Αφηρημένο

Τα microRNAs είναι αντικείμενο εκμετάλλευσης για τη διάγνωση, πρόγνωση και παρακολούθηση του καρκίνου και άλλων ασθενειών. υψηλή ειδικότητα ιστού τους και κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση παροχή νέων βιολογικών δεικτών για τη διάγνωση και την ταξινόμηση του καρκίνου καθώς και τα αποτελέσματα πρόβλεψη των ασθενών. Οι Τα microRNAs υπογραφές έχουν εντοπιστεί για πολλούς ανθρώπινους όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Στις περισσότερες περιπτώσεις, η μεταστατική ασθένεια είναι δύσκολο να προβλεφθεί και να προληφθεί με επαρκή θεραπείες. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να εντοπίσει μια υπογραφή microRNA για μεταστατικό CRC που θα μπορούσε να προβλέψει και να διαφοροποιηθούν μεταστατική εντόπιση όργανο-στόχο. Φυσιολογικών και καρκινικών ιστών από τρεις διαφορετικές ομάδες ασθενών CRC αναλύθηκαν. RNA μικροσυστοιχία και η ανάλυση TaqMan Array διεξήχθησαν σε 66 ιταλικά ασθενείς με ή χωρίς λεμφαδένες ή /και υποτροπές ήπαρ. Τα δεδομένα που λαμβάνονται με τις δύο δοκιμασίες αναλύθηκαν ξεχωριστά και στη συνέχεια διασταυρώνεται να προσδιορίσει ένα πρωτεύον CRC μεταστατικό υπογραφή. Πέντε διαφορικά εκφρασμένων microRNAs (HSA-miR-21, -103, -93, -31 και -566) έχουν επικυρωθεί από qRT-PCR σε μια δεύτερη ομάδα 16 ασθενών μεταστατικό Αμερικής.

Η in situ υβριδοποίηση

έγινε στις 16 αμερικανικές ασθενείς καθώς και σε τρεις διακριτές εμπορικές μικροσυστοιχιών ιστούς (ΤΜΑ) το οποίο περιέχει φυσιολογικό γειτονικό του παχέος εντέρου, το πρωτογενές αδενοκαρκίνωμα, φυσιολογικό και μεταστατικούς λεμφαδένες και ήπαρ. HSA-miRNA-21, -93 και -103 ρύθμιση προς τα άνω μαζί με HSA-miR-566 προς τα κάτω ρύθμιση ορίζεται το μεταστατικό υπογραφή CRC, ενώ

in situ υβριδισμού

δεδομένων εντόπισε λεμφαδενικές προφίλ εισβολή. Έχουμε παρείχε την πρώτη microRNAs υπογραφή που θα μπορούσαν να διακρίνουν μεταξύ του παχέος υποτροπές στους λεμφαδένες και στο ήπαρ, καθώς και μεταξύ του παχέος ηπατικών μεταστάσεων και πρωτογενών ηπατικού όγκου

Παράθεση:. Drusco Α, Nuovo GJ, Zanesi Ν, Di Leva G, Pichiorri F , Volinia S, et al. (2014) microRNA προφίλ εισάγουν διακρίσεις μεταξύ καρκίνου του παχέος εντέρου μετάσταση. PLoS ONE 9 (6): e96670. doi: 10.1371 /journal.pone.0096670

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 4 Ιανουαρίου 2014? Αποδεκτές: 10 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Drusco et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το ΝΙΗ Grant U01 CA152785 microRNAs /UCRs: βιοδείκτες για τον κίνδυνο του καρκίνου, την ανίχνευση των όγκων, την εξέλιξη και τη θεραπεία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η κύρια αιτία θανάτου σε ασθενείς με καρκίνο είναι μεταστατική νόσο [1]. Καρκινικά κύτταρα διάδοση έχει θεωρηθεί μια καθυστερημένη εκδήλωση πολλαπλών βημάτων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου. Μετά την πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου, γενετικά επιλεγμένα, τα κακοήθη κύτταρα εισβάλλουν στον τοπικό ιστό, εισάγετε στο αίμα και /ή λεμφαγγείων, μεταφέρονται σε μακρινές τοποθεσίες και αποικίζουν νέους ιστούς οργάνων. Πρόσφατες ενδείξεις υποδηλώνουν ότι η εξάπλωση του όγκου θα μπορούσε να είναι μια προηγούμενη περίπτωση που τελικά πρόδηλη μετά από αρκετά χρόνια από τη διάγνωση [2] – [5]

καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί την τρίτη πιο συχνή κακοήθεια στον ανεπτυγμένο κόσμο μετά του πνεύμονα και του μαστού. καρκίνος: περίπου οι μισοί από τους ασθενείς που πεθαίνουν από μεταστατική νόσο εντός 5 ετών από τη διάγνωση [6]. Οι πρώτες θέσεις της μεταστατικής νόσου του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι οι περιφερειακές λεμφαδένες και το ήπαρ. Παθολογική εξέταση του αδενοκαρκινώματος κόλου δεν μπορεί να προβλέψει με ακρίβεια τους ασθενείς που θα έχουν διαδοθεί ασθένεια σε τοπικούς λεμφαδένες ή /και σε απομακρυσμένες θέσεις. Ωστόσο, στο παχύ έντερο, καθώς και σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και μελάνωμα, η παρουσία ή η απουσία των λεμφαδένων εισβολής μπορεί να επηρεάσει τον τύπο της χειρουργικής εκτομής ή τον τύπο του καθεστώτος χημειοθεραπείας [7] – [9].

Αν και μεταστάσεις στο ήπαρ συχνά προέρχονται από καρκίνους του παχέος εντέρου, υπάρχουν περιπτώσεις όπου η μετάσταση είναι το πρώτο και μοναδικό εύρημα σε ασθενείς με άγνωστη πρωτοπαθή εντόπιση του όγκου [10], και η διάκριση μεταξύ πρωτοβάθμιας ηπατικές αλλοιώσεις και μετάσταση στο ήπαρ από διάφορες πιθανές περιοχές είναι θεραπευτικών και προγνωστική αξία [11].

