Abstract

Ιστορικό

Η αλλαγμένη έκφραση του Mcl-1, ένα αντι-αποπτωτικό μέλος της οικογένειας Bcl-2, έχει συνδεθεί με την πρόοδο και την έκβαση μιας ποικιλίας κακοηθειών. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως την υπερέκφραση της πρωτεΐνης Mcl-1 σε ανθρώπινη στοματική καρκίνους. Η παρούσα μελέτη είχε ως σκοπό να αξιολογήσει την κλινικοπαθολογοανατομικών σημασία της έκφρασης των τριών γνωστών Mcl-1 ισομορφών σε προφορική όγκων και η επίδραση της στόχευσης Mcl-1L ισομορφή για χημειοευαισθησία από του στόματος καρκινικών κυττάρων.

Μέθοδοι

Η έκφραση του Mcl-1 isoforms- Mcl-1L, Mcl-1S & amp? Mcl-1ES αναλύθηκε σε 130 ζεύγη του στόματος όγκους και 9 του στόματος κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου & amp? πρωτεΐνης με κηλίδωση Western. Τα επίπεδα Mcl-1 mRNA συσχετίστηκαν με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και την έκβαση των ασθενών με καρκίνο του στόματος. Η επίδραση του Mcl-1L shRNA ή Obatoclax (ένα μικρό μόριο αναστολέα Mcl-1), σε συνδυασμό με σισπλατίνη για χημειοευαισθησία του στόματος καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε επίσης.

Αποτελέσματα

Anti-αποπτωτικά Mcl -1L ήταν εκφράζεται κυρίως, πέρα ​​από τη χαμηλή ή μη ανιχνεύσιμη προ-αποπτωτικών Mcl-1S και Mcl-1ES ισομορφές. Οι μεταγραφές Mcl-1L ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές και σε 64% του στόματος όγκων έναντι γειτονικών κανονικών (

P

& lt? 0,02). Σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος, υψηλή έκφραση Mcl-1L συσχετίστηκε σημαντικά με τον κόμβο θετικότητα (

P

= 0,021), η προηγμένη μέγεθος του όγκου (

P

= 0,013) και η κακή συνολική επιβίωση (

P

= 0,002). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε Mcl-1L είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για μορφές καρκίνου του στόματος (

P

= 0.037). Mcl-1L shRNA knockdown ή η αναστολή της από Obatoclax σε συνδυασμό με σισπλατίνη μειωμένη συνεργικά βιωσιμότητα και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του στόματος, είτε από μόνη της θεραπείας.

Συμπέρασμα

Οι μελέτες μας δείχνουν ότι η υπερέκφραση του Mcl-1L σχετίζεται με κακή πρόγνωση και χημειοαντίσταση σε μορφές καρκίνου του στόματος. MCL-1L είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας και ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος σε μορφές καρκίνου του στόματος

Παράθεση:. Palve V, Mallick S, Ghaisas G, Kannan S, Teni T (2014) Η υπερέκφραση του MCL-1L Splice παραλλαγή που συνδέονται με την κακή πρόγνωση και χημειοαντίσταση σε μορφές καρκίνου του στόματος. PLoS ONE 9 (11): e111927. doi: 10.1371 /journal.pone.0111927

Επιμέλεια: Kithiganahalli Ν Balaji, Ινδικό Ινστιτούτο Επιστημών, Μπανγκαλόρ, Ινδία

Ελήφθη: 9 Ιουνίου του 2014? Αποδεκτές: ένατης Οκτώβρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 19 Νοεμ, 2014

Copyright: © 2014 Palve et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στόματος είναι ο συχνότερος καρκίνος μεταξύ των ινδικών άνδρες και κατά κύριο λόγο σχετίζονται με τον καπνό για μάσημα συνήθεια που επικρατεί στη χώρα [1]. Παρά τις πρόσφατες προόδους στην τρόπους θεραπείας όπως η χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία /χημειοθεραπεία, η μακροπρόθεσμη επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στόματος δεν έχει αλλάξει σημαντικά. Οι παράγοντες που σχετίζονται με κακή πρόγνωση του καρκίνου του στόματος περιλαμβάνουν, παρουσίαση σε προχωρημένο κλινικό στάδιο & amp? ανεξέλεγκτη τοπική-περιοχική υποτροπή [2]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό για τη διαλεύκανση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του στόματος και να προσδιορίσουν μοριακούς στόχους για την καλύτερη διαχείριση της νόσου.

Στοματική καρκίνους έχουν επανειλημμένα συνδεθεί με αποπτωτικό απορύθμιση [3]. Οι προ και αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2 είναι οι κύριοι ρυθμιστές της κυτταρικής απόπτωσης και παίζουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής επιβίωσης [4]. Mcl-1 (μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων-1) είναι ένας σημαντικός αντι-αποπτωτικό μέλος της οικογενείας γονιδίου Bcl-2, που είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό [5]. Κυτταρική έκφραση του Mcl-1 ρυθμίζεται αυστηρά μέσω πολλαπλών μεταγραφικών και μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς [6]. Αυξημένη έκφραση Mcl-1 μπορεί να παράγει μέτρια βραχυπρόθεσμη βελτίωση της βιωσιμότητας σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών τύπων. Mcl-1 μπορεί να προάγει επιβίωση κυττάρου με καταστολή της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος-c από μιτοχόνδρια μέσω ετεροδιμερισμού και την εξουδετέρωση του τελεστή προ-αποπτωτικών ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες όπως Bak και Noxa [7]. Η υπερέκφραση του Mcl-1 έχει αναφερθεί σε μία ποικιλία κακοηθειών περιλαμβανομένων αιματοποιητικών, λεμφοειδή και στερεών όγκων [8], [9]. Η υπερέκφραση του Mcl-1 έχει συσχετισθεί με την επιθετική χαρακτηριστικά όγκου, αντίσταση στη θεραπεία και κακή πρόγνωση σε μαστού, στομάχου, ωοθηκών & amp? καρκίνων του τραχήλου [10] – [13]

