Αφηρημένο

Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου, ειδικά γονιδιωματικής εκτροπών προκύπτουν ότι μπορεί να προσδιορίσει την έκταση της νόσου και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός ή προγνωστικοί δείκτες. Η ανίχνευση ειδικές ενισχύσεις γονιδίου ή διαγραφές σε ενιαίο μεταδίδονται με το αίμα ή διαδίδονται καρκινικά κύτταρα που μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη των μεταστάσεων έχει μεγάλη κλινικού ενδιαφέροντος αλλά τεχνικά δύσκολη. Σε αυτή τη μελέτη, παρουσιάζουμε μια μέθοδο για την ποσοτική υψηλής ανάλυσης γονιδιωματική ανάλυση των μεμονωμένων κυττάρων. Κύτταρα απομονώθηκαν υπό μόνιμη μικροσκοπική ελέγχου που ακολουθείται από υψηλής πιστότητας ενίσχυση ολόκληρο το γονιδίωμα και μετέπειτα αναλύσεις από ωραία πλακάκια array-CGH και qPCR. Η δοκιμασία εφαρμόσθηκε σε ενιαίο κύτταρα καρκίνου του μαστού για να αναλύσει την χρωμοσωμική περιοχή κεντράρεται με τη θεραπευτική σχετική

EGFR

γονίδιο. Η μέθοδος αυτή επιτρέπει την ακριβή ποσοτική ανάλυση του αντιγράφου παραλλαγές αριθμού στη διαγνωστική μόνο κύτταρο

Παράθεση:. Hannemann J, Meyer-Staeckling S, D Kemming, Alpers Ι, Joosse Α.Ε., Pospisil H, et al. (2011) Ποσοτική υψηλής ανάλυσης Γονιδιωματική ανάλυση των κυττάρων Ενιαία Καρκίνου. PLoS ONE 6 (11): e26362. doi: 10.1371 /journal.pone.0026362

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Αυγούστου 2011? Αποδεκτές: 25η Σεπτεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 30 Νοέμβρη 2011

Copyright: © 2011 Hannemann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Bundesministerium für Bildung Und Forschung (BMBF FKZ: 01ES0724, https://www.bmbf.de/de/1398.php). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κατά τη διάρκεια του σχηματισμού του καρκίνου και την εξέλιξη, κυτταρικών πληθυσμών με συγκεκριμένες γενετικές ανωμαλίες προκύπτουν, που αντιπροσωπεύουν μοναδικές κλινικές οντότητες που φέρουν ειδική θεραπευτική στόχους [1], [2]. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι το γονίδιο τόπο του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (

EGFR

), η οποία αποτελεί βασικό παράγοντα στη βιολογία του όγκου και ένας σημαντικός στόχος για την εξατομικευμένη θεραπεία του καρκίνου. Το DNA αντιγραφής αριθμούς για αυτό το ενιαίο τόπο καθορίζουν σημαντικά τον φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων και είναι δείκτες για την απόκριση του ασθενούς στη χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία [3]. Αντισώματα και αναστολέων μικρών μορίων έχουν αναπτυχθεί αλλοιώνοντας EGFR δραστικότητα κινάσης τυροσίνης σε διάφορους τύπους όγκων [1] – [3]

Οι περισσότεροι όγκοι μπορεί να αφαιρεθεί εντελώς από τη χειρουργική επέμβαση και είναι συνεπώς μη διαθέσιμα για επαναλαμβανόμενη δειγματοληψία για την παρακολούθηση είτε της θεραπείας. απόκριση ή αλλαγές θεραπεία επαγόμενης σε γονιδιωματική εκτροπές ή της εξέλιξης της νόσου, αντίστοιχα. Πρόσφατα, αυτά τα κρίσιμα διαδικασίες μπορούν να αξιολογηθούν από την ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων στο αίμα που μεταδίδονται ή διαδίδονται καρκινικά κύτταρα (DTC) στο μυελό των οστών, τόσο εμφανή παλιννόστησης οργάνων και κύρια θέση του έκδηλου μεταστάσεων σε ασθενείς με καρκίνο. Η μοριακή ανάλυση αυτών των κυττάρων μπορεί να αποκαλύψει μοναδικές πληροφορίες για να προσαρμόσει τις θεραπείες πρόληψης μεταστατική εξέλιξη [4], [5].

Ως εκ τούτου, έχουμε αναπτύξει μια προσέγγιση για μια αξιόπιστη, υψηλής ανάλυσης ποσοτική γενετική ανάλυση των απομονωμένων μόνο τα καρκινικά κύτταρα στο παράδειγμα του

EGFR

γονίδιο. Μετά τον εμπλουτισμό, κύτταρα απομονώθηκαν με μικροχειρισμού και επακόλουθη γραμμικής ενίσχυσης ολόκληρο το γονιδίωμα εκτελέστηκε. Η αξιολόγηση αυτής της διαδικασίας έχει γίνει από πρόστιμο-πλακόστρωση array-CGH και ποσοτική PCR, προκειμένου να προσδιοριστεί με ακρίβεια το πλάτος και την επέκταση του

EGFR

αμπλικόνιο σε μονά κύτταρα του όγκου.