Έτσι, υπάρχει μια αυξανόμενη ανάγκη νέων διαγνωστικών και προγνωστικών βιοδεικτών που θα μπορούσαν να διακρίνουν μεταξύ του πρωτογενούς όγκου και τα διάφορα σημεία μετάστασης, καθώς επίσης και την πρόβλεψη της μετάστασης ροπή του ο πρωτογενής όγκος.

τα microRNAs ή miRNAs, είναι μικρές (19-25 νουκλεοτίδια) μη κωδικοποίησης RNAs, που ρυθμίζουν τα γονίδια έκφρασης με μετα-μεταγραφικά καταστολή μετάφραση του mRNA, και /ή που προκαλούν αποικοδόμηση του mRNA. Έχουν εμπλέκονται στη ρύθμιση της πλειονότητας των φυσιολογικών διαδικασιών [12], και παρεκκλίνοντα εκφράζονται σε έναρξη και την εξέλιξη του όγκου, την πρόβλεψη της κατάστασης της νόσου και την κλινική έκβαση [13], [14]. Είναι ενδιαφέρον, microRNAs υπογραφές είναι εξαιρετικά ιστού ειδικά και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταξινόμηση των καρκίνων, και για τον προσδιορισμό του πρωτοπαθούς όγκου μιας μεταστατικής βλάβης άγνωστης προέλευσης [15] – [19].

Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να εντοπίσει μια υπογραφή microRNA που θα μπορούσε να επιτρέψει τη διαφοροποίηση μεταξύ λεμφαδενικές και ηπατικής μετάστασης σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνωμα.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστού ασθενούς

Τρεις ομάδες των ασθενών ήταν που εξετάζεται στη μελέτη (Πίνακας 1).

επιλέχθηκαν παραφίνη παραφίνη ιστούς που προέρχονται από 66 ασθενείς με διάγνωση του παχέος καρκίνωμα από το Πανεπιστήμιο της Ρώμης «La Sapienza», UOC ΑΝΑΤΟΜΙΑ ed Istologia Patologica C /Cardiovascolare, τράπεζα ιστών σύμφωνα στη σταδιοποίηση ΤΝΜ.

από 66 ασθενείς, 18 παρουσίασε πρωτογενές παχέος όγκου χωρίς μετάσταση (Οποιοδήποτε Τ, N0, M0), 33 είχαν καρκίνο του παχέος εντέρου με μετάσταση στους λεμφαδένες μόνο (Οποιοδήποτε Τ, οποιοσδήποτε Ν, M0) και 15 είχαν διαγνωστεί με καρκίνο του παχέος εντέρου, των λεμφαδένων και μεταστάσεις στο ήπαρ (Κάθε Τ, κάθε n, M1). Ξεχωριστή δείγματα όγκων από τον πρωτογενή όγκο, τους μεταστατικούς λεμφαδένες και μετάσταση στο ήπαρ συλλέχθηκαν για κάθε ασθενή και να μεταποιηθούν για μικροσυστοιχιών ιστού και TaqMan Array microRNA κάρτες.

Μια δεύτερη ομάδα 16 ασθενών που προέρχονται από τα αρχεία του OSU Τμήμα Παθολογίας είχαν εγγραφεί στη μελέτη. Για κάθε ασθενή, η κανονική κολικού ιστού, πρωτογενή κολονική adenocarcnoma, μεταστατικούς λεμφαδένες και μεταστατικών ήπατος αναλύθηκαν, καθώς και τα αντίστοιχα φυσιολογικούς λεμφαδένες και ήπαρ, όταν είναι διαθέσιμα. Το ΤΜΑ που δημιουργήθηκε από αυτά τα δείγματα ασθενών συν τρεις σειρές συστοιχιών ιστών ΗΠΑ Biomax (BN05014 με 24 περιπτώσεις, BC05118 με 50 περιπτώσεις, CO702 με 69 περιπτώσεις) χρησιμοποιήθηκαν για in situ υβριδοποίησης (ISH). περιπτώσεις US Biomax αντιπροσωπεύουν η τρίτη ομάδα των ασθενών που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη με φυσιολογικό γειτονικό του παχέος ιστούς, πρωταρχικός αδενοκαρκινώματος κόλου χωρίς λεμφαδένων /απομακρυσμένων μεταστάσεων και πρωτογενών παχέος εντέρου ασθενών με τεκμηριωμένη λεμφαδένες και μετάσταση ήπατος, και το πραγματικό λεμφαδένα και /ή ηπατικές μεταστάσεις

το σχέδιο εγκρίθηκε από την ιταλική (Presidente – Καθ. Aldo Isidori, Καθ Lucio Miano, Dott.ssa Αμαλία ALLOCCA, Dott.ssa Enrica Arduini, Dott.ssa Μαρία Caporale, Καθηγητής Luciano caprino, Dott.ssa Avia Carabelli, Καθηγητής Francesco COGNETTI, Dott.ssa Άννα dalle ORE, Prof.ssa Marzia Duse, Dott.ssa Giuseppina DI GIAMMARCO, Dott. Domenico Antonio IENTILE, Καθηγητής Giovanni Fabbrini, Prof.ssa Πάολα frati , Dott.ssa Maria Teresa LUPO, καθηγητής Franco Mandelli, Dott. Enrico MARINELLI, Dott.ssa Μπόζα MAURO, καθηγητή Paolo mene », Dott.ssa Elisabetta SIMONGINI, Καθηγητής Pietro SERRA, Καθηγητής Giovanni Spera, Dott. Ettore Tiberi , AVV. Angelo TUZZA, Prof.ssa Annarita Vestri, καθηγητής Vincenzo ZIPARO) και της Αμερικής (https://orrp.osu.edu/irb/irbforms/) Ηθικά Commettee (Prot.1119 /13, Prot.2007E0748 αντίστοιχα). Συγκεκριμένα, τόσο οι Commettees, το Διοικητικό Συμβούλιο Ohio State University Θεσμικών Έρευνας και il Comitato Etico «La Sapienza», μας απαλλάσσονται από τους ασθενείς πληροφορημένη συναίνεση, δεδομένου ότι, και στις δύο περιπτώσεις, ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστό ανώνυμα αρχειοθετημένα δείγματα, που επιλέγονται σύμφωνα με TNM στάσης και τους ασθενείς τους δεν ήταν πλέον διαθέσιμο.

