Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι σε μεγάλο βαθμό ανίατη ασθένεια, και αυξανόμενες ενδείξεις ενισχύει τις στρατηγικές που στοχεύουν πολλαπλές μοριακή μεσολαβητές των κρίσιμων λειτουργιών του παγκρεατικού πόρου κύτταρα αδενοκαρκινώματος. Η ενδοκυτταρική οξειδοαναγωγική κατάσταση ρυθμίζει τη δραστηριότητα των διαφόρων οδών μεταγωγής σήματος και βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής επιβίωσης, αντοχή φαρμάκου και την ανταπόκριση σε μικροπεριβάλλον παράγοντες. Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι ο παράγοντας μεταγραφής STAT3 είναι υπό έλεγχο οξειδοαναγωγής, αλλά οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στη ρύθμιση της είναι άγνωστη. Εδώ, αποδεικνύουμε για πρώτη φορά ότι η δέσμευση STAT3 DNA και μεταγραφική δραστικότητα ρυθμίζεται άμεσα από την λειτουργία οξειδοαναγωγής του APE1 /Ref-1 ενδονουκλεάση, χρησιμοποιώντας υπερέκφραση και οξειδοαναγωγής ειδικών μεταλλάξεων στρατηγικές, και γονίδιο knockdown. Επίσης, φαρμακολογική αποκλεισμό της APE1 /Ref-1 από την οξειδοαναγωγική-εκλεκτικός αναστολέας E3330 καταργεί δεσμευτική STAT3 DNA. Από APE1 /Ref-1 ασκεί επίσης τον έλεγχο οξειδοαναγωγής σε άλλους μεταγραφικούς παράγοντες σχετίζονται με τον καρκίνο, εκτιμήσαμε την επίδραση της διπλής στόχευσης της σηματοδότησης STAT3 και APE1 /Ref-1 οξειδοαναγωγής στις λειτουργίες του παγκρέατος καρκινικών κυττάρων. Παρατηρήσαμε ότι η διακοπή της APE1 /Ref-1 δραστηριότητας οξειδοαναγωγής συνεργεί με αποκλεισμό STAT3 να αναστέλλουν ισχυρά τον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα των ανθρώπινων κυττάρων PDAC. Μηχανιστικά, δείχνουμε ότι STAT3-APE1 /Ref-1 διπλή στόχευση προάγει έντονη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, με την εμπλοκή της κασπάσης-3 σηματοδότηση, οι οποίες αυξήθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τα αποτελέσματα που προκαλούνται από ενιαίο αποκλεισμό στόχο. Επίσης, δείχνουμε ότι STAT3-APE1 /Ref-1 διπλός αποκλεισμός έχει ως αποτέλεσμα σημαντική αναστολή της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων. Συνολικά, το έργο αυτό αποδεικνύει ότι η μεταγραφική δραστηριότητα της STAT3 άμεσα ρυθμίζεται από τη λειτουργία οξειδοαναγωγής του APE1 /Ref-1, και ότι η ταυτόχρονη αποκλεισμό της STAT3 και APE1 /Ref-1 οξειδοαναγωγής synergize αναστέλλουν αποτελεσματικά κρίσιμες λειτουργίες των κυττάρων PDAC.

Παράθεση: Cardoso AA, Jiang Υ, Luo Μ, Reed AM, Shahda S, Ο Υ, et al. (2012) APE1 /Ref-1 Ρυθμίζει STAT3 μεταγραφική δραστηριότητα και APE1 /Ref-1-STAT3 διπλή στόχευση αποτελεσματικά αναστέλλει καρκίνο του παγκρέατος κυττάρων επιβίωσης. PLoS ONE 7 (10): e47462. doi: 10.1371 /journal.pone.0047462

Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: 27 του Απρίλη του 2012? Αποδεκτές: 17 Σεπτεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Οκτώβρη, 2012

Copyright: © Cardoso et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση για το έργο αυτό προβλέπεται από τα Εθνικά Ινστιτούτα του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας του Καρκίνου (NCI) CA121168, CA114571 και CA121168S1 (MRK), CA122298 (MLF), CA113669, CA134292 και CA134767 (AM) Ίδρυμα (MRK) www.rileykids του Riley Παιδική .org /και ο Ralph W. και η Grace Μ Showalter Trust Fund Research (MLF). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και δηλώνουν ότι δεν έχουν καμία σύγκρουση συμφερόντων με εξαίρεση για Dr. Mark R. Kelley ο οποίος είναι ο επικεφαλής των επιστημονικών ιδρυτής και σύμβουλος για Apex Therapeutics, μια εταιρεία που έχει άδεια IP από τη δουλειά του. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανίατη ασθένεια, με τους ασθενείς που αντιμετωπίζουν τη χειρότερη επιβίωση 5 ετών ποσοστό οποιουδήποτε καρκίνου. Η πρόκληση είναι να προσδιοριστούν οι μοριακές τελεστές που ρυθμίζουν κριτικά την επιβίωση των κυττάρων παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC), να σχεδιάσουν αποτελεσματικά μοριακού στοχευμένες στρατηγικές που μπορεί να αποτρέψει ή να ελαχιστοποιήσει την επιλογή ανθεκτικών ποικιλιών των όγκων, και να ξεπεράσουν τον προστατευτικό ρόλο του σχετίζονται με τον όγκο ίνωση και στρώμα. Αύξηση στοιχεία υποστηρίζουν την ανάγκη για στρατηγικές που στοχεύουν πολλαπλές μοριακές τελεστές σε PDAC. Έτσι, μια στρατηγική είναι να εντοπίζονται τα κρίσιμα μόρια που ρυθμίζουν πολλαπλές μεσολαβητές σηματοδότησης (ως παράγοντες μεταγραφής) και ενδοκυτταρική μηχανισμούς με άμεσες επιπτώσεις στις πολλαπλές οδούς κρίσιμες για PDAC λειτουργίες.

