρατηρήθηκε ότι η αύξηση της P: αναλογία Ν ενισχυμένη η παράδοση των μορίων siRNA σε CAL 27 στόματος καρκινικά κύτταρα μετά από δύο ώρες επώασης. Πιο συγκεκριμένα, η 50:1 P: αναλογία Ν δείχθηκε να έχει μια αυξημένη ικανότητα στην επαγωγή πρόσληψης siRNA σε κύτταρα σε σύγκριση με την 20:01 P: N αναλογία η οποία είχε μόνο μια μέτρια επίδραση. Αντιστρόφως, κύτταρα κατεργασμένα με D-siCIP2A μόνη ή σε σύμπλοκο με 599 πεπτιδίου σε 1:01 P: αναλογία N ήταν ανίκανοι αποτελεσματικής πρόσληψης siRNA. Ποσοτικές μετρήσεις της εσωτερικεύεται D-siCIP2A σε CAL 27 κύτταρα μετά από 2,5 ώρες επώασης επιβεβαιώνεται επίσης ότι η αύξηση του 599 P: Ν αναλογίες αυξημένη πρόσληψη siRNA στα κύτταρα. Ειδικότερα, η 50:1 και 100:1 P: N αναλογίες παραδίδονται περίπου 18 και 42 φορές σημαντικά υψηλότερες ποσότητες D-siCIP2A, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με D-siCIP2A μόνο (Σχήμα 2Β).. Ως σύγκριση, ο εμπορικός αντιπρόσωπος μορφομετατροπής ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ™ (IFN) παραδίδονται μόνο περίπου 2 φορές υψηλότερες ποσότητες του D-siCIP2A, σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν μόνο D-siCIP2A. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αν και η 100:1 P: αναλογία Ν ήταν ικανή να παρέχει την υψηλότερη ποσότητα siRNAs στα κύτταρα, αυτό προκάλεσε σημαντικές μακροπρόθεσμες κυτταροτοξικά αποτελέσματα όπως μετρήθηκαν με τη χρήση ενός μη-στόχευσης siRNA (Sint) έλεγχος (Σχ 2C). . Ειδικότερα, η 100:1 P: αναλογία Ν μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 48 ώρες μετά τη θεραπεία σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αντίθετα, η 50:1 P: αναλογία Ν δεν είχε σημαντικές επιπτώσεις στη μακροπρόθεσμη κυτταροτοξικότητα. Ως αποτέλεσμα, με βάση αυτές τις διαπιστώσεις της 50:1 P:. Αναλογία Ν χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω χαρακτηρισμό και πειραματισμού

(Α) Μικροσκοπία φθορισμού ανάλυση των CAL 27 στόματος καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες με DY547-συζευγμένο siRNA που στοχεύει CIP2A (D-siCIP2A? κόκκινο) μόνη ή σε σύμπλοκο με αυξανόμενες ποσότητες 599 πεπτιδίου (που κυμαίνεται από 1 έως 50-πλάσια γραμμομοριακή περίσσεια του siRNAs). Πυρήνες (μπλε) ήταν αντίθετα με DAPI. bar Κλίμακα: 50 μm. (Β) CAL 27 κύτταρα επωάζονται για 2,5 ώρες με D-siCIP2A μόνη ή σε σύμπλοκο με αυξανόμενες ποσότητες 599 πεπτιδίου (που κυμαίνεται από 1 έως 100 φορές μοριακή περίσσεια siRNAs). Για σύγκριση, τα κύτταρα επίσης επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας το εμπορικό αντιδραστήριο διαμόλυνσης, ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ™ (IFN). Η ποσότητα του siRNA που παραδίδεται σε κύτταρα σε pmol ανά mg πρωτεΐνης αναφέρεται με κάθε θεραπεία ομαλοποιήθηκε σε D-siCIP2A μόνο. Τα δεδομένα είναι μέσοι ± SEM τεσσάρων ξεχωριστών πειραμάτων, όπου *** Ρ & lt? 0.001, ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με D-siCIP2A κύτταρα μόνο υποβλήθηκαν σε αγωγή (ANOVA, η εξέταση πολλαπλού Σύγκριση του Dunnett). (Γ) αξιολόγηση της μακροπρόθεσμης τοξικότητας (όπως μετράται με μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων) του CAL 27 κύτταρα 48 ώρες μετά τη θεραπεία με είτε μη-στόχευσης siRNA (Sint) μόνο, αυξανόμενες συγκεντρώσεις 599 πεπτίδιο μόνο, ή αυξανόμενες ποσότητες 599 πεπτίδιο (που κυμαίνεται από 1 έως 100 φορές μοριακή περίσσεια siRNAs) σε σύμπλοκο με Sint. Για λόγους σύγκρισης, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν επίσης με το εμπορικό αντιδραστήριο διαμόλυνσης, IFN. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα που ορίζεται ως 100% βιώσιμα. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν (n = 3), όπου *** Ρ & lt? 0.001, ** Ρ & lt?. 0.01 συγκριτικά με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (ANOVA, η εξέταση πολλαπλού σύγκρισης Dunnett)