RNA

εκχύλιση

Ολικό RNA εξήχθη επεξεργασία πέντε πάχους 20 μm τμήματα από κάθε ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστό, με τη χρήση της RecoverAll Σύνολο Nucleic Acid κιτ απομόνωσης (ΑΜΒΙΟΝ # 1975) και ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

επισήμανσης RNA και υβριδισμού επί miRNA μικροσυστοιχιών τσιπ διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Πέντε μg από κάθε δείγμα ολικού RNA υποβλήθηκε σε υβριδισμό σε miRNA μας μικροσυστοιχιών (Ohio State Comprehensive Cancer Center, έκδοση 2.0), το οποίο περιέχει 460 ώριμη miRNAs ανιχνευτές, εντόπισε εις τετραπλούν (235

Homo sapiens

, 222

Mus musculus

, και τρεις

Arabidopsis thaliana

). Διαφορετικοί ανιχνευτές χρησιμοποιήθηκαν για την αναγνώριση κάθε ώριμο miRNA και οι περισσότεροι από τους προδρόμους miRNAs. σήματα υβριδισμού ανιχνεύθηκαν με στρεπταβιδίνη Alexa Fluor 647 συζυγών και σαρωμένων εικόνων (Αχοη 4000B) ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GenePix 6.0 (Αχοη Instruments). Τα ίδια δείγματα αναλύθηκαν επίσης με κάρτες RT-PCR (Applied Biosystems).

miRNA μικροσυστοιχιών

μικροσυστοιχίες ουσιαστικά αναλύθηκαν όπως περιγράφεται από τους Liu et al [21]. Ποσοστιαία εξομάλυνση και τη στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση BRB ArrayTools αναπτύχθηκε από τον Richard Simon και η Amy Peng Lam [22].

διαφορικά εκφράζονται miRNAs ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα τυχαίο-διακύμανση t-test. Το t-test τυχαίας διακύμανσης είναι μία βελτίωση έναντι του προτύπου ξεχωριστό t-test, καθώς επιτρέπει την ανταλλαγή πληροφοριών μεταξύ των γονιδίων για εντός κλάσης παραλλαγή χωρίς υποθέτοντας ότι όλα τα γονίδια έχουν την ίδια διακύμανση. Γονίδια θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν Ρ-η αξία τους ήταν μικρότερη από 0,05. [23].

Πολλαπλές δοκιμές ελέγχθηκε με τη χρήση ψευδών ποσοστό ανίχνευσης. ονοματολογία miRNA ιδρύθηκε σύμφωνα με το πρόγραμμα περιήγησης UCSC γονιδίωμα (https://genome.ucsc.edu/) και η miRBase (https://www.mirbase.org/)? σε περίπτωση ασυμφωνίας η miRBase ακολούθησε.

είναι διαθέσιμα στην ιστοσελίδα του GEO Πρώτες δεδομένων (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350) .

TaqMan Array microRNA κάρτες και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Real Time PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας το TaqMan Array Ανθρωπίνων microRNA πίνακα (v.1, Applied Biosystems, Foster City, CA) και 50 ng του RNA ανά θύρα για ένα σύνολο 400 ng. Αυτή η σειρά περιέχει 365 στόχους miRNA καθώς και ενδογενείς ελέγχους. Κανονικοποίηση διεξήχθη με μικρά πυρηνικά RNA (snRNA) U44 και U48. Η έκφραση του ενιαίου ώριμου miRNAs αξιολογήθηκε από το TaqMan miRNAassay (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), και ομαλοποιήθηκε ως προς RNUB6 (Applied Biosystems). Ανεπεξέργαστα δεδομένα είναι διαθέσιμα στην ιστοσελίδα του GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350).

In situ υβριδισμού

η in situ υβριδοποίηση πραγματοποιήθηκε για επιλεγμένες microRNAs κατόπιν προηγουμένως περιγραφέν πρωτόκολλο [24], με τη χρήση Exiqon LNA-5’DIG σημασμένους ανιχνευτές. Τρεις USBiomax μικροσυστοιχίες ιστού (ΤΜΑ) διαφάνειες (Colon κανονική σειρά ιστών με 21 κανονικές περιπτώσεις και 3 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος, τον καρκίνο του παχέος εντέρου και συμφωνημένα γειτονικό φυσιολογικό σειρά ιστού με 25 περιπτώσεις, ο καρκίνος του παχέος εντέρου συστοιχία ιστού με μετάσταση και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό με 68 περιπτώσεις) και ένα χρησιμοποιήθηκαν διαφάνεια με πυρήνες ιστό από 16 ασθενείς (OSU TMA). Για κάθε επιλεγμένη microRNA, TMAs βαθμολογήθηκαν ανάλογα με τη σχετική έκφραση microRNA κάθε πυρήνα με δύο παθολόγους, όπως ορίζεται από το ποσοστό των θετικών κυττάρων όγκου και την ισχύ του σήματος σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα σε θετικές περιπτώσεις. Οι βαθμολογίες παρήχθησαν τυφλωθεί με την παρουσία ή απουσία μεταστατικής νόσου και της Mann-Whitney test εφαρμόστηκε για σύγκριση τάξεις

Αποτελέσματα

Η μελέτη μας αναπτύχθηκε σε τέσσερα στάδια, εκμεταλλευόμενοι.: (Ι) DNA μικροσυστοιχίες, (II) Taqman κάρτες υψηλής πυκνότητας, (III) Taqman μόνο ανάλυση qRT-PCR και (IV) in situ υβριδισμό. Για την επίτευξη πιο ισχυρή αποτελέσματα, χρησιμοποιήσαμε τρεις διαφορετικές ομάδες ασθενών (Πίνακας 1). Η πρώτη ομάδα περιελάμβανε 66 ιταλικές ασθενείς (ΙΙΙ Clinica Chirurgica, Universita ‘di Roma «La Sapienza», Ρώμη, Ιταλία) με αδενοκαρκίνωμα του κόλου: 18 ασθενείς δεν είχαν καμία μετάσταση, 33 είχαν επηρεαστεί λεμφαδένες και 15 παρουσίασαν μεταστάσεις στους δύο λεμφαδένες και το συκώτι. Ολικά RNAs από 18 κολονικό πρωτογενείς όγκους (Τ) χωρίς μετάσταση, 33 κολονικό πρωτογενείς όγκους (T