APE1 /Ref-1 (εφεξής APE1 ) είναι μία διπλή πρωτεΐνη λειτουργία, η οποία εκτός από την δραστικότητα επιδιόρθωσης DNA εξασκεί επίσης έλεγχο οξειδοαναγωγής των παραγόντων μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένου του ΝΡ-κΒ, ρ53, ΑΡ-1, ο HIF-1 και άλλοι [1], [2]. Η θεραπεία με E3330, έναν αναστολέα σηματοδότησης μικρού μορίου οξειδοαναγωγής που αναγνωρίζει μια εναλλακτική, οξειδοαναγωγής δραστική διαμόρφωση του APE1 [3], αναστέλλει σημαντικά το DNA δεσμευτική και μεταγραφική δραστικότητα του ΝΡ-Β, ΑΡ-1, και HIF-1 [4], [5 ]. Λειτουργώντας ως παράγοντα οξειδοαναγωγής, APE1 διεγείρει τη δραστηριότητα δέσμευσης DNA των παραγόντων μεταγραφής με τη μείωση υπολείμματα κυστεΐνης στην περιοχή πρόσδεσης του DNA του μεταγραφικού παράγοντα «στόχο». [6] Ενώ ο οργανισμός διαθέτει συστήματα γενική μείωση-οξείδωσης (θειορεδοξίνη και γλουταρεντοξίνη /γλουταθειόνη), [7], [8] APE1 λειτουργεί διαφορετικά καθώς ρυθμίζει επιλεκτικά παράγοντες που ρυθμίζουν άμεσα κρίσιμες κυτταρικές λειτουργίες, περιλαμβανομένων υποξία, την επιδιόρθωση του DNA, φλεγμονή, και την αγγειογένεση. [4], [9], [10] το προηγούμενο έργο μας ιδρύθηκε APE1 ως πιθανή μοριακό στόχο σε PDAC, αποδεικνύοντας ότι ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος και περι-παγκρεατικών μεταστάσεις παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση APE1 [11], και ότι ο αποκλεισμός του APE1 καθυστερήσεων δραστηριότητας οξειδοαναγωγής . εξέλιξη του όγκου σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ανθρώπινων PDAC, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του όγκου που λαμβάνονται από ασθενή [4]

STAT3 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ρυθμίζει κρίσιμες λειτουργίες των κυττάρων και παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές καρκίνους [12] – [15]. σηματοδότηση STAT3 έχει ενοχοποιηθεί σε παγκρεατικά βιολογία του καρκίνου, και συγκεκριμένα με τη μεσολάβηση ή τη ρύθμιση της κυτταρικής επιβίωσης, αγγειογένεσης και μετάστασης όγκου [16] – [18]. Αν και STAT3 σηματοδότησης μπορεί να εμπλακεί και να διαμορφώνονται από διαφορετικές διαδικασίες, η επίδραση του οξειδωτικού στρες και οξειδοαναγωγική κατάσταση του είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Μια πρόσφατη έκθεση κατέδειξε ότι η δραστηριότητα STAT3 είναι υπό έλεγχο redox και προσδιόρισε τις κρίσιμες οξείδωση ευαίσθητα κυστεΐνες στο DNA STAT3 τομέα δέσμευσης [19], [20]. Ωστόσο, ο τροποποιητής της STAT3 που το μετατρέπει από μια οξειδωμένη σε μία μειωμένη μορφή δεν έχει ταυτοποιηθεί. APE1 αλληλεπιδρά φυσικά με STAT3 στον υποκινητή του VEGF [21] και ενισχύει την IL-6 που προκαλείται από δραστικότητα δέσμευσης DNA των STAT3 σε κύτταρα HepG2 [22]. Ωστόσο, είναι άγνωστο εάν APE1 εμπλέκεται στον έλεγχο οξειδοαναγωγής της δραστηριότητας STAT3, και αν η κυτταρική οξειδωτική κατάσταση επηρεάζει σηματοδότηση STAT3 στα κύτταρα PDAC.

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι η δραστηριότητα οξειδοαναγωγής APE1 ρυθμίζει δέσμευσης και μεταγραφική STAT3 DNA δραστηριότητα, χρησιμοποιώντας γονιδιακή σίγηση, η υπερέκφραση του WT ή οξειδοαναγωγής ελαττωματικό APE1, και οξειδοαναγωγής εκλεκτική φαρμακολογική αναστολή. Ο αποκλεισμός του APE1 οξειδοαναγωγής συνεργεί με επιλεκτικούς ανταγωνιστές STAT3 να αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των ανθρώπινων κυττάρων PDAC, προώθηση κυτταρικής απόπτωσης. Οι μελέτες αυτές προσδιορίζουν τον μηχανισμό με τον οποίο APE1 ρυθμίζει την δραστηριότητα STAT3 και καθιερώνει το σκεπτικό για την ανάπτυξη της APE1- STAT3 στρατηγικές διπλής στόχευσης για τη θεραπεία της PDAC.

Αποτελέσματα

Redox Ελέγχου της STAT3 δραστηριότητα στο PDAC κύτταρα

Αν και δεσμευτική STAT3 DNA φέρεται να είναι υπό τον έλεγχο του redox [20], ο μοριακός μηχανισμός διαμεσολάβησης του κανονισμού αυτού είναι άγνωστη. Εδώ, ερευνήσαμε αν APE1 ρυθμίζει την δέσμευση DNA και μεταγραφική δραστηριότητα της STAT3 στο PDAC. Επιβεβαιώσαμε ενεργοποίηση STAT3 σηματοδότησης χρήση ανοσοκηλιδώσεως και EMSA (Σχήμα 1Α, Β). Και οι δύο κυτταρικές σειρές που λαμβάνονται από ασθενή και απαθανάτισε εκφράζουν APE1and έκθεμα STAT3 φωσφορυλίωσης (κατάλοιπα Y705) και πρόσδεσης στο DNA? όπως αναμενόταν, η δέσμευση STAT3 DNA ενισχύεται μετά από διέγερση με IL-6. Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της πρόσδεσης STAT3 DNA, εκτελέσαμε EMSA δοκιμασίες ανταγωνισμού με τη χρήση ανιχνευτών DNA κρύο (WT ή μεταλλαγμένης, STAT3 δέσμευσης-ελαττωματικός αλληλουχίες). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, μία εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στη STAT3 DNA δέσμευσης παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας τον ανιχνευτή ανταγωνιστή WT η οποία δεν παρατηρήθηκε με τη χρήση του μεταλλαγμένου ανιχνευτή. Εξειδίκευση αυτής της αλληλεπίδρασης αποδείχθηκε επίσης από μια ζώνη υπερμετατόπισης παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα STAT3-ειδικό αντίσωμα (Σχήμα 1D)