Η

Χαρακτηρισμός του 599 Peptide-siRNA Complex

Για να αποκτήσουν εικόνα για το μηχανισμό της εισόδου των κυττάρων της 599 /siRNA συγκρότημα, η υποκυτταρική εντόπιση του συγκροτήματος 599 /D-siCIP2A εξετάστηκε περαιτέρω σε ζωντανά κύτταρα με μικροσκόπιο φθορισμού σε συνδυασμό με εικόνες αντίθεσης φάσης (Σχ. 3Α). Με μια πιο προσεκτική επιθεώρηση του εσωτερικεύονται D-siCIP2As, εμφανίστηκε με βάση την εκτεταμένη μοτίβο πρόσληψη στικτή των siRNAs ότι το συγκρότημα 599 /D-siCIP2A είχε ενδοκυτταρώνεται. Συν-χρώση σταθεροποιημένων κυττάρων με τις αρχές του ενδοσωματιακή EEA1 δείκτη, επιβεβαίωσε την συνεντόπισης της D-siCIP2As με ενδοσωματιακή κυστίδια (Εικ. 3Β), δείχνοντας έτσι μια ενδοκυτταρική λειτουργία εσωτερίκευσης.

(Α) Μικροσκοπία φθορισμού ανάλυση και επικάλυψη μιας εικόνας αντίθεσης φάσης ζωντανής CAL 27 στόματος καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες με DY547-συζευγμένο siRNA που στοχεύει CIP2A (D-siCIP2A? κόκκινο) σε σύμπλοκο με το πεπτίδιο 599 σε γραμμομοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA. bar Κλίμακα: 50 μm. (Β) ανάλυση Έμμεση μικροσκοπία ανοσοφθορισμού των CAL 27 στόματος καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες με D-siCIP2A (κόκκινο) σε σύμπλοκο με το πεπτίδιο 599 σε γραμμομοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA. Ενδοσώματα (πράσινο) βάφτηκαν χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντι-EEA1 αντίσωμα. Πυρήνες (μπλε) ήταν αντίθετα με DAPI. Ο συν-εντοπισμός του D-siCIP2A με ενδοσωμάτων (κίτρινο) παρατηρείται στην νέα πάνελ και τονίζεται από τα βέλη. Ράβδος κλίμακας: 25 μm

Η

Για να αξιολογηθεί το πεπτίδιο 599 όσον αφορά το μέγεθος των σωματιδίων και το φορτίο επιφάνεια μετά συμπλοκοποίηση με siCIP2A τόσο δυναμική σκέδαση φωτός και ζήτα δυναμικό μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν. (Εικ 4Α.). Με βάση τις μετρήσεις, το 96% των σωματιδίων που σχηματίζονται επικεντρώθηκαν στα 74 nm και 4% στα 220 nm με βάση τον αριθμό-σταθμισμένη κατανομή μεγέθους, με το μέσο μέγεθος των σωματιδίων του μείζονος πληθυσμού είναι 80 ± 0.5 nm. Το δυναμικό ζήτα του συμπλόκου 599 /siCIP2A προσδιορίστηκε να είναι θετική με τιμή 32,5 ± 0,5 mV. Το συγκρότημα 599 /siCIP2A επίσης ορατή χρησιμοποιώντας σκοτεινού πεδίου με βάση οπτικές φωτισμού (Σχ. 4Β). Χρησιμοποιώντας αυτή την τεχνολογία απεικόνισης το σύμπλοκο 599 /siCIP2A βρέθηκε να παρουσιάζουν αρκετά ομοιόμορφες σφαιρικές δομές.