N) με λεμφαδενικές υποτροπές και οι αντίστοιχες 33 μεταστατικούς λεμφαδένες (Ν

N), 15 κολονικό πρωτογενείς όγκους (T

L,) των ασθενών με λεμφαδενικές και ηπατική μεταστατική νόσο και τα αντίστοιχα 15 μεταστατικούς λεμφαδένες (Ν

L) και ηπατικών βλαβών (L), ελέγχθηκαν για την πλατφόρμα έθιμο μικροσυστοιχίας που είχε προηγουμένως χρησιμοποιηθεί για τον καθορισμό microRNA καρκίνο υπογραφές σε διάφορες μελέτες [13], [14], [21], και σε Taqman Array microRNA κάρτες (Applied Biosystems). Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σύμφωνα με τις απαιτήσεις της πλατφόρμας και οι ίδιες συγκρίσεις μεταξύ των κατηγοριών εφαρμόστηκαν τόσο στις ομάδες δεδομένων ξεχωριστά. Σημαντικά εντοπίστηκαν αλλαγμένη miRNAs και τα αποτελέσματα ήταν διασταυρώνεται. Μόνο microRNAs με μια φορές διαφορά αλλαγή μεγαλύτερη από 2 ή μικρότερη από 0,5 θεωρήθηκαν ως οι υποθετικές προ-μεταστατικό και αντι-μεταστατικός miRNAs αντίστοιχα. Δώδεκα microRNAs ήταν σταθερά πάνω ρυθμισμένα σε μετάσταση (HSA-miR-103, -155, -16, -191, -200 ° C, -21, -24, -26a, -26b, -29a, -31 και 93) και μόνο δύο ήταν κάτω-ρυθμιζόμενη (HSA-miR-328 και -566) (Πίνακας 2).

Η

Η διπλή στρατηγική σειρά μας επέτρεψε να δοκιμάσει τα ίδια δείγματα με δύο διαφορετικές τεχνικές προσεγγίσεις.

για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η εντοπίστηκαν «μεταστατική» υπογραφή, επιλεγμένα microRNAs δοκιμάστηκαν σε δεκαέξι αμερικανική ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου (OSU Παθολογικό Τμήμα, Columbus, ΟΗ). Για κάθε ασθενή, το ολικό RNA από τομές παραφίνης πυρήνων ιστού κανονικών και κακοηθών κόλον, λεμφαδένας και το ήπαρ, αναλύθηκε με ενιαία qRT-PCR. Η δοκιμασία Mann-Whitney εφαρμόστηκε για να συγκριθούν τα αποτελέσματα της PCR από τις διάφορες ομάδες ασθενών.

Πρωτοβάθμια μεταστατικό παχέος αδενοκαρκινώματα παρουσίασαν σημαντική υπερέκφραση του HSA-miR-21 (P-value = 0,0011), -31 (Ρ -τιμή = 0,0003), -93 (Ρ-value = 0,0048), -103 (Ρ-value = 0,0142) και προς τα κάτω ρύθμιση του HSA-miR-566 (Ρ-value = 0,0075) σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό τους (Πίνακας 2 ). Επιπλέον, σε σχέση με την κανονική, HSA-miR-21 και -93 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε μετάσταση στο ήπαρ με ένα P-value = 0,020 και P-value = 0,0002 αντίστοιχα. HSA-miR-21 επίσης σημαντικά υπερεκφράζεται σε μεταστατικούς λεμφαδένες (P-value = 0,009) (Σχήμα 1). Αυτές οι πέντε επικυρωθεί microRNAs δεν σχετίζεται με την σταδιοποίηση του όγκου.

Κανονική ιστό του παχέος εντέρου (NORM), αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου (ADENOCA), λεμφαδενικές μετάσταση (POSLYM) και το συκώτι του παχέος εντέρου (LIVERMET) για miR-21 (Α), miR -31 (Β), miR-93 (C), miR-103 (D) και miR-566 (Ε). Μια δοκιμασία Mann-Whitney εφαρμόστηκε για σύγκριση ομάδων. Οι ομάδες εμφανίζονται στο x-άξονα των Boxplots », ενώ οι δέλτα Ct τιμές που εκπροσωπούνται στο y-άξονα. Για κάθε πλαίσιο, το μπαρ αντιπροσωπεύουν το διάμεσο, την περιοχή το 25

ου και 75

ο εκατοστημόριο και τα μουστάκια του γραφήματος από τις μεγαλύτερες και μικρότερες τιμές. Κάθε γραμμή P-τιμή αντιστοιχεί σε μια σύγκριση: για κάθε miR η πρώτη κάτω γραμμή αναφέρεται στην NORM vs σύγκριση ADENOCA? miR-21 δευτερόλεπτα P-τιμή κάτω γραμμή αντιστοιχεί στην NORM vs σύγκριση POS λέμφο, ενώ το πρώτο άνω μπάρα τόσο miR-21 και -93 αντιστοιχεί στο NORM vs σύγκριση ΗΠΑΡ ΚΟΑ.