Αν και το γονίδιο Mcl-1 έχει μελετηθεί εκτεταμένα σε πολλαπλό μυέλωμα και λευχαιμία, υπάρχουν σπάνιες αναφορές σχετικά με Mcl-1 ανάλυση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου.. Πρόσφατες μελέτες από το εργαστήριο μας έδειξαν σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Mcl-1 σε καρκίνο του στόματος κυτταρικές σειρές, προκαρκινικές αλλοιώσεις (OSF) και από του στόματος όγκων με ανοσοϊστοχημεία [14]. Έχουμε αποδείξει επίσης υψηλά PCNA και η έκφραση πρωτεΐνης Mcl-1 να συνδέεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος θεραπεία με οριστική ραδιοθεραπεία [15]. Ωστόσο, η κατάσταση είναι πολύπλοκη λόγω της ύπαρξης τριών διακριτών Mcl-1 ισομορφές που έχουν αντιθέσεις λειτουργίες δηλαδή αντι-αποπτωτικό Mcl-1L και προ-αποπτωτικών Mcl-1S & amp? MCL-1ES [16]. Είναι ενδιαφέρον ότι, το εργαστήριο μας έχει αναφερθεί πρόσφατα με τη σύνδεση των αντι-αποπτωτικών Mcl-1L ισομορφή με την επιβίωση και ραδιοαντοχή των κυττάρων του στόματος πλακώδους καρκινώματος [17].

Mcl-1 έχει επίσης αποδειχθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην χημειοαντίσταση του μια ποικιλία καρκίνων, αλλά ο ρόλος των ισομορφών της στην χημειοαντίσταση δεν έχει μελετηθεί σε καρκίνους συμπεριλαμβανομένων από του στόματος μορφών καρκίνου. Η ακτινοβολία ακολουθούμενη από χημειοθεραπεία είναι η κοινή τρόπος θεραπείας για τον καρκίνο του στόματος και Mcl-1 υπερέκφραση έχει δειχθεί ότι παρέχει αντίσταση σε συμβατικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα όπως η σισπλατίνη [18]. Πολλές αναφορές έχουν δείξει ότι Mcl-1 προάγει την επιβίωση των κυττάρων και τη στόχευση Mcl-1 μέσω BH3-μιμητικών μορίων μπορεί να επάγει κυτταρικό θάνατο σε Cisplatin ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα [19], [20]. Πρόσφατα, Obatoclax, ένα μιμητικό αναστολέας μικρό μόριο ΒΗ3 έχει αποδειχθεί ότι ανταγωνίζονται πρωτεΐνη Mcl-1 και Mcl ξεπεράσουν-1 διαμεσολαβείται αντίσταση στην απόπτωση [21], [22]. πρόσφατες μελέτες μας δείχνουν Mcl-1 είναι σημαντική για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του στόματος και ως εκ τούτου τη στόχευση Mcl-1 θα μπορούσε να είναι χρήσιμη στη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του στόματος. Ωστόσο, για το καλύτερο της γνώσης μας, οι μελέτες αυτές δεν είναι διαθέσιμες σε καρκίνο του στόματος. Η παρούσα μελέτη είχε ως εκ τούτου αναλάβει να αξιολογήσει την κλινική σημασία των Mcl-1 ισομορφών σε καρκίνο του στόματος και την αποτελεσματικότητα της στοχοθέτησης Mcl-1 έως chemosensitize τον καρκίνο του στόματος κύτταρα

in vitro

.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταροκαλλιέργειες

Επτά καρκίνο του στόματος κυτταρικών γραμμών SCC25, QLL1 (από Dr. Park, Yonsei University College of Medicine, την Κορέα [23] & amp? Δρ Rheinwald, Harvard Medical School, Boston [ ,,,0],24])? UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040 & amp? UPCI: SCC074 (Από Δρ S Gollin, University of Pittsburgh, PA) [25]? AW8507 & amp? AW13516 [26] χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Επιπλέον, μια απαθανάτισε εμβρύου στοματικού βλεννογόνου (FBM) [27] και ένα Dysplastic Προφορική κερατινοκυττάρων (DOK) (από το Δρ Ken Parkinson, της Ιατρικής Σχολής του Queen Mary του & amp? Οδοντιατρικής, Ηνωμένο Βασίλειο) [28] κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν επίσης στη μελέτη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ΜΕΜ ή IMDM συμπληρωμένο με 10% FBS & amp? 1% αντιβιοτικό πρότυπο μείγμα σε 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [23], [29].

Στοματική ιστούς

Αυτή η μελέτη ήταν εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Institutional Review του Memorial Κέντρου Tata και Sharad Pawar Dental College, Ινδία. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη. Θεραπεία αφελείς στοιχειώδη δείγματα από το στόμα του όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους ελήφθησαν από 130 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στο κεφάλι και στον αυχένα μονάδας και από την ICMR Εθνική Repository όγκου ιστών, Μνημείο Κέντρο Tata, Mumbai, Ινδία. Φλεγμονή ιστών του στόματος (n = 20) συλλέχθηκαν ως υγιείς φυσιολογικούς ιστούς από ασθενείς που υποβάλλονται σε ελάσσονες οδοντιατρική χειρουργική επέμβαση στο Τμήμα Στοματολογίας, Sharad Pawar Dental College, Βαρντχά, Ινδία. Όλες οι ιστοί καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση. Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά της κοόρτης που απεικονίζεται στον Πίνακα 1.