(Α) κατανομή μεγέθους και ζήτα δυναμικό της 599 πεπτιδίου σε σύμπλοκο με siCIP2A σε 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA μοριακή αναλογία 20 λεπτά μετά την τυποποίηση σε νερό. (Β) σκοτεινού πεδίου με βάση οπτική μικροσκοπία εικόνα του 599 πεπτιδίου σε σύμπλοκο με siCIP2A σε γραμμομοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA 20 λεπτά μετά την τυποποίηση σε νερό. μπαρ κλίμακα:. 10.000 nm

Η

Για να δοκιμαστεί η σημασία των δύο βασικών συστατικών (δηλαδή οι ενδόσωμα-διασπαστική και κατιονικές Νόνα κυττάρου-διεισδυτική (D-αργινίνη) τμήματα καταλοίπων) στην ανάθεση της ικανότητας του 599 πεπτίδιο για να παραδώσει siRNAs στα κύτταρα, δύο επιπλέον πεπτίδια συνετέθησαν αποτελείται είτε ενδοσώματος-διασπαστική αλληλουχία (616) ή τα κατάλοιπα μόνος του κατιονικού εννέα- κυττάρου-διεισδυτική (D-αργινίνη) (9R). Κατά την επεξεργασία των CAL 27 κυττάρων είτε με τα 599, 616, ή 9R πεπτίδια σε σύμπλοκο με D-siCIP2A σε 50:1 P: αναλογία Ν, μικροσκοπία φθορισμού αναλύσεις αποκάλυψαν ότι μόνο η ανέπαφη 599 πεπτίδιο με τόσο το ενδόσωμα-διασπαστική και κατιονικών κύτταρο-διεισδυτική νονα (D-αργινίνη) τμήματα υπόλειμμα θα μπορούσε να μεσολαβήσει παράδοση siRNAs στα κύτταρα, ενώ τόσο οι 616 και 9R πεπτίδια δεν είχε εμφανή επίδραση στην παράδοση siRNA 2 ώρες μετά τη θεραπεία (Εικ. 5).

μικροσκοπία φθορισμού αναλύσεις CAL 27 στόματος καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες με DY547-συζευγμένο siRNA που στοχεύει CIP2A (D-siCIP2A? κόκκινο) σε σύμπλοκο με τα πεπτίδια 599, 616, και 9R σε γραμμομοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA. Πυρήνες (μπλε) ήταν αντίθετα με DAPI. bar Κλίμακα: 50 μm

Η

Η αποτυχία του 616 πεπτιδίου να παραδώσει τα siRNA σε κύτταρα ήταν πιο πιθανό να οφείλεται στην αδυναμία του να δεσμεύει τα siRNA ακόμη και σε P:. Ν αναλογίες τόσο υψηλές όσο 100:1 (δεδομένα δεν φαίνεται). Ωστόσο, το αποτέλεσμα με το πεπτίδιο 9R ήταν κάπως περίεργο, αφού αποδείχθηκε να δεσμεύει αποτελεσματικά siRNAs σε 50:1 P: αναλογία Ν βασίζεται σε μία δοκιμασία μετατόπισης γέλης αγαρόζης (Εικ. S1 Α) και θα μπορούσε να σχηματίσει σωματίδια με ένα μέσο μέγεθος του 58.2 ± 0.2 nm και ένα ζήτα δυναμικό αξία των 25,8 ± 0,5 mV (Εικ. S1B). Λόγω παραφορμαλδεΰδη στερέωση των κυττάρων μπορεί να οδηγήσει στην τεχνητή αναδιανομή του (Arg)

9 πεπτίδια [27], ήταν πιθανό ότι η κυτταρική κατανομή του συμπλόκου 9R /D-siCIP2A μπορεί να έχει επηρεαστεί από αυτό το χημικό στερεωτικό. Ως εκ τούτου, η πρόσληψη D-siCIP2A αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας το ποσοτική προσέγγιση στερέωσης ανεξάρτητη οποία ομοίως βρεθεί ότι το πεπτίδιο 9R, που κυμαίνονται από 0,1 έως 100-πλάσια μοριακή περίσσεια siRNAs, ήταν ανίκανος να μεσολαβήσουν παράδοσης siRNA σε κύτταρα και δεν μπορούσε να διακριθεί από κύτταρα κατεργασμένα με D-siCIP2A μόνο (Σχ. S1c).

