Αφηρημένο

Ex vivo

-επεκταθούν, αλλογενή φυσικό κύτταρα φονείς (ΝΚ) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου. Σε αλλογενών θεραπεία κυττάρων ΝΚ, κύτταρα ΝΚ από υγιείς δότες πρέπει να επεκταθεί, ώστε να ληφθεί ένας επαρκής αριθμός υψηλής καθαρότητας, ενεργοποιημένα ΝΚ κύτταρα. Στην παρούσα μελέτη, ιδρύσαμε μια απλοποιημένη και αποτελεσματική μέθοδο για την επέκταση μεγάλης κλίμακας και την ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων από υγιείς δότες υπό την ορθή παρασκευαστική πρακτική (GMP) συνθήκες. Μετά από ένα μοναδικό στάδιο των μαγνητικών εξάντληση του CD3

+ Τ κύτταρα, τα εξαντλημένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) διεγέρθηκαν και επεκτάθηκαν με ακτινοβολημένα αυτόλογα PBMCs υπό την παρουσία ΟΚΤ3 και IL-2 για 14 ημέρες, με αποτέλεσμα ένα εξαιρετικά καθαρού πληθυσμού των CD3

-CD16

+ CD56

+ ΝΚ κύτταρα, τα οποία είναι επιθυμητή για αλλογενή σκοπό. Σε σύγκριση με πρόσφατα απομονωμένα κύτταρα ΝΚ, αυτά επεκτάθηκαν ΝΚ κύτταρα έδειξαν εύρωστη παραγωγή κυτοκίνης και ισχυρή δραστικότητα έναντι διαφόρων κυτταρολυτική καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Αξίζει να σημειωθεί, επεκτάθηκε ΝΚ κύτταρα θανατώνονται επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα χωρίς να αποδείξει κυτταροτοξικότητα έναντι αλλογενή μη καρκινικών κυττάρων σε προσδιορισμούς συγκαλλιέργειας. Η δραστικότητα κατά του όγκου του διογκωμένου ανθρώπινων κυττάρων ΝΚ εξετάστηκε σε ποντίκια SCID εγχύθηκαν με ανθρώπινα κύτταρα λεμφώματος. Σε αυτό το μοντέλο, επεκτάθηκε ΝΚ κύτταρα ελέγχονται αποτελεσματικά εξέλιξης λεμφώματος. Εν κατακλείδι, αλλογενή ΝΚ κύτταρα αποτελεσματικά επεκτάθηκαν σε ένα GMP-συμβατό εγκατάσταση και απέδειξαν ισχυρή δράση κατά των όγκων και

in vitro

και

in vivo

Η

Παράθεση:. Lim O, Lee Υ, Chung Η, JH της, Kang SM, Jung μου, et al. (2013) GMP-Compliant, μεγάλης κλίμακας Διευρυμένη αλλογενή Φυσικών Killer έχει ισχυρή κυτταρολυτική δράση κατά των κυττάρων του καρκίνου

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 8 (1): e53611. doi: 10.1371 /journal.pone.0053611

Επιμέλεια: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Δημόσια de la Santé (CRP-Santé), το Λουξεμβούργο

Ελήφθη: 3 Σεπτεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 29, Νοεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Lim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση του ενισχυτή Κορέα Υγειονομική περίθαλψη τεχνολογίας Ε &? D Έργου, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας & amp? Οικογενειακών Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας (A062260). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Eui-Cheol Shin είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE, και καταλαβαίνει ότι αυτό δεν δεν μεταβάλλουν την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: MJ και HS απασχολούνται σε Green Cross LabCell Corp. Mogam Βιοτεχνολογίας Ινστιτούτο Έρευνας είναι ένα ερευνητικό ίδρυμα μη κερδοσκοπικού χαρακτήρα. Αριθμός διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας: KR2008-74069. Ημερομηνία ευρεσιτεχνίας Εκδόθηκε: 28 Μαρτίου 2012. Τίτλος του διπλώματος ευρεσιτεχνίας: η μέθοδος ανάπτυξης για τα φυσικά κύτταρα δολοφόνων. Εκδοχέα: Green Cross LabCell Corp. και τη Σεούλ Εθνικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο. Εφευρέτης: Mi-νεαρό Jung, Dae Seog HEO, και Yu Kyeong Hwang. Αριθμός διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας: JP2011-521023. Ημερομηνία διπλώματος ευρεσιτεχνίας που κατατίθεται: 31 Ιανουαρίου 2011. Τίτλος του διπλώματος ευρεσιτεχνίας: η μέθοδος ανάπτυξης για τα φυσικά κύτταρα δολοφόνων. Εκδοχέα: Green Cross LabCell Corp. και τη Σεούλ Εθνικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο. Εφευρέτης: Mi-νεαρό Jung, Dae Seog HEO, και Yu Kyeong Hwang. Αριθμός διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας: CN200980130121.5. Ημερομηνία διπλώματος ευρεσιτεχνίας που κατατίθεται: 30 Ιανουαρίου 2011. Τίτλος του διπλώματος ευρεσιτεχνίας: η μέθοδος ανάπτυξης για τα φυσικά κύτταρα δολοφόνων. Εκδοχέα: Green Cross LabCell Corp. και τη Σεούλ Εθνικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο. Εφευρέτης: Mi-νεαρό Jung, Dae Seog HEO, και Yu Kyeong Hwang. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι άλλοι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν καμία σύγκρουση συμφερόντων.

Εισαγωγή

Φυσικό φονείς (ΝΚ) κύτταρα είναι εξειδικευμένα λεμφοκύτταρα που παρέχουν μια πρώτη γραμμή άμυνας κατά των ιογενών λοιμώξεων και του καρκίνου [1]. δραστικότητα των ΝΚ κυττάρων ρυθμίζεται από τα σήματα από την ενεργοποίηση και ανασταλτικών υποδοχέων [2]. Το σήμα ενεργοποίησης ΝΚ διαμεσολαβείται από διάφορους υποδοχείς ΝΚ συμπεριλαμβανομένων NKG2D και των φυσικών υποδοχέων κυτταροτοξικότητα (ΕΚΕΦΕ) [2], [3]. Σε αντίθεση, η αναστολή ΝΚ προσδίδεται από φονικών κυττάρων που μοιάζουν με ανοσοσφαιρίνη υποδοχέων (ΚΙΚ), τα οποία δεσμεύονται σε μόρια MHC τάξης Ι σε κύτταρα-στόχους [2], [4]. MHC έκφραση τάξης Ι τείνει να χαθεί ή προς τα κάτω ρυθμισμένη σε καρκινικά κύτταρα [5] και ως εκ τούτου, η ανασταλτική σήμα ΝΚ καταργείται, επιτρέποντας ΝΚ κυττάρων να ενεργοποιούνται και σκοτώνουν κακοήθη στόχους.