Α) Ανοσοκηλίδωση για STAT3 (pY705) σε κύτταρα PDAC.? συνολικά επίπεδα STAT3 φαίνεται στη μέση του πίνακα. Τα επίπεδα πρωτεΐνης APE1 δεικνύεται για τις γραμμές που λαμβάνονται από ασθενή και τουμπουλίνης είναι ο έλεγχος φόρτωσης. Β) STAT3 EMSA δοκιμασίας σε κύτταρα PaCa-2 διεγείρονται με IL-6, ΝΕ = πυρηνικό εκχύλισμα? Γ) Ανταγωνιστική EMSA για STAT3 χρησιμοποιώντας εκχύλισμα πυρήνων από κύτταρα PaCa-2 και είτε 25- ή 50-φορές κρύο καθετήρα (WT ή STAT3 δεσμευτική-ελαττωματικό μεταλλαγμένο)? Δ) υπερμετατόπισης της STAT3 DNA δεσμευτική χρήση πυρηνικού εκχυλίσματος? Ε) STAT3 EMSA δοκιμασία μετά από θεραπεία με DTT και διαμιδίου. ΣΤ) STAT3 EMSA δοκιμασίας μετά από θεραπεία με DTT ή αυξανόμενες συγκεντρώσεις διαμιδίου, όπως υποδεικνύεται. G) STAT3 EMSA δοκιμασία με μειωμένη APE1. DTT (carry-over) αντανακλά 0,04 mM DTT, όπως χρησιμοποιείται στην αντίδραση μετά τη μείωση της πρωτεΐνης APE1. Για όλες τις δοκιμασίες EMSA, πυρηνικό εκχύλισμα από κύτταρα PaCa-2 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με IL-6, εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά (50 ng /mL) για 2 ώρες σε 2% FBS.

Η

Ερευνήσαμε τις επιπτώσεις της οξειδωτικές και αναγωγικές συνθήκες επί της σύνδεσης STAT3 με το DNA, καθώς και υποθετικών ρύθμιση της από APE1, χρησιμοποιώντας PDAC πυρηνικά εκχυλίσματα και θεραπεία με διαμίδιο ή DTT. Οξειδωτικές συνθήκες (διαμίδιο) καταργεί τη σύνδεση του STAT3 στο DNA (Σχήμα 1 Ε, F)? Σε αντίθεση, πυρηνικά εκχυλίσματα κατεργάζεται με τον αναγωγικό παράγοντα DTT έδειξαν αυξημένη σύνδεση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο STAT3 DNA (Σχήμα 1 Ε? 1,4 σε 2-πλάσια αύξηση). Δεδομένου ότι η κατάσταση οξειδοαναγωγής των STAT3 επηρεάζει δραστικότητα σύνδεσης του DNA, έχουμε τότε αξιολογούνται κατά πόσον η λειτουργία του redox APE1 διαμορφώνει δέσμευσης DNA της. Η προσθήκη της μειωμένης πρωτεΐνης APE1 να PaCa-2 πυρηνικά εκχυλίσματα αυξήθηκε DNA STAT3 δεσμευτικός 1,8-φορές (Σχήμα 1G). Ως μάρτυρες, έχουμε αποδείξει ότι τις ακέραιες APE1 και μεταφορές DTT από τη μείωση των APE1 (0,04 mm) δεν διεγείρουν STAT3 DNA δεσμευτική. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η σηματοδότηση STAT3 δραστηριοποιείται στην PDAC, και ότι η δέσμευση STAT3 στο DNA σε redox ευαίσθητο και ρυθμίζεται από APE1.

STAT3 μεταγραφική δραστηριότητα αυξάνεται κατά APE1 υπερέκφραση και αναστέλλεται από APE1 Νοκ ντάουν

Λόγω του πολυλειτουργικού χαρακτήρα της APE1 με δραστηριότητες τόσο επιδιόρθωση του DNA και οξειδοαναγωγής, πραγματοποιήσαμε πειράματα για να αποδείξουν περαιτέρω ότι APE1 και οξειδοαναγωγής της λειτουργίας απαιτείται για τη σύνδεση και τη δραστηριότητα STAT3 DNA. Χρησιμοποιώντας λεντοϊού μεταγραφικό φορέα ρεπόρτερ, pGreenFire-STAT3-Luc (PGF-STAT3-Luc) και pGreenFire-mCMV (αρνητικός έλεγχος), από το Σύστημα Biosciences Inc. (Mountainview, CA), δημιουργήσαμε εκφράζουν σταθερά κυτταρικές γραμμές αναφοράς για την ανάλυση για δραστικότητα STAT3 , παρόμοια με κατασκευάσματα που χρησιμοποιούνται σε προηγούμενες μελέτες με ΝΡ-κΒ, ΑΡ-1, και HIF-1 [4]. κύτταρα Panc-1 μεταγωγή με PGF-STAT3-Luc, και μεμονωμένες αποικίες υποβλήθηκαν σε διαλογή για βασικοκυτταρικό STAT3 και IL-6 που διεγείρεται δραστικότητα STAT3. κύτταρα PDAC εκφράζουν STAT3 με γνώμονα λουσιφεράσης επιμολύνονται να υπερεκφράζουν παροδικά wtAPE1 ή την οξειδοαναγωγική-ελαττωματικό μεταλλαγμένο C65A-APE1 (C65A). Η υπερέκφραση του wtAPE1 διεγείρει τη δραστηριότητα των STAT3 σε δύο κλώνους (~ 3 φορές), μια επίδραση που δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν το οξειδοαναγωγικό νεκρούς APE1 μετάλλαγμα (Σχήμα 2Α). Σε πειράματα υπερέκφραση στο Σχήμα 2Α, μεμονωμένες αποικίες αναλύθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης μετά από παροδική επιμόλυνση με pcDNA, pcDNA-wt-APE1, και ροϋΝΑ-C65A-APE1, και η ομαλοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας Renilla ως έλεγχος επιμόλυνσης.

