έχουν

Αφηρημένο

miRNAs έχουν εμπλακεί σε πολλές κρίσιμες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης. Έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι η απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος προεκλήθη διά αδαμαντύλ ρετινοειδή που σχετίζονται με (ARR) μόριο 3-Cl-AHPC. Εδώ αναφέρουμε ότι 3-Cl-AHPC-εξαρτώμενη απόπτωση περιλαμβάνει ρύθμιση ενός αριθμού των microRNAs συμπεριλαμβανομένων των miR-150 * και miR-630. 3-Cl-AHPC διεγείρεται miR-150 * έκφραση και προκάλεσε μειωμένη έκφραση του c-Myb και IGF-1 R στα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. 3-Cl-AHPC μεσολάβηση μείωση του c-Myb οδήγησε σε μειωμένη σύνδεση του c-Myb με IGF-1 R και Bcl-2 υποκινητές, προκαλώντας έτσι την καταστολή της έκφρασης μεταγραφής και πρωτεΐνες. Υπερ-έκφραση του miR-150 * οδήγησε επίσης σε μειωμένη επίπεδα πρωτεϊνών Bcl-2, C-Myb και. Περαιτέρω, η προσθήκη του αναστολέα miRNA 2′-Ο-μεθυλιωμένο miR-150 μπλοκάρει 3-Cl-AHPC μεσολάβηση αύξηση miR-150 * επίπεδα και κατήργησε απώλεια της c-Myb πρωτεΐνη. Knockdown του c-Myb σε κύτταρα PANC-1 είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένη απόπτωση τόσο σε παρουσία ή απουσία 3-Cl-AHPC επιβεβαιώνοντας την αντι-αποπτωτική ιδιότητα του c-Myb. Η υπερέκφραση του miR-630 επάγεται επίσης απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος και ανέστειλε IGF 1R-mRNA πρωτεΐνης στόχου και της έκφρασης πρωτεΐνης. Μαζί αυτά τα αποτελέσματα εμπλέκουν βασικούς ρόλους για miR-150 * και miR-630 και στόχευση τους IGF-1R για την προώθηση της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Παράθεση:. Farhana L, Dawson MI, Murshed F, Das JK, Rishi AK, Fontana JA (2013) Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-150 * και miR-630 διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος από Στόχευση IGF-1R. PLoS ONE 8 (5): e61015. doi: 10.1371 /journal.pone.0061015

Επιμέλεια: Jörg Δ Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 14 του Δεκέμβρη του 2012? Αποδεκτές: 5 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Μαΐου 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Υποθέσεων Βετεράνων Merit κριτική Grant (JAF, MID) και το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) επιδοτήσεις (JAF, MID) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μετά την αρχική τους ανακάλυψη το 1993, έχουν microRNAs έχουν μελετηθεί για το σκοπό τους με ένα μεγάλο αριθμό των συγγραφέων [1]. Η ικανότητα των microRNAs να ρυθμίζει την έκφραση μίας ευρείας ποικιλίας γονιδίων στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο έχει τεκμηριωθεί καλά [2]. Αυτά τα μικρά μόρια RNA συντηρημένα και εκφράζονται σε ένα μεγάλο αριθμό οργανισμών, συμπεριλαμβανομένων

Homo sapiens

και παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ζωτικής σημασίας βιολογικών διεργασιών συμπεριλαμβανομένης κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση.

Τα microRNAs είναι μεταγράφεται στον πυρήνα κυρίως από την RNA πολυμεράση όσο πρωτογενείς μεταγραφές (προ-microRNAs). Αυτά τα μόρια στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία στο πυρήνα από RNAse III Drosha σε 70- έως 100 νουκλεοτίδια προ-microRNAs και στη συνέχεια εξάγονται στο κυτταρόπλασμα όπου περαιτέρω επεξεργασία από την RNAse III Dicer να παράγουν δίκλωνα RNA (dsRNA) περίπου 22 νουκλεοτίδια [3]. Είτε, υπάρχει υποβάθμιση του αντινοηματικού κλώνου σε αυτό το σημείο είναι αμφιλεγόμενη. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν έντονα ότι η αντίστροφη κλώνου mRNA μπορεί να μην είναι υποβαθμισμένη και μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση ενός αριθμού κυτταρικών λειτουργιών [4]. Το υπόλοιπο ώριμο μονόκλωνο micro RNA αναστέλλει μετάφραση από την ένωση ενός συμπλόκου που δεσμεύεται συμπληρωματικό προς το 3′-UTR του γονιδίου στόχου. Μέσω έχουν δωρεάν δέσμευσης, ειδικών microRNAs έχει αποδειχθεί ότι στοχεύουν σε ένα αριθμό γονιδίων ενισχύοντας ή αναστέλλοντας την έκφρασή τους, με αποτέλεσμα πλειοτροπικές επιδράσεις σε έναν αριθμό κυτταρικών λειτουργιών [5].