Πρόσφατα, η αντικαρκινική δραστικότητα των ΝΚ κυττάρων έχει καταδειχθεί κατά τον καθορισμό των αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων (HSCT) [6]. Σε κυττάρων Τ-εξαντλημένα HSCT, δότης κύτταρα ΝΚ είναι τα κύρια κύτταρα τελεστές υπεύθυνες για τον έλεγχο υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα [7]. Το μόσχευμα-έναντι-όγκου (GVT) δραστηριότητα του δότη ΝΚ κυττάρων βελτιώνεται σημαντικά όταν ΚΙΚ και MHC τάξης Ι είναι ασυμβίβαστες μεταξύ δότη και λήπτη, όπως ανασταλτικά σήματα απουσιάζουν [8], [9]. Ως εκ τούτου, η αυξημένη δραστηριότητα GVT των ΝΚ κυττάρων με ΚΥΡ-MHC ασυμβατότητα είναι το σκεπτικό για την ανάπτυξη των αλλογενών θεραπείας ΝΚ κυττάρων.

Στην αλλογενή θεραπεία ΝΚ κυττάρων, τα κύτταρα ΝΚ από υγιείς δότες παρασκευάζονται από

ex vivo

διαστολή και ενεργοποίηση, και στη συνέχεια χορηγούνται σε ασθενείς με καρκίνο [10]. κύτταρα αλλογενών ΝΚ από υγιείς δότες είναι ανώτερη από αυτόλογα κύτταρα ΝΚ από ασθενείς με καρκίνο, οι οποίες καθίστανται λειτουργικά απομειωθεί κατά την εξέλιξη του όγκου [11], [12]. Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα κατά του όγκου αλλογενών κυττάρων ΝΚ ενισχύεται μέσω δότη-δέκτη ασυμβατότητα μεταξύ ΚΙΚ και MHC τάξης Ι συνδέτες [13].

Προκειμένου να καταστεί δυνατή θεραπευτική χρήση αλλογενών κυττάρων ΝΚ στην κλινική , πρέπει να ληφθεί ένας επαρκής αριθμός εξαιρετικά εμπλουτισμένα ΝΚ κυττάρων. Διάφορες μέθοδοι για

ex vivo

ΝΚ κυτταρική επέκταση με κλινικού βαθμού αναφερθεί [14]. Αν και τα κύτταρα ΝΚ διαφοροποιείται από το αίμα του ομφάλιου λώρου [15] ή ΝΚ-92 κύτταρα [16] έχουν χρησιμοποιηθεί για θεραπεία, οι μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) που συλλέγονται από πλήρες αίμα ή λευκαφαίρεση χρησιμοποιούνται ως γενικές πηγές των ΝΚ κυττάρων [17], [18]. Λόγω της πλεονέκτημα άσηπτη συλλογή σε ένα κλειστό σύστημα, συλλογή PBMC με λευκαφαίρεση έχει ευρέως χρησιμοποιηθεί για την ορθή παρασκευαστική πρακτική (GMP) -συμμορφούμενα επέκταση των ΝΚ κυττάρων [14]. Η γενική διαδικασία επέκτασης για αλλογενή εφαρμογή ξεκινά με δύο διαδοχικές βαθμίδες μαγνητικού εξάντληση του CD3

+ Τ κύτταρα και ο εμπλουτισμός του CD56

+ ΝΚ κύτταρα [19] – [21]. Για να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΝΚ, τα ακτινοβολημένα τροφοδοτικά κύτταρα όπως PBMCs [19], τον ιό-μετασχηματισμένων λεμφοβλαστοειδών κυτταρικών γραμμών Epstein-Barr (EBV-LCLs) [20] ή με γενετική μηχανική λευχαιμικών κυτταρικών σειρών [21] χρησιμοποιούνται συχνά. Ακτινοβολημένα τροφοδοτικά κύτταρα διεγείρουν τα κύτταρα ΝΚ μέσω τόσο χυμική παράγοντες και άμεση κύτταρο-με-κύτταρο επαφή [22].

Στην παρούσα μελέτη, ιδρύσαμε μια απλοποιημένη και αποτελεσματική μέθοδο για τη μεγάλης κλίμακας επέκταση και ενεργοποίηση των ΝΚ κύτταρα από υγιείς εθελοντές κάτω από συνθήκες GMP. Μετά από ένα μοναδικό στάδιο των μαγνητικών εξάντληση του CD3

+ Τ κυττάρων, τα εξαντλημένα PBMCs διεγέρθηκαν και επεκτάθηκαν με ακτινοβολημένα αυτόλογα PBMCs υπό την παρουσία ΟΚΤ3 και IL-2 για 14 ημέρες, με αποτέλεσμα ένα εξαιρετικά καθαρό πληθυσμό CD3

-CD16

+ CD56

+ ΝΚ κύτταρα, τα οποία είναι επιθυμητή για αλλογενή σκοπό. Αυτά τα κύτταρα έδειξαν ισχυρή κυτοτοξικότητα έναντι κυττάρων όγκου

in vitro

, ενώ διαφυλάσσει αλλογενή μη νεοπλασματικά κύτταρα. Μπορούν αποτελεσματικά ελεγχόμενη εξέλιξη του όγκου σε ένα SCID μοντέλο ποντικού ανθρώπινου λεμφώματος. Στο σύνολό τους, αλλογενή κύτταρα ΝΚ αποτελεσματικά επεκτάθηκαν σε ένα GMP-συμβατό εγκατάσταση και απέδειξαν ισχυρή δραστικότητα κατά του όγκου τόσο

in vitro

και

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλα τα δείγματα της μελέτης ελήφθησαν μετά την απόκτηση των γραπτή συγκατάθεση των συμμετεχόντων στη μελέτη, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Αυτό το πρωτόκολλο της έρευνας εξετάστηκε και εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Εθνικού Πανεπιστημίου της Σεούλ Νοσοκομείο (Αριθμός Άδειας: H-1004-027-315).