ο 599 Peptide Μεσολαβεί CIP2A γονιδιακή σίγηση σε Oral Cancer Cells

για το πεπτίδιο 599 να θεωρείται ένα αποτελεσματικό όχημα παράδοσης για siRNA- θεραπευτικά βάση, πρέπει να είναι ικανά να μεταφέρουν λειτουργικό siRNAs σε κύτταρα που μπορούν να σιγήσει επιδιωκόμενο στόχο γονίδιο τους. Για να αξιολογηθεί η λειτουργικότητα των 599 /siRNA συγκρότημα, δύο από του στόματος καρκινικές κυτταρικές σειρές, CAL 27 και SCC-25, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το 599 πεπτίδιο σε σύμπλοκο με είτε siCIP2A ή όργανα ελέγχου Sint σε 50:1 P: αναλογία Ν, μετά την οποία τόσο το mRNA CIP2A και τα επίπεδα πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν 48 ώρες μετά τη θεραπεία με πραγματικού χρόνου PCR και αναλύσεις στυπώματος Western, αντιστοίχως. Η ποσοτικοποίηση με πραγματικού χρόνου PCR κατέδειξαν σημαντικό knockdown στα επίπεδα mRNA CIP2A σε αμφότερες στοματική καρκινικές κυτταρικές γραμμές που έλαβαν θεραπεία με το 599 /siCIP2A σύμπλοκο σε σύγκριση με τον έλεγχο 599 /Sint επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 6Α). Πιο συγκεκριμένα, ένας -60% και -85% μείωση στα επίπεδα CIP2A mRNA παρατηρήθηκε σε CAL 27 και SCC-25 από το στόμα καρκινικές κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα. Επιπλέον, την τεχνική Western blot επιβεβαίωσαν την ικανότητα του 599 πεπτιδίου να μεσολαβήσει παράδοση των λειτουργικών siRNAs στις δύο κυτταρικές σειρές, αποδεικνύοντας την καταστολή των επιπέδων της πρωτεΐνης CIP2A 48 ώρες μετά τη θεραπεία με το 599 /siCIP2A σύμπλοκο σε σύγκριση με τον έλεγχο 599 /Sint κατεργασμένα κύτταρα ( Σχ. 6Β). Αξίζει να σημειωθεί, τα επίπεδα πρωτεΐνης της ογκογόνου παράγοντα μεταγραφής c-Myc αξιολογήθηκαν επίσης επειδή CIP2A είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την σταθερότητα της πρωτεΐνης αυτής [25]. Οι αναλύσεις στυπώματος Western επιβεβαίωσε ότι αποσιώπηση του CIP2A προκάλεσε αποσταθεροποίηση του c-myc σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 6Β).

(Α) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση των επιπέδων CIP2A mRNA σε CAL 27 και SCC-25 από το στόμα καρκινικά κύτταρα 48 ώρες μετά τη θεραπεία με 599 πεπτίδιο σε σύμπλοκο σε μία μοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA στα 100 ηΜ siRNA που στοχεύει CIP2A (siCIP2A) σε σύγκριση με τον έλεγχο μη-στόχευσης siRNA (Sint). Τα επίπεδα CIP2A mRNA ομαλοποιήθηκαν στο 18S rRNA. Τα δεδομένα είναι μέσοι ± SEM τριών χωριστών πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν, όπου ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με Sint επεξεργασμένα κύτταρα (δοκιμασία t Student). (Β) αναλύσεις Western blot των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης CIP2A και c-Myc σε CAL 27 και SCC-25 από το στόμα των καρκινικών κυττάρων 48 ώρες μετά τη θεραπεία με 599 πεπτίδιο σε σύμπλοκο με είτε 100 ηΜ Sint ή siCIP2A σε 50:1 πεπτιδίου-προς -siRNA μοριακή αναλογία. τα επίπεδα πρωτεΐνης GAPDH παρακολουθήθηκαν για να διασφαλιστεί η ίση φόρτωση των δειγμάτων.