Η

απομόνωση RNA και PCR πραγματικού χρόνου

RNA από τα σφαιρίδια κυττάρου και ιστών εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRI (Sigma, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το RNA διαλύθηκε σε νερό επεξεργασμένο με DEPC και μολύνοντας DNA απομακρύνθηκε με κατεργασία DNaseI (Sigma, USA). ακεραιότητα του RNA αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση και τα δείγματα διατηρούνται στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση, όπως περιγράφεται προηγουμένως [17]. cDNA συντέθηκε με 500 ng ολικού RNA, χρησιμοποιώντας ένα κιτ σύνθεσης First Strand cDNA (ΜΒΙ Fermentas, Canada) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA στη συνέχεια υποβλήθηκε για ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας Taqman καθολικής PCR κύριο μείγμα (ΑΒΙ, 4304437) και 1-Mcl ισομορφή ειδικούς ανιχνευτές γονιδιακή έκφραση (ΑΒΙ,

Mcl-1L

: Hs00172036_m1?

Mcl -1δ

: Hs00766187_m1 & amp?

Mcl-1ES

: 4331348). Η ενίσχυση έγινε σε ΑΒΙ-7900HT πραγματικού χρόνου σύστημα PCR (Applied Biosystems, USA). GAPDH (ΑΒΙ, Hs99999905_m1) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την εξομάλυνση των μεταξύ διακύμανση δείγματος RNA εισόδου & amp? αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης. Όλες οι αντιδράσεις ενίσχυσης πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, χρησιμοποιώντας το επεξεργασμένο νερό DEPC ως αρνητικοί μάρτυρες. Η ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης έγινε με χρήση του Συγκριτικού C

μέθοδος T σχετικής ποσοτικοποίησης [30].

κηλίδωση Western

Οι πρωτεΐνες εκχυλίσθηκαν από τα σφαιρίδια κυττάρου και ιστούς όγκου όπως περιγράφεται νωρίτερα [14]. Εν συντομία, 30 mg κατεψυγμένου ιστού έγινε σκόνη σε θανάσιμο & amp? γουδοχέρι τη χρήση υγρού αζώτου, διαλύεται σε παγωμένο Αντιδραστήριο Λύσης ProteoJET κυττάρων θηλαστικών που περιέχουν ProteoBlock Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης (Fermentas, USA) και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους επί πάγου. Τα προϊόντα λύσης ιστού ή κυττάρου διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στις 14.000 rpm στους 4 ° C. Η εκτίμηση πρωτεΐνη διεξήχθη με την μέθοδο Bradford. Τα προϊόντα λύσης ιστού /κυττάρου (30-50 μα) διαχωρίστηκαν επί 12% πηκτών SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBS για 2 ώρες. και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι Mcl-1L (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, USA). Οι μεμβράνες απομακρύνθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται με κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι β-ακτίνης (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, USA) ως έλεγχος φόρτωσης. Δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν υπεροξειδάση χράνου συζευγμένη IgG (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, USA). Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με ενισχυμένη κιτ χημειοφωταύγειας (GE Healthcare, ΗΠΑ). ανάλυση πυκνομετρία αναπτυχθεί φιλμ ακτίνων Χ εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (ΝΙΗ, Bethesda, MD).

Mcl-1L knockdown

Η έκφραση των Mcl-1L ήταν μειωτικά με κλωνοποίηση Mcl-1L shRNA κασέτα σε σύστημα λεντοϊού pTRIPZ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems, USA). Ένα μη-αλληλουχία στόχευσης ολιγονουκλεοτίδιο κλωνοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα ιικά σωματίδια παρήχθησαν με συν-επιμόλυνση των ανασυνδυασμένων κατασκευασμάτων Mcl-1LshRNA-pTRIPZ και συσκευασίας πλασμιδίων σε κύτταρα HEK293FT. Περαιτέρω, τρεις καρκίνο του στόματος κυτταρικές σειρές δηλαδή AW8507, UPCI: SCC029B & amp? UPCI: SCC040 υπέστησαν μεταγωγή και η σταθερή επιλογή έγινε χρησιμοποιώντας δείκτη επιλογής πουρομυκίνης. Η έκφραση για shRNA προκλήθηκε με δοξυκυκλίνη και μετά 72 ώρες. της θεραπείας, τα επίπεδα του Mcl-1L αξιολογήθηκαν από qRT-PCR και κηλίδωση Western. Η συγκεκριμένη αποσιώπηση των Mcl-1L επιβεβαιώθηκε σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

κυτταρικός θάνατος από ΡΙ χρώση

PI (ιωδιούχο προπίδιο, Santa Cruz Biotechnology, CA) χρώση έγινε για την ανίχνευση των κυττάρων το θάνατο των τριών καρκίνο του στόματος κυτταρικές σειρές (AW8507, UPCI: SCC029B & amp? UPCI: SCC040) μετά από διαφορετικούς συνδυασμούς θεραπείας. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, υποβάλετε διαφορετικές επεξεργασίες όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και προστέθηκαν 10 μΐ ΡΙ. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 2 λεπτά σε σκοτάδι και αναλύθηκε στα 488 nm, σε ένα κυτταρόμετρο ροής (FACS Caliber, BD, ΗΠΑ).