Αποτελέσματα

μικροχειρισμού και ολόκληρο ενίσχυση γονιδίωμα μονά κύτταρα

επιλέχθηκε ως κατάλληλο μοντέλο για την αξιολόγηση μέθοδος Η ανθρώπινη μαστική κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος MDA-MB-468, δεδομένου ότι φιλοξενεί ένα

EGFR

ενίσχυσης και παρουσιάζει ισχυρή υπερέκφραση του EGFR, καθώς και οθόνες α /δεσμευτεί φαινότυπο προγονικών κυττάρων βλαστική ικανότητα [6], [7]. Ωστόσο, το επίπεδο της ενίσχυσης ποικίλλει μεταξύ των κυττάρων. Για την ενίσχυση ολόκληρο το γονιδίωμα (WGA), μη-μόνιμη ή ελαφρώς σταθεροποιημένα κύτταρα συλλέχθηκαν από τη γυάλινη επιφάνεια χρησιμοποιώντας ένα μικροχειριστή εξοπλισμένο με τριχοειδή σχεδιαστεί για συγκεκριμένες απαιτήσεις μας. Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε ένα υδατικό γύρω σε ένα C

γυαλί 18-σιλανίου επικάλυψη stick που μεταφέρουν ένα σημείο αποξηραμένων πλήρες ρυθμιστικό κυτταρική λύση (δείτε σε απευθείας σύνδεση μεθόδους). Το προϊόν λύσης κυττάρου στη γυάλινη ραβδί άμεσα μεταφέρθηκε σε ένα σωλήνα αντίδρασης ήδη προετοιμαστεί με το ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος για WGA να αποφευχθεί οποιαδήποτε απώλεια του γονιδιωματικού υλικού. Η διαδικασία βασίζεται στην ενίσχυση πολλαπλών μετατοπίσεως με τη χρήση τυχαίων εξαμερών και την επιμέλεια DNA πολυμεράση Phi29 να εξασφαλίζεται γραμμική ενίσχυση [8]. Ένα μόνο κύτταρο απέδωσε σε 2,04 έως 2,96 μg PCR-ενισχύσιμου DNA (μέσος όρος: 2,42 μg, SD 0,26), η οποία είναι ανώτερη από τα αποτελέσματα που περιγράφονται προηγουμένως [9]

αποτελεσματικότητα της μεταφοράς του μικροχειρισμού και πιστότητα της WGA. από ένα μόνο κύτταρο, συμπεριλαμβανομένου του

EGFR

τόπο του περίπου 4,5 ΜΒ επικυρώθηκαν με μικροδορυφόρων PCR. Οι μικροδορυφορικού τόποι έχουν προσαρμοστεί από Tidow et al. [10] και λεπτομερείς πληροφορίες παρέχονται ως συμπληρωματικές πληροφορίες (Πίνακας S1, S2). Όλα μικροδορυφορικού τόπους θα μπορούσε να επαληθευτεί.

Περιγραφή του αμπλικονίου EGFR σε μονά κύτταρα με λεπτή array CGH πλακάκια

Για τον έλεγχο για γραμμική ενίσχυση των αλληλουχιών DNA με WGA και για τη διερεύνηση της δομής του

EGFR

αμπλικόνιο, αναλύσαμε την περιοχή που φιλοξενεί το

EGFR

γονίδιο από ένα υψηλής ανάλυσης δύο χρωμάτων πρόστιμο-πλακόστρωση array-CGH (Roche NimbleGen Inc., Madison, WI, USA). Τα ειδικά σχεδιασμένα συστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων με 15 bp απόσταση μεσαίο ανιχνευτή καλύπτουν μια γονιδιωματική αλληλουχία των περίπου 4,7 Mbp στο χρωμόσωμα 7p11.2, συμπεριλαμβανομένου του

EGFR

το ίδιο γονίδιο, και δύο περιοχές αναφοράς στο χρωμόσωμα 2 και το χρωμόσωμα 10 περίπου 200 μήκος kbp κάθε [11]. Σε γενικές γραμμές, αυτές οι περιοχές αναφοράς δείχνουν μόνο μικρές γονιδιωματικής εκτροπές. Ένα διάγραμμα συσχέτισης συγκρίνοντας τις εντάσεις του σήματος μεταξύ του υβριδισμού από το ενισχυμένο DNA που λαμβάνεται από ένα μόνο κύτταρο σε σύγκριση με γονιδιωματικό DNA που ελήφθη από 500 κύτταρα δείχνει την αξιοπιστία των παρασκεύασμα, τα βήματα πριν την ενίσχυση και υβριδισμό συστοιχίας (σχήμα 1γ).

α: Array-CGH οικόπεδα γονιδιακού DNA διαφορετικών κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού με διαφορετικούς

EGFR

αριθμούς αντιγράφων του γονιδίου. b: Array-CGH οικόπεδα του WGA ενισχυμένου DNA από 500 MDA-MB-468 ή μονά MDA-MB-468 κύτταρα (που αγοράζονται σε ATCC), αντίστοιχα. Η περιοχή του

EGFR

γονίδιο απεικονίζεται στο πράσινο. c: οικόπεδο Συσχέτιση των εντάσεων σήματος μετά συστοιχία υβριδισμού συγκρίνοντας τα σήματα του DNA από ένα ενιαίο MDA-MB-468 κυττάρων με τα σήματα που λαμβάνονται από το DNA που απομονώθηκε από 500 MDA-MB-468 κύτταρα. Σημεία απεικονίζονται με κίτρινο χρώμα αντιπροσωπεύουν τα σήματα έξω από την περιοχή αμπλικόνιο, ενώ τα σημεία που υποδεικνύεται από το μπλε χρώμα αντιπροσωπεύουν τα σήματα που λαμβάνονται από την περιοχή αμπλικόνιο στο χρωμόσωμα 7.