Η

Χαρακτηρισμός της 599 /siCIP2A Complex τη μεσολάβηση RNAi Response

Σε μια προσπάθεια περαιτέρω χαρακτηρισμό 599 μέσω πεπτιδίου αποσιώπηση της CIP2A σε στοματική καρκινικά κύτταρα με τη διάρκεια της γονιδιακής σίγησης, δοσοεξαρτώμενη γονιδιακή σίγηση, και τη δραστηριότητα των φίμωση στον ορό αξιολογήθηκαν επίσης. Η επιτυχής εφαρμογή του RNAi ως μια μορφή θεραπείας εξαρτάται από αυτά τα τρία βασικά χαρακτηριστικά. Έτσι, σε μια προσπάθεια να καθοριστεί η επιμονή των 599 μέσω πεπτιδίου αποσιώπηση του CIP2A σε στοματική καρκινικά κύτταρα την πάροδο του χρόνου, μια κηλίδα Western αναλύσεις των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης CIP2A σε CAL 27 και SCC-25 από το στόμα καρκινικά κύτταρα 1, 3, 5, 7 , διεξήχθησαν και 9 ημέρες μετά την αγωγή με 599 πεπτίδιο σε σύμπλοκο με είτε Sint ή siCIP2A σε μοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA (Σχ. 7Α). Μετά από μια μονή αγωγή με 599 /siCIP2A, η επίδραση σίγησης παρατηρήθηκε να διαρκέσει για 5 ημέρες σε CAL-27 κύτταρα και μέχρι 9 ημέρες σε SCC-25 κυττάρων με μέγιστη σιγαστήρα που συμβαίνουν για 3 και 7 ημέρες, αντιστοίχως. Σε πειράματα δόσης-απόκρισης σε SCC 25-κύτταρα (Σχ. 7Β), το πεπτίδιο 599 παρατηρήθηκε να προσδώσει siCIP2A μεσολάβηση αποσιώπηση δοσοεξαρτώμενο με συγκεντρώσεις siRNA ≥50 ηΜ προσδίδει -100% πρωτεΐνη CIP2A νοκ ντάουν και οι συγκεντρώσεις siRNA τόσο χαμηλά όσο 20 ηΜ εξακολουθούν να έχουν μετρήσιμα αποτελέσματα αποσιώπηση. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε CAL 27 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), εκτός από το ότι υψηλότερες συγκεντρώσεις siRNA (≥80 ηΜ) χρειάστηκαν για να προσδώσει στην καλύτερη -90% σίγηση πρωτεΐνη CIP2A. Τέλος, επειδή η σταθερότητα του siRNAs είναι ένα σημαντικό μέλημα σε RNAi-θεραπεία, 599 μέσω πεπτιδίου CIP2A αποσιώπηση αξιολογήθηκε απουσία και παρουσία ορού και σε σύγκριση με αρκετές εμπορικά διαθέσιμο πρότυπο κατιονικό βασιζόμενα σε λιπίδια αντιδραστήρια επιμόλυνσης (Σχ. 7C). Κατά τη θεραπεία SCC-25 κύτταρα με 599 /siCIP2A, -95% πρωτεΐνη CIP2A χτυπήθηκε κάτω απουσία μιας πρώτης εισόδου του ορού και ήταν συγκρίσιμη με CIP2A αποσιώπηση παρατηρείται για όλες τις κατιονικές αντιδραστήρια επιμόλυνσης με βάση λιπίδιο που δοκιμάστηκαν (& gt? 99%) εκτός HiPerFect® οποίο εμφάνισε μόνο μία μείωση περίπου 30% σε επίπεδα πρωτεΐνης. Από σημασίας, ωστόσο, είναι ότι ακόμη και με την παρουσία του ορού, το σύμπλοκο 599 /CIP2A μπορούσε να εξακολουθούν να παράγουν μια πολύ αποτελεσματική αντίδραση RNAi στο ~ 70% knockdown πρωτεΐνη CIP2A. Η ποσοτικοποίηση αυτών των στοιχείων βασίστηκαν στην πυκνομετρική ανάλυση τριών πειραμάτων ανεξάρτητων κηλίδος Western χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J [28].