ΜΤΤ δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 2000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων που περιέχουν ϋΜΕΜ με 10% FBS. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης (0,025 έως 10,0 μg /ml) (ΜΡ Biomedicals, Ινδία) ή Obatoclax (0, 1,0-10,0 ηΜ) (Σέλεκ Chem USA). Οι ανασταλτικές συγκεντρώσεις 50% (IC50) για Cisplatin και Obatoclax υπολογίστηκαν από τις καμπύλες επιβίωσης για όλες τις κυτταρικές γραμμές. DMSO που περιέχουν μέσο υπηρέτησε ως το αντίστοιχο έλεγχο. Μετά την επώαση των κυττάρων με Obatoclax ή /και σισπλατίνης για 72 ώρες, η κυτταρική ανάπτυξη εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Sigma, USA). Εν συντομία, το εξαντλημένο μέσο απομακρύνθηκε και 50 μΙ διαλύματος ΜΤΤ (1 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C σε CO

2 επωαστήρα και κρυστάλλων φορμαζάνης σε βιώσιμα κύτταρα διαλύθηκαν με τη χρήση διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO, 100 μΐ ανά φρεάτιο). Η πλάκα ανακινήθηκε επί ελλειπτικής τροχιάς ανακινητή για 10 λεπτά και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας μήκος κύματος αναφοράς 690 nm επί αναγνώστη μικροπλάκας (Spectramax, USA). Πέντε φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε συγκέντρωση φαρμάκου, και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Σε ένα άλλο πείραμα, για να αξιολογηθεί κατά πόσο ο συνδυασμός των θεραπειών θα επιτύχουν υψηλότερη αναστολή της ανάπτυξης από την ατομική αγωγή, τον καρκίνο του στόματος κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δοξυκυκλίνη να knockdown Mcl-1 έκφραση ή Obatoclax (5 ηΜ) για την αναστολή της δραστηριότητας Mcl-1, ακολουθούμενη από σισπλατίνη σε συγκέντρωση χαμηλότερη από τη δόση IC50. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν

Trypan blue δοκιμασία & amp.? Ομοεστιακή Μικροσκοπία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

4 ανά φρεάτιο. Η έκφραση Mcl-1 είχε ως στόχο είτε με δοξυκυκλίνη ή Obatoclax αγωγές ή σε συνδυασμό με σισπλατίνη, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα trypsinzed μετά από 48 ώρες. της θεραπείας και trypan blue διεξήχθη (0,4%) χρώση. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο και σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η απεικόνιση των κυττάρων μετά από διάφορες θεραπείες διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο με Browser LSM Εικόνα 4.2 του λογισμικού (Carl Zeiss, USA).

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας μια έκδοση με άδεια της πακέτο λογισμικού SPSS 15.0. Να συσχετίζονται στατιστικά την έκφραση των Mcl-1 ισομορφών με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους, τα δεδομένα διαχωρίστηκαν μεταξύ τους σε δύο ομάδες και συγκεκριμένα: την Mcl-1 ισομορφή υψηλή εκφραστές και χαμηλή εκφραστές. Για σύγκριση, η έκφραση του Mcl-1 ισομορφών σε υγιή φυσιολογικά άτομα και ιστολογικά φυσιολογικό παρακείμενους ιστούς σημαίνει χρησιμοποιήθηκαν. Η συσχέτιση μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους (φύλο, ηλικία, περιοχή, τις συνήθειες, το μέγεθος, ο κόμβος, μετάσταση, υποτροπή) έγινε χρησιμοποιώντας το τεστ πλατεία Chi (χ

2). Καμπύλες κατά Kaplan Meier χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της συνολικής επιβίωσης και η διαφορά στο πλαίσιο των ομάδων υπολογίστηκε με log rank test σημασία. Τα προγνωστικά παράμετροι στην μονοπαραγοντική ανάλυση ενσωματώθηκαν σε πολυπαραγοντική ανάλυση με τη χρήση της δοκιμής αναλογικών κινδύνων του Cox για να εντοπίσει τους παράγοντες που ήταν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες της επιβίωσης. Το λογισμικό Graphpad Prism5 χρησιμοποιήθηκε για να σχεδιάσει γραφήματα και τα δεδομένα των δύο παρόμοιες & amp? ανόμοιες ομάδες αναλύθηκαν στατιστικά με Student-t test & amp? δοκιμασία Mann Whitney. Η διακύμανση μεταξύ των μέσων τιμών των ομάδων αναλύθηκε με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης δοκιμής (ANOVA). Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD. Η τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η έκφραση των Mcl-1 ισομορφών σε προφορική κυτταρικές σειρές

ανάλυση qRT-PCR αποκάλυψε, κυρίαρχη υψηλή έκφραση. αντι-αποπτωτικών ισομορφή Mcl-1L πάνω από χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα προ-αποπτωτικών Mcl-1S και Mcl-1ES έκφρασης σε όλες τις προφορικές κυτταρικές σειρές (Figure1a). Mcl-1L βρέθηκε να υπερεκφράζεται σημαντικά τόσο σε mRNA & amp? πρωτεϊνικό επίπεδο σε όλες τις επτά στόματος καρκινικές κυτταρικές σειρές (SCC25, UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040, UPCI: SCC074, QLL1, AW8507 και AW13516) σε σύγκριση με την κανονική αθανατοποιημένα FBM & amp? DOK κυτταρική σειρά δυσπλαστικά (Σχήμα 1)

(α) Έκφραση των Mcl-1L & amp.? MCL-1S mRNA σε προφορική κυτταρικές σειρές? Mcl-1 επίπεδα ES ήταν μη ανιχνεύσιμες (* P≤0.03) (β) έκφραση MCL-1L πρωτεΐνης σε προφορική κυτταρικές σειρές.