Η

όγκους, οι φλεγμονώδεις και στρωματικά κύτταρα διασκορπισμένα μεταξύ καλοηθών και κακοηθών επιθηλιακών κυττάρων, και μεταβλητά συμβάλλουν στην κυτταρικότητα της βλάβης. Είναι, ως εκ τούτου, σημαντικό να κατανοήσουμε ποιος τύπος κυττάρου εκφράζει μία συγκεκριμένη microRNA. Για το σκοπό αυτό, σε πειράματα situ υβριδισμό διεξήχθησαν σε TMAs με πρωτογενή αδενοκαρκινώματα, μεταστατικούς λεμφαδένες, ηπατική μετάσταση και φυσιολογικούς ιστούς. HSA-miR-21, -93, -103 και -566 ανιχνευτές υβριδίστηκαν σε OSU TMA και USBiomax TMA διαφάνειες. Δύο ανεξάρτητες παθολόγοι δέχεται κάθε πυρήνα slide τυφλωμένο στην θέση του πυρήνα βιοψίας και στην ιστορία κλινικής σταδιοποίησης, λαμβάνοντας υπόψη την ένταση του σήματος του κόλου κακοήθων κυττάρων σε σύγκριση με τα γειτονικά φυσιολογικά επιθηλιακά και μη επιθηλιακά κύτταρα (Σχήμα 2). HSA-miR-21 (Ρ-τιμή & lt? 0.0001) και -103 (Ρ-value = 0,0009) ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε αδενοκαρκινώματα και μεταστατικούς καρκίνους σε σύγκριση με φυσιολογικούς (Εικ.2: Α, Β). Μια Chi-τετράγωνο τεστ αποκάλυψαν μια γραμμική τάση και για τους δύο, HSA-miR-21 (P-value & lt? 0.0001) και HSA-miR-103 (P-value & lt? 0.0001): ήταν όλο και περισσότερο προς τα πάνω ρυθμισμένη προχωρούν από την κανονική, με αδενοκαρκίνωμα και να μετάσταση (Σχήμα 3, Σχήμα 4). Ωστόσο, ενώ HSA-miR-103 ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε μετάσταση στο ήπαρ σε σύγκριση με αδενοκαρκινώματα και θετικούς λεμφαδένες, HSA-miR-21 δεν έδειξε κάποια σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών τάξεων. ISH της HSA-miR-93 επιβεβαίωσε ρύθμιση προς τα πάνω της σε αδενοκαρκινώματα και μετάσταση στο ήπαρ, που δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ κανονικών και είτε αδενοκαρκινώματα (P-value = 0,0345) ή ηπατική μετάσταση (P-value = 0,007) και μεταξύ αδενοκαρκινώματα και μετάσταση στο ήπαρ (P -τιμή = 0,043). Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά κατά τη σύγκριση φυσιολογικά και αδενοκαρκινώματα έναντι θετικών λεμφαδένων (Σχ. 2C και Εικ.5). Έτσι, HSA-miR-93 πρότυπο έκφρασης θα μπορούσε να διαφοροποιήσει την κανονική του παχέος εντέρου από την πρωτοβάθμια αδενοκαρκίνωμα, και η κανονική του παχέος εντέρου και του πρωτογενούς αδενοκαρκίνωμα από μετάσταση στο ήπαρ, αλλά όχι από τη δευτεροβάθμια όγκων lymphnodal εισβολή. HSA-miR-566 ήταν εξίσου υπερεκφράζεται σε φυσιολογικό γειτονικό ιστό του κόλου, πρωτογενή κακοήθη κύτταρα αδενοκαρκινώματος και του ήπατος του κόλου μεταστατικά κύτταρα (Σχ. 2D). Ωστόσο, τα θετικά λεμφαδένες έδειξαν σημαντικά ασθενέστερο σήμα σε σχέση με τους φυσιολογικούς (P-value = 0,002) και το αδενοκαρκίνωμα (P-value = 0,043), υποδεικνύοντας ότι η απώλεια του HSA-miR-566 μπορεί να διευκολύνει λεμφαδένα εισβολή στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

με φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου (NORM), αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου (ADENOCA), λεμφαδενικές μετάσταση (POSLYM) και το συκώτι του παχέος εντέρου (LIVERMET) για miR-21 (Α), miR-103 (Β), miR-93 ( C), miR-566 (D) και miR-200c (Ε). Μια δοκιμασία Mann-Whitney εφαρμόστηκε για σύγκριση ομάδων. Οι ομάδες εμφανίζονται στο x-άξονα των Boxplots », ενώ οι μέσες τιμές βαθμολογίας εκπροσωπούνται στο y-άξονα. Για κάθε πλαίσιο, το μπαρ αντιπροσωπεύουν το διάμεσο, την περιοχή το 25

ου και 75

ο εκατοστημόριο και τα μουστάκια του γραφήματος από τις μεγαλύτερες και μικρότερες τιμές. Κάθε γραμμή P-τιμή αντιστοιχεί σε μια σύγκριση: για miR-21, -103, -93 και -200 ° C η πρώτη κάτω γραμμή αντιστοιχεί στην NORM vs σύγκριση ADENOCA? miR-21, -103 και -93 πρώτο άνω μπαρ ανατρέξτε στην NORM vs σύγκριση ΣΥΚΩΤΙ ΚΟΑ, ενώ miR-566 και -200 ° C επάνω μπάρα δείχνει την NORM vs σύγκριση POS LYMPH? miR-566 και miR-200c κάτω μπάρες δείχνουν την ADENOCA vs POS λέμφου και ο κανόνας vs σύγκριση POS LYMPH αντίστοιχα.

Η

Όπως τεκμηριώνεται στη βιβλιογραφία, miR-21 έδειξε ένα ασθενές σήμα σε κανονική σχέση του παχέος εντέρου σε αδενοκαρκίνωμα (P-value = 0,0011) και ήταν εντόνως εκφρασμένων σε μετάσταση. MiR-21 έκφραση ανιχνεύθηκε μόνο στην πρωτοβάθμια αδενοκαρκίνωμα και μεταστατικό κακοήθη κύτταρα.

Η

Στην κανονική του παχέος εντέρου το βέλος δείχνει την έλλειψη του miR-103 έκφρασης σε επιθηλιακά κύτταρα. Στον πρωτογενή όγκο το βέλος δείχνοντας την αυξημένη έκφραση του miR-103 στο διηθητικό αδενοκαρκίνωμα. Το βέλος στο ήπαρ επανάληψη και τα δύο τόξα στις μεταστάσεις λεμφαδένα δείχνουν μια δραματική αυξημένη έκφραση του miR-103 στο μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα επιθήλια.

Η

Η επαγωγή Επιθηλιακών-to-Mesenchimal Μετάβασης (ΕΜΤ) θεωρείται ένα σημαντικό βήμα για την ανάπτυξη του μεταστατικού καρκίνου. Πρόσφατα, έχει αποδειχθεί ότι η HSA-miR-103/107 ρυθμίζει προς τα κάτω έμμεσα miR-200 μέλη της οικογένειας, και ότι η συμπεριφορά αυτή σχετίζεται με φαινότυπο μεσεγχυματικά σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [24].