Δυσλειτουργία της έκφρασης microRNA έχει συσχετιστεί με τον καρκίνο έναρξη και την πρόοδο με τη ρύθμιση της έκφρασης καταστολείς όγκων και ογκογονίδια. Έχει καταδειχθεί προηγουμένως ότι τα προφίλ microRNA βρέθηκε σε ιστούς καρκινώματος του παγκρέατος διαφέρουν σημαντικά από εκείνα που βρέθηκαν σε φυσιολογικό παγκρεατικό ιστό ή σε παγκρεατίτιδα [6]. Έχει υποτεθεί ότι η ενισχυμένη ή μειωμένη έκφραση ειδικών microRNAs μπορεί να είναι ισχυρή προσέγγιση στη θεραπεία ενός αριθμού κακοηθειών [5]. Ένας αριθμός προσεγγίσεων για να ρυθμίζει έκφραση microRNA έχουν επινοηθεί. Η σθεναρά-υποκατεστημένη ρετινοειδές σχετίζονται έχουν (ARR) μόρια έχουν βρεθεί ότι διεγείρει απόπτωση σε ποικιλία κακοηθών κυττάρων τόσο

in vitro

και

in vivo

[7]. Ένας αριθμός μηχανισμών έχουν προταθεί μέσω των οποίων η απόπτωση επιτυγχάνεται μέσω αυτής της κατηγορίας μορίων [7]

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι arrs είναι ισχυροί επαγωγείς απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος – α. Μελαγχολική ασθένεια με μια συχνά καταστροφική πρόγνωση [8]. Υποθέσαμε ότι η έκθεση των κυττάρων στην 3-Cl-AHPC μπορεί να οδηγήσει στην διαμόρφωση της έκφρασης microRNA και ότι αυτή η έκφραση απόκλιση microRNA μπορεί να συμβάλουν στην ARR μεσολάβηση αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή κυτταρικού θανάτου. Στην παρούσα σειρά πειραμάτων, αποδεικνύουμε ότι η arrs ρυθμίζουν πράγματι έκφραση microRNAs και ότι αυτή η αύξηση της ειδικής έκφρασης microRNA miR-150 * και miR-630 έχει σαν αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρύθμιση του IGF-1 R πρωτεΐνης που είναι σημαντικός μεσολαβητής της κυτταρικής ανάπτυξης και επαγωγή της απόπτωσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα αντιδραστήρια και τα κύτταρα

(

E

) -4- [3- (1-αδαμαντυλο) -4- υδροξυφαινυλ] -3-χλωροκινναμωμικό οξύ (3-Cl-AHPC) συντέθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρικές σειρές καρκινώματος, PANC-1 και MiaPaCa-2 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) και διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM-F12 που περιείχε 10% FBS και 100 μg /ml γενταμυκίνη. μέσο DMEM-F12, ορού εμβρύου μόσχου (FBS) και Lipofectamine 2000 αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Αντισώματα και τις πηγές τους έχουν ως εξής: αντισωμάτων για κυτταρομετρία ροής, CD44-ΡΕ, CD24-FITC από την BD Biosciences (San Jose, CA)? αντι-IGF 1Rβ, αντι-SMAD1, αντι-διασπασμένη κασπάση 3 (Asp-175), αντι-κασπάσης 3 ήταν από την Cell Signaling Technology (Boston, ΜΑ)? αντι-ΕΟΡΚ, αντι-CDK6, αντι-c-Myb και αντι-Bcl2 αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)? Cdc14A και ABCC1 από Abcam, Cambridge, MA και Thermo Scientific, Rockford, IL, αντίστοιχα? και αντι-α-τουμπουλίνης και αντίσωμα β-ακτίνης (Oncogene Research Products, Boston, ΜΑ). Πουρομυκίνη αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louise, ΜΟ).

miRNA ανάλυση μικροσυστοιχιών και επικύρωση

PANC-1 κύτταρα εκτέθηκαν σε 1 μΜ 3-Cl-AHPC για 30 ώρες. Ολικό RNA από 3-Cl-AHPC επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα που εκχυλίζεται με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και στη συνέχεια την προετοιμασία του δείγματος, υβριδοποίηση σε G4470A 15K Ανθρώπινα miRNA Microarray (V2) (Agilent Technologies) και η ανάλυση έγιναν από Asuragen, Inc. (Austin, TX). Για την επικύρωση miRNA, ολικό RNA καθαρίστηκε με RNeasy Mini Kit (Qiagen) και 100 ng RNA χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή cDNA χρησιμοποιώντας κιτ TaqMan microRNA αντίστροφη μεταγραφή (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές microRNA. Το συγκεκριμένο έναυσμα ακολουθία miRNA και ο ανιχνευτής του miR-134, miR-150 *, miR-630, miR-345, miR-382, miR410 και miR129-5P, ενδογενή RNU6B ελέγχου και TaqMan 2 × PCR Δάσκαλος μίγμα για αναλύσεις TaqMan microRNA αγοράστηκαν από την Applied Biosystems και ακολούθησε το πρωτόκολλο όπως περιγράφεται από τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR και ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε Applied Biosystems 7500 σύστημα Real Time PCR. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τιμές ΔCt του miRNAs από κάθε δείγμα υπολογίζεται από την κανονικοποίηση με RNU6B εσωτερικού ελέγχου και κάθε τιμή ήταν μέσος όρος των τριών επαναλήψεων.

mRNA Ο ποσοτικός

Ολικό RNA παρασκευάστηκε από PANC- 1 κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το Rneasy Mini Kit (Qiagen). Για πραγματικό χρόνο PCR, cDNA παρασκευάστηκε με το σύστημα σύνθεσης First-Strand cDNA SuperScript III για RT-PCR (Invitrogen) και αναλύθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το 2 × SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) και το σύστημα ανίχνευσης 7500 αλληλουχία ΑΒΙ Prism . PCR αποτελούνταν από 40 κύκλους των 95 ° C για 10 λεπτά και στη συνέχεια 95 ° C για 15 sec, 60 ° C για 60 sec. Οι ομάδες εναρκτήρα ολιγονουκλεοτιδίου συντέθηκαν από Integrated DNA Technology Inc. (Coralville, ΙΑ). Το αλφαβητάρι που καθορίζονται για κάθε γονίδιο που αναφέρονται παρακάτω:

EGFR, μπροστά 5′-CTTTCGATACCCAGGACCAAG-3 ‘? αντίστροφη 5’-CAACTTCCCAAAATGTGCCC -3 ‘? CDK6, μπροστά 5’-TGCACAGTGTCACGAACAGA -3 ‘?

αντίστροφη 5′-ACCTCGGAGAAGCTGAAACA-3′? ABCC1,

μπροστά 5′-AGGTGGACCTGTTTCGTGAC-3 ‘?

αντίστροφη 5′-ACCCTGTGGATCCACCAGAAG-3′? SMAD1 μπροστά

5′-CAACAATCGTGTGGGTGAAG -3 ‘? αντίστροφη 5’-TCCGGTTAACATTGGAGAGC -3 ‘?

CDC14A, μπροστά 5′-GCACACCCAGTGACAACATC -3′? αντίστροφη

5′-CCTTCACTGGATGGTCGATT -3 ‘? IGF-1R, μπροστά

5′-AACCCCAAGACTGAGGTGTG -3 ‘? αντίστροφη 5’-TGACATCTCTCCGCTTCCTT -3 ‘?

c-Μγβ, μπροστά 5′-GTCCGAAACGTTGGTCTGTT -3′? αντίστροφη

5′-GGCAGTAGCTTTGCGATTTC-3 ‘? BCL2, μπροστά 5’-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA -3 ‘

αντίστροφη 5′-ACAGTTCCACAAAGGCATCC -3′? β-ακτίνη, μπροστά

5′-TCCTTCCTGGGCATGGAG-3 ‘? αντίστροφη 5’-AGGAGGGGCAATGATCTT-3 ‘.

miRNAexpression διάνυσμα κατασκευή και shRNA-c-Myb πλασμίδιο

Για την κατασκευή του miR-150 * φορέα έκφρασης, προ-miR-150 * αλληλουχίες συντέθηκαν από Integrated Technologies Inc. και ανόπτηση miR-150 * ακολουθία ήταν κλώνοι σε pcDNA6.2-GW φορέα /EmGFP-miR από BLOCK-it-Δημοσκόπηση II miR RNAi φορέα έκφρασης κιτ (Invitrogen). miR-150 * αλληλουχία στο πλασμίδιο ραχοκοκαλιά προ-miR-150 * επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση. miR-150 * φορέα έκφρασης διαμολύνθηκαν σταθερά σε PANC-1 κύτταρα χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 και οι σταθερές κυτταρικές σειρές επιλέχθηκαν με puromycin.Vector περιέχει κωδικοποιημένα αλληλουχία χρησιμοποιήθηκε ως ένας έλεγχος.

Μικρές φουρκέτα (sh) -RNA Μγβ φορέας έκφρασης κατασκευάστηκε από κατευθυνόμενης κλωνοποίησης 5 ‘-

Bam

ΗΙ και 3

EcoR

έχω προεξοχή νουκλεοτιδίων σε ένα φορέα pSIREN-RetroQ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Clontech, Mountain View, CA). Το γονίδιο αποσιώπηση αλληλουχίες στόχους ήταν από την αλληλουχία κωδικοποίησης των αριθμών προσχώρησης NM_001130172 και SH-RNA αλληλουχίες PubMed, 5′-TGAAGAAGCTGGTGGAACA -3 ‘(Μγβ-Kd1) και 5′-ACAGATGACTGGAAAGTTA -3’ (Μγβ-Kd2), 5 ‘ – CAGAAGAGGAAGACAGAAT-3 ‘(Μγβ-KD3) συνετέθησαν από περιοχές Integrated DNA τεχνολογία Inc. shRNA στο σκελετό του πλασμιδίου επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας. shRNA-Myb knockdown πλασμίδια διαμολύνθηκαν σταθερά σε κύτταρα PANC-1 χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 και οι σταθερές κυτταρικές σειρές επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Το SH-οργανισμούς φορείς, που περιέχει κωδικοποιημένα αλληλουχίες στο φορέα pSIREN-RetroQ χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Για miR-630 υπερέκφραση, PEP-έχει-miR-630 φορέα έκφρασης αγοράστηκε από κινητό Biolabs. Inc. (San Diego, CA). Να αναστέλλει miR-150 * και miR-630 miRNAs, τα κύτταρα επιμολυσμένα με αντίθετης φοράς O’methylated miR-150 * (ΟΜΕ-miR-630) ακολουθίες (ΟΜΕ-miR-150) και miR-630? Οι αλληλουχίες συντέθηκε από Integrated DNA Technology Inc.

Απόπτωση και Ανάπτυξης αναστολή

Ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μΜ 3-Cl-AHPC για διάφορες υποδεικνυόμενο χρόνο. Απόπτωση σε κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη δέσμευσης μαζί με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) V-FITC χρώση (Αννεξίνη V-FITC ανιχνεύσεως αποπτώσεως Kit 1, BD Biosciences, San Diego, CA). Η απόκτηση των δεδομένων έγινε σε ροή FACS Calibur κυτταρόμετρο (BD) και αναλύθηκαν με λογισμικό CellQuest (BD Biosciences). Η επαγωγή του κυτταρικού θανάτου του miR-630 παροδικά επιμολυσμένα PANC-1 κύτταρα εκτιμήθηκε με Θανάτου Κυττάρου εντοπισμό των παραβιάσεων ELISAplus κιτ (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ). Η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης προσδιορίστηκε με 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) δοκιμασία -2,5-διφαινυλτετραζολίου (ΜΤΤ). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε όγκο 200 μΙ μέσου καλλιέργειας και προ-miR-630 φορέα έκφρασης, miR φορείς επιμολύνθηκαν με λιποφεκταμίνη. Μετά από 48 h επιμόλυνσης, 25 μΙ /φρεάτιο ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκαν στο μέσο και επωάστηκαν για 4 ώρες και ΜΤΤ ιζήματα διαλυτοποιήθηκαν με 200 μΐ DMSO και οι πλάκες αναγνώστηκαν σε Biotek Synergy ΗΤ (Biotek Instrument Inc ., Βερμόντ) σε απορρόφηση 590 nm. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τετραπλούν για να καθορίσει μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις.

κηλίδες Western

Τα κύτταρα εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 25 mM ρυθμιστικό Tris-Cl (ρΗ 8,0), 150 mM NaCl, 0,2 % Nonidet Ρ-40, 10% γλυκερόλη 10 mM NaF, 8 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 0,2 mM Να

3νο

4, 1 mM DTT, και 10 μl /ml κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma Aldrich, St. Louise , ΜΟ) και στυπώματα Western διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10].

χρωματίνης ανοσοκαθίζηση (μάρκας) δοκιμασία

PANC 1-κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ 3-Cl-AHPC για 24 ώρες και η ανάλυση φορμαλδεΰδης εγκάρσιας σύνδεσης και ανοσοκαθίζηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας μία μέθοδο που περιγράφεται [10]. λύμα χρωματίνης επωάστηκε με 1 μα αντι-c-Myb αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C και ανοσοκαθιζάνουν σύμπλοκα συνελέγησαν με Dynal magntic σφαιρίδια (Invitrogen). Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν σε στα δείγματα δοκιμασίας ChIP για IGF-1 R και της περιοχής υποκινητή Bcl2,

IGF-1 R, προς τα εμπρός, 5′-AGGGGAATTTCATCCCAAAT-3 ‘? αντιστραφεί,

5′-AGGAAAAGTTCCCGCAGTG – 3 ‘? BCL2, προς τα εμπρός,

5′-CAGAGGAGGGCTTTCTTTCTTCTT-3 ‘? αντίστροφη, 5’-CCCGGCCTCTTACTTCATTCT -3 ‘

Real-Time PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως στο τμήμα mRNA ποσοτικοποίησης. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τιμές ΔCt από κάθε δεσμευμένο στοιχείο ελέγχου c-Μγβ. 3-Cl-AHPC επεξεργασμένα δείγματα υπολογίσθηκαν από την κανονικοποίηση με έλεγχο εισόδου και αξία αντιμετωπίζεται εισόδου και κάθε τιμή ήταν ο μέσος όρος των τριών επαναλήψεων. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου και η εικόνα συλλαμβάνεται από Gel Logic 2200 σύστημα απεικόνισης, Σύστημα Μοριακής Απεικόνισης Carestream Health, Inc.

ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS ) του CD44

+ /CD24

+ κυττάρων και το σχηματισμό σφαίρα

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-80% συρροή, τρυψινοποιήθηκαν και πλύθηκε με διαλογή ρυθμιστικό διάλυμα (1 χ PBS, 5% FCS). Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν με 100 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος διαλογής και επωάστηκε με 15-20 μΐ αντι-CD44-ΡΕ και αντι-CD24-FITC πρωτογενή αντισώματα για 30 λεπτά σε πάγο. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 500 μλ διαλογής ρυθμιστικού και ταξινομούνται χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής συστήματος FACSAria (BD Ανοσοκυτοχημεία Systems, Franklin Lakes, NJ).

Κατάταξη σύμφωνα CD44

+ /CD24

+ κύτταρα αιωρούνται σε μέσο βλαστοκυττάρων χωρίς ορό που περιείχε DMEM /F12 (1:01) συμπληρωμένο με Β27 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 20 ng /ml EGF (Biomol International, Plymouth, ΡΑ), 20 ng /ml παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών (Biomol International, Plymouth, ΡΑ), και 100 μg /ml γενταμυκίνη. Περίπου 150-200 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε ένα εξαιρετικά χαμηλό προσάρτηση πλάκας 96-φρεατίων (Corning Inc, Lowell, ΜΑ). 3-Cl-AHPC (1,0 μΜ) προστέθηκε την ημέρα μετά τα κύτταρα τοποθετήθηκαν ή μετά από 7 ημέρες σχηματισμού σφαίρας. Σφαίρες φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus (OLYMPUS CKX41) και μικροσκόπιο Olympus ψηφιακή φωτογραφική μηχανή με το λογισμικό DP2-BSW (Όλυμπος λύσεις μαλακό απεικόνισης GmbH, Γερμανία). Όλες οι στατιστικές διενεργήθηκαν χρησιμοποιώντας VassarStats web στατιστικού λογισμικού (Richard Lowry, Poughkeepsie, NY, USA). Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ΑΝΟνΑ) για την ανίχνευση των διαφορών μεταξύ των ομάδων ελέγχου σφαίρας, 3-Cl AHPC αγωγή σφαίρες. Εάν το αποτέλεσμα της ANOVA ήταν σημαντική (** P & lt? 0,01 έναντι ελέγχου), κατά ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν με δοκιμή post-hoc (διαδικασία HSD ​​του Tukey). Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο ** P & lt? 0.01 vs ελέγχου και * P & lt? 0,05 vs ελέγχου. Αγκύλες χρησιμοποιήθηκαν τα στοιχεία για να δείξει θεραπείες που είναι σημαντικά διαφορετική από τον έλεγχο.

Αποτελέσματα

3-Cl-AHPC μεσολάβηση διαμόρφωση συγκεκριμένων microRNAs

PANC-1 έκθεση των κυττάρων σε 1 μΜ 3-Cl-AHPC διαμορφωμένο έκφραση ενός αριθμού microRNAs (Πίνακας 1 ανάλυση μικροσυστοιχιών). Up-ρύθμιση του miR-134, miR-150 *, miR-630, miR-345, miR-382, miR-410 και miR-129-5p και κάτω ρύθμιση του miR-202 και miR-578 παρατηρήθηκαν επίσης ( δεν φαίνεται). Περαιτέρω απόδειξη του 3-Cl-AHPC μεσολάβηση διαμόρφωση miRNA ελήφθη με πραγματικού χρόνου PCR-χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή Taqman. Real-time PCR έδειξε μια στατιστικά σημαντική αύξηση στην έκφραση των διαφόρων ειδών microRNA στις 24 ώρες (Σχήμα 1) σε

Τα microRNAs επικυρώθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3-Cl-AHPC για 24 ώρες. μεθοδολογίες Λεπτομέρεια ήταν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± την τυπική απόκλιση (SD). *, ** Και *** (& lt? 0,05, & lt? 0.01 και & lt? 0.001) ήταν σημαντικά διαφορετικό σε σύγκριση μεταξύ ελέγχου και κατεργασμένων δειγμάτων χρησιμοποιώντας το

t-δοκιμή

Η

PANC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα. Μπορούμε επίσης προσδιοριστεί αν 3-Cl-AHPC διαμόρφωση της έκφρασης microRNA οδήγησε σε ανάντη ή προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων αποτελούν στόχο αυτών των microRNAs? γονίδια-στόχους εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας το TargeScanHuman βάση 5,0 δεδομένων. Διαφοροποίηση των στοχοθετημένων γονιδίων που περιλαμβάνουν EGFR, c-Myb, CDC14A, IGF-1 R, SMAD1, ABCC1, CPEB3, και CDK6 τόσο στο mRNA (Σχήμα 2Α και Β) και το επίπεδο πρωτεΐνης (Εικόνα 2C και Ε) αποδείχθηκε εντός 24 h έκθεσης 3-Cl-AHPC. Βρήκαμε επίσης ότι η έκθεση των κυττάρων PANC-1 προς 3-Cl-AHPC για 24 ώρες ή 48 ώρες αυξημένη έκφραση του miR-150 *, ενώ μειώνεται η έκφραση πρωτεΐνης c-Myb και IGF-1R σε κύτταρα (Σχήμα 2D και Ε) .

(Α και Β) μειωμένη έκφραση του mRNA με SYBR πράσινο RT-PCR? (C και Ε) μειώθηκε πρωτεΐνες επίπεδα καταδείχθηκαν με ανάλυση Western blots. ΡΕ). έκθεση 3-Cl-AHPC αυξημένη miR-150 * έκφρασης και ακολούθως μειωμένη έκφραση του c-Myb και πρωτεΐνες IGF-1 R (E). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± την τυπική απόκλιση (SD). *, ** Και *** (& lt? 0,05, & lt? 0.01 και & lt? 0.001) ήταν σημαντικά διαφορετικό σε σύγκριση μεταξύ ελέγχου και κατεργασμένων δειγμάτων χρησιμοποιώντας το

t-δοκιμή

Η

Πάνω-έκφραση miR150 * αυξημένη απόπτωση ρυθμίζοντας c-Μγβ και IGF-1R και ανέστειλε CD44

+ /CD24

+ βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με σφαίρες σχηματισμό

Προηγούμενες έρευνες έχουν δείξει ότι ΜΙΚ 150 στόχοι πρωτο-ογκογονιδίου παράγοντα μεταγραφής c-Myb κατά την διάρκεια πολλαπλά στάδια της ανάπτυξης των λεμφοκυττάρων [11]. Για την περαιτέρω αποδείξει miR-150 * ρύθμιση της c-Myb και IGF-1 R στα κύτταρα PANC-1, προ-miR-150 * ήταν σταθερώς υπερ-εκφράζεται με τη χρήση ενός προ-miR-150 * φορέα έκφρασης (προ-miR -150 *) σε PANC-1 κύτταρα με αποτέλεσμα ένα 7-πλάσια αύξηση σε προ-miR-150 * έκφρασης (Σχήμα 3Α)? προ-miR-150 * υπερέκφραση οδήγησε σε αναστολή του 80% του IGF-1 R και τα επίπεδα c-Myb mRNA, ένα 50% μειωμένη έκφραση των επιπέδων της πρωτεΐνης c-Myb και μια μείωση κατά 32% στην έκφραση του IGF-1 R (Σχήμα 3Β -ΡΕ). Επιπλέον, τόσο αυξημένη έκφραση των προ-miR-150 * από την ίδια και με την παρουσία 3-Cl-AHPC σημαντικά ενισχυμένη απόπτωση στα κύτταρα PANC-1 (Σχήμα 3Ε). Προ-miR-150 * ενεργοποιημένης κασπάσης 3 1,5-φορές, δείχνοντας πρωτεολυτική σχάση-κασπάσης 3 θραύσματα (Σχήμα 3Ε, το άνω δεξί πάνελ) και επάγουν την DNA κατακερματισμού (Σχήμα 3Ε, κάτω δεξιά πλαίσιο). Αυτά τα αποτελέσματα μαζί εμπλέκουν ένα προ-αποπτωτικό ρόλο του miR-150 μέσω της ρύθμισης της γονιδίων στόχων του. Η επώαση των κυττάρων PANC-1 με τον αναστολέα 2′-Ο-meyhylated miR-150 * αντινόημα (ΟΜΕ-miR150 *) μπλοκάρει 3-Cl-AHPC μεσολάβηση ανύψωση του miR-150 * επίπεδα και μειώθηκαν στην έκφραση c-Myb έντονα . Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η 3-Cl-AHPC ασκεί τις δράσεις της για c-Myb και έκφραση του IGF-1 R μέσω διαμόρφωσης του microRNAs (Σχήμα 4Α-C).

(Α) Η αυξημένη έκφραση του προ-miR-150 * φορέα έκφρασης και προ-miR-150 * μειωμένη έκφραση του c-Myb και IGF-1 R mRNA και πρωτεΐνης σε προ-miR-150 * σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα (Β-D). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ 3-Cl-AHPC για 24 ώρες. (Ε) προ-miR-150 * απόπτωση που επάγεται από την ίδια και ενισχυμένη 3-Cl-AHPC απόπτωση σε κύτταρα PANC-1. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR-150 * φορέας έκφρασης για 24 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε 3-Cl-AHPC για 24 ώρες. Η επαγωγή της απόπτωσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας επισήμανση Annexin V-FITC με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση σε κύτταρα και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± την τυπική απόκλιση (SD). Όλα τα επεξεργασμένα δείγματα είναι σημαντικά διαφορετική από miR-φορέα. * (& Lt? 0.05), ** (& lt? 0,01) και *** (& lt? 0.001) διαφέρει σημαντικά σε σύγκριση με το miR-φορέα από

t

-δοκιμή. Υπερ-έκφραση του miR-150 * επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης 3 όπως υποδεικνύεται από διασπασμένης κασπάσης 3 θραύσματα σε προ-miR-150 * παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα (άνω δεξιό πλαίσιο). προ-miR-150 * εκφράζεται PANC-1 κύτταρα επαγόμενη απόπτωση, όπως αναφέρεται στο ακριδίνη πορτοκαλί /βρωμιούχο αιθίδιο χρωματισμένα κύτταρα σε κάτω δεξιά πάνελ. Τα κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-150 * για 48 ώρες και στη συνέχεια βάφονται και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Olympus φθορισμού μικροσκόπιο ψηφιακή φωτογραφική μηχανή και το λογισμικό DP2-BSW.

Η

(Α) Αναστολέας 2′-O-μεθυλιωμένα miR-150 * (ΟΜΕ-150) ανέστειλε 3-Cl-AHPC μεσολάβηση miR-150 * έκφραση σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα. (Β και Γ) miR-150 αναστολέα εμπόδισε την 3-Cl-AHPC μεσολάβηση της υποβάθμισης γ-Μγβ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ 3-Cl-AHPC για 24 ώρες. (Δ) Γκρεμίζω της έκφρασης c-Μγβ στα κύτταρα. (Ε) Γκρεμίζω του c-Μγβ ενίσχυσε την απόπτωση στα κύτταρα. Κύτταρα σταθερά διαμολυσμένα με τρεις φορείς έκφρασης knockdown SH-Myb και scrumble φορέα μάρτυρα αλληλουχία εκτέθηκαν σε 3-Cl-AHPC για 24 ώρες. Η επαγωγή της απόπτωσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας επισήμανση Annexin V-FITC με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση σε κύτταρα και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± την τυπική απόκλιση (SD). Όλα τα επεξεργασμένα δείγματα και SH-Μγβ είναι σημαντικά διαφορετική από τον έλεγχο και την SH-φορέα? • και ••, ** (& lt? 0.05 και & lt? 0,01 αντίστοιχα) είναι σημαντικά διαφορετικές από

t

-δοκιμή και • εκπροσωπείται η σύγκριση μεταξύ 3-Cl-AHPC να ΟΜΕ-150 + 3-Cl -AHPC επεξεργασμένα δείγματα.

η

Υποθέσαμε ότι c-Myb ήταν αντι-αποπτωτικό στα κύτταρα PANC-1 και knockdown του c-Myb θα ενισχύσει την απόπτωση των κυττάρων τόσο στην απουσία και την παρουσία του 3-Cl-AHPC. Τρεις κλώνοι του sh-Myb knockdown παράχθηκαν σε PANC-1 κύτταρα και τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης c-Myb βρέθηκαν (Σχήμα 4D). Εξόντωση Μγβ καταδείξει ενισχυμένη απόπτωση σε κύτταρα SH-Myb-KD. Η προσθήκη του 3-Cl-AHPC σε αυτά τα κύτταρα είχε επίσης ως αποτέλεσμα σημαντικά υψηλότερα επίπεδα απόπτωσης από σημειώνεται με κύτταρα επιμολυσμένα με μόνο τον φορέα (Σχήμα 4Ε).

Bcl-2 παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στον ανταγωνισμό της απόπτωσης από έναν αριθμό παραγόντων [12]. Εχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι το c-Myb έχει μία θέση πρόσδεσης στον υποκινητή Bcl-2 και είναι ένας θετικός ρυθμιστής της έκφρασης Bcl-2. Μειωμένα επίπεδα c-Myb στο επαγώγιμο κυρίαρχο-αρνητικό πρωτεΐνη Μγβ κλώνος ΡϋΟΡ-mix Α4 κύτταρα οδήγησε σε μειωμένη Bcl-2 έκφραση [13]. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε την έκφραση Bcl-2 σε κύτταρα που εκτίθενται σε 3-Cl-AHPC. Βρήκαμε μειώθηκε σημαντικά Bcl-2 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης στα δύο κύτταρα PANC-1 και MiaPaCa-2 (Σχήμα 5Α και Β). Επιπλέον, πάνω από την έκφραση της προ-miR-150 * οδήγησε σε μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης Bcl-2 υποδηλώνοντας ότι είναι ρυθμίζονται από miR-150 * έως C-Myb (Σχήμα 5C). Χρωματίνης προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης εκτελέσθηκαν για τη διαλεύκανση του μηχανισμού με τον οποίο 3-Cl-AHPC μειώνεται Bcl-2 και IGF-1 R έκφρασης. 3-Cl-AHPC έκθεση οδήγησε σε σημαντική μείωση στην πρόσδεση του c-Myb στον IGF-1R και Bcl-2 υποκινητές (Σχήμα 5D).

(Α και Β) 3-Cl-AHPC μειώθηκε Bcl-2 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης. (Γ) Η υπερέκφραση του προ-miR-150 * μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης Bcl-2. (D) 3-Cl-AHPC μειωμένη δέσμευση σε IGF-1 R και τοποθεσίες υποκινητή Bcl-2 σε δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης c-Myb-. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 3-Cl-AHPC για 24 ώρες. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± την τυπική απόκλιση (SD). ** Και *** (& lt? 0.01 και & lt? 0.001). Ήταν σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση μεταξύ του ελέγχου σε 3-Cl-AHPC επεξεργασία mRNA και Μγβ δεσμευτικός ως προς όλα τόπους υποστηρικτής χρησιμοποιώντας το

t-δοκιμή

Έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι PANC-1 κύτταρα εμπλουτισμένα για CD24 /CD44 θετικότητα κατείχε το κύτταρο-σαν χαρακτηριστικό στέλεχος των σφαιρών σχηματίζουν το μη-προσκολλημένα συνθήκες ανάπτυξης [8]. Η προσθήκη του 3-Cl-AHPC σε αυτές τις σφαίρες ανέστειλε την ανάπτυξη τους και είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή απόπτωσης. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε την επίδραση των αυξημένων επιπέδων προ-miR-150 * και knockdown της έκφρασης c-Myb για την ανάπτυξη αυτών των σφαιρών (Σχήματα 6Α, Β και C). Και τα δύο αυξημένα επίπεδα προ-miR-150 * και knockdown της έκφρασης c-Myb οδήγησε σε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των σφαιρών στις 7 και 14 ημέρες. Ομοίως, Zhang

et al.

[14] έχουν δείξει πρόσφατα ότι η αυξημένη miR-150 έκφρασης αναστέλλει CD133 θετικό καρκίνο του ήπατος βλαστικά κύτταρα μέσω της αναστολής της έκφρασης c-Μγβ.

(Α και C ) προ-miR-150 * ανέστειλε σχηματισμό σφαίρα στο CD44

+ /CD24

+ κύτταρα. (Β και Γ) γ-Μγβ νοκ ντάουν ανέστειλε σχηματισμό σφαίρα στο CD44

+ /CD24

+ κύτταρα PANC-1. Για το σχηματισμό σφαίρας, η CD44

+ /CD24

+ κύτταρα ταξινομήθηκαν με κυτταρομετρία ροής από σταθερά επιμολυσμένα προ-miR150 * και SH-Μγβ γκρεμίζω κύτταρα, αντίστοιχα. Τα μεγέθη των σφαιρών φωτογραφήθηκαν και μετριέται σε μια κλίμακα 100 μm και μεγέθυνση 400 × χρησιμοποιώντας Ολύμπου φθορισμού μικροσκόπιο λογισμικό ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής και του λογισμικού DP2-BSW. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή των 15 προσδιορισμών σφαίρας ± την τυπική απόκλιση. ** Ήταν σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με τον έλεγχο σφαίρες. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με ANOVA? δοκιμή Tukey HSD για πολλαπλές συγκρίσεις. ** P & lt? 0,0001 έναντι του ελέγχου. (D) Σχέδιο δείχνει προβλεπόμενο στόχο συντηρημένη περιοχή του miR-630 στην 3’UTR του IGF-1R.

Η

πρωτεΐνη-στόχος IGF-1R ρυθμίζεται από miR-630

Galluzzi

et al.

έχουν δείξει ότι miR-630 ρυθμίζει προκαλούμενη σισπλατίνη διακοπή της ανάπτυξης με ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου αναστολέα ρ27

Kip1 και επάγει την απόπτωση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [14]. Έχουμε βρει ότι PANC- 1 κύτταρα εκτίθενται σε 3-Cl-AHPC ενισχυμένη έκφραση miR-630 6-πλάσια. Χρησιμοποιώντας TargetScanHuman 5,1 λογισμικό (Πίνακας 1), βρήκαμε δυναμικό γονιδίων στόχων miR-630 IGF-1 R και Cdc14A. miR-630 ζευγών σε 7 νουκλεοτιδίου διατηρημένη περιοχή που βρίσκεται στη θέση 2658-2665 του IGF-1 R 3′-UTR (Σχήμα 6D). Υπερ-έκφραση των προ-miR-630 μειωμένη IGF-1 R mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 7Α-D) ενώ δεν υπήρξε μεταβολή στο γονίδιο στόχο Cdc14A επίπεδο mRNA. 3-Cl-AHPC μείωσε το mRNA Cdc14A και την έκφραση της πρωτεΐνης (Σχήμα 2Α και C). Ο μηχανισμός με τον οποίο 3-Cl-AHPC προκάλεσε μειωμένη έκφραση Cdc14A μένει να καθοριστεί. Ο αναστολέας αντινόημα 2′-Ο-μεθυλιωμένο miR-630 μπλοκάρει προ-miR-630 με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης IGF-1 R mRNA έδειξαν ότι ένα γονίδιο στόχος miR-630 είναι IGF-1 R (Σχήμα 7Ε). Επιπλέον, η υπερέκφραση του προ- miR-630 αυξημένη αναστολή και την απόπτωση σημαντικά PANC-1 κυττάρων (Σχήματα 7F και G). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν το σημαντικό ρόλο του miR-630 στην επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

(Α) προ-miR-630 έκφραση σε κύτταρα MiaPaCa-2 PANC-1 και. (Β και C) Αυξημένη έκφραση του προ-miR-630 μειώθηκε IGF 1Κ-mRNA, αλλά όχι Cdc14A στα κύτταρα. (ΡΕ). Μειώθηκε IGF-1 R έκφραση πρωτεΐνης σε προ-miR-630 που εκφράζεται κύτταρα. (Ε) Αναστολέας 2′-Ο-μεθυλιωμένο miR-630 (ΟΜΕ-630) μπλοκάρει την αποικοδόμηση IGF-1 R mRNA. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR-630 για 48 ώρες (F και G) προ-miR-630 έκφραση ανέστειλε την ανάπτυξη και απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα PANC-1. Η αναστολή της κυτταρικής πολλαπλασιασμών αξιολογήθηκε μετά από 48 ώρες προ miR-630-παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα με δοκιμασία ΜΤΤ και εκφράστηκαν ως επί τοις εκατό του ότι ανέστειλε τη φορά σε σχέση με τον έλεγχο miR-φορέα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή των τεσσάρων ξεχωριστών προσδιορισμών ± την τυπική απόκλιση (SD). *, ** Και *** (& lt? 0,05, & lt? 0.01 και & lt? 0.001) ήταν σημαντικά διαφορετικό σε σύγκριση μεταξύ miR-φορέα και miR-630? • ήταν ιδιαίτερα σημαντική και εκπροσώπησε τη σύγκριση μεταξύ miR-630 στο miR-630 + ΟΜΕ-630 χρησιμοποιώντας το

t

-δοκιμή. Απόπτωση του miR-630 κύτταρα αξιολογήθηκε μετά από 48 ώρες των επιμολυσμένων κυττάρων. Ο θάνατος των κυττάρων μετρήθηκε με κυτταροπλασματική ιστόνης σχετιζόμενη-DNA-θραύσματα με ELISA (συντελεστής εμπλουτισμού = OD του miR-630 που εκφράζεται λύματος /OD του miR-φορέα, OD στα 405 nm-490 nm).

Η

Συζήτηση

Η σημασία της έκφρασης microRNA στη διατήρηση της φυσιολογικής κυτταρικής φυσιολογίας έχει τεκμηριωθεί καλά [15]. Η αναστολή της επεξεργασίας microRNA έχει δειχθεί ότι ενισχύει την κυτταρική μεταμόρφωση [16]. Η ατελής knockdown του Dicer 1 σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα ποντικού οδήγησε σε αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διεισδυτικότητα, καθώς και ενισχυμένα

in vivo

σχηματισμό όγκου [16]. Περαιτέρω, μειωμένη έκφραση microRNA στο ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών οδήγησε σε ατελή μετασχηματισμό των κυττάρων [16]. Οι μηχανισμοί με τους οποίους η έκφραση microRNA μειώσεις στις κακοήθη κύτταρα σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα δεν είναι σαφής. Πρόσφατα, επιγενετική ρύθμιση της έκφρασης microRNA έχει καταδειχθεί σε μία ποικιλία όγκων [17]. γονίδια microRNA σίγησαν σε ανθρώπινους όγκους από ανώμαλη υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων δίπλα και γύρω από τα γονίδια microRNA και με ακετυλίωση των γονιδίων που συνδέονται microRNA ιστόνες [17]. Έχει βρεθεί ότι ένα μεγαλύτερο ποσοστό των γνωστών γονιδίων microRNA έχουν βρεθεί να ρυθμίζονται επιγενετικώς μέσω μεθυλίωσης (11,6%) από εκείνη που βρέθηκε στα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (1-2%) [18], [19].

στην παρούσα δημοσίευση, έχουμε αποδείξει ότι η 3-Cl-AHPC διαμορφώνει την έκφραση ενός αριθμού microRNAs που ρυθμίζουν την μετάφραση και την υποβάθμιση του mRNA. Αυτά τα mRNA κωδικοποιούν την έκφραση των πρωτεϊνών προηγουμένως αποδειχθεί ότι έχουν σημαντικές φυσιολογικές ρόλους στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και θάνατο. Έχουμε βρει ότι η έκθεση 3-Cl-AHPC είχε ως αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα πάνω ενός αριθμού microRNAs συμπεριλαμβανομένων miR-150 * και miR-630. Η σημασία της διαμόρφωσης αυτών των microRNAs καταδείχθηκε με την παρατήρηση μετέπειτα διαμόρφωση της προβλεπόμενης genes- στόχο τους, συμπεριλαμβανομένων των EGFR, c-Μγβ, SMAD1, ABCC1, CPEB3, IGF-1R και CDK6.

3-Cl-AHPC up -Κανονισμός του miR-150 * ως αποτέλεσμα την μειωμένη έκφραση του c-Myb και IGF-1 R. Αμφότερες οι πρωτεΐνες παίζουν κρίσιμους ρόλους στην ενίσχυση κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Υπερ-έκφραση του IGF-1 R έχει βρεθεί σε μια ποικιλία κακοηθειών περιλαμβανομένων του καρκίνου του παγκρέατος [20]. Αναστολή της IGF-1 R χρησιμοποιώντας μικρομοριακούς αναστολείς κινάσης έχει σαν αποτέλεσμα τη μειωμένη ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος [21].