προετοιμασία των κυττάρων ΝΚ και επέκταση

PBMCs ήταν απομονωμένος από υγιείς δότες με λευκαφαίρεση. CD3

+ Τ κύτταρα εξαντλούνται από VarioMacs (Miltenyi Biotec, Γερμανία). κύτταρο-εξαντλημένο PBMCs Τ επεκτάθηκαν σε συγκέντρωση σποράς 2 × 10

5 κύτταρα /mL σε Cellgro SCGM μέσο άνευ ορού (CellGenix, Γερμανία) με 1% αυτόματη πλάσμα, 1 × 10

6 κύτταρα /mL ακτινοβολημένα (2000 rad) αυτόλογα PBMCs, 10 ng /mL αντι-CD3 μονοκλωνικό αντίσωμα ΟΚΤ3 (Orthoclon, Ελβετία) και 500 IU /mL IL-2 (Proleukin, Switzerland) σε ένα σάκο καλλιέργειας Α-350N (NIPRO, Ιαπωνία). ΟΚΤ3 συμπληρώθηκε μόνο μία φορά κατά την έναρξη της επέκτασης για την τόνωση του πληθυσμού των κυττάρων Τ στα ακτινοβολημένα τροφοδοτικά κύτταρα. ΝΚ κύτταρα τροφοδοτήθηκαν με νωπό μέσο με 500 IU /mL IL-2 κάθε δύο ημέρες χωρίς αφαίρεση του προϋπάρχοντος μέσου καλλιέργειας για να διατηρήσει την κυτταρική συγκέντρωση στην 1~2 × 10

6 κύτταρα /mL για 14 ημέρες. Η βιωσιμότητα του διογκωμένου ΝΚ κυττάρων αξιολογήθηκε με χρώση ιωδιούχου προπιδίου. Η επέκταση των ΝΚ κυττάρων πραγματοποιήθηκε υπό τις συνθήκες GMP σε Green Cross LabCell Corp. (Κορέα).

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές

Κ562, Jurkat, SW480, Ramos και Raji κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). SNU398 κύτταρα ελήφθησαν από Κορέας Κυτταρική Γραμμή Τράπεζα (KCLB). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (GIBCO) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (GIBCO). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ανάπτυξη λογαριθμικής φάσης στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα συμπληρωμένη με 5% CO

2.

Ανοσοκηλίδωση και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

κύτταρα

ΝΚ βάφτηκαν με το κατάλληλα μονοκλωνικά αντισώματα ως εξής: αντι-CD56-ΡΕ-Cy5 (Β159), αντι-CD3-FITC (UCHT1), αντι-NKp30-ΡΕ (P30-15), αντι-NKp44-ΡΕ (P44-8.1), αντι- NKp46-ΡΕ (9E2 /NKp46), αντι-DNAM-1-ΡΕ (DX11), αντι-CD25-ΡΕ (Μ-A251), αντι-CD158b-FITC (CH-L) (όλα από την BD Biosciences), αντι- NKG2A-ΡΕ (131.411), αντι-NKG2C-ΡΕ (134.591), αντι-NKG2D-ΡΕ (149.810), αντι-CD69-ΡΕ (298.614) (όλα από R &? συστήματα D), αντι-CD158a-APC (EB6B) , αντι-CD158e-ΡΕ (Z27.3.7) (όλα από την Beckman Coulter), αντι-CD56-APC-eFluor®780 (CMSSB), και αντι-CD62L-ΡΕ (ϋΡΕΟ-56) (όλα από eBioscience). Για κυτταρικές γραμμές όγκου, αντι-HLA-τάξης Ι-ΡΕ (G46-2.6) και αντι-MIC-A /B-ΡΕ (6D4) αγοράστηκαν από την BD Biosciences, αντι-ULBP-1-ΡΕ (170,818) και αντι- ULBP-2-ΡΕ (165903) αγοράστηκαν από την R & amp? Α και αντι-CD112-ΡΕ (TX31) και αντι-CD155-ΡΕ (SKII.4) αγοράστηκαν από BioLegend. Τα δείγματα που αποκτήθηκαν σε BD FACS Canto II ή LSR Fortessa και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (TreeStar Inc., OR).

Η ενδοκυτταρική κυτοκίνη και CD107a χρώση

ΝΚ κύτταρα και Κ562 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1:01 αναλογία για 4 ώρες με την παρουσία των αντι-CD107a-APC (H4A3? BD Biosciences), BD GolgiStop ™ και BD GolgiPlug ™. Τα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-CD56-APC-eFluor®780, διαπερατά από την BD Cytofix /Cytoperm ™ και περαιτέρω χρωματίστηκαν με αντι-ΙΡΝ-γ-ΡΕ (B27? BD Biosciences) ή αντι-ΤΝΡ-α-ΡΕ-Cy7 (Mab11 ? eBioscience). Τα δείγματα που αποκτήθηκαν σε BD FACS Canto II ή LSR Fortessa και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (TreeStar Inc., OR).

δοκιμασία κυτταροτοξικότητας 51Cr αποδέσμευσης

Ένα πρότυπο 4 h

δοκιμασία κυτταροτοξικότητας 51Cr αποδέσμευσης εκτελέστηκε. Τα κύτταρα στόχοι σημάνθηκαν με 100 μθί

χρωμικό νάτριο 51Cr (BMS), και επωάστηκαν με κύτταρα ΝΚ σε τρεις διαφορετικές αναλογίες E:T σε U-bottom 96 βοθρίων (Nunc, Δανία). Η αυθόρμητη απελευθέρωση και μέγιστη απελευθέρωση προσδιορίστηκε με επώαση κυττάρων-στόχων χωρίς τελεστές μόνο σε μέσο ή σε 4% Triton Χ-100, αντίστοιχα. Η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν. Η ραδιενέργεια μετρήθηκε σε ένα μετρητή γάμμα, και το ποσοστό της ειδικής λύσης προσδιορίστηκε σύμφωνα με τον τύπο: ειδική λύση% = [(μέση πειραματική cpm απελευθέρωσης μέση αυθόρμητη απελευθέρωση cpm) /(μέση μέγιστη cpm αυθόρμητης απελευθέρωσης cpm απελευθέρωσης μέσος όρος)] × 100. Για το κλείδωμα πειράματα, τα κύτταρα ΝΚ ήταν προ-επωάστηκαν με 10 μg /mL αντι-ποντικού IgG1κ (MOPC-21? BD Biosciences), 10 μg /mL αντι-DNAM-1 (DX11? BD Biosciences), 2 μg /mL αντι- NKG2D (149.810? Ε & amp? συστήματα Δ), 2 μg /mL αντι-NKp30 (P30-15? BioLegend) ή 10 μg /mL αντι-NKp44 (P44-8? BioLegend) για 30 λεπτά στους 4 ° C, και

δοκιμασία 51Cr-απελευθέρωσης πραγματοποιήθηκε κατά SW480 και SNU398 σε αναλογία E:T των 10:01. Η αναστολή της θανάτωσης υπολογίσθηκε ως ποσοστό της αναστολής από το αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου.