Στη μελέτη μας, η πλατφόρμα μικροσυστοιχιών και δοκιμασία Taqman, απομονωμένο τόσο HSA-miR-103 και HSA-miR-200c. Θέλαμε να καταλάβουμε αν, όπως στο στήθος μεταστατικό καρκίνο, αυτά τα δύο miRNAs ήταν αντιστρόφως ανάλογη με του παχέος εντέρου μεταστατικό καρκίνο. Αν και δεν είναι σημαντικές από qRT-PCR, TMAs υβριδοποιήθηκαν με ανιχνευτή HSA-miR-200c και σκόραρε (Σχ. 2Ε). Σε σύγκριση με φυσιολογικά, ένα υψηλότερο ένταση σήματος ανιχνεύθηκε σε αδενοκαρκινώματα (P-value = 0,0023) και θετικούς λεμφαδένες (P-value = 0,0006). Μια σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ HSA-miR-103 και HSA-miR-200c ήταν παρόν σε λεμφαδένα μετάσταση (P-value = 0,0225), αλλά όχι σε αδενοκαρκινώματα ή μετάσταση ήπατος. Ως εκ τούτου, HSA-miR-103 και HSA-200c δεν συσχετίζονταν αντίστροφα και δεν ρυθμίζουν EMT στο μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου

in vivo

, αλλά και οι δύο υπερεκφράζεται σε αδενοκαρκινώματα και των λεμφαδένων μεταστάσεων. Εμείς δεν ερεύνησε HSA-miR-107 ή οποιαδήποτε άλλα μέλη της οικογένειας miR-200, επειδή EMT δεν ήταν σχετικές με τον στόχο της μελέτης μας.

Είναι ενδιαφέρον, HSA-miR-31 ISH (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) αποκάλυψε ένα πολύ ισχυρό σήμα σε φλεγμονώδη κύτταρα που περιβάλλουν τους όγκους. Μία ασθενέστερη χρώση παρατηρήθηκε σε όγκο και φυσιολογικό κολονικό κύτταρα, αλλά μόνο λίγοι HSA-miR-31 που εκφράζουν λεμφοκυττάρων ήταν παρόντα σε φυσιολογικούς λεμφαδένες, γεγονός που υποδηλώνει ότι HSA-miR-31 προς τα πάνω ρύθμιση προέκυψε κυρίως από τη φλεγμονώδη και όχι από την κακοήθη συνιστώσα του όγκου

ο Πίνακας 1 αναφέρει τον αριθμό των περιπτώσεων με TNM στάσης που αναλύθηκαν σε κάθε τεχνικό βήμα της μελέτης μας.? Ο Πίνακας 2 δείχνει τις υπογραφές microRNA που ελήφθησαν με κάθε τεχνική διαδικασία.

Συζήτηση

Το 2009 AJCC έκδοση έχει δημοσιεύσει ένα νέο καρκίνο του παχέος εντέρου ταξινόμησης ΤΝΜ, στην οποία έχουν υποκατηγορίες προστεθεί στο (Ν) κομβικό σταδιοποίηση της νόσου. Άλλοι συγγραφείς έχουν προτείνει την αντικατάσταση αυτών των κατηγοριών N με τον αριθμό των θετικών λεμφαδένων, και διάφορες χειρουργικές δημοσιεύσεις έχουν προτείνει μια πιο ριζική λεμφαδενεκτομή για να ορισθεί καλύτερα πρόγνωση, ώστε να βελτιωθεί κόλον ασθενείς με καρκίνο επιβίωση [26] – [29]. Κομβικό εισβολή είναι ένα κρίσιμο βήμα για τον καθορισμό ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου πρόγνωση και τη θεραπεία. Ωστόσο, το 25% των ασθενών με αρνητικούς λεμφαδένες λέμφου βιώνουν υποτροπή και όχι όλοι οι ασθενείς με θετικούς λεμφαδένες έχουν φτωχή πρόγνωση [30] – [32].

Από την άλλη πλευρά, οι πρωτογενείς εξάπλωση του όγκου στο ήπαρ, είναι η κύρια αιτία της εξέλιξης της νόσου σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, με 15-30% των ασθενών που παρουσιάζουν με σύγχρονη ηπατικές αλλοιώσεις κατά τη στιγμή της πρωτογενούς χειρουργική του παχέος εντέρου, και, δείχνοντας metachronous υποτροπές μετά την επιθετική εκτομή ήπατος [33] – [35].

Έτσι, είναι απαραίτητο να προσδιοριστούν νέων μοριακών βιοδεικτών που, μαζί με το σύστημα σταδιοποίησης TNM, μπορεί να βελτιώσει τη διάγνωση και ταξινόμηση των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου.

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει μια υπογραφή microRNA για τον μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου που θα μπορούσε να εισάγει διακρίσεις μεταξύ λεμφαδένες και μετάσταση στο ήπαρ.

στη βιβλιογραφία, οι περισσότερες από τις αναφερόμενες καρκίνου microRNAs υπογραφές έχουν ταυτοποιηθεί και επικυρωθεί στα ίδια δείγματα ιστών. Για να αυξηθεί η αξιοπιστία των δεδομένων μας, με την εξαίρεση των δύο πρώτων αναλύσεων, κάθε στάδιο επικύρωσης διεξήχθη σε μία διαφορετική ομάδα ασθενών.