Η αναλύει

Τα στοιχεία των κυτταρικών σειρών που φέρουν

EGFR

ενισχύσεις (MDA-MB-468, Α431, και ΒΤ20) αποκάλυψε ένα αμπλικόνιο στο χρωμόσωμα 7 που αποτελείται από ένα κύριο μέρος που περιέχει ολόκληρο το

EGFR

γονίδιο. Αυτό το κεντρικό στοιχείο επεκτείνεται κατά την κατεύθυνση τελομερών με ένα κοφτερό σύνορα στο άκρο (σχήμα 1 a, b), η οποία έδειξε ότι το αμπλικόνιο αρχίζει σε μια διακριτή αλληλουχία του DNA. Από την ανάλυση απλού κυττάρου των ΜϋΑ-ΜΒ-468 κύτταρα που εμφανίζουν διαφορετικές

EGFR

αντιγραφή αριθμούς, οι ακριβείς σύνορα amplicon υπολογίστηκαν με τη λειτουργία εξομάλυνσης του αλγορίθμου Quantsmooth [12]. Μία περαιτέρω επέκταση του αμπλικονίου βρέθηκε σε MDA-MB-468 κύτταρα με την υψηλότερη απολαβή αριθμού αντιγράφων (32 αντίγραφα), που δείχνει μια επιπλέον επέκταση αλληλουχία στην κεντρομερική θέση (Εικόνα 1Β). Τα δεδομένα που επικυρώθηκαν από ποσοτική SYBR πράσινο PCR χρησιμοποιώντας LINE1 επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες ως αναπόσπαστο συνεχή έλεγχο αντίγραφο [13] (Πίνακας S3 και S4). Αυτή η προσέγγιση επιτρέπει να αναπαραχθούν ποσοτικοποίηση απόλυτη DNA σε ένα μόνο κύτταρο, το οποίο δεν έχει αναφερθεί μέχρι στιγμής.

Περιγραφή της amplicon EGFR σε μονά κύτταρα με qPCR

επόμενος στόχος μας ήταν η ανάπτυξη ενός αξιόπιστη δοκιμασία που μπορούν να βοηθήσουν τις αποφάσεις της θεραπείας στην κλινική ρουτίνα. Τα αποτελέσματα του προστίμου-πλακόστρωση array-CGH έχουν δείξει ότι οι ενισχυμένες περιοχές διαφέρουν σε μήκος που εξαρτάται από το επίπεδο της ενίσχυσης σε ολόκληρη την περιοχή (εικόνα 1), αλλά σε όλες τις περιπτώσεις, η

EGFR

εαυτό γονίδιο είναι περιλαμβάνεται. Με βάση τα επίπεδα αριθμό αντιγράφων προσδιορίζεται με ανάλυση της σειράς πρόστιμο-πλακόστρωση, θα τυποποιηθεί απόλυτες μετρήσεις qPCR για τις

EGFR

εξώνια 4, 7, 9, 15, και 21 και το μη-κωδικοποίησης 5′-αλληλουχία του αμπλικονίου στη θέση 54.485.000 σε SYBR πράσινο δοκιμασία για να περιγράψει με ακρίβεια

EGFR

ενισχύσεις σε ένα μόνο κύτταρο (Πίνακας S5). Η αποτελεσματικότητα της PCR κυμάνθηκε μεταξύ 98,07% και 99,02% (μέσος όρος: 98,78%, SD 0,36). Όλες οι αναλύσεις έδειξαν συνεπή αποτελέσματα όπως παρουσιάζονται στην Εικόνα 2Α. Σε κλινικές ρουτίνα, όπου μια απλή και ισχυρή δοκιμασία είναι επιθυμητή, η μείωση αυτών των αντιδράσεων PCR σε εξώνιο 7 και 9 και στο 5′-άκρο αλληλουχία είναι επαρκής

α:. Ποσοτική PCR δοκιμασίες για διαφορετικούς

EGFR

εξώνια σε MDA-MB-468 κλώνους b: οι καμπύλες βαθμονόμησης από τους προσδιορισμούς qPCR για τον έλεγχο LINE-1 και

EGFR

εξώνια 7 και 9, τα οποία δείχνουν ότι αποτελεσματικότητες ενίσχυσης του ελέγχου, όπως καθώς και δείγμα DNA είναι παρόμοια. c, d: Αποτελέσματα της ανάλυσης qPCR του εξονίου 7 και 9 σε μονά κύτταρα όγκου από ασθενείς με καρκίνο. c: Boxplots μετρήσεων qPCR των 10 μη-καρκινική κύτταρα από 3 διαφορετικούς ασθενείς. Η διάμεση τιμή των τιμών που μετρήθηκαν στα μη καρκινικά κύτταρα είναι περίπου 0,9 (οριζόντια γραμμή σε κουτιά). Οι τιμές πάνω από 95% όρια εμπιστοσύνης 1.377 και 1.679 θεωρούνται κέρδος του εξονίου 7 και 9, αντίστοιχα. Τα μονά μαύρες κουκίδες αντιπροσωπεύουν τις τιμές που μετρώνται στα καρκινικά κύτταρα από δείγματα ασθενών, σύμφωνα με τον πίνακα που περιλαμβάνεται στο δ.

Η

Γονιδιωματική ετερογένεια στα καρκινικά κύτταρα του αίματος που μεταδίδονται και DTC πληθυσμών από μεμονωμένους ασθενείς