Α) κύτταρα Panc-1 παροδικά επιμολυσμένα με pcDNA3, pcDNA3-wt-APE1, ή pcDNA3-C65A-APE1 προσδιορίστηκαν για δραστικότητα STAT3 μέσω δοκιμασίας ανταποκριτή λουσιφεράσης στους 30 hr μετά την επιμόλυνση. ** Ρ & lt? 0,01, η = 3 για κάθε κλώνο σύγκριση κ.β. έως C65A. Β) δοκιμασία STAT3 Reporter του Panc-1 κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο ή APE1 siRNA (50 ηΜ) και διεγέρθηκαν με IL-6 (50 ng /mL, 6 ώρες). * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0.01, n = 6 συγκρίνοντας SC να siAPE1. Γ) Western στύπωμα της συνολικής επιπέδων πρωτεΐνης STAT3 εξής APE1 knockdown σε κύτταρα PaCa-2. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δ) p-STAT3 (Y705) επίπεδα μετά APE1 νοκ ντάουν στα κύτταρα PaCa-2. Ε) ανοσοστυπώματα εκχυλισμάτων ολόκληρων κυττάρων δείχνουν ότι η διέγερση με IL-6 (50 ng /mL, 3 ώρες) αυξάνει τα επίπεδα ρ-STAT3 τόσο SC-και siAPE1- επεξεργασμένα κύτταρα, αλλά δεν μεταβάλλει τα επίπεδα της ολικής πρωτεΐνης STAT3. ΣΤ) κηλίδα Western του κλασματωμένου κυττάρων PaCa-2 διεγείρονται με IL-6 και επιμολύνθηκαν με siRNA: πυρηνική (Ν) και κυτταροπλασματική (C) κλάσματα. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης για κυτταρόπλασμα και Lamin Β1 για τα πυρηνικά.

Η

Νοκ ντάουν της APE1 δεν επηρεάζει τα συνολικά επίπεδα STAT3 πρωτεΐνη, η STAT3 φωσφορυλίωση ή την πυρηνική μετατόπιση

Στη συνέχεια αξιολογούνται ο αντίκτυπος της APE1 νοκ ντάουν στη δραστηριότητα STAT3 στο PDAC κύτταρα. Όπως και παραπάνω, απλές αποικίες από ΡΟΡ-STAT3-Luc επιμολύνθηκαν παροδικά με APE1 siRNA για τα πειράματα που δείχνονται στο Σχήμα 2Β. Τα αποτελέσματα από PGF-STAT3-Luc κλώνοι # 3 και # 9 συνενώθηκαν σε πειράματα φαίνεται στην Εικόνα 2Β με αντιπροσωπευτικά πειράματα για κάθε κλώνο παρουσιάζεται στην Εικόνα S1A, τα επίπεδα Β Basal δραστηριότητας STAT3 μειωθεί σημαντικά όταν η έκφραση APE1 καταρριφθεί χρησιμοποιώντας παροδική , ειδικό siRNA (Σχήμα 2Β? ρ & lt? 0.001). Η μείωση στην δραστηριότητα STAT3 με APE1 knockdown ήταν εντονότερη σε κύτταρα διεγερμένα με IL-6, υποστηρίζοντας περαιτέρω ένα ρυθμιστικό ρόλο για APE1 στη δραστικότητα δέσμευσης του DNA του STAT3 (σχήμα 2Β, ρ & lt? 0,05? Και τα Σχήματα S1A, Β). Οι επιδράσεις επί της δραστικότητας STAT3 μεταγραφική όταν τα επίπεδα APE1 μειωμένα δεν οφείλονται σε αύξηση της συνολικής πρωτεΐνης STAT3 όπως δείχνεται με ανοσοκηλίδωση για ολική πρωτεΐνη STAT3 (σχήμα 2C και ποσοτικοποίηση των κηλίδων στο σχήμα S1c) και με qPCR για STAT3 mRNA (Σχήμα S1D) . Πραγματοποιήσαμε επίσης μελέτες για να δείξουν ότι η επίδραση των APE1 επί σηματοδότησης STAT3 περιορίστηκε στην ρύθμιση της δραστικότητας δέσμευσης του DNA, και δεν επηρέασε τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης STAT3 (σχήμα 2D και ποσοτικοποίηση στο Σχήμα S1E). Επιπλέον, η διέγερση με IL-6 υπό συνθήκες APE1 knockdown δεν επηρέασε επίπεδα ολικής πρωτεΐνης STAT3 (σχήμα 2Ε). Όπως ήταν αναμενόμενο, η διέγερση με IL-6 αυξάνει τα επίπεδα του p-STAT3, και αυτή η ρύθμιση της δραστηριότητας STAT3 δεν εξαρτάται από τα επίπεδα APE1 πρωτεΐνης.

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την πυρηνική μετατόπιση της STAT3 με διερεύνηση προϊόντα λύσης από πυρήνες και κυτταρόπλασμα των κυττάρων PaCa-2 επιμολυσμένα με APE1 siRNA ή τον έλεγχο SC? συνολική STAT3 και φωσφο-STAT3 (Y705) αναλύθηκαν, με τουμπουλίνης και Lamin Β χρησιμοποιούνται ως κυτταροπλασματική και πυρηνική ελέγχους, αντίστοιχα. Όπως ήταν αναμενόμενο, η διέγερση με IL-6 οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων του ρ-STAT3 (Σχ. 2Ε, F). Εξομάλυνση των p-STAT3 με τα επίπεδα Lamin B έδειξε ότι δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στον πυρηνικό π-STAT3 στο APE1-σιγήσει έναντι του ελέγχου SC (0,83 φορές η αλλαγή). Αυτό το εύρημα επιβεβαιώθηκε τόσο σε κυτταρικά εκχυλίσματα σύνολο (Σχήμα 2 D, E) και σε πυρηνικά εκχυλίσματα (σχήμα 2F). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν επίσης ότι APE1 ρυθμίζει δεσμευτική STAT3 DNA χωρίς να επηρεάζει άλλους μηχανισμούς ρύθμισης, δηλαδή φωσφορυλίωση, πυρηνικής μετατόπισης, ή το ποσό της συνολικής πρωτεΐνης STAT3 υπό βασικές ή IL-6 που προκαλείται από τις συνθήκες.