Microarray και κάρτες πλατφόρμες διασταυρώνεται δεδομένων που προσδιορίζονται δεκατέσσερις εκφράζονται διαφορικά microRNAs, εκ των οποίων πέντε επικυρώθηκαν από qRT-PCR. HSA-miR-21, -31, -93, -103 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε πρωτογενείς όγκους σε σύγκριση με το φυσιολογικό, ενώ HSA-miR-566 ήταν μειωτικά. HSA-miR-93 και -31 είχαν επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω σε μετάσταση στο ήπαρ, αλλά όχι στους λεμφαδένες θετικά για μετάσταση, ενώ η HSA-miR-21 υπερ-έκφραση ήταν εμφανής και στις δύο, το ήπαρ και λεμφαδένες μετάσταση. Με την εξαίρεση του HSA-miR-31, in situ υβριδισμού (ISH) του κόλου αδενοκαρκινώματα και το αντίστοιχο παρακείμενο φυσιολογικό ιστό, καθώς επίσης και κομβικών και μετάσταση ήπατος μικροσυστοιχίες ιστού της, επιβεβαίωσε τις υπογραφές που προσδιορίζονται από τις κάρτες και αναλύσεις qRTPCR. HSA-miR-31 έχει βρεθεί απορρυθμισμένη σε διάφορες πρωτογενείς επιθηλιακούς όγκους όπου, σύμφωνα με τον εντοπισμό του όγκου, φαίνεται να ενεργοποιούν διαφορετικές οδούς καρκίνος: είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ορισμένες καρκινώματα [36] – [41], και ρυθμισμένα προς τα κάτω σε άλλοι [42] – [45]. Μια τέτοια δυαδικότητα, έχει βρεθεί σε επεμβατικές όγκους, καθώς και: σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, εισβολή προωθείται από HSA-miR-31 υπερέκφραση [46], [47], ενώ, σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, τα χαμηλά επίπεδα του προωθήσει μια πιο επιθετική συμπεριφορά [42], η οποία συσχετίζεται με φτωχότερη πρόγνωση του ασθενούς.

Στοχευμένες λειτουργίες της HSA-miR-31 περιλαμβάνουν την αγγειογένεση, όπου προς τα άνω ρύθμιση της αυξάνει την αρτηριακή, αλλά δεν λεμφαγγείων βλάστησης [48], και οξεία φλεγμονή [49]. Βρήκαμε ότι HSA-miR-31 είναι ως επί το πλείστον ρυθμίζονται περινεοπλαστικό φλεγμονώδη κύτταρα, σε σύγκριση με τον καρκίνο και τα φυσιολογικά κύτταρα. Έτσι, HSA-miR-31 απορρύθμισης στην πρωτοβάθμια επιθετικούς όγκους είναι ένα αναμφισβήτητο αποδεικτικό στοιχείο, αλλά η αλληλεπίδραση των λειτουργιών της μεταξύ της φλεγμονής, neoangiogenic και όγκων μεταστατικό πλαίσιο, χρειάζεται, ακόμα, να διευκρινιστεί.

HSA-miR -21 είναι ένα άλλο microRNA Multitask που έχει εμπλακεί στην φλεγμονή [50] – [53], ανοσολογική ασθένεια [54] – [57], η ανάπτυξη [58] – [61], η αγγειογένεση [62], [63], τον καρκίνο και μετάσταση [18], [64] – [82]. Αρκετές μελέτες έχουν, στην πραγματικότητα, ανέφερε η υπερέκφραση του σε διαφορετικό είδος των όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του παχέος εντέρου, όπου τα επίπεδα της συσχετίζονται με την κλινική εξέλιξη, κακή επιβίωση και θεραπευτικού αποτελέσματος [83], [84].

Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες μας και εκείνων των άλλων, qRT-PCR επικυρωμένη HSA-miR-21 προς τα πάνω ρύθμιση σε κολικό αδενοκαρκινώματα και μετάσταση σε σύγκριση με το φυσιολογικό. In situ υβριδισμού δεδομένα έδειξαν μια τάση: HSA-miR-21 επίπεδα ήταν η χαμηλότερη σε φυσιολογικό ιστό, και όλο και υψηλότερα σε αδενοκαρκίνωμα και μετάσταση, εν τω μεταξύ, μια παρόμοια έκφραση παρατηρήθηκε σε καρκινικά κύτταρα κόμβους και υποτροπές του ήπατος, υποδηλώνοντας ότι η HSA-ΜΙΚ 21 προς τα άνω ρύθμιση θα μπορούσε να προβλέψει ένα προηγμένο μεταστατική νόσο.

Όπως με HSA-miR-31, τα υψηλά επίπεδα της HSA-miR-21 και -93 έχουν περιγραφεί από άλλους συγγραφείς σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [39], [85] , [86] και, ως εκ τούτου, δεν μπορούν να θεωρηθούν ως ένα διαγνωστικό απόκλιση υπογραφή μεταξύ μετάσταση στο ήπαρ και το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα

τα στοιχεία ISH για HSA-miR-93 επικαλύπτονται πλήρως τα αποτελέσματα qRT-PCR:. ένα έντονο κηλίδωση ανιχνεύθηκε σε πρωτογενή κολονική αδενοκαρκινώματα και μετάσταση ήπατος. Προκαλούμενη υπερ-έκφραση του HSA-miR-93 δείχθηκε: να είναι ογκογονικά in vitro και in vivo, για την προαγωγή της επιβίωσης, αλλά όχι τον πολλαπλασιασμό, και για την ενίσχυση της νεοαγγειογένεσης [87]. Επιπλέον, η αυξημένη HSA-miR-93 επίπεδα, συσχετίζονται με την εξέλιξη και μειωμένη ασθενείς επιβίωσης σε ορώδες καρκίνωμα των ωοθηκών [88], και δεν μπορεί να προβλέψει την υποτροπή του καρκίνου του μαστού [89].

Ωστόσο, το μόνο μέχρι ρυθμιζόμενων επικυρωθεί microRNA προσδιορίζονται στην υπογραφή μας που θα μπορούσαν να διακρίνουν μεταξύ του παχέος εντέρου ηπατική μετάσταση και την πρωτοβάθμια ηπατοκυτταρικού καρκινώματος ήταν HSA-miR-103. Η σημασία αυτού του miRNA στον καρκίνο έχει αξιολογηθεί σε παγκρέατος, της ουροδόχου κύστης, του οισοφάγου, του στομάχου και του μαστού όγκους [29], [90] – [93]. Τα υψηλά επίπεδα της HSA-miR-103 συσχετίστηκαν με κακή επιβίωση στον καρκίνο του οισοφάγου και συνδέονται σε μεταστατική νόσο σε καρκίνο του μαστού και του στομάχου. Ιδιαίτερα, HSA-miR-103 προς τα πάνω ρύθμιση ανιχνεύθηκε σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο φέρουν θετικούς λεμφαδένες. Ομοίως, στη μελέτη μας, qRT-PCR ανιχνεύεται HSA-miR-103 υπερ-έκφραση σε πρωτογενείς όγκους, καθώς και μεταστατικούς κόμβους και το ήπαρ. Και πάλι, ISH μας έδωσε πιο συγκεκριμένο κελί προέλευσης πληροφορίες: ενώ, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των πρωτογενών όγκων και θετικούς λεμφαδένες, το ήπαρ μετάσταση έδειξε τα υψηλότερα επίπεδα της HSA-miR-103 έκφρασης

. μελέτη μας, αν και δεν έχουν επικυρωθεί από qRT-PCR, HSA-miR-200c ήταν ένα από τα επιλεγμένα microRNA από μικροσυστοιχιών και κάρτες πλατφόρμες. Πρόσφατα, HSA-miR-103/107 επίπεδα βρέθηκαν αντιστρόφως συσχετίζεται με HSA-miR-200c στη ρύθμιση της Επιθηλιακών-to-Mesenchimal μετάβαση στον καρκίνο του μαστού [25]. Για να ελέγξετε αν θα μπορούσε να δημιουργήσει την ίδια συσχέτιση του καρκίνου του παχέος εντέρου, εκτελέσαμε ISH του παχέος εντέρου TMA με καθετήρα miR-200c. Εμείς δεν τήρησε καμία αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των δύο miRNAs. Ήταν και οι δύο εκφράζονται υπερβολικά, αλλά, HSA-miR-200c ήταν έντονα πάνω ρυθμισμένα σε λεμφαδένες κομβικές μετάσταση σε σύγκριση με φυσιολογικό κόλον, αδενοκαρκινώματα και υποτροπές ήπατος. Αυτό υποδηλώνει ότι η HSA-miR-103 και HSA-miR-200c δεν ελέγχουν EMT στον καρκίνο του παχέος εντέρου, και ότι τα υψηλά επίπεδα της HSA-miR-200c που απαιτούνται για κομβικά εισβολή.

HSA-miR-200c του ήπατος μετάσταση ISH βαθμολογίες έδειξαν υψηλή μεταβλητότητα, καλύπτοντας τις μέσες τιμές του φυσιολογικού ιστού, αδενοκαρκινώματα, και θετικούς λεμφαδένες. Προς τα κάτω ρύθμιση της HSA-miR-200c έχει προταθεί ως μια χαρακτηριστική υπογραφή του πρωτοπαθούς καρκίνου του ήπατος (ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, ενδοηπατικής χολαγγειοκαρκίνωμα και αγγειοσάρκωμα του ήπατος) από μετάσταση στο ήπαρ επιθηλιακής προέλευσης [86], [94], ενώ ρύθμιση προς τα άνω του σε αδενοκαρκίνωμα κόλου ήταν σχετίζεται με κακή πρόγνωση [95]. Στη μελέτη μας, HSA-miR-200c αυξητική ρύθμιση σε κομβικό μετάσταση επιβεβαιώθηκε από ISH, αλλά δεν επικυρώθηκε από qRT-PCR. Αυτό το εύρημα οφείλεται κυρίως στην πειραματική και τεχνικές διαδικασίες. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε διαφορετικές ομάδες ασθενών για την επικύρωση, η οποία, αν και παρέχει πιο αξιόπιστα δεδομένα άκρο, εισήχθη περισσότερο μεταβλητότητα στην πειραματική διαδικασία. Δεύτερον, RNAs που προέρχονται από την πρώτη μας μικροσυστοιχίες ομάδα ασθενών, δεν εκχυλίζονται από μικροτομή παραφίνη παραφίνη ιστούς και περιείχε διάφορες αναλογίες του καρκίνου και καλοήθεις περιβάλλοντα ιστό, ενώ τα RNAs και οι ιστοί αναλύθηκαν στην qRT-PCR και ISH ήταν μικροτομή ιστού πυρήνες με μια σημαντική συστατικό του καρκίνου. Ωστόσο, qRT-PCR δεν μπορεί να διακρίνει από καλοήθεις ή /και μη καρκινικά κύτταρα, ενώ ISH μπορεί να διακρίνει μεταξύ των διαφορετικών τύπων κυττάρων. Άλλοι συγγραφείς επικυρωμένα δεδομένα τους με τους ίδιους τους ασθενείς, και το RNA εκχυλίστηκε από το σύνολο των ιστών. Επιπλέον, στο καλύτερο της γνώσης μας, στη βιβλιογραφία δεν υπάρχει καμία μελέτη που ανέφερε μια τέτοια μεγάλη κλίμακα των microRNA ISH. Έχουμε αποδείξει ότι ISH μπορεί να παρέχει πολύ χρήσιμες συγκεκριμένες πληροφορίες κυττάρων, προτείνοντας επιπλέον microRNAs

in vivo

λειτουργίες για περαιτέρω έρευνες.

Μια σημαντική καινοτομία της υπογραφής μας ήταν HSA-miR-566. Προφανώς ρυθμισμένα προς τα κάτω μόνο σε αδενοκαρκινώματα σε σχέση με τους ελέγχους και μεταστατικών του παχέος ιστούς με qRT-PCR, HSA-miR-566 σημασμένο ανιχνευτή διγοξιγενίνη, ήταν ασθενώς ανιχνεύθηκε σε θετικούς λεμφαδένες καρκινικά κύτταρα, και εξίσου εκφράζεται σε φυσιολογικό κόλον, καθώς και αδενοκαρκινώματα και μετάσταση στο ήπαρ, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι ISH μπορεί να μας δώσει πιο κατατοπιστική λεπτομέρειες από microarrays ή qRT-PCR. Δυστυχώς, στη λογοτεχνία, δεν υπάρχει καμία μελέτη αναφορά συμμετοχή HSA-miR-566 στον καρκίνο, ή περιγράφουν βιολογικές λειτουργίες του, που θα μπορούσε να βοηθήσει τη συζήτηση των δεδομένων μας.