για να διερευνηθεί κατά πόσον η παρούσα ολοκληρωμένη προσέγγιση που αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας MDA-MB-468 κυττάρων, όπως το μοντέλο είναι επίσης κατάλληλη για τις αναλύσεις των δειγμάτων ασθενών, εξετάσαμε δείγματα αίματος και τα δείγματα μυελού των οστών από ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [5], [14]. Οι Cytokeratin και EpCAM αντισώματα χρησιμοποιούνται ως δείκτες για την ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων στο αίμα που μεταδίδονται ή διαδίδονται [5]. Απομονώσαμε διάφορα μεμονωμένα κύτταρα, χρωματίστηκαν με το αντίσωμα A45B /Β3, από διαφορετικά δείγματα ασθενών με μικροχειρισμού και εκτελείται WGA όπως περιγράφεται παραπάνω. Το WGA απέδωσε σε 1,96 έως 2,84 μg DNA (μέσος όρος: 2,36 μg, SD 0,25), η οποία είναι συγκρίσιμη με την απόδοση που λαμβάνεται από απλά καλλιεργημένα κύτταρα. WGA ελέγχθηκε με τη χρήση του LINE1 DNA [13], η οποία απέδωσε μία μέση 330 ng (εύρος 3 ng-621 ng, SD 211) προϊόν ενίσχυσης και επέτρεψε την ακριβή υπολογισμό της PCR-ενισχύσιμου DNA σε κάθε δείγμα. Από κάθε δείγμα ασθενούς, αναλύσαμε τέσσερα κύτταρα με qPCR για τα εξόνια 7 και 9 (σχήμα 2) και το 5′-άκρο-αλληλουχία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι τιμές του

EGFR

μετρήσεις σε μη καρκινικά κύτταρα έχουν μια μέση περίπου 0,9 και στις δύο αναλύσεις qPCR, η οποία αναμένεται να αντικατοπτρίζουν το κανονικό αριθμό αντιγράφων των 2 (οικόπεδα κουτί του σχήματος 2γ). Σε σύγκριση με τις τιμές αυτές, το ένα τρίτο των κυττάρων έδειξε ένα υψηλό

EGFR

ενίσχυση τουλάχιστον 5 φορές (ρ & lt? 0,0001), και περίπου 25% των δειγμάτων έδειξε ένα κέρδος μεταξύ 2- και 3-φορές (p & lt? 0.001). Τα αναλυτικά αποτελέσματα για τα μονά κύτταρα φαίνεται στο σχήμα 2γ και 2δ. Ένα δείγμα δεν έδειξε συνοχή μεταξύ των μετρήσεων στα εξόνια 7 και 9. Για αυτό το δείγμα, πραγματοποιήσαμε πρόσθετες μετρήσεις qPCR επί εξώνια 4, 15, και 21, τα οποία όλα δείχνουν ένα κανονικό αριθμό αντιγράφων για το αντίστοιχο τόπο. Κανένα μεμονωμένο κύτταρο όγκου παρουσιάζονται με μια «κανονική» αριθμού αντιγράφων γονιδίου. Τα καρκινικά κύτταρα χωρίς ενίσχυση του γονιδίου EGFR έδειξαν τιμές χαμηλού αριθμού αντιγράφων (& lt? 0,7). Αυτές οι τιμές είναι μάλλον αναμένεται να προκληθεί από μεταβολή στη διαδικασία WGA παρά από τεχνικά αντικείμενα της qPCR, δεδομένου ότι το υπολογιζόμενο αρχικού ποσού του DNA από τα περισσότερα δείγματα που εφαρμόζεται στην αντίδραση qPCR (& gt? 40 PG) είναι επαρκής για την αξιόπιστη μετρήσεων και είναι στην περιοχή των καμπυλών βαθμονόμησης όπως φαίνεται για την Γραμμή 1 εγγενή ελέγχου (εικόνα 2d).

Συζήτηση

ο σκοπός της μελέτης ήταν η ανάπτυξη ενός πρωτοκόλλου που επιτρέπει την ποσοτική γονιδιωματικής ανάλυσης της ενιαίας κύτταρα όγκου. Πρωτογενή καρκινικά κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης είναι ετερογενείς. Έχει σκεφτεί ότι μόνο ένα μικρό ποσοστό αυτών των κυττάρων εμφανίζουν συγκεκριμένες «βλαστικών κυττάρων – όπως» χαρακτηριστικά και μπορεί να προκαλέσει μεταστάσεις (αναθεωρούνται στο [15]). Αυτά τα κύτταρα μπορούν να χαρακτηρίζονται από ειδικές γονιδιωματικές εκτροπές που θα τους παρέχουν πλεονεκτήματα ανάπτυξης και μια πιο επιθετική φαινότυπο. Αυτή η άποψη υποστηρίζεται από τα δεδομένα από μελέτες με αναστολείς του EGFR ως τέτοια, EGFR-μεταλλαγμένο αδενοκαρκίνωμα αντιπροσωπεύουν μια μοναδική κλινική οντότητα που απαιτούν μοριακή διάγνωση για την καθοδήγηση της θεραπείας [1]. Επιπλέον, η παραγωγή ανθεκτικών θεραπεία κυτταρικών κλώνων που φέρουν επιπρόσθετες μεταλλάξεις του EGFR ή πολλαπλασιασμούς τη διάρκεια της θεραπείας, καθώς και την υπερέκφραση και ενίσχυση του EGFR που ρυθμίζουν γονιδίων, π.χ. ERFI1, έχουν ήδη αναφερθεί [2], [16] Ως εκ τούτου, η γονιδιωματική έρευνα των απλών κυττάρων όγκου τα οποία είτε διαμένουν στο αίμα ή στο μυελό των οστών μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της πρόβλεψης μοριακή διάγνωση. Ιδιαίτερη στον καρκίνο του μαστού, EGFR σηματοδότηση φαίνεται να ρυθμίζεται προς τα πάνω στην βασική-όπως όγκους (triple-αρνητικά), ειδικά σε κύτταρα με βλαστικών κυττάρων, όπως χαρακτηριστικά [6], [7], [17], [18]. Υπάρχουν προκαταρκτικά πειραματικά δεδομένα ότι benetits από EGFR στοχευμένη θεραπεία με cetuximab ή laptinib σχετίζονται με το επίπεδο ενίσχυσης EGFR [6].

Πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν διερευνήσει την δυνατότητα να αναλύσει ένα μόνο κύτταρο όγκου σε μοριακό επίπεδο [19] , [20]. Έχει αποδειχθεί ότι είναι δυνατή η γονιδίωμα ευρεία ανίχνευση εκτροπών με τη χρήση συστοιχιών BAC στα λευκοκύτταρα και κύτταρα κυτταρικής γραμμής [21]. Επιπλέον, οι μελέτες των Stoecklein et al έδειξε μία απόκλιση μεταξύ της πρωτοβάθμιας και της συστημικής νόσου [19] σε ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου, το οποίο δείχνει εντυπωσιακά την ανάγκη της ανάλυσης του ενιαίου διαδίδονται καρκινικά κύτταρα.

Στη μελέτη μας, επέλεξαν το μοντέλο κυτταρικής γραμμής MDA-MB-468 για την ανάπτυξη του πρωτοκόλλου λόγω των διαφορετικών σταθερά επίπεδα ενίσχυση EGFR σε διαφορετικούς κλώνους αυτής της κυτταρικής γραμμής. Με αυτό, τα κύτταρα αυτά με κάποιο τρόπο να μιμηθεί την ετερογενή

in vivo

κατάσταση και να χρησιμεύσει ως μια καλά ισορροπημένη ελέγχου για τον προσδιορισμό των επιπέδων του γονιδίου αντιγράφου. Μπορούμε να δείξουμε ότι το ενισχυμένο DNA που λαμβάνεται από ένα μόνο κύτταρο είναι επαρκούς ποιότητας για να χρησιμοποιηθεί σε μια υψηλής ανάλυσης λεπτή πλακάκια ανάλυση της σειράς. Τα προφίλ των μεμονωμένων κυττάρων δείξει περισσότερα στοιχεία, αλλά σε σύγκριση με τα προφίλ από γονιδιακό DNA του πληθυσμού κυττάρων τα ίδια αμπλικονίου σύνορα μπορούν να προσδιορίζονται σαφώς. Γονιδιώματος μεγάλη ανάλυση arrayCGH δίνει μια εξαιρετική εικόνα για τη μεγάλη εκτροπές του γονιδιώματος μέσα σε ένα μόνο κύτταρο, αλλά η ποσοτικοποίηση των γονιδιακών αλλαγών είναι περιορισμένος. Μια προσέγγιση qPCR δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαλογή νέων εκτροπών, αλλά μας επιτρέπει να ποσοτικοποιηθεί γνωστών, δυνητικά κλινικά σχετική ενίσχυση και διαγραφές. Με την χρήση της τεχνικής qPCR, διαφορές στον αριθμό αντιγράφων του γονιδίου θα μπορούσαν να διακριθούν σαφώς, καθώς το επίπεδο του γονιδιακού DNA από μια δεξαμενή κυττάρων ως επί το ενισχυμένο DNA που λαμβάνεται από ένα μόνο κύτταρο. Θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι κύτταρα που λαμβάνονται από έναν συγκεκριμένο ασθενή είναι ετερογενείς όσον αφορά την ενίσχυση του γονιδίου EGFR τους. Η ανάλυση του μόνο μία ή δύο κύτταρα ανά δείγμα αίματος μπορεί να οδηγήσει σε αποτελέσματα τα οποία μπορεί να μην αντανακλούν την πραγματική κλινική κατάσταση. Ανάλυση των ως πολλά κύτταρα όσο το δυνατόν είναι απαραίτητο να εντοπιστούν αυτά τα κύτταρα τα οποία δεν μπορούν να στοχεύονται με μία ειδική θεραπεία λόγω της ετερογένειας του κυτταρικού πληθυσμού. Η διαπίστωση αυτή, εφόσον επιβεβαιωθεί σε μια μεγαλύτερη ομάδα των δειγμάτων, θα μπορούσε να προσφέρει νέες ιδέες στη βιολογία της μετάστασης και μπορεί να βοηθήσει να εξηγήσει την αποτυχία των στοχευμένων θεραπειών σε ένα σημαντικό ποσοστό των ασθενών.

Η χρήση ενός ποσοτικού προσδιορισμού PCR εμφανίζει μια ισχυρή και οικονομικά αποδοτική μέθοδο που μπορεί να καθοριστεί κάτω από συνήθεις συνθήκες. Σε σύγκριση με την χρήση του προστίμου-πλακόστρωση-μικροσυστοιχίες, τα οποία είναι πιο δαπανηρή και λιγότερο ισχυρή όσον αφορά την ερμηνεία των δεδομένων, αυτό μέθοδοι θα μπορούσαν ενδεχομένως να χρησιμοποιηθούν σε κλινικές ρουτίνα για την μοριακή διερεύνηση των απλών κυττάρων. Η μέθοδος αυτή για πρώτη φορά, εμφανίζει μια απλή προσέγγιση για την ποσοτικοποίηση της ποσότητας DNA ενός ειδικού γονιδιωματική περιοχή από το ένα μόνο κύτταρο.

Με αυτό, παρουσιάζουμε μια αξιόπιστη μέθοδο για την απόλυτη ποσοτικό προσδιορισμό της γονιδιακής αντίτυπα στην ενιαία καρκίνο κύτταρα που απομονώνονται από περιφερικό αίμα ή το μυελό των οστών των ασθενών με καρκίνο. Η μέθοδος αυτή δεν μπορεί να περιορίζεται σε διερεύνηση της βιολογίας της διάδοσης κυττάρων του όγκου, αλλά μπορεί επίσης να γίνει ένα νέο εργαλείο για την αξιολόγηση της ενιαίας γονιδιωματικής κυττάρου με ευρεία εφαρμογή σε πολλούς τομείς της πειραματικής έρευνας. Επιπλέον, μπορεί να προβλεφθεί μέλλον κλινικές εφαρμογές. Πέρα από την έρευνα του

EGFR

γονίδιο, η μέθοδός μας μπορεί να προσαρμοστεί για την αξιολόγηση άλλων μοριακών στόχων (π.χ. HER2 [21]), και να αναλύσει τα καρκινικά κύτταρα σε άλλα κυτταρολογικά δείγματα, όπου το χαμηλό ποσοστό των κυττάρων του όγκου όρια οι γονιδιωματικές αναλύσεις από τις τρέχουσες μεθόδους.