APE1 Redox αναστολέα, E3330 αναστέλλει STAT3 μεταγραφική δραστικότητα

για να αντιμετωπιστεί πιο συγκεκριμένα τον ρόλο της λειτουργίας οξειδοαναγωγής του APE1 επί STAT3 μεταγραφική δραστηριότητα, εκτελέσαμε πειράματα χρησιμοποιώντας το μικρό E3330 μόριο, το οποίο αναστέλλει επιλεκτικά δραστικότητα οξειδοαναγωγής APE1 χωρίς να επηρεάζεται η λειτουργία του ενδονουκλεάση. [3], [5] E3330 αναστέλλει αξιοσημείωτα δραστηριότητα STAT3 τόσο σε σταθερές γραμμές (Σχήμα 3Α? Σχήματα S2A, Β), καθώς και σε παροδικές αναλύσεις λουσιφεράσης (Σχήμα S2C). Βασική δραστικότητα STAT3 αναστάλθηκε σημαντικά με E3330 (Σχήμα 3Α? Ρ & lt? 0,05) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επίσης, η θεραπεία E3330 ανέστειλε σημαντικά την δραστηριότητα STAT3 που προκαλείται από IL-6 διέγερση των κυττάρων PDAC (Σχήμα 3Α? Ρ & lt? 0,05), το οποίο καταργήθηκε σε υψηλότερες δόσεις E3330. Αυτή η αναστολή της δραστικότητας STAT3 δεν οφειλόταν σε μείωση των συνολικών επιπέδων πρωτεΐνης STAT3 ή μείωση της ρ-STAT3 επίπεδα. Τα αποτελέσματα από ανοσοστύπωμα λυμάτων ολόκληρων κυττάρων έδειξαν ότι η ποσότητα της πρωτεΐνης STAT3 και φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη STAT3 (0,95-φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO) μετά από θεραπεία με αναστολέα οξειδοαναγωγής APE1, E3330 σε κύτταρα PaCa-2 δεν άλλαξε σημαντικά (Σχήμα 3Β).

Α) δοκιμασία ρεπόρτερ STAT3 σε κύτταρα Panc-1 μετά από αγωγή με E3330 (24 ώρες) και η διέγερση με IL-6 (6 h). Οι δόσεις βασίστηκαν σε δεδομένα επιβίωσης από τα προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα [4]. * Ρ & lt? 0,05 δοκιμασία t, n = 6 συγκρίνοντας DMSO ελέγχου σε δείγματα υποστεί αγωγή με φάρμακο. Β) Εκπρόσωπος κηλίδας Western των κυττάρων PaCa-2 αντιμετωπίζεται με E3330 (50 μΜ, 24 ώρες). Γ) την προσθήκη του E3330 στην αντίδραση EMSA αναστέλλει τη σύνδεση της STAT3 DNA των πυρηνικών εκχυλισμάτων που διεγείρονται με IL-6. Αντιπροσωπευτικά EMSA Κηλίδα φαίνεται με ποσοτικοποίηση των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων στα Δ * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO, χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student. Ε) STAT3 δέσμευσης DNA μέσω δοκιμασίας EMSA μετά από αγωγή των κυττάρων PaCa-2 με E3330 (2 ώρες) και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με IL-6 (50 ng /mL, 2 h) με ποσοτικοποίηση σε (F), όπου η ένταση της πρόσδεσης σε σύγκριση με το ποσότητα της πρόσδεσης STAT3 DNA με IL-6 διέγερση? G) qPCR ανάλυση της έκφρασης Σουρβιβίνης μετά τη θεραπεία E3330 για 24 ώρες σε κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενή, Pa02C. Εμφανίζονται είναι τα δεδομένα 2-3 ξεχωριστά πειράματα (μέσος όρος ± SE). Τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο του οχήματος DMSO.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η αναστολή της STAT3 πρόσδεση στο DNA από αποκλεισμό οξειδοαναγωγής APE1, πυρηνικά εκχυλίσματα από κύτταρα PaCa-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με E3330 και αναλύθηκαν από τον EMSA για τη δέσμευση STAT3? μια δοσοεξαρτώμενη μείωση της STAT3 δέσμευση παρατηρήθηκε (Σχήμα 3C), με μια IC

50 για E3330 περίπου 30 μΜ (Σχήμα 3D). Μπορούμε επίσης αντιμετωπίζονται κύτταρα PaCa-2 με E3330 και στη συνέχεια διεγείρονται δεσμευτικός STAT3 DNA με IL-6 και προσδιορίστηκαν ως προς τη δέσμευση STAT3 DNA χρησιμοποιώντας δοκιμασία EMSA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Ε και F, IL-6 που προκαλείται από δραστικότητα STAT3 αναστέλλεται δραματικά μετά την αγωγή E3330 στα κύτταρα. Περαιτέρω επιβεβαιώνουν μια μείωση STAT3 δέσμευσης DNA μετά την αναστολή της δραστικότητας οξειδοαναγωγής APE1, η έκφραση του γονιδίου στόχου STAT3, Σουρβιβίνης μειώνεται με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο τόσο σε κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενή (Σχήμα 3G) και σε κύτταρα PaCa-2 (Σχήμα S2D) . Αυτές οι μελέτες αποδεικνύουν ότι ο χειρισμός της έκφρασης APE1 και διακοπή της λειτουργίας οξειδοαναγωγής της επηρεάζει σημαντικά δεσμευτική STAT3 DNA και μεταγραφική δραστηριότητα.

Φαρμακολογική αποκλεισμός των APE1 και STAT3 Αποτελέσματα σε συνεργιστική επίδραση της PDAC ανθρώπινα κύτταρα

Πρώτα δείχνουμε ότι η θεραπεία με δύο περιγράφηκε προηγουμένως ανταγωνιστές STAT3, STATTIC [23] και S3I-201 [24] ανέστειλε φωσφορυλίωση STAT3 (σχήμα 4 Α, Β), καθώς και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε κύτταρα PDAC (Σχήμα 4C). Στατιστικά σημαντική αναστολή της φωσφορυλίωσης του Y705 παρατηρείται σε δόσεις S3I-201 μεγαλύτερες των 100 μΜ και με δόσεις μεγαλύτερες από STATTIC 3.125 μΜ, όπως εκτιμήθηκε με πυκνομετρία (ρ & lt? 0,05). Κατά την ανασταλτική δόσεις που δοκιμάστηκαν, οι ενώσεις αυτές δεν επηρέασαν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του STAT1 (Y701) ή STAT5 (Y694) σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 4Α, Β). Λειτουργικές μελέτες με χρήση της ανάλυσης MTS έδειξε ότι STAT3 αποκλεισμός αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των δύο PDAC γραμμών (Σχήμα 4C), με ED

50 -2.5 μΜ για PaCa-2 και ~ 4 μΜ για Panc-1 για STATTIC, και ED

50 ~190 μΜ για PaCa-2 και ~310 μΜ για Panc-1 για S3I-201. Και για τα δύο φάρμακα, παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ μείωση στην φωσφορυλίωση STAT3 και αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων PDAC.

ανοσοαποτύπωσης των πρωτεϊνών STAT, ρ-STAT3 (Y705), ρ-STAT1 (Y701) και π- STAT5 (Y694) σε PDAC κύτταρα επεξεργασμένα με S3I-201 (Α) ή STATTIC (Β). DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος του οχήματος και περιλαμβάνεται στη λωρίδα χωρίς αναστολέα STAT3. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με S3I-201 για 30 ώρες και STATTIC για 30 λεπτά. κύτταρα PaCa-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με S3I-201 και STATTIC για 24 ώρες. Γ) δόσης-απόκρισης σε PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα μετά από 72 ώρες κατεργασίας με S3I-201 ή STATTIC μέσω δοκιμασίας MTS. D, E) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετά E3330 (50 μΜ για όλες τις γραμμές, εκτός από 40 μΜ για Panc10.05) και S3I-201 ή STATTIC θεραπεία. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις διπλούν, αντιπροσωπευτικό πείραμα από 2-4 ανεξάρτητα πειράματα. ΣΤ) δείκτη συνδυασμού () τιμές CI υπολογίζεται με CalcuSyn για το συνδυασμό των αναστολέων APE1 και STAT3 σε ED τους

’50 στη δοκιμασία MTS. τιμές CI της & lt? 0.1, πολύ ισχυρή συνέργεια? 0,1-0,3: ισχυρή συνέργεια? και 0,3-0,7:. συνέργεια

Η

Εκτός από τη ρύθμιση της μεταγραφικής δραστικότητας του STAT3, APE1 εξασκεί επίσης έλεγχο οξειδοαναγωγής άλλων παραγόντων μεταγραφής, οι οποίες έχουν ενοχοποιηθεί στον καρκίνο του παγκρέατος (όπως HIF-1α και NF-κΒ). [4], [16], [25] Στη συνέχεια αξιολογήθηκε το εάν η συνδυασμένη αποκλεισμός της δραστηριότητας οξειδοαναγωγής STAT3 και APE1 συνεργούν να αναστέλλουν πιο αποτελεσματικά τα ανθρώπινα κύτταρα PDAC. Η κυτταρική επιβίωση αποτιμήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα xCELLigence, η οποία παρακολουθεί τις αλλαγές σε πραγματικό χρόνο σε προσκόλληση των κυττάρων, τη μορφολογία και τη βιωσιμότητα? [4], [26] δείκτης κυττάρων (CI) παρακολουθήθηκε επί φαρμακευτική αγωγή 72 ώρες. E3330 χρησιμοποιήθηκε σε δόσεις που αναστέλλουν αποτελεσματικά δραστικότητα οξειδοαναγωγής APE1, και αναστολείς STAT3 σε δόσεις που χρησιμοποιήθηκαν στην MTS με βάση δοκιμασία για την κυτταροτοξικότητα (Εικόνα 4C) και ότι ανέστειλε φωσφορυλίωση STAT3 σε κύτταρα PDAC (Σχήμα 4Α, Β και Ref. [24 ]). Σαν απλούς παράγοντες, ελάχιστη αναστολή των κυττάρων PDAC παρατηρήθηκε με E3330 ή στις δόσεις της STATTIC ή S3I-201 που χρησιμοποιείται (Εικόνα 4D, E). Παρατηρήσαμε ότι APE1 οξειδοαναγωγής αναστολή από E3330 συνεργεί με αποκλεισμό STAT3 με STATTIC ή S3I-201, με αποτέλεσμα την ισχυρή αναστολή των κυττάρων Panc-1 και PaCa-2, αλλά και του πρωτεύοντος Pa03C και κυττάρων Panc10.05 (Σχήμα 4D, Ε) . Η ενίσχυση των ανασταλτικών αποτελεσμάτων που παρατηρήθηκαν με αυτή τη διπλή στόχευση, σε υπο-βέλτιστες δόσεις αυτών των παραγόντων, δεν παρατηρήθηκε τόσο με τη χρήση xCELLigence (Σχήμα 4) και δοκιμασίες MTS (Σχήμα S3). Είναι ενδιαφέρον ότι, στον ασθενή κύτταρα προερχόμενα Pa03C και Panc10.05, αυτή η ενίσχυση παρατηρήθηκε σε χαμηλότερες δόσεις του E3330 από εκείνες που παρατηρήθηκαν με τις καθιερωμένες κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο αποκλεισμός της σηματοδότησης μέσω τόσο της δραστηριότητας οξειδοαναγωγής APE1 και STAT3 έχει δραματικές συνέπειες στην επιβίωση των κυττάρων. Για να καταδειχθεί ότι το αποτέλεσμα αυτό δεν οφειλόταν σε γενική φαινόμενο οξειδαναγωγής, μπορούμε επίσης να συνδυαστεί αναστολείς STAT3 με αναστολέα θειορεδοξίνη, PX-12 [27] – [29]. Προσθήκη αναστολέα STAT3 S3I-201 για να PX-12 θεραπεία δεν βελτιώσει σημαντικά τα αποτελέσματα της PX-12 (Πίνακας S1? Αξιολογούνται από τη σύγκριση των ΕΔ

25, ED

50, και ΕΔ

75).

Για την ποσοτικοποίηση πιθανών συνεργιών των ναρκωτικών, η μέθοδος Chou-Talalay χρησιμοποιήθηκε με την αύξηση συνδυασμούς δόσεων ενός ανταγωνιστή STAT3 συν τον αναστολέα E3330 APE1. Η ΕΔ

50 για τις τρεις ενώσεις προσδιορίστηκε όπως φαίνεται παραπάνω, χρησιμοποιώντας δοκιμασίες MTS (Σχήμα 4 και Ref. [4]). Panc-1 ή PaCa-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με συνδυασμούς δύο φαρμάκων σε σταθερή αναλογία δόσεων που αντιστοιχούν σε 0,125, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,125, και 1,25 φορές της ατομικής τους ΕΔ

50 αξίες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4F, ισχυρός συνεργιών παρατηρήθηκαν με τιμές δείκτη συνδυασμού σημαντικά & lt? 1 για ED

50 και ED

75 στις δύο κυτταρικές σειρές. Συνολικά, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι η ταυτόχρονη στόχευση των APE1 οξειδοαναγωγής και STAT3 σηματοδότησης synergize να βλάψει σημαντικά την επιβίωση των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων, ακόμη και σε υπο-βέλτιστες δόσεις των επιμέρους παραγόντων.

Διπλή Στόχευση των APE1 Redox Δραστηριότητα και STAT3 εναύσματα Αύξηση αποπτωτικά αποτελέσματα σε PDAC κύτταρα

στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μηχανιστικές μελέτες για να εξετάσει κατά πόσον αυτά τα συνεργιστικά αποτελέσματα περιλαμβάνουν την αυξημένη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και δέσμευση της οδού κασπάσης. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία αννεξίνης-ΡΕ /7-AAD για την εκτίμηση του κυτταρικού θανάτου και της βιωσιμότητας σε κύτταρα PDAC σε επεξεργασία με τους συνδυασμούς φαρμάκων που αναφέρονται (Σχήμα 5Α, C). Πάνελ Α και Β απεικονίζουν αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις της ροής αναλύσεις κυτταρομετρίας, και δείχνουν ότι ο συνδυασμός του E3330 με έναν αναστολέα STAT3 σημαντικά αυξήσει τη συχνότητα των Αννεξίνη-θετικό, μη-βιώσιμα κύτταρα? συγκρίσιμα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για τα κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενή (Σχήμα 5Β, D). Η ανάλυση των δεδομένων από 4 έως 6 ξεχωριστά πειράματα καταδεικνύουν ότι ο συνδυασμός της E3330 με STATTIC ή με S3I-201 αυξάνει σημαντικά τον καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 5Β). Επιπλέον, παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στα κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενή στον οποίο παρατηρείται ~6-8-πλάσια αύξηση σε κυτταρικό θάνατο με τη συνδυασμένη στόχευση APE1 και STAT3 (σχήμα 5Β, D).

αναστολείς προστίθενται ταυτόχρονα (E3330 40, 50, ή 75 μΜ), και η απόπτωση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αννεξίνη-ν (χ-άξονας) και 7-AAD ή ΡΙ (άξονας γ) χρώση μετά από 24 ώρες. Αντιπροσωπευτικά διαγράμματα στιγμών φαίνεται στα Α και Β με υψηλή δόση αναστολέα STAT3 για Panc-1 και PaCa-2 και 50μMS3I-201 για τα κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενή. Γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει & gt? 3 ανεξάρτητα πειράματα? *, P & lt? 0,05, **, p & lt? 0,01 όλα σε σχέση με αναστολέα STAT3 και μόνο σε αντίστοιχη δόση (A, C) ή 2 ανεξάρτητα πειράματα για (Β, D)

Η

Για να αξιολογηθεί το δυναμικό. εμπλοκή της κασπάσης-εξαρτώμενη κυτταρικό θάνατο, εκτελέσαμε πειράματα μέτρησης της ενεργοποίησης της κασπάσης 3 σε PDAC κύτταρα επεξεργασμένα με τους ίδιους συνδυασμούς φαρμάκων, χρησιμοποιώντας ένα ΡΙΤΟ-συζευγμένο αναστολέα κασπάσης-3 (ΡΙΤΟ-DEVD-FMK) και κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, αν και απλούς παράγοντες δεν επάγουν σημειώνονται κασπάσης 3 ενεργοποίησης, οι συνδυαστική επιδράσεις της APE1 αναστολής οξειδοαναγωγής και αποκλεισμός STAT3 οδήγησε σε σημαντική ενεργοποίηση της κασπάσης 3, στις δύο κυτταρικές σειρές PDAC (Σχήμα 6Α, Β, εκπρόσωπος ιστογράμματα ροής αριστερό πάνελ). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν στατιστικώς σημαντική (Σχήμα 6Β? Δεξιά πάνελ) όταν E3330 συνδυάστηκε με STATTIC (Α, ρ & lt? 0,05) ή με S3I-201 (Β, ρ & lt? 0,05). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι με το συνδυασμό υπο-βέλτιστες δόσεις των επιμέρους επιλεκτικοί παράγοντες, η ταυτόχρονη στόχευση των APE1 οξειδοαναγωγής και STAT3 αποτελέσματα σηματοδότησης σε σημαντικό κυτταρικό θάνατο των κυττάρων PDAC, με την εμπλοκή της κασπάσης 3 προ-αποπτωτικά αποτελέσματα.

Panc-1 και PaCa-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με E3330 (50, 75 μΜ) και αυξανόμενες ποσότητες STATTIC (Α) ή S3I-201 (Β) και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα κασπάσης 3. Τα γραφήματα αντιπροσωπεύουν & gt? 3 ανεξάρτητα πειράματα? *, P & lt?. 0.05, όλα σε σύγκριση με αναστολέα STAT3 και μόνο σε αντίστοιχη δόση

Η

Διπλή Στόχευση των APE1 Redox και STAT3 Σηματοδοσίας αναστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση των PDAC κύτταρα

Τέλος, από το κύτταρο μετανάστευση αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό βήμα στην εξέλιξη και τη διάδοση του καρκίνου του παγκρέατος, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της APE1 και αποκλεισμός STAT3 σχετικά με την ανταπόκριση των κυττάρων PDAC σε χημειοτακτικά ερεθίσματα, χρησιμοποιώντας το σύστημα xCELLigence. κύτταρα Panc-1 ορού στερηθεί τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο μιας πλάκας CIM, και διεγείρονται με μέσα συμπληρωμένα με ορό, η οποία παρέχει χημειοτακτικά ερεθίσματα (Κάτω Βουλή). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα Panc-1 άνευ ορού δεν μεταναστεύουν απουσία χημειοτακτικά ερεθίσματα, και επίστρωση φιμπρονεκτίνη βοηθά την προσκόλληση των μεταναστευτικών κυττάρων (Σχήμα S4A). Θεραπεία της Panc-1 κύτταρα με E3330, STATTIC ή S3I-201 σαν απλούς παράγοντες οδήγησε σε περιορισμένη αναστολή της Panc-1 κυτταρική μετανάστευση, ακόμη και σε σχετικά υψηλές δόσεις αυτών των ενώσεων (Σχήμα 7). Ωστόσο, ο συνδυασμός του E3330 με S3I-201 (50 μΜ και 100 μΜ, Εικ. S4D) ή με STATTIC οδήγησε σε μειωμένα σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων (Σχήμα 7D, E), τόσο με S3I-201 /E3330 και συνδυασμούς /E3330 STATTIC καταλήγοντας σε σημαντικές ανασταλτικές επιδράσεις στην Panc-1 κυτταρική μετανάστευση (Σχήμα 7F, Σχήμα S4D, σ & lt? 0,01? Σχήμα 6G, σ & lt? 0,05 σε σύγκριση με E3330 μόνη της και η p & lt? 0,01 σε σύγκριση με STATTIC μόνο). Σημαντικά, αυτά τα φάρμακα ή συνδυασμοί δεν έδειξαν σημαντικές επιδράσεις στη βιωσιμότητα των κυττάρων Panc-1 στα χρονικά σημεία και δόσεις αξιολογούνται στις δοκιμασίες μετανάστευσης (Σχήμα S4 Β, C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ταυτόχρονη αποκλεισμός του APE1 οξειδοαναγωγής και σηματοδότηση STAT3 συνεργάζεται επίσης να αναστέλλουν τις ιδιότητες μετανάστευση των κυττάρων PDAC.

Μετανάστευση αναλύθηκαν μέσω του συστήματος xCELLigence, θεραπεία με αυξανόμενες ποσότητες S3I-201 (Α), STATTIC (Β ), ή E3330 (C). Συνδυασμός E3330 (75 μΜ) με αναστολέα STAT3 S3I-201 (D), 50 μΜ ή STATTIC (Ε), 10 μΜ μειώνει δραματικά τα μεταναστευτικά ικανότητα του κυττάρου. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των τριών επιμέρους πειράματα σε 8 ώρες φαίνεται στο ΣΤ και Ζ * p & lt? 0,05, ** p & lt? 0.01 χρησιμοποιώντας paired t test συγκρίνοντας αναστολέα μόνη της σε σχέση με τη θεραπεία συνδυασμού

Η

Συζήτηση

στην έκθεση αυτή, που αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι η δέσμευση STAT3 DNA είναι υπό τον έλεγχο του redox, η οποία διαμεσολαβείται από τη δράση οξειδοαναγωγής του APE1. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η οξείδωση των κρίσιμων υπολειμμάτων κυστεϊνών στην STAT3 πρωτεΐνης μέσω επεξεργασίας με υπεροξείδιο θα μπορούσε να μειώσει STAT3 (αλλά όχι STAT1) δέσμευσης DNA και μεταγραφική δραστηριότητα [20]. Χρησιμοποιώντας πυρηνικά εκχυλίσματα από PDAC κύτταρα, που χαρακτηρίζονται συστηματικά τις επιπτώσεις της μείωσης και οξειδωτικές συνθήκες για STAT3 DNA δεσμευτική. Σαφώς, STAT3 δεσμεύεται με DNA πιο αποτελεσματικά όταν είναι μειωμένη, και η δραστικότητα οξειδοαναγωγής των APE1 είναι ικανό να διεγείρει δέσμευσης STAT3 DNA. Επιπλέον, ο χειρισμός των επιπέδων APE1 επηρεάζει τη δραστικότητα δέσμευσης του DNA του STAT3. Η ταυτόχρονη αποκλεισμός της δραστηριότητας οξειδοαναγωγής STAT3 και APE1 δρα συνεργικά για να διαταράξει τη βιωσιμότητα των κυττάρων PDAC καθώς και οι ιδιότητές της μετανάστευσής τους.

Αυτή είναι η πρώτη απόδειξη ότι APE1 ρυθμίζει δέσμευσης και μεταγραφική δραστηριότητα στα κύτταρα PDAC το DNA STAT3. Η διαπίστωση αυτή υποδηλώνει την αλληλεπίδραση των APE1 και STAT3 ως μέρος της επιβίωσης σηματοδότησης σε PDAC αντί για ένα μη-ειδικό αποτέλεσμα του γενικού ρυθμιστών οξειδοαναγωγής. Η υπερέκφραση του ενός οξειδοαναγωγικού ανεπάρκεια APE1 πρωτεΐνη απέτυχε να προωθήσει STAT3 μετενεργοποίηση σε κύτταρα PDAC, και αποκλεισμός της λειτουργίας οξειδοαναγωγής του APE1 μέσω E3330 ανέστειλε δραματικά την μεταγραφική δραστικότητα της STAT3, τόσο τα βασικά επίπεδα, καθώς και IL-6 που προκαλείται από δραστικότητα. Ωστόσο, νοκ ντάουν της APE1 μειώνει δραστηριότητας STAT3 χωρίς να επηρεάζει τη φωσφορυλίωση της ή πυρηνική μετατόπιση. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι APE1 ελέγχει άμεσα τη δραστικότητα δέσμευσης του DNA του STAT3. Με τα υψηλά επίπεδα έκφρασης σε όγκους APE1 PDAC (Σχήμα 1Α, Ref. [11]), η διέγερση του STAT3 σηματοδότησης μέσω δραστικότητα οξειδοαναγωγής APE1 μπορεί να συμβάλει στην όριο δραστηριότητας STAT3 στον όγκο που οδηγεί σε μια πιο επιθετική φαινότυπο. Αύξηση fitness σήμα STAT3 μέσω ογκογόνο γεγονότων και /ή σήματα εξωγενή σχετίζονται με τον όγκο όπως η IL-6 μπορεί να κινείται εν μέρει μέσω APE1.

Μέσα στην οικογένεια STAT των παραγόντων μεταγραφής, STAT3 είναι το πρώτο μέλος να είναι STAT φαίνεται να ρυθμίζεται από APE1. Εργασία από Li et al κομψά αποδεικνύεται χρησιμοποιώντας χίμαιρα πρωτεΐνες STAT1 /STAT3 που STAT3, αλλά δεν STAT1, είναι υπό έλεγχο οξειδοαναγωγής. [20] ROS μπορεί να ενεργοποιήσει σηματοδότηση STAT και αντι-οξειδωτικά μπορούν να αναστείλουν αυτή την ενεργοποίηση.