Η

Η έκφραση των Mcl-1 ισομορφών σε προφορική ιστούς

qRT-PCR ανάλυση έδειξε σημαντική (p≤0.02) υψηλή έκφραση του Mcl 1L-mRNA σε 64% (84/130) των από του στόματος όγκους διαφορετικών υπο-θέσεις σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό (Εικόνα 2a). Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ της έκφρασης Mcl-1L από όγκους των διαφορετικών υπο-θέσεις. Η σχετική έκφραση των Mcl-1L ισομορφή ~ 5 φορές υψηλότερη από ό, τι Mcl-1S και ~ 10 φορές υψηλότερη για να Mcl-1ES ισομορφή σε από του στόματος όγκους (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Παρομοίως, ανάλυση στυπώματος western έδειξε υψηλή έκφραση πρωτεΐνης Mcl-1L σε από του στόματος όγκους έναντι γειτονικών κανονικών ιστών (Σχήμα 2Β).

(α) Έκφραση του Mcl 1L-mRNA σε φυσιολογικούς vs. όγκους διαφορετικών υπο-θέσεις του στόματος (* P≤0.02)? (Β) η έκφραση Mcl-1L πρωτεΐνης σε γειτονικό φυσιολογικό έναντι όγκων

Η

Συσχέτιση των Mcl-1 έκφρασης με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων & amp.? έκβαση

Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε σημαντική συσχέτιση της υψηλής έκφρασης Mcl-1L με κόμβο θετικότητα (p = 0,021) και προχωρημένους όγκους (p = 0,013). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των Mcl-1 ισομορφών και το φύλο, την ηλικία, το κάπνισμα /συνήθειες αλκοόλ, πρωταρχική θέση & amp? διαφοροποίηση των ασθενών με καρκίνο του στόματος (Πίνακας 2). Αξίζει να σημειωθεί ότι, χαμηλή έκφραση των προ-αποπτωτικών Mcl-1S ισομορφή έδειξε μια τάση προς θετική σημασία με ελάχιστα διαφοροποιημένα καρκινώματα (p = 0,053).

Η

Συσχέτιση των Mcl-1 έκφρασης με τη συνολική επιβίωση

Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier της χαμηλής και υψηλής εκφραστές των Mcl-1L έδειξαν στατιστικά σημαντική διαφορά (p = 0,002). Οι ασθενείς που εκφράζουν υψηλά αντι-αποπτωτικό Mcl-1L επέδειξε κακή συνολική επιβίωση έναντι εκείνων που εκφράζουν χαμηλά Mcl-1L (Εικόνα 3α). Αντιστρόφως, οι ασθενείς που εκφράζουν υψηλά προ-αποπτωτικά Mcl-1S εμφάνισαν σημαντικά καλύτερη συνολική επιβίωση (ρ = 0,051) σε σύγκριση με εκείνα που έχουν χαμηλή Mcl-1S (σχήμα 3β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η σχετική αναλογία του Mcl-1L /Mcl-1S παρουσίασαν επίσης θετική συσχέτιση (p = 0,006) με το φτωχό συνολική επιβίωση των ασθενών καρκίνο του στόματος (Εικόνα 3c). Επιπλέον, η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε επίσης κακή συνολική επιβίωση στον κόμβο θετικά έναντι των ασθενών κόμβο αρνητικό καρκίνο του στόματος (p = 0,003). Οι άλλες παράμετροι όπως η ηλικία, το κάπνισμα /συνήθειες και διαφοροποίηση αλκοόλ δεν επηρέασε σημαντικά τη συνολική επιβίωση των ασθενών αυτών.

εκτιμήσεων (ac) Kaplan-Meier για τη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στόματος με χαμηλή ή υψηλή έκφραση του Mcl- 1 ισομορφές? (Δ) Η πολυπαραγοντική ανάλυση των ασθενών με καρκίνο του στόματος

Η

Η πολυπαραγοντική ανάλυση

Μεταξύ των δύο ισομορφές (Mcl-1L & amp? Mcl-1S). Αναλυθεί, theMcl-1L έκφραση επηρέασε τη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στόματος. Η μεταβλητή Mcl-1L, τα οποία είχαν προκύψει σημαντικά στην μονοπαραγοντική ανάλυση, εξετάστηκε με χρήση του μοντέλου παλινδρόμησης Cox στην πολυπαραγοντική ανάλυση (Figure3d). Οι ασθενείς που εκφράζουν υψηλά Mcl-1L παρουσίασαν μικρότερη συνολική επιβίωση και αυξημένο κίνδυνο 3,2 ώρα της κακή επιβίωση σε σύγκριση με εκείνους που εκφράζουν χαμηλά Mcl-1L (p = 0.037). Αυτό σημαίνει ότι οι Mcl-1L είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τον καρκίνο του στόματος

shRNA μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση των Mcl-1L

Στις τρεις καρκίνο του στόματος κυτταρικές σειρές (AW8507, UPCI:. SCC040 & amp? UPCI: SCC029B) μετάγονται με Mcl-1L shRNA-pTRIPZ λεντοϊού σωματίδια, η έκφραση Mcl-1L ήταν μειωτικά με επιτυχία τη θεραπεία μετά τη δοξυκυκλίνη. Τα φρεάτια ελέγχου αντιπροσωπεύουν τα κύτταρα χωρίς θεραπεία με δοξυκυκλίνη. Η ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και ανάλυση στυπώματος western επιβεβαίωσε την προς τα κάτω ρύθμιση του Mcl-1L σε επίπεδα τόσο mRNA και της πρωτεΐνης, σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του τρία (Σχήμα 4). Ωστόσο, τα επίπεδα του Mcl-1 S & amp? MCL-1ES παρέμεινε αμετάβλητη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

(α & amp? Β). ShRNA μεσολάβηση κάτω ρύθμιση της MCL 1L-mRNA & amp? πρωτεΐνης σε AW8507, UPCI: SCC040 & amp? SCCC29B καρκίνο του στόματος κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Επίδραση του Mcl-1L knockdown & amp?. /Ή Σισπλατίνη επί του κυτταρικού θανάτου

Η επαγωγή του κυτταρικού θανάτου αναλύθηκε με χρώση ΡΙ ακολουθούμενη με ανάλυση FACS στις τρεις στόματος καρκινικές κυτταρικές σειρές (AW8507, UPCI: SCC040 & amp? UPCI: SCC029B) μετά διαφορετικές θεραπείες όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Η shRNA μεσολάβηση knockdown του εκφράζεται σε αφθονία ισομορφής Mcl-1L ή θεραπεία Cisplatin αποκάλυψε επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Το κυτταρικό θάνατο που επάγεται στο AW8507, UPCI: SCC040 & amp? UPCI: SCC29B, μετά Mcl-1L νοκ ντάουν ήταν 31% (SD 2,5), 27% (SD 1,5) και 24% (SD 3,5) ή μετά Cisplatin θεραπεία ήταν 50% (SD 2,1), 42% (SD 2,7), και 46% (SD 3,1) αντίστοιχα. Επιπλέον, shRNA μεσολάβηση Mcl-1L knockdown ακολουθούμενη από κατεργασία Cisplatin μαζί έδειξε 78% (SD, 1.2), 71% (SD 1,8) και 82% (SD 2,0) του κυτταρικού θανάτου, αντιστοίχως. Οι συνδυασμένες θεραπείες των Mcl-1L knockdown και Cisplatin έδειξε στατιστικά σημαντική (ρ & lt? 0,05) διαφορά στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε σύγκριση με άλλες θεραπείες μόνο του (Σχήμα 5b), έτσι, υποδηλώνοντας μια συνεργική δράση των συνδυασμένων θεραπειών επί του κυτταρικού θανάτου.

Η

Επίδραση του ΒΗ3 μιμητικής Obatoclax ή /και Cisplatin στη βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάπτυξη

Το σχήμα 6α απεικονίζει αντιπροσωπευτικό εικόνες ομοεστιακό μικροσκόπιο των κυττάρων AW8507 θεραπεία με σισπλατίνη ή /και Obatoclax. Είναι ενδιαφέρον ότι οι συνδυασμένες θεραπείες της Obatoclax & amp? Η σισπλατίνη έδειξε αυξημένη κυτταρικό θάνατο, σε σύγκριση με μεμονωμένες θεραπείες. Επιπλέον, το μπλε τρυπάνης δοκιμασία αποκλεισμού χρώσης εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί η επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου στη στοματική καρκινικές κυτταρικές σειρές (AW8507, UPCI: SCC040 & amp? UPCI: SCC029B) μετά από διαφορετικές επεξεργασίες. Συγκεκριμένα, ο ΒΗ3 μιμητικό Obatoclax ή Cisplatin θα μπορούσε να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων με επιτυχία σε όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου. Επιπλέον, ο συνδυασμός του Obatoclax και Cisplatin μαζί σημαντικά (ρ & lt? 0,05) μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα σε σύγκριση με άλλες θεραπείες και μόνο. Η συνδυασμένη θεραπεία του Obatoclax & amp? Η σισπλατίνη παρουσίασαν 3-7 φορές μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε σύγκριση με τα επιμέρους θεραπείες (Σχήμα 6β). Επιπλέον, η δοκιμασία πολλαπλασιασμού ΜΤΤ αποκάλυψε επίσης μια σημαντική (ρ & lt? 0,05) μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων (2-4 φορές) μετά συνδυασμένη αγωγή σισπλατίνης και Obatoclax σε σύγκριση με μόνη είτε αγωγές (Σχήμα 6γ) έτσι, υποδηλώνοντας μια συνεργική δράση των . συνδυασμένη θεραπεία για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάπτυξη των στοματικών καρκινικών κυττάρων

(α) Ομοεστιακή μικροσκοπική εκπρόσωπος εικόνες των κυττάρων AW8507 δημοσιεύσετε διαφορετικές θεραπείες? (Β) Αξιολόγηση των εκατό κυτταρικής βιωσιμότητας του στόματος καρκινικών κυττάρων δημοσιεύσετε διαφορετικές θεραπείες με trypan δοκιμασία μπλε χρωστική αποκλεισμού (* P & lt? 0,05, έναντι ατομικών θεραπειών)? (Γ) Ανάλυση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του στόματος μετά διαφορετικές θεραπείες με δοκιμασία ΜΤΤ. (* P & lt? 0,05, έναντι ατομικών θεραπειών).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την έκφραση των Mcl-1 ισομορφών (Mcl-1L, Mcl-1S & amp? Mcl-1ES) σε προφορική όγκους έναντι των φυσιολογικών ιστών, προκειμένου να διαπιστωθεί αν θα είναι χρήσιμοι ως προγνωστικοί δείκτες σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος. Μέχρι στιγμής, υπάρχουν περιορισμένες διαθέσιμες πληροφορίες σχετικά με το ρόλο των Mcl-1 ισομορφών σε παθογένεση του καρκίνου του στόματος. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που συσχετίζει την έκφραση των τριών Mcl-1 ισομορφών με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων των ασθενών με καρκίνο του στόματος. Η μελέτη μας δείχνει σημαντική υψηλή έκφραση των αντι-αποπτωτικών Mcl-1L στην πλειονότητά της από του στόματος καρκινικών κυτταρικών σειρών και όγκων (64%) σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυσιολογικά. Μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι η υψηλή έκφραση Mcl-1L συσχετίστηκε σημαντικά με την κακή έκβαση των ασθενών με καρκίνο του στόματος. Περαιτέρω, με στόχο Mcl-1L από shRNA ή Obatoclax σε συνδυασμό με σισπλατίνη θα μπορούσε συνεργικά προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε προφορική καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, η υπερέκφραση του Mcl-1L μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό μηχανισμό που συμβάλλουν στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του στόματος, συμβάλλοντας έτσι στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του στόματος.

Η απορύθμιση των γονιδίων που ρυθμίζουν την απόπτωση έχει αναφερθεί ότι διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των διαφόρων ανθρώπινων κακοηθειών. Το αντι-αποπτωτικό Mcl-1 είναι ένα σημαντικό μέλος της απόπτωσης που ρυθμίζουν οικογένειας Bcl-2 και έχει αποδειχθεί ότι υπερεκφράζεται σε ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων, του τραχήλου της μήτρας, των ωοθηκών, του παγκρέατος, του ηπατοκυτταρικού, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνους των όρχεων γεννητικών κυττάρων και μελανωμάτων [8]. Αξίζει να σημειωθεί ότι η παρούσα μελέτη, για πρώτη φορά καταδεικνύει υπερέκφραση της παραλλαγής ματίσματος Mcl-1L στη στοματική καρκινικές κυτταρικές σειρές & amp? πλειονότητα των στοματικών όγκων έναντι των φυσιολογικών ιστών. Υπάρχει μόνο μία έκθεση στην οποία αναλύονται Mcl-1 ισομορφών & amp? κλινική σημασία τους μέχρι τώρα, με σαφή νεφρική καρκινώματα κυττάρων [31]. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματά μας, η μελέτη αυτή όμως αποδεικνύεται μια ένωση χαμηλή έκφραση Mcl-1L με επιθετικό φαινότυπο σε σαφή νεφρική καρκινώματα κυττάρων. Επίσης, δεν υπάρχει διαθέσιμο στην έκφραση των Mcl-1 ισομορφών σε στοματικών καρκίνων πληροφορίες. Στην παρούσα μελέτη, ο συσχετισμός των Mcl-1 ισομορφών και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων των ασθενών με καρκίνο του στόματος, αποκάλυψε σημαντική συσχέτιση της παραλλαγής ματίσματος Mcl-1L με προχωρημένη το μέγεθος του όγκου (ρ = 0,013) και λεμφαδένα θετικότητα (p = 0.021). ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier της χαμηλής έναντι υψηλής εκφραστές των Mcl 1L-mRNA έδειξε ότι η υψηλή έκφραση Mcl-1L ήταν σημαντικά σχετίζονται με την κακή συνολική επιβίωση (p = 0,002). Όπως παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη για Mcl-1 ισομορφές, υψηλή έκφραση της πρωτεΐνης Mcl-1 και η σύνδεσή της με κακή πρόγνωση έχει αποδειχθεί σε τραχήλου της μήτρας, του στομάχου, του πνεύμονα και των ωοθηκών [11] – [13], [32]. Ωστόσο, μια προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας δεν μπορούσε να βρει το παραπάνω συνεταιρίζεσθαι σε επίπεδο πρωτεΐνης Mcl-1 [14]. Η παρούσα μελέτη έγινε για να διαφωτίσει το προφίλ έκφρασης του Mcl-1 ισομορφών σε από του στόματος κυτταρικές σειρές και μια μεγάλη ομάδα των όγκων, η οποία κατέδειξε την ένωση της έκφρασης αντι-αποπτωτικό Mcl-1L με πρόγνωση στον καρκίνο του στόματος. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αποδεικνύει την συσχέτιση της παραλλαγής ματίσματος Mcl-1L με έκβαση των ασθενών καρκίνο του στόματος και Mcl-1L ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για στοματική καρκίνους.

Mcl-1 ρυθμίζεται αυστηρά στο μεταγραφικό, μετά την μεταγραφικές και μεταφραστικές επίπεδα [6] και ο ακριβής μηχανισμός του Mcl-1 υπερέκφραση σε από του στόματος καρκίνους δεν είναι γνωστή. Η προ-αποπτωτικά Mcl-1S & amp? ισομορφές Mcl-1ES εκφράστηκαν σε χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα σε σύγκριση με την εκφράζεται κυρίως Mcl-1L και δεν σχετίζεται με την κλινικοπαθολογικών παραμέτρων των ασθενών με καρκίνο του στόματος. Ειδικότερα, οι σύντομες προ-αποπτωτικά Mcl-1S συνδέεται μόνο προς Mcl-1L πιθανώς εξουδετερωτικών αντι-αποπτωτική λειτουργία του [33]. Επιπλέον, η πρόσφατα εντοπιστεί προ-αποπτωτικά Mcl-1ES ισομορφή μπορεί επίσης να δεσμεύουν και εξουδετερώνουν την αντι-αποπτωτική λειτουργία του πλήρους μήκους Mcl-1L ισομορφή, αν και εκφράζεται σε πολύ χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα. Ως εκ τούτου, ανέλυσε τις σχετικές αναλογίες των Mcl-1L /Mcl-1S ισομορφές, η οποία αποκάλυψε μια σημαντική θετική συσχέτιση με την κακή συνολική επιβίωση των ασθενών, υποδηλώνοντας ότι η χαμηλή έκφραση του Mcl-1 S & amp? Mcl-1ES σε στοματικών καρκίνων είναι πιθανώς ανεπαρκής για να εξουδετερώσει πλήρως την υψηλή έκφραση των αντι-αποπτωτικών Mcl-1L ισομορφή. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη ποσοτικοποίηση της έκφρασης των τριών Mcl-1 ισομορφών και η συσχέτισή τους με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων & amp? έκβαση των ασθενών με καρκίνο του στόματος. Τα ευρήματά μας υποστηρίζεται επίσης από τις προηγούμενες εκθέσεις του στομάχου και του τραχήλου της μήτρας που αποδεικνύουν τη σχέση μεταξύ της υψηλής πρωτεϊνικής έκφρασης Mcl-1 με το μέγεθος του όγκου, η ιστολογική βαθμό, τη συμμετοχή των λεμφαδένων, μετάσταση & amp? κακή κλινική έκβαση [11], [34]. Επιπλέον, η προγνωστική σημασία της υψηλής έκφρασης πρωτεΐνης Mcl-1 έχει επίσης αποδειχθεί σε μαστού, των ωοθηκών, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και αρκετές αιματολογικές κακοήθειες [10], [13], [35].

Mcl -1 υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία ανθρώπινων κακοηθειών και προτείνεται να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος [8]. Mcl-1 υπερέκφραση φαίνεται επίσης να είναι ένας βασικός παράγοντας για την αντίσταση των διαφόρων τύπων καρκίνου στις συμβατικές θεραπείες, συμπεριλαμβανομένης της ακτινοβολίας και χημειοθεραπείας. Η ρύθμιση προς τα κάτω του Mcl-1 έχει αποδειχθεί ότι ευαισθητοποιεί τα κύτταρα νευροβλαστώματος στην κυτταροτοξική χημειοθεραπεία και ανθεκτικά κύτταρα μελανώματος σε Fas απόπτωση [36], [37]. Επιπλέον, στην παρούσα μελέτη μας, shRNA μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση των Mcl-1L έχει αποδειχθεί ότι chemosensitize τον καρκίνο του στόματος κύτταρα (AW8507, UPCI: SCC040 & amp? UPCI: SCC029B) να Cisplatin δείχνει έναν κρίσιμο ρόλο για Mcl-1 στην αντίσταση θεραπεία σε μορφές καρκίνου του στόματος . Μελέτες στόχευσης Mcl-1 μέσω αντινόημα θεραπεία έχουν δείξει επίσης να chemosensitize ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυττάρων

in vitro

[38], [39]. Αν και η μελέτη μας δείχνει εξάντληση της έκφρασης Mcl-1L από 90% έως 20% κατά shRNA (Σχήμα 4Α) ένα ελάχιστο κυτταρικό θάνατο (25%) παρατηρήθηκε. Αυτό υποδηλώνει ότι εκτός Mcl-1 μπορεί να υπάρχουν και άλλοι παράγοντες που συμβάλλουν στην επιβίωση των κυττάρων μετά την Cisplatin θεραπεία. Αρκετές άλλες μελέτες έχουν επίσης αναφέρει πρωτεΐνες όπως Σουρβιβίνη [40], Oct4 & amp? Nanog [41], MUC4 [42], γραμματέας Kin17 [43], κλπ παίζουν σημαντικό ρόλο στην χημειοαντίσταση των κυττάρων από το στόμα πλακώδους καρκινώματος. Ωστόσο, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που συσχετίζει τη σύνδεση της παραλλαγής συρραφής Mcl-1L με χημειοαντίσταση του καρκίνου του στόματος.

Πρόσφατες μελέτες από το εργαστήριο μας έχουν δείξει ένα ρόλο για Mcl-1L ισομορφή σε ραδιοαντοχή των κυττάρων από το στόμα πλακώδους καρκινώματος και ως προγνωστικός παράγοντας για την πρόβλεψη της ελεύθερης νόσου επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στόματος θεραπεία με οριστική ακτινοθεραπεία. [15], [17]. Ως εκ τούτου, η εξάντληση των Mcl-1 φαίνεται να είναι μια προϋπόθεση για ραδιο /χημειο ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν πρωτεΐνη Mcl-1, για την προώθηση της απόπτωσης. Αρκετές προσπάθειες έχουν γίνει για να στοχεύουν τα αντι-αποπτωτικά οικογένεια Bcl-2 πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων Mcl-1 σε όγκους χρησιμοποιώντας μία ποικιλία αναστολέων. Μεταξύ αυτών, η πιο πολλά υποσχόμενη αναστολέας, ένα ΒΗ3 μιμητικό ΑΒΤ-737 δεν κατόρθωσε να ξεπεράσει την αντίσταση λόγω Mcl-1 υπερέκφραση. Περαιτέρω μελέτες δείχνουν ότι, Mcl-1 ρύθμιση προς τα κάτω και μόνο μπορεί να ενισχύσει ΑΒΤ-737 θνησιμότητα σε κύτταρα λευχαιμίας [44]. Στην παρούσα μελέτη ένα τηγάνι Bcl-2 αναστολέα μικρού μορίου, Obatoclax (GX15-070), η οποία είναι γνωστό ότι ανταγωνίζεται Mcl-1 και Mcl ξεπεράσουν-1 αντίσταση που προκαλείται στην απόπτωση χρησιμοποιήθηκε [21]. Obatoclax έχει δειχθεί ότι απομονώνουν αντι-αποπτωτικών Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών και up-ρυθμίζουν την έκφραση του Puma, Noxa & amp? Bim οποία περαιτέρω επαγόμενη απόπτωση σε νεοπλασματικά μαστοκύτταρα [45].