Υλικά και μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

από τους ασθενείς που έδωσαν δείγματα αίματος, γραπτή συγκατάθεση έχει ληφθεί. Από δείγματα μυελού των οστών συλλέχθηκαν μετά από αυτοψία, γραπτή έγκριση δόθηκε από τα μέλη της οικογένειας. Η χρήση των ιατρικών αρχείων, το αίμα και το μυελό των οστών εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Ιατρικού Συμβουλίου του Αμβούργου (αριθμός αναφοράς # 190504).

Γραμμές κυττάρων και καλλιέργεια

Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού MDA -ΜΒ-468, ΒΤ-20, και MCF-7 καθώς και η κυτταρική γραμμή καρκινώματος Α431 αποκτήθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 5% ορό απενεργοποιημένο με θέρμανση εμβρυϊκό ορό σε 5% CO

2. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% έως 80% συρροή πριν από τη συγκομιδή και τη μεταφορά σε διαφάνειες για ενιαία μάζεμα των κυττάρων.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Τα κύτταρα επωάστηκαν για 45 λεπτά με το πρωτογενές αντίσωμα A45B /Β3 (Micromet, Μόναχο, Γερμανία), που ακολουθείται από ένα στάδιο πλύσεως και επώαση 30 λεπτά με ένα γεφύρωσης κουνελιού-αντι-ποντικού αντίσωμα (Z0259, Dako, Glostrup, Δανία). Η ανίχνευση έχει πραγματοποιηθεί με το σύμπλοκο μονοκλωνικό ποντικού-ΑΡΑΑΡ (Dako, Glostrup, Denmark) και ΒΟΙΡ /ΝΒΤ ως χρωμογόνο υπόστρωμα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (BioRad, Hercules, CA, USA).

Τα δείγματα ασθενούς

Τα δείγματα ασθενών ελήφθησαν από το Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία. χρησιμοποιήθηκαν αρχειακό δείγματα μυελού των οστών για κυτοστροβιλίσματα. Από τους ασθενείς που έδωσαν δείγματα αίματος, γραπτή συγκατάθεση έχει ληφθεί. Αυτά τα δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε αυτοψία και της οποίας τα μέλη της οικογένειας είχαν δώσει γραπτή έγκριση να λαμβάνουν δείγματα μυελού των οστών για ερευνητικούς σκοπούς. Η διαδικασία αυτή έχει εγκριθεί από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας. Από τους ασθενείς που έδωσαν δείγματα αίματος, γραπτή συγκατάθεση έχει ληφθεί.

Διαδικασία εμπλουτισμού για τα καρκινικά κύτταρα του αίματος που μεταδίδονται και DTC

δείγματα μυελού των οστών και δείγματα περιφερικού αίματος έχουν υποστεί επεξεργασία από ένα FICOLL- διαβάθμιση πυκνότητας να εμπλουτίσουν μονοπύρηνα κύτταρα και πιθανώς επιθηλιακά κύτταρα όγκου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Σύντομα, τα δείγματα μυελού των οστών ελήφθησαν από την άνω λαγόνιο ακρολοφία με αναρρόφηση με βελόνα και αποθηκεύονται σε σωλήνες με ηπαρίνη θεραπεία. Τα μονοπύρηνα κύτταρα συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του όγκου διαχωρίστηκαν με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας Ficoll-Hypaque, με πυκνότητα 1,077 g /ml. 7 × 10

5 κύτταρα περιδινήθηκαν σε γυάλινες πλάκες, ξηραίνεται σε θερμοκρασία δωματίου και αποθηκεύονται στους -80 ° C.

Μεταφορά μεμονωμένων κυττάρων

1. Σιλυλίωσης γυαλιού ραβδιά.

Οι γυάλινες ράβδοι με διάμετρο 1.9 έως 2.3 mm ξεπλύθηκαν για μία ώρα σε 85 ° C σε ένα διάλυμα 10% Neodisher Laboclean FT (Dr. Weigert, Αμβούργο, Γερμανία). HPLC-καθαρό νερό χρησιμοποιήθηκε για όλα τα στάδια αραίωσης και το πλύσιμο. Μετά την ξήρανση, οι ράβδοι ήταν επηρεάζονται σε H

2SO

4 (98%, Merck, Darmstadt, Germany) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και ξεπλένονται με νερό. Sticks αφέθηκαν να στεγνώσουν για 15 λεπτά στους 110 ° C και στη συνέχεια επηρεάζονται σε 0.5% octadecyltrichlorsilane στο κλάσμα οκτάνιο (Fluka, Erlangen, Germany) για δύο ώρες. Μετά από επώαση σε 96% αιθανόλη για μία ώρα, τα υπολείμματα αιθανόλης και σιλανίου απομακρύνθηκαν με έκπλυση με νερό προσεκτικά και δυναμικά. Sticks μπορεί να αποθηκευτεί ξηρό και σκοτεινό μέρος για έως οκτώ εβδομάδες.

2. ρυθμιστικού διαλύματος λύσης.

