Οι

Αφηρημένο

Ιστορικό

Πολλές σημαντικές βιολογικές διεργασίες που ελέγχονται μέσω αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου, συμπεριλαμβανομένου του αποικισμού των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων και τον έλεγχο της διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων εντός θέση τους. Παρά την κρίσιμη σημασία του κυτταρικού περιβάλλοντος στη ρύθμιση της κυτταρικής σηματοδότησης,

in vitro

μεθόδους για τη μελέτη αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι δύσκολο ή /και έμμεση.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Αναφέρουμε σχετικά με την ανάπτυξη μιας μεθόδου εικόνας με βάση για τη διάκριση δύο τύπους κυττάρων που καλλιεργούνται σε συγκαλλιέργεια. Περαιτέρω, τα κύτταρα ενός τύπου που βρίσκονται σε άμεση επαφή με τα κύτταρα ενός δεύτερου τύπου (γειτονικά κύτταρα) μπορούν να αναλυθούν χωριστά από τα κύτταρα τα οποία δεν εμπίπτουν σε μία και μόνο. Οι μεταβολές αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας στατιστικές πληθυσμού, τα οποία είναι χρήσιμα στην ανίχνευση ανεπαίσθητες αλλαγές σε δύο πληθυσμούς. Έχουμε χρησιμοποιήσει αυτό το σύστημα για να χαρακτηρίσει αλλαγές στην κυτταρική σειρά καρκινώματος προστάτη LNCaP όταν καλλιεργούνται σε επαφή με ανθρώπινα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs). Βρίσκουμε ότι η έκφραση και η φωσφορυλίωση της WWOX μειώνεται στα κύτταρα LNCaP όταν αναπτύσσονται σε άμεση επαφή με HUVECs. Μειωμένη σηματοδότηση WWOX έχει συσχετιστεί με μειωμένη ενεργοποίηση ή την έκφραση της JNK και ρ73. Θεωρούμε ότι τα επίπεδα p73 είναι επίσης μειωμένη σε LNCaP κύτταρα καλλιεργούνται σε επαφή με HUVECs, αλλά εμείς δεν παρατηρούμε μια τέτοια αλλαγή στα επίπεδα JNK.

Συμπεράσματα /Σημασία

Θεωρούμε ότι η μέθοδος που περιγράφεται είναι στατιστικά ισχυρή και μπορεί να προσαρμοστεί σε μια ευρεία ποικιλία των μελετών όπου κυτταρικής λειτουργίας ή σηματοδότηση επηρεάζονται από ετερότυπη επαφή κυττάρου-κυττάρου. Ειρωνικά, ένας δυνητικός πρόκληση με τη μέθοδο που είναι το υψηλό επίπεδο της ευαισθησίας είναι ικανή ταξινόμηση γεγονότων ως στατιστικά σημαντική (λόγω του υψηλού αριθμού κυττάρων αξιολογήθηκαν ξεχωριστά), όταν το βιολογικό αποτέλεσμα μπορεί να είναι λιγότερο σαφής. Η μεθοδολογία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί καλύτερα σε συνδυασμό με πρόσθετες μεθόδους για την αξιολόγηση του βιολογικού ρόλου των δυνητικά λεπτές διαφορές μεταξύ των πληθυσμών. Ωστόσο, πολλά σημαντικά γεγονότα, όπως η δημιουργία ενός μεταστατικού όγκου, να προκύψει μέσα από σπάνιες αλλά σημαντικές αλλαγές, και μεθόδους όπως περιγράφουμε εδώ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση και το χαρακτηρισμό της συμβολής του περιβάλλοντος σε αυτές τις αλλαγές.

Παράθεση: Λαμπάν Ρ, Zhang J, Χιλ Α, Zhang Υ, Martinez R, Haney S (2009) Εικόνα-Based Αξιολόγηση της ανάπτυξης και της Σηματοδοσίας Αλλαγές στον Καρκίνο κυττάρων που προκαλείται από απευθείας κυττάρων-Cell Επικοινωνία. PLoS ONE 4 (8): e6822. doi: 10.1371 /journal.pone.0006822

Επιμέλεια: Ανδρέας Bergmann, Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Απριλίου 2009? Αποδεκτές: 13 του Ιουλίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 31 του Αυγούστου του 2009

Copyright: © 2009 Λαμπάν et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια πολύπλοκη ασθένεια που χαρακτηρίζεται συχνά ως. απορυθμισμένη ανάπτυξη [1]. Ενώ η ρίζα του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων είναι το αποτέλεσμα της απώλειας της ανάπτυξης και του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστικούς ελέγχους εντός των ίδιων των καρκινικών κυττάρων, οι αλλαγές στον τρόπο καρκινικά κύτταρα αλληλεπιδρούν με το περιβάλλον είναι επίσης κρίσιμη για την ανάπτυξη του όγκου και την κλινική του καρκίνου [2], [3]. Αυτές περιλαμβάνουν πολλαπλασιαστικές και επεμβατική σήματα που μεταδίδονται από τα στρωματικά κύτταρα και προ-αγγειογόνος σήματα από τα καρκινικά κύτταρα στο ενδοθήλιο. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και του περιβάλλοντός τους ήταν πιο δύσκολο για τον χαρακτηρισμό και στόχο για θεραπευτική παρέμβαση από εγγενή αλλαγές στα κύτταρα του καρκίνου, δεδομένου ότι

in vitro

μοντέλα των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου είναι δύσκολο να προσδιοριστεί και να τυποποιήσουν, ειδικά σε η αναγκαία για τη διαλογή φαρμάκων κλίμακα. Παρά τις δυσκολίες αυτές, η αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και του περιβάλλοντός τους έχει αποδειχθεί ότι είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για την αντιμετώπιση καρκίνου [4], και ως εκ τούτου αυξημένη προσοχή στο πώς τα καρκινικά κύτταρα να λειτουργήσουν ως όγκοι είναι ένα σημαντικό πρόβλημα.

Μέθοδοι η

in vitro

μελέτη του καρκινικού κυττάρου αλληλεπιδράσεις με στρωματικά και ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν αναπτυχθεί, όπως το πώς τα καρκινικά κύτταρα επάγουν την αγγειογένεση και την πρόσληψη μακροφάγων [5] – [8]. Σχετικές μέθοδοι επιτρέπουν τη μελέτη των ενδοκυτταρικών σηματοδότηση μέσω μιας φάσης συγκαλλιέργεια για επαγωγή παρακρινείς και ετερότυπη αλλαγές εξαρτώμενη από την επαφή, που ακολουθείται από διαχωρισμό των κυτταρικών τύπων για ποσοτικοποίηση από μεταγραφικό προφίλ, κηλίδωση Western ή σχετικές μεθόδους. Η ικανότητα να ανιχνεύει τις αλλαγές σε δείγματα που καλλιεργούνται σε άμεση συγκαλλιέργεια, μικτή μονοκαλλιέργεια (μέσω της χρήσης των ένθετων ή συναφών φυσικά εμπόδια), και πρότυπο μονοκαλλιέργεια χρησιμοποιώντας ρυθμισμένα μέσα επιτρέπουν τέτοιες διαδικασίες πρέπει να αποδοθεί σε συγκεκριμένα επίπεδα των αλληλεπιδράσεων. Ενώ πολύτιμη, αυτά τα συστήματα φέρουν περιορισμούς στηριζόμενη στις απαντήσεις που πρέπει να κατά μέσο όρο σε όλη την δείγμα για κάθε επεξεργασία, και τυπικά συνεπάγονται σημαντική επεξεργασία για να διαχωριστούν οι τύποι κυττάρων μετά από άμεση συγκαλλιέργεια να παράγουν ομογενή δείγματα για δημιουργία προφίλ ή σχετικές αναλύσεις. Η ενσωμάτωση της ποσοτικής μικροσκοπίας φθορισμού (Υψηλή Προβολή Περιεχόμενο, ή HCS) στη διαδικασία έγκαιρης ανακάλυψη φαρμάκων και τη βασική βιολογική έρευνα [9] – [11] προσφέρει μεθόδους για τη βελτίωση των μελετών συγκαλλιέργεια με τη διευκόλυνση της άμεσης μέτρησης της μορφολογίας, του πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής σηματοδότησης σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε άμεση επαφή με διαφορετικούς τύπους κυττάρων.

Έχουμε αναπτύξει και δοκιμάστηκαν έναν αλγόριθμο για την ποσοτικοποίηση αλλαγές στα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα που αναπτύσσονται σε άμεση επαφή με τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η μέθοδος προσδιορίζει τον τύπο του κυττάρου και την τοποθεσία για να προσδιοριστεί η εγγύτητα των ενδοθηλιακών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα, και ποσοτικοποιεί κυτταρικών χαρακτηριστικών, συμπεριλαμβανομένης της υγείας των κυττάρων και την έκταση της ενεργοποίησης των οδών σηματοδότησης για κύτταρα γειτονικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα και συγκρίνει αυτά τα χαρακτηριστικά με τα επιθηλιακά κύτταρα τα οποία είναι μη -adjacent στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η διαδικασία μπορεί να αντιστραφεί, να χαρακτηρίζει αλλαγές στα ενδοθηλιακά κύτταρα που προκύπτουν από τις αλληλεπιδράσεις με τα καρκινικά κύτταρα. Η επίδραση των καρκινικών κυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα μπορεί να μετρηθεί με τη σύγκριση αυτών των δύο ομάδων εντός του ίδιου δείγματος χωρίς διαχωρισμό κυττάρων. Έχουμε αποδείξει την προσέγγιση με τη χρήση του προστάτη και του καρκίνου του μαστού, και επικυρώνει τη μέθοδο αποδεικνύοντας ότι οι αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης που προσδιορίζονται στο μεταγραφικό μελέτες προφίλ παρατηρούνται σε δείγματα που μελετήθηκαν με τις μεθόδους που περιγράφονται.

Υλικά και Μέθοδοι

τα κύτταρα, τα μέσα ενημέρωσης, τα αντιδραστήρια και συνθήκες καλλιέργειας

HUVEC κύτταρα αγοράστηκαν από την Cambrex (Cat #: CC-2519) και διατηρούνται σε μέσο ΕΒΜ-2 (μέσου αναπτύξεως ενδοθηλιακών κυττάρων: CC-3162 με 2% FBS) , τα κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν για όχι περισσότερο από δέκα περάσματα. Η γραμμή του καρκίνου του προστάτη LNCaP (ATCC, Manassas, VA) αναπτύχθηκε σε RPMI1640 συμπληρωμένο με γλουταμινικό, μη απαραίτητα αμινοξέα, πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη και 10% FBS (όλα από την Invitrogen, Carlsbad, CA).

Ποντίκι αντι-CD31 (Cat #: 550389) ήταν από την BD Pharmingen (San Diego, CA), ποντικού αντι-CDw75 (IgM) (Cat #: ab9515-500) ήταν από την Abcam (Cambridge, ΜΑ), Rabbit anti WWOX (28- 42) (Cat #: AP1008) ήταν από την Calbiochem /EMD Chemicals (Gibbstown, NJ), κουνελιού αντι- (pThr33) WWOX (Cat #: AP1009), ήταν από Calbiochem /EMD Chemicals, αντι p73 ποντικού (Cat #: 32- 4200) ήταν από τη Zymed /Invitrogen, ποντικού αντι-c-Jun (Cat #: OP55) ήταν από την Calbiochem, ποντικού αντι-JNK1 (Cat #: MAB17761) ήταν από την R Οι επιπτώσεις της αλλαγής του τρόπου με τον οποίο τα κύτταρα επιστρώνονται είχε εξεταστεί στη συνέχεια, η συνολική επίπτωση της μεταβλητότητας των συνθηκών συγκαλλιέργειας επιμετάλλωσης για την ευρωστία της προσέγγισης σε γενικές γραμμές αξιολογήθηκε στο τμήμα ανάλυσης, αργότερα, σε αυτή τη μελέτη.

υποψήφια γονίδια στα ενδοθηλιακά κύτταρα που δείχνουν μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης όταν καλλιεργούνται με τα καρκινικά κύτταρα

Αρκετές μελέτες έχουν δημοσιευθεί που περιγράφουν τις αλλαγές στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου που αναπτύσσονται σε συγκαλλιέργεια [21] – [25]. Κάθε σύστημα έχει εντοπίσει συγκεκριμένα γεγονότα σηματοδοτικό μονοπάτι, και στις δύο καρκίνο και στρωματικά κύτταρα, που ενεργοποιούνται από την επαφή κυττάρου-κυττάρου. Επιδιώξαμε να προσδιοριστούν οι αλλαγές στις κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιούμε σε αυτές τις μελέτες ως η πιο ισχυρή πηγή των υποψήφιων πρωτεϊνών που θα χρησιμοποιηθούν για την επικύρωση του συστήματος που περιγράψαμε. Χρησιμοποιήσαμε κύτταρα καρκινώματος seeded LNCaP του προστάτη και ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC καθώς το σύστημα συγκαλλιέργειας να αναπτύξουν μια λίστα των υποψηφίων γονιδίων για μελέτες επικύρωσης. Αυτό επιτεύχθηκε με τη χρήση παραδοσιακών μεθόδων για την άμεση συγκαλλιέργεια, την ανάπτυξη των κυττάρων για μια συγκεκριμένη χρονική περίοδο, που ακολουθείται από ένα μηχανικό διαχωρισμό των δύο τύπων κυττάρων. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιείται CD31-συζευγμένα σφαιρίδια για την ταχεία και ποσοτική διαχωριστούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα από τα κύτταρα του καρκινώματος του προστάτη, μετά θρυψινοποίηση της μικτής καλλιέργειας. Η ικανότητα των σφαιριδίων για το διαχωρισμό των δύο τύπων κυττάρων που χαρακτηρίζεται από ανοσοφθορισμό και με RT-PCR. Τα δύο δείγματα των κυττάρων ελέγχθηκαν με έμμεσο ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας CD31 αντισωμάτων, και δείχθηκε ότι τα κύτταρα διαχωρίζονται από τα σφαιρίδια ήταν πράγματι CD31 θετικά, ενώ τα κύτταρα δεν δεσμεύονται από τα σφαιρίδια CD31 αρνητικά. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέθοδος ήταν σε θέση να διαχωρίσει ποσοτικά τους δύο τύπους κυττάρων μετά συγκαλλιέργεια.

Η μεταγραφική αλλαγές που συμβαίνουν στα κύτταρα LNCaP μετά συγκαλλιέργεια με τα κύτταρα HUVEC ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτιδικούς συστοιχίες, συγκρίνοντας την ανάπτυξη των κυττάρων σε συγκαλλιέργεια με HUVEC κύτταρα και μετά από την ανάπτυξη ως μια παρωδία συγκαλλιέργεια? κύτταρα μονοκαλλιέργεια υποβλήθηκαν σε αγωγή με το πρωτόκολλο διαχωρισμού με βάση σφαιρίδια κατά τρόπο πανομοιότυπο με τα πραγματικά δείγματα συγκαλλιέργεια. Πριν από την πλήρη μεταγραφικού προφίλ με μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων, ελέγξαμε τον διαχωρισμό των κυτταρικών τύπων με RT-PCR τριών γονιδίων που εκφράζονται σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 2. Εδώ, τα αποτελέσματα για τρία γονίδια που εμφανίζονται για την συνκαλλιέργεια και ψευδο δείγματα. Τα τρία γονίδια, PECAM /CD31, ΚΟΚ /ΚΟΑ και VE καδχερίνη εκφράζονται καλά σε κύτταρα HUVEC, αλλά κακώς σε κύτταρα LNCaP, όπως φαίνεται στα μονοκαλλιέργεια (mock) πειράματα στο Σχήμα 2. Τα δεδομένα από τα δείγματα συγκαλλιέργεια δείχνει την εξάλειψη του HUVEC κύτταρα από τα κύτταρα LNCaP στα υπερκείμενα να είναι ουσιαστικά πλήρης. Ως εκ τούτου, ήμασταν σε θέση να καλλιέργεια κυττάρων LNCaP με κύτταρα HUVEC, και στη συνέχεια ο διαχωρισμός των κυτταρικών τύπων για μεταγραφική ανάλυσης των χαρακτηριστικών.

RT-PCR ανάλυση των entothelial γονιδίων σε δείγματα μονο- και συγκαλλιέργειας μετά από διαχωρισμό του κυττάρου τύπους. Κύτταρα που αναπτύχθηκαν ως μονοκαλλιέργειες, είτε ενδοθηλιακά ή κύτταρα προστάτη, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα τρόπο ταυτόσημο με εκείνο που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των κυττάρων μετά συγκαλλιέργεια. Τα κύτταρα ανακτήθηκαν με σύνδεση προς σφαιρίδια μυρμήγκι-CD31 συζευγμένο με και σφαιροποιήθηκαν. δεδομένα έκφρασης για κάθε γονίδιο /κατάσταση αναφέρεται ως επίπεδο έκφρασης σε σχέση με το γονίδιο ελέγχου (β-2-μακροσφαιρίνη) για κάθε δείγμα. Κύκλοι: pellet? Τρίγωνα: υπερκείμενο [ανάλογα με την Εφημερίδα, μπορεί να θέλουν αυτές τις πληροφορίες σε ένα μύθο? Το αρχικό σχήμα έχει μια λεζάντα]

Η

Η μεταγραφική profiling εντοπίστηκαν 44 γονίδια που απορυθμίζεται με συγκαλλιέργεια με τα κύτταρα HUVEC, και 4 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω, φαίνονται στον Πίνακα ταυτοποιήθηκαν 1. Τέσσερα γονίδια από δύο προκριματικούς κάθε στις συστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων, MOBK1B, SASH1, TGOLN2 και WIPI49? περιττές προκριματικά αφαιρέθηκαν από τη λίστα. Από τα υποψήφια γονίδια σε αυτή τη λίστα, θα προβληθεί εμπορικά προμηθευτές για αντισώματα τα οποία θα προσδιορίζουν συγκεκριμένα οι στόχοι του Western και έμμεσο ανοσοφθορισμό. Σε πολλές περιπτώσεις, οι εμπορικές αντισώματα δεν ήταν επαρκώς συγκεκριμένες, όπως προσδιορίζεται τόσο από κηλίδωση Western και HCS. Γενικά, τα αντισώματα είτε έδωσε σημαντική διασταυρούμενη αντίδραση band σε κηλίδες Western ή δεν έδειξε χρώση τιτλοδοτήσιμη σε ένα κυψελοειδές μοτίβο που αναμένεται για το αντιγόνο. Αυτή ήταν η περίπτωση για TNFRSF19, η οποία είχε την πιο δραματική αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης του mRNA. Ωστόσο, στην περίπτωση των WWOX, που προσδιορίζονται ως κάτω-ρυθμίζονται από την επαφή κυττάρου-κυττάρου σε LNCaP κύτταρα, ήμασταν σε θέση να εντοπίσει και επικύρωση κατάλληλων αντιδραστηρίων. WWOX έχει καλώς χαρακτηριστεί ως καταστολέας όγκου, μετά από μελέτες που η έκφρασή του συχνά χάνεται ως αποτέλεσμα μετατοπίσεις κατά την εύθραυστη θέση FRA16D [26], [27], συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του προστάτη [28]. Αν και η έκφραση έχει χαθεί σε πολλούς καρκίνους, η έκφραση του μπορεί συχνά να παρατηρηθεί σε πολλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές [29]. WWOX φωσφορυλιώνεται στο κατάλοιπο Thr-33 σε απόκριση σε θεραπεία με TNF-α και hyaluranidase [30]. Φωσφορυλιωμένη WWOX τότε θα ενεργοποιήσει p53, αλλά αυτή η επαγωγή της απόπτωσης καταστέλλεται από JNK1, εν μέρει μέσω μιας άμεσης σύνδεσης με WWOX [31]. Ως εκ τούτου, η μειωμένη έκφραση WWOX θα μετριάσει επίσης απόπτωση που προκύπτει από την έκθεση σε ξένα περιβάλλοντα, όπως προ-μεταστατικές θέσεις πριν από την καθιέρωση του νέου ανάπτυξη του όγκου. Η αναγνώριση των σημαντικά μειωμένη έκφραση της WWOX σε LNCaP κύτταρα από την επαφή με HUVECs παρουσιάζει μια βιολογικά σχετική διαδικασία που θα μπορούσε να αναλυθεί στο σύστημα που περιγράφουμε.

Η

Ανίχνευση αλλαγών σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος σε καρκίνωμα του προστάτη κύτταρα που προκύπτουν από την επαφή κυττάρου-κυττάρου

για να δοκιμαστεί η απόκριση των επιπέδων WWOX να συγκαλλιέργεια, η μεθοδολογία που χρειάζεται για να μεταβληθεί. Συγκεκριμένα, η μέθοδος είναι επί του παρόντος δεν στιβαρή σε τέσσερα κανάλια, λόγω φασματική επικάλυψη στο μπλε σε πορτοκαλί φάσμα των φασμάτων και κάποια αδυναμία στην ένταση στην περιοχή του ερυθρού. Ως εκ τούτου, η επισήμανση ενός αντιγόνου που απαιτείται για να παραληφθεί ώστε να συμπεριλάβει WWOX. Προσπαθήσαμε παραλείποντας το αντιγόνο CD31 και δοκιμάζοντας αν χρώση CDw75 αρκούσε για να διαφοροποιήσει μεταξύ των κυττάρων LNCaP και HUVECs. Μονοκαλλιέργειες και συγκαλλιέργειες αξιολογήθηκαν για να προσδιοριστεί η κατανομή των επιπέδων χρώσης CDw75 σε κάθε τύπο κυττάρου και να προσδιοριστεί το σημείο στο οποίο HUVECs άρχισε να ονομάζεται ως LNCaPs. Το εύρος των επιπέδων για τους δύο τύπους κυττάρων ήταν παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε κατά την αρχική φάση της μελέτης (σχήμα 1), όπου τα κύτταρα LNCaP έδειξε ένα ευρύ φάσμα χρώσης, αλλά μόνο λίγα κύτταρα ανά πεδίο βάφτηκαν αρκετά ελαφρά ώστε να θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως HUVECs, και ως εκ τούτου, αυτή η μέθοδος διαχωρισμού των δύο τύπων κυττάρων φάνηκε αρκετά ισχυρή για να επιτρέψει την χρώση των WWOX ή φωσφο-WWOX, καθώς και. Η ταυτοποίηση των κυτταρικών τύπων και ποσοτικοποίηση των επιπέδων WWOX παρουσιάζονται στο Σχήμα 3. Σύνδεση των εντάσεων σηματοδότησης με το σωστό τύπο κυττάρων ήταν βελτιωμένη πάνω αρχικές μελέτες (που περιγράφεται παραπάνω) με τον περιορισμό του αριθμού των κυττάρων που απλώθηκαν, ιδιαίτερα για την HUVECs.

κύτταρα LNCaP και HUVECs σε συγκαλλιέργεια σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας (πίνακας Α) DAPI, για τον εντοπισμό πυρήνων, (πλαίσιο Β) αντι-CDw75 αντισώματα, για την ταυτοποίηση κυττάρων LNCaP και (πάνελ C) αντι-WWOX αντισώματα. Στο πάνελ D, τα κύτταρα που ταξινομούνται ως HUVEC εμφανίζονται ως κόκκινα τετράγωνα, γειτονικά κύτταρα LNCaP ως κίτρινο πλατείες και μη γειτονικά κύτταρα LNCaP ως μπλε τετράγωνα.

Η

Για να δοκιμάσετε την προσέγγιση της εικόνας που βασίζεται έχουμε αναπτύξει, εξετάσαμε κατά πόσο οι αλλαγές στην έκφραση WWOX εντοπίσαμε στο μεταγραφικό μελέτες προφίλ θα μπορούσε να ανακεφαλαιωθούν στα κύτταρα LNCaP στο σύστημα που περιγράψαμε παραπάνω. επίπεδα πρωτεΐνης WWOX σε κύτταρα LNCaP σε παρακείμενες και μη γειτονικά κύτταρα συγκρίθηκαν. Πολλαπλές φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για καλλιέργεια κυττάρων LNCaP και HUVECs και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και χρωματίσθηκαν με ϋΑΡΙ και αντισώματα προς CDw75 και είτε WWOX ή φωσφο-WWOX. LNCaP κύτταρα προσδιορίστηκαν να είναι είτε γειτονικά ή μη γειτονικά προς HUVECs και αναλύθηκαν για τα επίπεδα της πρωτεΐνης-στόχου. προσδιορίστηκαν κατά μέσο όρο τα επίπεδα της πρωτεΐνης-στόχου και τυπικές αποκλίσεις. Από αυτά τα δεδομένα, η αναλογία και ρ-τιμή των επιπέδων της πρωτεΐνης-στόχου σε γειτονικές ή μη γειτονικά κύτταρα LNCaP υπολογίστηκαν. Τα δεδομένα από αυτές τις συγκρίσεις που παρουσιάζονται στο Σχήμα 4. Τα δεδομένα δείχνουν ότι γειτονικά κύτταρα LNCaP συχνά έχουν μειωμένα επίπεδα τόσο WWOX και φωσφο-WWOX και ως η διαφορά γίνεται μεγαλύτερο, τόσο μεγαλύτερη είναι η σημασία της μέτρησης. Αντίθετα, πηγάδια δεν δείχνει διαφορά δεν ήταν τόσο στατιστικά ισχυρή. Αυτό φαίνεται να δείχνει ότι δεν είναι πάντα δυνατό να αποφανθεί σχετικά με το αν η άμεση επαφή είχε αποτέλεσμα, αλλά όταν μπορούμε να κάνουμε μια αποφασιστικότητα, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα αντιγόνα αυτά είναι χαμηλότερα στα LNCaP κύτταρα που έρχονται σε επαφή HUVEC. έχουν πηγάδια που αποτυγχάνουν να δείξει μια επίδραση έχουν σε σύγκριση με εκείνους που κάνουν, και παρατηρούμε ότι τα φρεάτια που δεν δείχνουν μια διαφορά το πράξουν, ως αποτέλεσμα της πολύ λίγα κύτταρα LNCaP που σκόραρε ως παρακείμενη, συνήθως μέσα από μια άνιση κατανομή των κυττάρων κατά τη διάρκεια της επιμετάλλωσης .

ανεξάρτητων προσδιορισμών, μέσω πολλαπλών πηγαδιών, του λόγου WWOX (μαύρα τετράγωνα) και επίπεδα σε LNCaP κύτταρα που είναι γειτονικές ή μη γειτονικές προς HUVECs φωσφο-WWOX (κόκκινα τετράγωνα) δείχνονται. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει ένα άτομο καλά, όπου αξιολογήθηκαν ~350 γειτονικά και ~1500 μη γειτονικά κύτταρα LNCaP.

Η

Ένα ξεχωριστό παρατήρηση είναι ότι αν και οι διαφορές σε πολλά πηγάδια είναι στατιστικά σημαντικές (με ρ τιμές κάτω από 1 × 10

-3), το μέγεθος της επίδρασης φαίνεται μέτριο. Σε αυτό το στάδιο θεωρείται μια διαφορετική αριθμητική δοκιμασία από τη διαφορά μεταξύ των επιπέδων πρωτεΐνης-στόχου σε πληθυσμούς LNCaP. Το τεστ που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Kolmogorov-Smirnov (ή KS) στατιστική. Η δοκιμή συγκρίνει δύο πληθυσμοί ως κλασματική συνεισφορές προς τη συνολική ποσότητα του αντιγόνου. Τα αποτελέσματα για τα επίπεδα WWOX απεικονίζεται στο Σχήμα 5Α και για φωσφορυλιωμένο WWOX, η οποία διαμεσολαβείται από Src, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β. Η διαφορά στις δύο καμπύλες δείχνει ότι τα κύτταρα LNCaP που γειτνιάζουν με HUVECs έχουν λιγότερη πρωτεΐνη WWOX από κύτταρα LNCaP που είναι μη παρακείμενα HUVECs σε σύγκριση με ανάλογα λίστα.

Η ποσότητα της πρωτεΐνης WWOX (στον πίνακα Α) και φωσφο-WWOX πρωτεΐνη (στον πίνακα Β), δείχνονται για τα κύτταρα LNCaP που γειτνιάζουν με HUVECs (σε κόκκινο) και αυτά τα κύτταρα μη γειτονικά HUVECs (σε μαύρο). Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν (φωσφο-) τα επίπεδα πρωτεΐνης ανά κύτταρο όπως ένα συμβάλλουν στην συνολική ένταση αντιγόνου για ολόκληρο τον τομέα.

Η

Η φωσφορυλίωση του WWOX από τα αποτελέσματα Src στη σύνδεση προς ΙΝΚ1, ρ53 και ρ73 [31 ] – [33], και οι ενώσεις αυτές έχουν συσχετισθεί με μειωμένη απόπτωση. Η μείωση της απόπτωσης είναι ένα ουσιαστικό βήμα για την ογκογένεση [2], και θα πρέπει να αναμένεται για τα καρκινικά κύτταρα αντιμετωπίζουν μη φυσικούς τύπους κυττάρων κατά τη διάρκεια της εισβολής και της μετάστασης, και στην πραγματικότητα αυτό συνδέεται άμεσα με τη λειτουργία JNK1 [34]. Δεδομένου ότι τα επίπεδα WWOX και pWWOX μειωμένη σε γειτονικά κύτταρα LNCaP, αποφασίσαμε να εξετάσουμε τα επίπεδα του c-Jun, JNK1 και ρ73, καθώς και. Τα αποτελέσματα για τις πρωτεΐνες αυτές φαίνονται στον Πίνακα 2. Οι τρεις πρωτεΐνες παρουσιάζουν διαφορετικό βαθμό ευαισθησίας της εγγύτητας των HUVECs. c-Jun και JNK1 εμφανίζουν μόνο μέτρια αποτελέσματα, όπως φαίνεται από τις περισσότερες δοκιμές που δείχνουν υψηλή ρ-τιμές και αναλογίες κοντά 1. p73 δείχνει ισχυρότερη επίδραση, συγκρίσιμο με αυτό που παρατηρήθηκε για WWOX και φωσφο-WWOX στις προηγούμενες δοκιμασίες.