(Α) αναλύσεις Western blot των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης CIP2A σε CAL 27 και SCC-25 από το στόμα καρκινικά κύτταρα 1, 3, 5, 7, και 9 ημέρες μετά την αγωγή με 599 πεπτίδιο σε σύμπλοκο με είτε 100 ηΜ ελέγχου μη-στόχευσης siRNA (Sint) ή siRNA που στοχεύει CIP2A (siCIP2A) σε ένα 50:1 πεπτίδιο-προς-siRNA μοριακή αναλογία. τα επίπεδα πρωτεΐνης GAPDH παρακολουθήθηκαν για να διασφαλιστεί η ίση φόρτωση των δειγμάτων. (Β) Ανάλυση Western blot της πρωτεΐνης CIP2A knockdown σε SCC-25 από το στόμα των καρκινικών κυττάρων 48 ώρες μετά τη θεραπεία με 599 πεπτίδιο μόνο (5 μΜ) ή σε σύμπλοκο σε μία μοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA είτε Sint (100 ηΜ ) ή μείωση των συγκεντρώσεων siCIP2A. Τα επίπεδα πρωτεΐνης CIP2A σε μη επεξεργασμένα κύτταρα αναλύθηκαν επίσης για σύγκριση. τα επίπεδα πρωτεΐνης GAPDH παρακολουθήθηκαν για να διασφαλιστεί η ίση φόρτωση των δειγμάτων. (Γ) αναλύσεις Western blot CIP2A πρωτεΐνης knockdown στο SCC-25 από το στόμα των καρκινικών κυττάρων 48 ώρες μετά τη θεραπεία με 599 πεπτίδιο σε σύμπλοκο με είτε 100 ηΜ Sint ή siCIP2A σε μοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA, με την παρουσία (+) ή απουσία (-) του ορού, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ή κύτταρα που κατεργάζονται με εμπορικά αντιδραστήρια διαμόλυνσης LipofectAMINE® RNAiMAX (RNAiMAX), LipofectAMINE® 2000 (LF2000), ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ™ (IFN), και HiPerFect®. τα επίπεδα πρωτεΐνης GAPDH παρακολουθήθηκαν για να διασφαλιστεί η ίση φόρτωση των δειγμάτων.

Η

Το 599 μέσω πεπτιδίου κατασιγάσει του CIP2A Μειώνει Oral Cancer Cell της διεισδυτικότητας και Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη

Προηγουμένως δημοσιευμένη βιβλιογραφία έχει καταδείξει ότι σίγηση CIP2A σε καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από διάφορους ιστούς, όπως HNSCCs, καρκινώματα νεφρικών κυττάρων, και του καρκίνου του μαστού μπορεί να έχει αποτελέσματα επί των καρκινικών κυττάρων και εισβολή αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη [25], [29], [30]. Έτσι, για να αποδειχθεί περαιτέρω η δυνητική χρησιμότητα του πεπτιδίου 599 σε θεραπευτικά siRNA που βασίζεται για τον καρκίνο του στόματος, ελέγξαμε αν 599 μέσω πεπτιδίου αποσιώπηση του CIP2A μπορούσε να επηρεάσει την διεισδυτικότητα και ανεξάρτητη από προσκόλληση ιδιότητες ανάπτυξης του στόματος καρκινικών κυττάρων. Λόγω του γεγονότος ότι CAL 27 κύτταρα εμφάνισαν μόνο μια σύντομη επίδραση σίγησης και δεν αναπτύσσονται καλά σε ημι-στερεό μέσο [31], οι 599 CIP2A φίμωση αποτελέσματα μέσω πεπτιδίου στην κυτταρική εισβολή και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη εξετάστηκαν μόνο σε SCC- 25 κύτταρα. Κατά την θεραπεία του SCC-25 κύτταρα με το πεπτίδιο 599 συμπλέκεται με siCIP2A, παρατηρήσαμε μια σημαντική ~ 33% αναστολή στο κελί διεισδυτικότητα, σε σύγκριση με τον έλεγχο 599 /Sint επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 8Α). Επιπλέον, 599 μέσω πεπτιδίου αποσιώπηση του CIP2A σε SCC-25 κύτταρα μείωσε σημαντικά αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη από ~39% σε σχέση με τον έλεγχο 599 /Sint επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 8Β). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν την ικανότητα του πεπτιδίου 599 για να λειτουργήσει ως ένα αποτελεσματικό όχημα παράδοσης για siRNA που βασίζεται τον καρκίνο του στόματος θεραπευτικά μέσα.

(Α) Η ποσοτικοποίηση του ποσοστού της εισβολής SCC-25 από το στόμα καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία με 599 πεπτίδιο σε σύμπλοκο σε μία μοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA στα 100 ηΜ siRNA που στοχεύει CIP2A (siCIP2A) σε σύγκριση με τον έλεγχο μη-στόχευσης siRNA (Sint). Τα δεδομένα είναι μέσοι ± SEM τεσσάρων ξεχωριστών πειραμάτων, όπου * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με Sint επεξεργασμένα κύτταρα (δοκιμασία t Student). (Β) Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη του SCC-25 από το στόμα καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία με 599 πεπτίδιο σε σύμπλοκο σε μία μοριακή αναλογία 50:1 πεπτιδίου-προς-siRNA στα 100 ηΜ siCIP2A σύγκριση με Sint ελέγχου. Τα δεδομένα είναι μέσος όρος ± SEM από τέσσερα ξεχωριστά πειράματα, όπου * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με Sint επεξεργασμένα κύτταρα (δοκιμασία t του Student)

Η

Συζήτηση

Για τεχνολογίες RNAi που βασίζεται για να είναι αποτελεσματική θεραπειών, απαιτούν την αποτελεσματική ενδοκυτταρική χορήγηση θεραπευτικών siRNAs στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Ωστόσο, επειδή οι περισσότεροι παράδοση πλησιάζει διακίνηση φορτίου siRNA σε κύτταρα μέσω ενδοκυττάρωσης, η παγίδευση αυτών των μορίων εντός των ενδοκυτταρικά κυστίδια έχει γίνει ένα σημαντικό βήμα για τον περιορισμό [11], [12] και, επομένως, αποτελεί εμπόδιο για την αποτελεσματική χρήση των θεραπειών RNAi που βασίζεται. Για να παρακαμφθεί αυτό το πρόβλημα, σχεδιάσαμε και δοκιμάστηκαν ένα πεπτίδιο, που ονομάζεται 599, που συνίστατο εν μέρει οι αλληλουχίες και των δύο εξαιρετικά αποδοτικό CPP και του ενδοσώματος-αποσταθεροποίηση INF-7 πεπτίδιο ότι όταν συνδυάζονται θα επέτρεπε την αποτελεσματική διανομή του συμπλοκοποιημένου siRNA φορτίου μέσα στα κύτταρα. Τα αποτελέσματα από τη μελέτη μας έδειξε ότι το 599 πεπτίδιο θα μπορούσε να αυξήσει την ενδοκυτταρική βιοδιαθεσιμότητα των siRNAs σε προφορική καρκινικά κύτταρα και να μεσολαβήσει αποτελεσματικά την αποσιώπηση του στοχευόμενου CIP2A ογκοπρωτεΐνη με επακόλουθη αναστολή της προφορικής καρκινικών κυττάρων εισβολής και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη.

Λόγω ομοιοπολική σύζευξη του siRNAs να ΠΠΚ μπορεί να οδηγήσει στην αναποτελεσματική διανομή λειτουργικών siRNAs στα κύτταρα [18], [32], [33], το πεπτίδιο 599 έχει σχεδιαστεί για να περιλαμβάνουν κατιονικά Νόνα (D-αργινίνη) τα κατάλοιπα που θα μπορούσε να λειτουργήσει όχι μόνο ως το συστατικό CPP, αλλά επίσης να επιτρέπει πρόσδεση του αρνητικά φορτισμένα μόρια siRNA με το πεπτίδιο μέσω φορτισμένη αλληλεπιδράσεων μη-ομοιοπολική. δοκιμασίες μετατόπισης σε πήκτωμα αγαρόζης επιβεβαίωσε ότι το πεπτίδιο 599 μπορούσε συγκρότημα σε μόρια siRNA και ότι η σύνδεση μεταξύ του πεπτιδίου και 599 siRNAs φάνηκε να εξαρτάται από την υπολείμματα εννέα- (D-αργινίνη). Αυτό ήταν ιδιαίτερα εμφανές με βάση το γεγονός ότι η 616 πεπτίδιο, το οποίο περιελάμβανε μόνο το ιδιαίτερα ανιονικά πεπτιδική αλληλουχία INF-7, δεν θα μπορούσε να δεσμεύσει siRNAs.

Διερεύνηση εάν ο σχηματισμός συμπλόκου 599-πεπτιδίου siRNA ήταν επαρκής για να επάγει η εσωτερικοποίηση των siRNAs στα κύτταρα, αποκάλυψε ότι η αύξηση της P: N αναλογίες θα έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη πρόσληψη siRNA σε κύτταρα μετά θεραπείας δύο ώρες σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ™ ή γυμνός siRNA. Αυτά τα ευρήματα ήταν σύμφωνα με αρκετές άλλες μελέτες που ομοίως βρεθεί ότι η αύξηση των συγκεντρώσεων των ειδικών ΠΠΚ αυξημένη ικανότητά τους πρόσληψης siRNA [20], [23]. Η αυξημένη πρόσληψη siRNAs στα κύτταρα πιθανότατα έλαβε χώρα σε υψηλότερες P: N αναλογίες βασίζονται σε διάφορους παράγοντες. Πρώτον, επειδή το υψηλότερο P: N αναλογίες ήταν πιο αποτελεσματική στην δεσμευτικός δωρεάν siRNAs σε διάλυμα, καθώς ήταν προφανές από τα δοκιμασίες μετατόπισης πηκτώματος αγαρόζης, αυτό εν μέρει θα συνέβαλαν στην μεγαλύτερες ποσότητες siRNAs που εσωτερικοποιούνται μέσα στα κύτταρα. Δεύτερον, επειδή κατεργασία των κυττάρων με υψηλές εξωκυτταρικές συγκεντρώσεις ΠΠΚ έχει αναφερθεί ότι επάγει την εσωτερικοποίηση τους σε κύτταρα μέσω ενεργοποίησης της ενδοκυττάρωσης [34], η αυξημένη πρόσληψη siRNAs στα κύτταρα σε υψηλότερες P: N αναλογίες μπορεί να έχουν επίσης αποδοθεί στην παρουσία υψηλότερων ποσοτήτων του πεπτιδίου 599, πράγμα που συνεπάγεται πιο αποτελεσματικά ενδοκύτωση του συγκροτήματος.

CPP-μεσολάβηση εσωτερικοποίηση μέσα σε κύτταρα οδηγείται από κατιονικά κατάλοιπα που βρέθηκαν μέσα στην αλληλουχία τους και η διαδικασία αυτή έχει αναφερθεί ότι συμβεί μέσω διαφόρων μορφών ενδοκυττάρωση [18]. Στη μελέτη μας, η 599 πεπτίδιο παρατηρήθηκε να μεσολαβεί στην εσωτερικοποίηση των siRNAs μέσα στις πρώτες δύο ώρες για να ενδοκυτταρικά κυστίδια και η απομάκρυνση του Νόνα (D-αργινίνες) από το 599 πεπτίδιο, όπως αντιπροσωπεύεται από το 616 πεπτίδιο, επιβεβαίωσε την απαίτηση κατιονικών υπολειμμάτων για την παράδοση των siRNA φορτίου. Παραδόξως, το πεπτίδιο 9R οποίο αποτελείτο μόνο από υπολείμματα κατιονικών Νόνα (D-αργινίνη) ήταν παρομοίως ανίκανη να προσφέρει siRNAs στα κύτταρα, ακόμη και αν θα μπορούσαν να σχηματίσουν σύμπλοκα με τα siRNA.