Το ρυθμιστικό λύσης αποτελείται από 0,25% Ν-λαουροϋλ σαρκοσίνη, 2 Μ θειοκυανικό γουανιδίνιο, 0,01 Μ κιτρικό νάτριο ρΗ 7,0, και 1% διμεθυλοσουλφοξείδιο σε HPLC-καθαρό νερό. Το ρυθμιστικό αποστειρώθηκε με διήθηση μέσω φίλτρου 0,2 μm PES (VWR, Darmstadt, Germany) και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση.

3. Stick παρασκεύασμα.

Πριν από τη χρήση, DTT προστέθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης σε μια τελική συγκέντρωση 60 mM. Η πλήρης ρυθμιστικό λύσης αραιώθηκε 1:10 με HPLC-καθαρό νερό. Στο ένα άκρο του κάθε ποτήρι ραβδί, 0.2 μΐ πλήρους ρυθμιστικού λύσης εφαρμόστηκε και αφέθηκε να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι την πλήρη ξηρότητα. Τα υπόλοιπα άλατα αποτελούν σήμερα τη λεγόμενη «Lysospot».

4. Ενιαία μάζεμα των κυττάρων

Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τη χρήση ενός μικροχειριστής:. Η μικροενετήρα Celltram Vario και μικροεπεξεργαστής TransferMan NKII (Eppendorf Instruments, Αμβούργο, Γερμανία) ήταν εξοπλισμένα με ειδικά σχεδιασμένα, ευέλικτο τριχοειδή τύπου customTip ΙΙΙ με εσωτερική διάμετρο 40 μm και ένα λοξό άκρο (45 °), που αναπτύχθηκε σε στενή συνεργασία με Eppendorf Όργανα. Τα κύτταρα μεταφέρονται από το γυάλινο πλακίδιο κάτω από οπτικό έλεγχο από μια πυρηνική φθορίζουσα βαφή ϋΑΡΙ για να εξασφαλιστεί ότι όλο το πυρήνων συνελήφθησαν. Για να αποφευχθεί η απώλεια υλικού κατά τη διάρκεια της μεταφοράς και της λύσης των κυττάρων, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν άμεσα από το τριχοειδές στο σιλανίου επικαλυμμένο γυαλί ραβδί που φέρουν το Lysospot. Λόγω του σιλανίου επικάλυψης, DNA δεσμευτική στο γυαλί θα εμποδίζεται. Επιπλέον, τα άλατα της Lysospot συμπυκνώθηκε σε ένα πολύ μικρό χώρο λόγω των αλλαγών στην επιφανειακή τάση, λόγω της επικάλυψης. Η πλήρης Lysospot ενεργοποιείται με απόφαση οφείλεται στο υδατικό γύρω κατά τη διάρκεια της μεταφοράς του χειραγωγείται κυττάρων. Το κύτταρο που περιέχει γυάλινο ραβδί μεταφέρθηκε σε 200 μΐ σωλήνα αντίδρασης PCR που περιέχει 9 μΐ ρυθμιστικού δείγματος του κιτ ενίσχυσης Genomiphi V2 (GE Healthcare Ευρώπη, Freiburg, Γερμανία) και μεταφέρθηκε σε -80 ° C για 15 λεπτά. Μετά την απόψυξη, προσετέθησαν 0,1 μΙ διάλυμα πρωτεάσης (Qiagen, Hilden, Γερμανία), που ακολουθείται από ένα στάδιο επώασης 15 λεπτά στους 50 ° C για την πέψη των πρωτεϊνών και ένα επιπλέον στάδιο επώασης 15 λεπτών στους 75 ° C για ένζυμο απενεργοποίησης.

ολόκληρο το γονιδίωμα ενίσχυση

Όλη η ενίσχυση γονιδιώματος έγινε με το κιτ Genomiphi V2 (GE Healthcare Ευρώπης, Freiburg, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με τις ακόλουθες τροποποιήσεις: το ποτήρι ραβδί παραμένει στο σωλήνα αντίδρασης κατά τη διάρκεια της ενισχύσεως. Η αντίδραση ενίσχυσης αφέθηκε να τρέξει για 150 λεπτά στους 30 ° C σε ένα συνολικό όγκο 20 μΙ. Το προϊόν WGA είχε καθαριστεί με στήλες NucleoSEQ σπιν (Macherey-Nagel, Düren, Γερμανία) και οι συγκεντρώσεις DNA μετρήθηκαν με την Nanodrop1000 (Peqlab, Erlangen, Γερμανία).

Μικροδορυφορικοί Ανίχνευση

Η κατάσταση αλληλόμορφο των πολυμορφικών επαναλήψεων ερευνήθηκε με ενίσχυση PCR ακολουθούμενη από διαχωρισμό είτε σε γέλη αγαρόζης 2% ή τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα συνολικό όγκο 10 μΐ κάτω από τις συνθήκες που δίδονται παρακάτω (Πίνακας S1) σε κλίση Mastercycler (Eppendorf Instruments, Αμβούργο, Γερμανία). Η θερμοκρασία συγκολλήσεως προσαρμόζονται σύμφωνα με τους εκκινητές που χρησιμοποιούνται όπως φαίνεται στον Πίνακα S2. Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός λέιζερ προκαλούμενη φθορισμού σύστημα τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης τεσσάρων χρωμάτων (AbiPrism 3130? Applied Biosystems, Wilmington, GE, USA) χρησιμοποιώντας GeneScan Πρότυπο ROX-500 για την αξιολόγηση μήκος θραύσματος. Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Genemapper αξιολόγηση v2.03 (Applied Biosystems, Wilmington, DE, USA).