κυτταρομετρίας ροής κυτταροτοξικότητα δοκιμασία

Η κυτταροτοξικότητα των ΝΚ κυττάρων επεκτάθηκε κατά αλλογενή PBMCs αξιολογήθηκε με δοκιμασία κυτταροτοξικότητας κυτταρομετρίας ροής. Κ562 κύτταρα στόχου όγκου σημάνθηκαν με 100 ηΜ καλσεΐνη-ΑΜ (Molecular Probes, Eugene, OR), και αλλογενή ή αυτόλογα κύτταρα στόχους PBMC σημάνθηκαν με αντι-ΗΙΑ τάξης Ι Expanded κύτταρα ΝΚ, σημασμένα κύτταρα-στόχους Κ562, και επισημαίνονται PBMC κύτταρα στόχοι καλλιεργήθηκαν σε αναλογία 3:01:01 για 2 ώρες. Τα νεκρά κύτταρα βάφτηκαν με 7-AAD (BD Biosciences). Το ποσοστό της ειδικής λύσης προσδιορίστηκε σύμφωνα με τον τύπο: ειδική λύση% = (μέσος όρος% του 7-AAD

+ κύτταρα σε φρεάτια με NK συγκαλλιέργεια) – (μέσος όρος% του 7-AAD

+ χρωματισμένα κύτταρα σε φρεάτια με στόχο μόνο)

In vivo

μελέτη σε ποντίκια SCID

CB-17-Prkdc

SCID ποντίκια (Animal Resources Centre, Αυστραλία) χρησιμοποιήθηκαν στις 7 εβδομάδες ηλίκίας. SCID ποντίκια στεγάζονται σε κλουβιά μικροαπομονωτικά, και όλα τα τρόφιμα, νερό και κλινοσκεπάσματα έγιναν σε αυτόκλειστο πριν από τη χρήση. Διευρυμένη κύτταρα ΝΚ σημάνθηκαν με 5 μΜ CFSE (Sigma), και 2 χ 10

7 του CFSE-επισημασμένα κύτταρα ενέθηκαν ενδοφλεβίως σε κάθε ποντίκι. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν σε 2, 24, 48, 72 και 168 ώρες κάτω από γενική αναισθησία. εναιωρήματα απλού κυττάρου παρασκευάστηκαν από μεγάλα όργανα όπως πνεύμονες, σπλήνα, περιφερικό αίμα, το ήπαρ, λεμφαδένες, μυελό των οστών, τα νεφρά, ωοθήκες, όρχεις και τον εγκέφαλο. Το ποσοστό των CFSE

+ κυττάρων αναλύθηκε σε lymphogating με κυτταρομετρία ροής αναλύσεις στα αιωρήματα μονών κυττάρων από σειριακή δείγματα. Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα κατά του όγκου του διογκωμένου ΝΚ κυττάρων, CB-17-Prkdc

scid ποντικοί εγχύθηκαν ενδοφλεβίως στη φλέβα της ουράς με 1 χ 10

5 κύτταρα Raji και 1 × 10

7 επεκτάθηκε ΝΚ κυττάρων σε 400 μι του PBS την ημέρα 0. Τρεις επιπλέον δόσεις επεκταθεί ΝΚ κυττάρων (1 × 10

7cells /ποντίκι) χορηγήθηκαν μέσα σε εννέα ημέρες. Το μονοκλωνικό αντι-CD20 αντίσωμα, ριτουξιμάμπη (0,01 μg /ποντικό) υποδορίως με ένεση κατά τον χρόνο της πρώτης χορήγησης της διογκωμένης ΝΚ κυττάρων. Μεμονωμένα ποντικοί παρακολουθήθηκαν καθημερινά για σχετίζονται με όγκους νοσηρότητα και θνησιμότητα. Ειδικότερα, σημειώθηκε η μη φυσιολογική στάση των οπισθίων άκρων που προκύπτουν από την αδυναμία να επεκτείνουν τα οπίσθια άκρα. Όταν τα ποντίκια που εμφανίζονται σημάδια που σχετίζονται με όγκους νοσηρότητα, όπως η υπερβολική απώλεια βάρους, λήθαργο και /ή διατρέχουν κίνδυνο, υποβλήθηκαν σε ευθανασία σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές θεσμικές φροντίδα των ζώων. Γενική αναισθησία προκλήθηκε με μία ενδομυϊκή ένεση 100 mg /kg κεταμίνης (Yuhan, Κορέα) και 12,5 mg /kg ξυλαζίνης (Rompun, Bayer). στέγασης των ζώων, το χειρισμό, και όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ποντίκια είχαν εγκριθεί από το θεσμικό επιτροπή Mogam Βιοτεχνολογίας Ινστιτούτο Ερευνών (Αριθμός Άδειας: MG-10-111A), και όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις εθνικές κατευθυντήριες γραμμές που διέπουν την φροντίδα των ζώων στην Κορέα

Στατιστική ανάλυση

t-test unpaired Student χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση της κυτταροτοξικότητας και έκκριση κυτοκίνης ΝΚ κυττάρων πριν και μετά την διαστολή. t-test ζευγών Student χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση της έκφρασης δείκτη επιφανείας των ΝΚ κυττάρων πριν και μετά την διαστολή. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA).

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά της μεγάλης κλίμακας, GMP-επεκτάθηκε ΝΚ κυττάρων

Στην παρούσα μελέτη, αποτελεσματικά επεκταθεί ΝΚ κύτταρα από υγιείς δότες με καλλιέργεια PBMCs κυττάρων Τ-εξαντλημένα και ακτινοβολημένα αυτόλογα PBMCs υπό την παρουσία IL-2 και ΟΚΤ3 για 14 ημέρες σε ένα GMP-συμβατό εγκατάσταση. Την ημέρα 14, τα προϊόντα, που ονομάζεται MG4101, αποτελούνταν από υψηλά εμπλουτισμένου CD3

-CD56

+ (98.10 ± 0.88%) ή CD56

+ CD16

+ (97,43 ± 1,66%) των κυττάρων ΝΚ με ελάχιστη μόλυνση από CD3

+ Τ κύτταρα (0,06 ± 0,14%), CD14

+ μονοκύτταρα (0,09 ± 0,14%) ή CD19

+ Β κύτταρα (0,04 ± 0,07%) (Σχ. 1 Α-Β ). Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, τα κύτταρα ΝΚ επεκτάθηκαν 691,4 ± 170,2 φορές (Σχ. 1C) με 95,2 ± 1,9% βιωσιμότητα (Σχ. 1D). Σε προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας έναντι διαφόρων κυττάρων όγκου, επεκτάθηκε κύτταρα ΝΚ που εξασκείται αυξημένη κυτταρολυτική δράση σε σύγκριση με πρόσφατα απομονωμένα κύτταρα ΝΚ (Εικ. 1 Ε). Η ισχυρή δραστικότητα των ΝΚ κυττάρων επεκτάθηκε επίσης καταδείχθηκε με CD107a δείκτη αποκοκκίωση, και με έκκριση της ΙΡΝ-γ και ΤΝΡ-α κατά την διάρκεια συγκαλλιέργειας με κύτταρα Κ562 (Εικ. 1 F).

(Α-Β) Τ- κύτταρο εξαντληθεί PBMCs επεκτάθηκαν υπό τις συνθήκες GMP που περιγράφονται στα Υλικά και Μέθοδοι. Το ποσοστό των CD3

-CD56

+, CD56

+ CD16

+, CD3

+, CD14

+ και CD19

+ κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής αναλύει ( Β, η = 8). Αντιπροσωπευτικά διαγράμματα σημείων FACS παρουσιάζονται (Α). (Γ) Η αναδίπλωση επέκταση των ΝΚ κυττάρων προσδιορίστηκε πριν (D0) και μετά (D14) επέκταση των κυττάρων ΝΚ (n = 8). (Δ) Η βιωσιμότητα του διογκωμένου ΝΚ κυττάρων αξιολογήθηκε με χρώση ιωδιούχου προπιδίου. (Ε) Κυτταροτοξικότητα των κυττάρων ΝΚ έναντι διαφόρων κυττάρων όγκου συγκρίθηκε πριν (D0) και μετά (D14) επέκταση των κυττάρων ΝΚ (n = 4). Ο λόγος effector:target ήταν 10:01. κύτταρα (F) ΝΚ συνκαλλιεργήθηκαν με κύτταρα Κ562 σε 1:01 αναλογία για 4 ώρες, και χρώση για ενδοκυτταρικό κυτοκίνες (ΙΡΝ-γ και ΤΝΡ-α) και CD107a διεξήχθη όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα συγκρίθηκαν πριν (D0) και μετά (D14) επέκτασης. Η μέση και SD παρουσιάζονται. *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt?. 0.001

Η

Η έκφραση των υποδοχέων ΝΚ κυττάρων σε μεγάλη κλίμακα, GMP-επεκτάθηκε ΝΚ κυττάρων

Η επιφανειακή έκφραση της ενεργοποίησης ή ανασταλτική ΝΚ υποδοχείς αναλύθηκε πριν και μετά την επέκταση μεγάλης κλίμακας. Μεταξύ ενεργοποιώντας τους υποδοχείς, NKG2C, NKp30 και NKp44 αυξήθηκε σημαντικά κατά τη διάρκεια της επέκτασης, ενώ NKG2D, NKp46 και DNAM-1 δεν το έκανε (Σχ. 2Α). Έκφραση των ανασταλτικών υποδοχέων, NKG2A και KIR παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό αμετάβλητη κατά την καλλιέργεια, ενώ οι αναλογίες του CD158a

+ b

+ ε

+, CD158a

+ ε

+ και CD158b

+ e

+ ΝΚ κύτταρα μειώθηκαν (Σχ. 2Β). κατάσταση ενεργοποίησης των κυττάρων ΝΚ αξιολογήθηκε με χρώση για CD25, CD62L και CD69, τα οποία βρέθηκαν να αυξάνονται επί της επιφανείας του διογκωμένου ΝΚ κυττάρων (Σχ. 2C). Έκφραση των υποδοχέων χημειοκινών όπως CXCR3 και CXCR4 αξιολογήθηκε επίσης. Η συχνότητα των CXCR4

+ ΝΚ κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά κατά τη διάρκεια της διαστολής των ΝΚ κυττάρων, ενώ η συχνότητα των CXCR3

+ ΝΚ κυττάρων δεν άλλαξε (Σχ. 2D).

Η επιφανειακή έκφραση της ενεργοποίησης των υποδοχέων (Α ), ανασταλτικοί υποδοχείς (Β), δείκτες ενεργοποίησης (C) και υποδοχείς χημειοκινών (D) αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής πριν (D0) και μετά (D14) επέκταση των κυττάρων ΝΚ (n = 10~12). Μεμονωμένα ή συν-έκφραση του ΚΙΚ (CD158a, CD158b ή CD158e) υπολογίστηκε με Boolean πύλες χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (Β). *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

ρ

& lt?. 0.001

Η

Η κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι διαφόρων κυτταρικών γραμμών όγκου

Στη συνέχεια, η κυτταροτοξική δραστικότητα του διογκωμένου πληθυσμού των κυττάρων ΝΚ αξιολογήθηκε. Διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές που εμφανίζονται διαφορετικά επίπεδα ευαισθησίας σε διευρυμένη ΝΚ κύτταρα (Σχ. 3Α). Για να κατανοήσουμε αυτό ποικίλη ευαισθησία, έκφραση προσδεμάτων για τους υποδοχείς ΝΚ αναλύθηκε σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Από αυτούς δοκιμάστηκαν για την έκφραση, οι πιο σχετικές συνδέτες ήταν HLA τάξης Ι, NKG2D συνδέτες? ULBP-1, ULBP-2 και MIC-A /B και DNAM-1 συνδέτες? CD112 (nectin-2) και CD155 (Necl5). Η πιο ευαίσθητα κυτταρική σειρά, Κ562, που εκφράζεται NKG2D συνδετήρες αλλά όχι το συνδετήρα KIR, ΗΕΑ τάξης Ι (Σχ. 3Β). Jurkat, SW480 και SNU398 κύτταρα εξέφρασαν όχι μόνο NKG2D συνδέτες, αλλά επίσης και HLA τάξης Ι, και ήταν μετρίως ευαίσθητα σε διευρυμένη ΝΚ κυττάρων. ΝΚ-ευαίσθητα κύτταρα στόχους (Κ562, Jurkat, SW480 και SNU398) τείνουν να υπερεκφράζουν CD112 και CD155 σε σύγκριση με ΝΚ-ανθεκτικά κύτταρα στόχους (Ramos, Raji και PBMCs). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα κύτταρα ΝΚ δεν σκοτώνουν αλλογενή ΜΚΠΑ, τα οποία εξέφραζαν HLA τάξης Ι χωρίς NKG2D και DNAM-1 συνδέτες (Εικ. 3Α και Β).

(Α) Κυτταροτοξικότητα του διογκωμένου ΝΚ κυττάρων έναντι διαφόρων κυτταρικών γραμμών όγκου αναλύθηκε με

δοκιμασία 51Cr-απελευθέρωσης με αναλογία ενδεικνυόμενη effector:target (E:T) εις τριπλούν. Κυτταροτοξικότητα εναντίον κανονική PBMCs αναλύθηκε επίσης. Η δοκιμασία διεξήχθη δύο φορές με διευρυμένη ΝΚ κύτταρα από διαφορετικούς δότες, και παρουσιάστηκε αντιπροσωπευτικά δεδομένα. Κάθε γράφημα αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SD. (Β) Έκφραση HLA τάξης Ι, ULBP-1, ULBP-2, MIC-A /B, CD112 και CD155 αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής σε διάφορες κυτταρικές σειρές όγκων και φυσιολογικών PBMCs (συνεχείς γραμμές). Γκρι ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν έλεγχοι ισοτόπου. (Γ) Expanded ΝΚ κύτταρα προ-επωάστηκαν με αντισώματα αποκλεισμού για DNAM-1, NKG2D, NKp30 ή /και NKp44, και κυτταροτοξικότητα αναλύθηκε κατά SW480 ή SNU398 κύτταρα με

δοκιμασία 51Cr-απελευθέρωσης εις τριπλούν. αναλογία E:T ήταν 10:01. Το ποσοστό αναστολής της κυτταροτοξικότητας υπολογίστηκε ως ποσοστό της αναστολής από το αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου. Η δοκιμασία διεξήχθη δύο φορές με διευρυμένη ΝΚ κύτταρα από διαφορετικούς δότες, και αντιπροσωπευτικά δεδομένα παρουσιάζονται. Κάθε γράφημα μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση + SD.

Η

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του ενεργοποιώντας τους υποδοχείς ΝΚ, μία δοκιμασία κυτοτοξικότητας με ενισχυμένη ΝΚ κύτταρα διεξήχθη με την παρουσία αντισωμάτων αποκλεισμού ειδικά για NKG2D, DNAM-1, NKp30 και NKp44. Ενώ το κλείδωμα ενός ενιαίου υποδοχέα μόνο επηρεάζεται ελαφρώς κυτταροτοξικότητα, μπλοκάροντας πολλαπλούς υποδοχείς οδήγησαν σε σημαντική μείωση της κυτταροτοξικότητας. Ειδικότερα, τον αποκλεισμό όλων των τεσσάρων υποδοχέων αναστέλλει την κυτταροτοξικότητα κατά περισσότερο από 85% (Σχ. 3C). Ετσι, η κυτταροτοξικότητα του διογκωμένου πληθυσμού των κυττάρων ΝΚ είναι συνεργικά αυξάνεται από την ταυτόχρονη ενεργοποίηση μέσω πολλαπλών ενεργοποιώντας τους υποδοχείς ΝΚ.

Απουσία κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι αλλογενών κυττάρων μη-όγκου

Η κλινική χρήση του επεκτάθηκε κυττάρων ΝΚ από άσχετα υγιείς δότες μπορεί να οδηγήσει σε τοξικότητα οφείλεται σε κυτταροτοξική δράση έναντι αλλογενή μη μετασχηματισμένα κύτταρα δέκτες. Για την αξιολόγηση του δυναμικού για κυτταροτοξικότητα εναντίον κανονική κύτταρα δέκτες, επεκτάθηκε κύτταρα ΝΚ καλλιεργήθηκαν ταυτόχρονα με κύτταρα όγκων Κ562 και φυσιολογικό αλλογενή PBMCs, και η κυτταροτοξικότητα εναντίον κάθε αντίστοιχη στόχος αξιολογήθηκε. Η κυτταροτοξικότητα ενάντια στα αλλογενή PBMCs βρέθηκε να είναι αμελητέα (0,43 ± 0,27%) (Σχ. 4Α) και να συγκριθεί με κυτταροτοξικότητα κατά των αυτόλογων ΜΚΠΑ (0,40 ± 0,40%) (Εικ. 4Β). Αυτή η ελάχιστη κυτταροτοξικότητα δεν επηρεάστηκε από την παρουσία ή την απουσία των καρκινικών κυττάρων Κ562. Εν τω μεταξύ, επεκτάθηκε ΝΚ κύτταρα θανατώνονται αποτελεσματικά τα καρκινικά κύτταρα Κ562 ανεξάρτητα από την παρουσία αλλογενών ή αυτόλογων ΜΚΠΑ (Σχ. 4Α-Β). Ως εκ τούτου, επεκτάθηκε κύτταρα ΝΚ διακρίσεις αποτελεσματικά τα καρκινικά κύτταρα από αλλογενείς κανονική PBMCs και επιλεκτικά σκοτώθηκαν μετασχηματισμένα κύτταρα. Η ογκο-ειδική κυτταροτοξικότητα χωρίς θανάτωση των αλλογενών κυττάρων μη-όγκου μας επέτρεψε να εφαρμόσει τις επεκταθεί ΝΚ κύτταρα από άσχετα, υγιείς δότες σε έναν αλλογενή ρύθμιση.

εκλεκτική κυτταροτοξικότητα των κυττάρων ΝΚ επεκτάθηκε κατά μικτών στόχους της κανονικής PBMCs και Κ562 κύτταρα αναλύθηκε με προσδιορισμό κυτταροτοξικότητας κυτταρομετρίας ροής όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Κ562 κύτταρα στόχου όγκου σημάνθηκαν με καλσεΐνη-ΑΜ, και είτε αλλογενή (Α) ή αυτόλογα (Β) PBMC κύτταρα-στόχοι σημάνθηκαν με αντι-ΗΙΑ τάξης Ι Τα επεκταθέντα κύτταρα ΝΚ, τα επισημασμένα κύτταρα στόχοι Κ562, και το σημασμένο PBMC κύτταρα στόχοι καλλιεργήθηκαν σε αναλογία 3:01:01 για 2 ώρες. Τα νεκρά κύτταρα βάφτηκαν με 7-AAD, και η επί τοις εκατό ειδικής λύσης υπολογίστηκε. Κυτταροτοξικότητα έναντι PBMCs (αριστερά κάθε πίνακα) και Κ562 κύτταρα (δικαίωμα του κάθε πίνακα) παρουσιάζονται ξεχωριστά. Η δοκιμασία διεξήχθη σε διπλότυπο. Κάθε γράφημα μπάρα αντιπροσωπεύει μέση τιμή + SD.

Η

In vivo

αντινεοπλασματική δραστικότητα των επεκτάθηκε ΝΚ κυττάρων σε ποντίκια SCID

Για

in vivo

μελέτη επεκτάθηκε ΝΚ κυττάρων, που χορηγείται CFSE σημασμένο, επεκτάθηκε ανθρώπινα κύτταρα ΝΚ σε SCID ποντίκια και παρακολουθείται η κινητική της διανομής τους. Σημασμένα κύτταρα ΝΚ εμφανίστηκε για πρώτη φορά στους πνεύμονες, όπου διέμεναν για 48 ώρες, στη συνέχεια, σταδιακά εξαφανίστηκαν (Εικ. 5Α). Στην σπλήνα, περιφερικό αίμα και το ήπαρ, η συχνότητα των χορηγούμενων κυττάρων ΝΚ έφτασε στο αποκορύφωμά της στις 48 ώρες και στη συνέχεια σταδιακά μειώθηκε (Σχ. 5Α). Στο μυελό των οστών, λεμφαδένες, τον εγκέφαλο, τα νεφρά, ωοθήκες και όρχεις, ο εγχυόμενη CFSE

+ ΝΚ κύτταρα ελάχιστα ανιχνεύθηκαν (≤1.1%) (Πίνακας S1). Όλα τα ΝΚ ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε φάνηκε υγιής παρόμοια με την ομάδα ελέγχου κατά τη διάρκεια της μελέτης.

(Α) CFSE-σημασμένα κύτταρα ΝΚ (2 × 10

7 κύτταρα /ποντικό) εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε SCID ποντίκια. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν σε 2, 24, 48, 72 και 168 ώρες, και το ποσοστό των CFSE

+ κύτταρα στους πνεύμονες, σπλήνα, περιφερικό αίμα και το ήπαρ αναλύθηκε σε lymphogating με κυτταρομετρία ροής (n = 4). Κάθε γράφημα αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM. (Β-Ο) ποντικούς SCID εγχύθηκαν ενδοφλεβίως στη φλέβα της ουράς με 1 χ 10

5 κύτταρα Raji και 1 × 10

7 επεκτάθηκε ΝΚ κυττάρων σε 400 μΙ PBS την ημέρα 0 (η = 10 /ομάδα) . Τρεις επιπλέον δόσεις επεκταθεί ΝΚ κυττάρων (1 × 10

7cells /ποντίκι) χορηγήθηκαν μέσα σε εννέα ημέρες. Το μονοκλωνικό αντι-CD20 αντίσωμα, ριτουξιμάμπη (0,01 μg /ποντικό) υποδορίως με ένεση κατά τον χρόνο της πρώτης χορήγησης της διογκωμένης ΝΚ κυττάρων. Tumor-σχετίζεται παράλυση (Β) και επιβίωσης (C) παρακολουθήθηκαν. Η δοκιμή αποτελεσματικότητα επιβεβαιώθηκε με πρόσθετο σύνολο πείραμα χρησιμοποιώντας 10 ποντίκια ανά κάθε ομάδα, και το αντιπροσωπευτικό σύνολο των δεδομένων που παρουσιάζονται.

Η

Στη συνέχεια, η αντικαρκινική δραστικότητα των ΝΚ κυττάρων επεκτάθηκε εξετάστηκε SCID ποντίκια ενδοφλεβίως ένεση με ανθρώπινα κύτταρα Β-λεμφώματος κυττάρων Raji. Νοσηρότητα αξιολογήθηκε με παράλυση οπισθίου σκέλους, καθώς τα κύτταρα Raji έχουν τροπισμό του νωτιαίου μυελού, και αξιολογήθηκε η θνησιμότητα. Η χορήγηση του διογκωμένου ανθρώπινων κυττάρων ΝΚ κατήργησε σημαντικά την εξέλιξη του όγκου, όπως αποδεικνύεται από την μειωμένη νοσηρότητα (Εικ. 5Β) και θνησιμότητα (Εικ. 5C). Η αποτελεσματικότητα της διογκωμένης ανθρώπινων κυττάρων ΝΚ ενισχύθηκε περαιτέρω με την ταυτόχρονη χορήγηση του rituximab χαμηλής δόσης (0,01 μg /ποντικό), ενώ η ίδια δόση του rituximab χωρίς κύτταρα ΝΚ δεν βελτίωσε έκβαση της νόσου. Αυτή η δόση του rituximab θεωρείται ότι είναι εξαιρετικά χαμηλή και είναι συγκρίσιμη με 1 /25.000 της κανονικής δόσης σε ανθρώπους [29]. Συνοπτικά, τα κύτταρα ΝΚ επεκτάθηκε καταδειχθεί

in vivo

αντικαρκινική δραστικότητα σε ένα μοντέλο ποντικού όγκου, και η προσθήκη του αντισώματος όγκου-ειδικό σημαντικά ενισχυμένη αποτελεσματικότητα τους, πιθανώς με ενεργοποίηση εξαρτώμενη από αντίσωμα κυτταρική κυτταροτοξικότητα (ADCC).

Συζήτηση

ανοσοθεραπείες του καρκίνου έχουν χρησιμοποιήσει διάφορους τύπους κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των δενδριτικών κυττάρων (DCs), κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTLs), λεμφοκίνη-ενεργοποιημένα κύτταρα φονείς (LAK), κυτοκίνη επαγόμενη από killer (CIK) κύτταρα και κύτταρα ΝΚ [23] – [26]. Παρά το γεγονός ότι υπήρξε πρόσφατες εξελίξεις στην θεραπεία DC και τη θεραπεία CTL, κλινική εφαρμογή είναι κάπως περιορισμένη, δεδομένου ότι τα καρκινικά αντιγόνα πρέπει πρώτα να χαρακτηριστεί [23], [24]. Σε αντίθεση, τα κύτταρα LAK, CIK κύτταρα και κύτταρα ΝΚ έχουν αντιγόνο-ανεξάρτητο δραστικότητα κυτταρολυτική έναντι κυττάρων όγκου. Συχνά, τα κύτταρα LAK ή CIK κύτταρα που παρασκευάζονται από ασθενείς με καρκίνο και αυτόλογα χορηγείται μετά

ex vivo

χειραγώγηση [25], [26]. Στην περίπτωση των κυττάρων ΝΚ, τόσο αλλογενή και αυτόλογα κύτταρα ΝΚ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για αντικαρκινική θεραπεία. Προηγούμενες εργασίες έχουν δείξει ότι αλλογενή ΝΚ κύτταρα μπορεί να χορηγηθεί με ασφάλεια σε ασθενείς με καρκίνο [10]. κυτταρική θεραπεία αλλογενή NK είναι ιδιαίτερα ευεργετική, καθώς ενισχύει την αποτελεσματικότητα αντι-καρκίνου των ΝΚ κυττάρων μέσω της επαγωγής του δότη-λήπτη ασυμβατότητα μεταξύ ΚΙΚ στο δότη ΝΚ κύτταρα και MHC τάξης Ι συνδετήρες για τον δικαιούχο ιστούς [13].

Σε προηγούμενες μελέτες, διάφορες μέθοδοι

ex vivo

ΝΚ κυτταρική επέκταση έχουν αναπτυχθεί για κλινική χρήση [14]. Τα PBMCs συλλέγονται με λευκαφαίρεση συχνά χρησιμοποιείται ως γενική πηγή των κυττάρων ΝΚ, τα οποία έχουν ένα πλεονέκτημα της ασηπτικής συλλογής σε ένα κλειστό σύστημα [14]. Η γενική διαδικασία επέκτασης για αλλογενή εφαρμογή ξεκινά με δύο διαδοχικές βαθμίδες μαγνητικού εξάντληση του CD3

+ Τ κύτταρα και ο εμπλουτισμός του CD56

+ ΝΚ κύτταρα [19] – [21]. Στην παρούσα μελέτη, μόνο ένα βήμα από μαγνητική εξάντληση των CD3

+ Τ κύτταρα ικανοποίησε την ποιότητα των προϊόντων όσον αφορά το σεβασμό της καθαρότητας και της βιωσιμότητας. Την day14, το τελικό προϊόν αποτελείται από υψηλής καθαρότητας CD3

-CD56

+ ΝΚ κύτταρα (98.10 ± 0.88%) με ελάχιστη μόλυνση από CD3

+ Τ κύτταρα (0,06 ± 0,14%), CD14

+ μονοκύτταρα (0,09 ± 0,14%) ή CD19

+ Β κύτταρα (0,04 ± 0,07%). Μεταξύ PBMCs κυττάρων Τ-εξαντλημένα, ΝΚ κύτταρα επεκτείνονται επιλεκτικά ενώ άλλα κύτταρα όπως Β κύτταρα και μονοκύτταρα έγινε ελάχιστα ανιχνεύσιμη. Για τον αλλογενή κλινική εφαρμογή, η εξάντληση των Τ κυττάρων στο τελικό προϊόν επιθυμείται η αποφυγή μοσχεύματος έναντι ξενιστή [10].

Σε προηγούμενες μελέτες, διάφορες προσπάθειες είχαν προσπαθήσει να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΝΚ με ακτινοβολημένα κύτταρα τροφοδότες όπως PBMCs, ΕΒν LCLs ή μηχανικής λευχαιμικών κυτταρικών σειρών [19] – [21]. Η παρούσα διαδικασία περιλαμβάνει τα ακτινοβολημένα αυτόλογα PBMCs που παρέχεται με ΟΚΤ3 κατά την έναρξη της επέκτασης. ΟΚΤ3-διεγερμένα Τ κύτταρα μεταξύ ακτινοβολημένα τροφοδοτικά κύτταρα μπορεί να διεγείρει ΝΚ κύτταρα πολλαπλασιασμό μέσω τόσο χυμική παραγόντων και την άμεση επαφή κυττάρου-προς-κύτταρο. Περαιτέρω μελέτες είναι υπό έρευνα να διευκρινίσει το λειτουργικό ρόλο των τροφοδοτικών κυττάρων.

Στην παρούσα μελέτη, επεκτάθηκε ΝΚ κύτταρα έδειξαν εύρωστη παραγωγή κυτοκίνης και ισχυρή κυτταρολυτική δραστικότητα έναντι διαφόρων κυτταρικών γραμμών καρκίνου σε σύγκριση με προσφάτως απομονωμένα κύτταρα ΝΚ. Αυτά τα κύτταρα υπερεκφράζουν NKG2C, NKp30, NKp44 και δείκτες ενεργοποίησης, συμπεριλαμβανομένων CD25, CD62L και CD69. Αξίζει να σημειωθεί, επεκτάθηκε ΝΚ κύτταρα θανατώνονται επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα χωρίς κυτταροτοξικότητα έναντι αλλογενή μη καρκινικών κυττάρων σε προσδιορισμούς συγκαλλιέργειας. Αυτή η κατευθυνόμενη κυτταροτοξική δράση των ΝΚ κυττάρων επεκτάθηκε πρότεινε ότι αλλογενή εφαρμογή του επεκτάθηκε ΝΚ κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο θα ήταν ασφαλής. Στην πραγματικότητα, δεν έχουν σημαντικές παρενέργειες έχουν σημειωθεί σε μια εν εξελίξει μελέτη φάσης Ι με χρήση επεκταθεί κύτταρα αλλογενών ΝΚ (www.clinicaltrial.gov? NCT 01212341).

Για την παρακολούθηση της κινητικής της

in vivo

διανομή, χορηγήσαμε CFSE σημασμένο, επεκτάθηκε ανθρώπινα κύτταρα ΝΚ να SCID ποντίκια. Σημασμένα κύτταρα ΝΚ εμφανίστηκε για πρώτη φορά στους πνεύμονες, όπου διέμεναν για 48 ώρες, στη συνέχεια, σταδιακά εξαφανίστηκαν (Εικ. 5Α). Στην σπλήνα, περιφερικό αίμα και το ήπαρ, η συχνότητα των χορηγούμενων κυττάρων ΝΚ έφτασε στο αποκορύφωμά της στις 48 ώρες και στη συνέχεια σταδιακά μειώθηκε (Σχ. 5Α). Εν τω μεταξύ, μελετήσαμε επίσης την έκφραση των υποδοχέων χημειοκινών, όπως CXCR3 και CXCR4 σε επεκταθεί ΝΚ κυττάρων.