Πρόστιμο Πλακάκια Array Ανάλυση

Το πρόστιμο σειρά πλακάκια σχεδιάστηκε από Nimblegen (Roche NimbleGen Inc. , Madison, WI) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22] σύμφωνα με προσαρμοσμένες παραμέτρους μας (Πίνακας S6). έχουν βάσεις που αποτελούν μέρος των επαναλαμβανόμενων στοιχείων έχουν απομακρυνθεί από το να θεωρηθεί για το σχεδιασμό του ανιχνευτή. Επιπλέον, τα επιλεγμένα ανιχνευτές δεν επιτρεπόταν να περιέχουν διφορούμενη κώδικες νουκλεοτιδίων. Πρόσθετα κριτήρια ήταν: θερμοκρασία 76 ° C, μήκος καθετήρα μεταξύ 50-75 bp ανόπτησης, ο ανιχνευτής επιτράπηκε να ταιριάζει μόνο μία φορά σε ολόκληρο το γονιδίωμα, σύμφωνα με διάταξη του ανθρωπίνου γονιδιώματος Μαρτίου 2006 (hg18), http: //genome.ucsc. edu (Πίνακας S6), και οι ανιχνευτές ιδανικά ξεκίνησε με μια μετατόπιση των 15 bp. Με αυτές τις προδιαγραφές, περίπου 395.000 ανιχνευτές μπορούν να εντοπιστούν σε μια συστοιχία. Τα σύνορα των αμπλικονίων των διαφορετικών κλώνων κυττάρων MDA-MB-468 υπολογίστηκαν από τη λειτουργία εξομάλυνσης του αλγορίθμου Quantsmooth [12] και επικυρώνονται στη συνέχεια από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Για το σκοπό αυτό, το συνολικό ποσό των 53 SYBR πράσινο δοκιμασίες σχεδιάστηκαν πλαισιώνουν το υπολογιζόμενο έναρξης και τελικά σημεία που μοιράζονται τις ίδιες προδιαγραφές. Οι δοκιμασίες σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν ενικό γονιδιωματικές αλληλουχίες 50-150 bps το μήκος να εξασφαλισθεί η ειδική ποσοτικοποίηση. Χρωμόσωμα 2 και το χρωμόσωμα 10 χρησιμοποιήθηκαν ως σταθερές περιοχές αναφοράς σύμφωνα με Naylor

et al.

[11]. Εάν είναι απαραίτητο, η υπολογιζόμενη έναρξης και τελικά σημεία διορθώθηκαν με βάση το array CGH πλοκή και τα αποτελέσματα qPCR.

Ποσοτική RT-PCR

Η ποσοτικοποίηση του μέσου αριθμού αντιγράφων γονιδίου του

EGFR

πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ειδικών εκκινητών που στοχεύουν ενικό ακολουθίες των 50-150 bps μέσα διαφορετικά εξώνια του

EGFR

γονίδιο όπως δίνονται στον πίνακα S3. Οι αντιδράσεις PCR εκτελέστηκαν σε Mastercycler epgradientS Realplex4 υπό τις συνθήκες που δίνονται στον Πίνακα S4in ένα συνολικό όγκο 15 μΙ. Κάθε δείγμα μετρήθηκε εις τριπλούν. Μια ξεχωριστή καμπύλη βαθμονόμησης δημιουργήθηκε για το καθένα όπως λένε σε κάθε κίνηση χρησιμοποιώντας λευκοκυττάρων DNA από τον ίδιο ασθενή που κυμαίνονται από 10-0.15 ng ανά αντίδραση. Οι συγκεντρώσεις DNA ομαλοποιήθηκαν αναφερόμενος στο σταθερό αριθμό αντιγράφων LINE1 αναφοράς [13]. αναλύσεις τήξη πραγματοποιήθηκαν μετά από κάθε ανάλυση για την επαλήθευση ενίσχυσης μοναδικό προϊόν.

έχουν EGFR

αριθμό αντιγράφων του γονιδίου έχουν προσδιοριστεί με υπολογισμό της αναλογίας μεταξύ του ποσού DNA στο

EGFR

περιοχή διαιρούμενη με την ποσότητα του DNA στην περιοχή αναφοράς. Ένα κανονικό, διπλοειδή αριθμό αντιγράφων γονιδίου είναι ιδανικά αντανακλάται από 1 (2n /2π), τρία αντίγραφα του

EGFR

γονίδιο θα πρέπει να αναμένεται γύρω στο 1,5 (3Ν /2n). Για τον υπολογισμό της cut-off για να καλέσει ένα δείγμα που έχει αποκτηθεί, χρησιμοποιήθηκαν 95% όρια εμπιστοσύνης των τιμών αναφοράς (). Όλες οι μετρήσεις πάνω από το ανώτερο όριο θεωρήθηκαν ένα

EGFR

αριθμό αντιγράφων του γονιδίου κέρδος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. πρωτόκολλο

PCR του μικροδορυφορικού PCR.

doi: 10.1371 /journal.pone.0026362.s001

(PDF)

Πίνακας S2.

Επισκόπηση των αλληλουχιών των εκκινητών μικροδορυφόρων.

doi: 10.1371 /journal.pone.0026362.s002

(PDF)

Πίνακα S3. ζεύγη εκκινητών

PCR για την qPCR του

EGFR

γονίδιο.

doi: 10.1371 /journal.pone.0026362.s003

(PDF)

Πίνακας S4. πρωτόκολλο

PCR για το

EGFR

-qPCR.

doi: 10.1371 /journal.pone.0026362.s004

(PDF)

Πίνακας S5. ζεύγη

εκκινητή PCR στο χρωμόσωμα 7.

doi: 10.1371 /journal.pone.0026362.s005

(PDF)

Πίνακας S6.

contigs για το σχεδιασμό διάταξης.

doi:. 10.1371 /journal.pone.0026362.s006

(PDF)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Α BAUCHE και O. Mauermann για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια